阿尔茨海默氏病的诊断和治疗方法

阿尔茨海默氏病的诊断和治疗方法
【专利摘要】本发明公开了诊断和治疗阿尔茨海默氏病的方法。特别地，本发明公开了在患有阿尔茨海默氏病的患者中恢复血-脑屏障完整性和/或促进血管复原的方法，所述方法包括施用抗血管生成剂或是能够使紧密连接恢复完整性的试剂。本发明也公开了在患者中预防或推迟阿尔茨海默氏病发病的方法。
【专利说明】阿尔茨海默氏病的诊断和治疗方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及诊断和治疗领域，特别是涉及阿尔茨海默氏症的诊断和治疗领域。
【背景技术】
[0002]阿尔茨海默氏病是最常见的痴呆形式。人们尚没有很好地理解该疾病的原因和进展，但是长期以来，淀粉样斑块的逐步形成和淀粉样蛋白β_肽在血管内的沉积被认为是阿尔茨海默氏病的病理标志。
[0003]在阿尔茨海默氏病的动物模型中，血脑屏障(BBB)功能异常最先被识别出来，然后才在这些动物模型中识别出老年斑的形成(Ujiie等，(2003)，Microcirculation, 10:463-470)。BBB功能异常后来被证实是患者体内阿尔茨海默氏病的突出(虽然原因尚不明)的临床病征(Farrall&Wardlaw, (2009)Neurobiol Aging30:337-352)。在阿尔茨海默氏病的病程中BBB功能异常是何时起源的还是未知的，但淀粉样β-肽(Αβ )可能直接参与了这一过程，这是由于已经证实在许多阿尔茨海默氏病的转基因动物模型中都存在BBB泄漏，在这些动物模型中，淀粉样蛋白前体蛋白(APP)都过度表达(Ujiie等，出处同上；Kumar-Singh等，(2005) Am J Pathol 167:527-543 ;Paul 等，(2007) J Exp Med204:1999-2008 ；Dickstein等，(2006)Faseb J, 20:426-433)。用Αβ肽接种已显示出能逆转BBB病状(Dickstein等，出处同上)。
[0004]安德森等人(Cardiov ascularPsychiatry and Neurology, (2011), ArticleID616829)提出，在阿尔茨海默氏病中水调节被扰乱了，从而导致血脑屏障的通透性异常以及跨血管壁的交换速率异常。
[0005]已经有人报道了在阿尔茨海默氏症中微血管病变的高发病率(Perlmutter等，(1990) ,Brain Res.508 (I): 13-19)。也有人报道在受阿尔茨海默病影响的大脑区域一直有血管生成，并暗示其与组织损伤有关(Desai等，(2009)，J NeuralTransmission, 116(5):587-597)。
[0006]已经报道了长期使用诸如非留体抗炎药、降脂他汀类药物、组胺H2受体阻断剂和钙通道阻断剂等这些药物，能在降低高危人群罹患阿尔茨海默氏病的风险。基于这些药物可能也具有抗血管生成的性能，产生了这样一个初步的假设，即阿尔茨海默氏病是由病理性血管生成导致的，并且脑内皮的血管生成的活化导致了 β_淀粉样蛋白斑的沉积以及导致了能杀死关键神经元的神经肽的分泌(Vagnucci&Li，(2003)，Lancet, 361:605-608)。
[0007]先前也有人描述了一种抑制血管生成的方法，该方法针对与血管生成相关的疾病或以血管生成增加为特征的病症(例如，黄斑变性、糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病、肥胖症、银屑病、动脉粥样硬化、血管畸形、血管瘤、子宫内膜异位症)，采用选自pl90RhoGAP活化剂、TFI1-1激活因子、GATA-2抑制剂中的一种抗血管生成试剂(W02009/155504)。
[0008]提供该背景信息的目的是披露那些 申请人:认为可能与本发明有关的已知信息。 申请人:不意在承认，也不应理解为，上述任何信息已构成本发明的现有技术。
【发明内容】

[0009]根据本发明的一个方面，提供了一种通过在患有阿尔茨海默氏病或有风险发展成阿尔茨海默氏病的患者的大脑中抑制血管生成来治疗阿尔茨海默氏病或延缓阿尔茨海默氏病发作的方法。
[0010]根据本发明的另一个方面，提供了一种通过单独施用或与治疗剂组合施用抗血管生成剂来治疗阿尔茨海默氏病的方法。
[0011]根据本发明的一个方面，提供了一种使患有阿尔茨海默氏病或有风险发展成阿尔茨海默氏病的受试者恢复血脑屏障(BBB)完整性的方法，包括向所述受试者施用有效量的抗血管生成剂和/或使用能防止Aβ淀粉样蛋白形成的试剂和/或施用能促进Αβ肽从大脑中除去的试剂。
[0012]根据本发明的一个方面，提供了一种使受试者维持血脑屏障完整性的方法，包括向所述受试者施用有效量的抗血管生成剂和/或施用能抑制A β淀粉样变性的试剂和/或施用能促进Aβ肽从脑中除去的试剂。
[0013]根据本发明的另一个方面，提供了一种在患有阿尔茨海默氏病或有风险发展成阿尔茨海默氏病的受试 者中促进脑血管复原的方法，包括向所述受试者施用有效量的抗血管生成剂和/或施用能促进Αβ肽从脑中除去的试剂。
[0014]根据本发明的另一个方面，提供了一种在受试者中预防或延缓血脑屏障泄漏的方法，包括给受试者施用有效量的抗血管生成剂和/或施用能抑制Aβ淀粉样变性和/或能促进Αβ肽从脑中除去的试剂。
[0015]根据本发明的另一个方面，提供了一种用于对具有发展成阿尔茨海默氏病风险的或患有早期阿尔茨海默氏病的受试者进行鉴定的方法，包括在受试者脑中检测血管生成，检测TJ破坏和/或检测血脑屏障破坏。
[0016]根据本发明的另一个方面，提供了一种识别阿尔茨海默氏病的潜在治疗剂的方法，包括对候选试剂的使脑血管紧密连接得以恢复的能力进行测试或对候选试剂的促进脑中血管复原的能力进行测试。
【专利附图】

【附图说明】
[0017]下面参照附图进行对本发明进行详细描述，本发明的这些特征和其它特征将更加明显。
[0018]图1:Tg2576AD小鼠脑有紧密连接的病理。该图示出了老龄Tg2576和野生型小鼠的脑血管的代表性共聚焦显微镜照片，免疫标记咬合蛋白(occludin)或ZO-1 (红色)并用T0T0-3复染DNA(蓝色)。在野生型中示出，新皮层和海马成像的血管呈现出强烈的、持续的和线性的咬合蛋白(A和C)或ZO-1 (E和G)，这样的血管表达被认为是正常的。在Tg2576小鼠脑血管中看到异常的咬合蛋白(B和F)和ZO-1 (D和H),其染色显示为点状(白色箭头)，不连续的或间断的(白色空心箭头)。结果是在3个独立试验中每组3只小鼠中的代表性结果。比例尺为20微米。
[0019]图2:老龄Tg2576小鼠的紧密功能的表达降低。在野生型和Tg2576小鼠的新皮层(A和B)和海马(C和D)之间，对咬合蛋白或ZO-1的表达进行定量比较。(A)与年龄一致的野生型小鼠相比，老龄Tg2576小鼠中，具有ZO-1异常表达类型的皮层脑血管的比例显著增高(***p〈0.001)。与幼龄的Tg2576小鼠相比，老龄Tg2576小鼠的皮层中，ZO-1破坏的发生率也显著增高(幼龄野生型，n=4 ;幼龄Tg2576，n=3 ;老龄野生型，n=5 ;老龄Tg2576中，n=4 ;*p〈0.05)。(B)与年龄一致的野生型小鼠相比，老龄Tg2576小鼠中皮层的咬合蛋白水平显著降低(n=7，**p=0.0072)。(C)与年龄一致的野生型小鼠相比，老龄Tg2576小鼠中，具有ZO-1异常表达类型的海马脑血管的比例显著升高(***p〈0.001)。同样，与幼龄的Tg2576小鼠相比，老龄Tg2576小鼠的海马中ZO-1中断的发生率显著升高(幼龄野生型，n=4 ;幼龄 Tg2576，n=3 ;老龄野生型，n=5 ;老龄 Tg2576，η=4 ;*ρ〈0.05)。(D)与年龄一致的野生型小鼠相比，老龄Tg2576小鼠中海马咬合蛋白水平显著降低(η=7，#ρ=0.0076)。数值表不为均值土标准误(SEM)。
[0020]图3:血管生成而不是凋亡诱导Tg2576小鼠紧密连接的免疫反应的改变。该图示出了在老龄野生型和Tg2576小鼠中，TJ (Z0-1)、对血管生成或凋亡的标志物双染的代表性共聚焦显微镜照片。不考虑TJ的表达类型，对所有血管的CD105染色。白色箭头指向脉管系统中TJ异常区域。在野生型(a)和Tg2576 (b)的新皮层中，对血管的ZO-1 (红色)和⑶105 (绿色)进行双染。在野生型(c)和Tg2576 (d)的新皮层中，对血管的ZO-1 (红色)和caspase3 (绿色)进行双染。Caspase-3染色不与Z0-1的染色共定位,这表明在脉管系统中不存在凋亡。(E和F)为⑶105和caspase3的蛋白质印迹分析。结果是在3个独立试验中每组3只小鼠中的代表性结果。比例尺为20微米。
[0021]图4:在老龄Tg2576小鼠和阿尔茨海默病人类患者中微血管密度增加。在老龄和幼龄的Tg2576和野生型中，通过⑶105染色，对脑血管系统中的MVD和⑶105蛋白的表达进行了定量。(A)与年龄一致的野生型相比，老龄Tg2576小鼠有显著较高的MVD(***ρ〈0.001)。与幼龄的Tg2576相比，老龄Tg2576有显著较高的MVD (老龄野生型，n=5 ;老龄Tg2576，n=4 ;幼龄野生型，n=4 ;幼龄Tg2576，n=3 ;*p〈0.05)。与野生型相比，幼龄Tg2576小鼠有更高的平均MVD的趋势，虽然并不显著。(B)与年龄一致的野生型相比，老龄Tg2576小鼠在皮层中CD105蛋白水平有显著升高(野生型，n=5 ；Tg2576,n=6 ;*#p〈0.001 )。(C)与年龄一致的野生型相比，老龄Tg2576小鼠在海马中的⑶105蛋白水平显著升高(n=7，*p〈0.05)。(D)与ND患者相比，用层粘连蛋白染色的通过％占用面积测量，AD患者的皮层有显著增加的MVD (n=4，*p〈0.05)。(E)与ND患者相比，AD患者的海马中MVD显著增加(通过用层粘连蛋白染色，测得占面积的％) (n=4，#*p〈0.001 )。在ND患者(F)和AD患者(G)的皮层中用层粘连蛋白的免疫组化染色的代表性图像。比例尺表示95μπι。数值表示为均值土标准误。
[0022]图5:通过共聚焦显微镜评价A β和PBS免疫的Tg2576小鼠表现出正常和异常的TJ表达。对来自Αβ免疫的(预防性或治疗性)Tg2576小鼠的脑血管标记咬合蛋白或ZO-1(红色)，并用T0T0-3复染DNA(蓝色)，示出了其代表性共聚焦显微图像。正常的紧密连接表达在血管有强烈的，持续的和线性的咬合蛋白或ZO-1的表达。(a)在用Αβ治疗性免疫的Tg2576小鼠的海马微血管中正常的咬合蛋白的表达。(b)在用Αβ预防性免疫的Tg2576小鼠的皮层微血管中正常的ZO-1的表达。在皮层和海马的血管中，紧密连接的异常表达呈现出模糊的、点状和不连续形态(白色箭头)。(c)在治疗性用Αβ免疫的Tg2576小鼠的皮层中ZO-1的异常表达。(d)在预防性免疫的Tg2576小鼠海马中咬合蛋白的异常表达。(e)在治疗性免疫的Tg2576小鼠的大横截面血管中咬合蛋白的异常表达。(f)在预防性免疫的Tg2576小鼠的大横截面血管中ZO-1的异常表达。结果是在3个独立试验中每组3只小鼠中的代表性结果。比例尺为20微米。
[0023] 图6:与PBS免疫对照组相比，用A β预防性免疫I年的Tg2576小鼠紧密连接异常减少。对用PBS或Αβ预防性免疫的Tg2576 (Tg/+)和野生型(+/+)小鼠的(a)皮层及(b)海马的TJ异常的发生率进行了定量比较。图表通过ZO-1的表达类型示出了 TJ表达异常血管的百分比。在(a)皮层中，与PBS+/+相比，用PBS免疫的Tg/+小鼠中TJ破坏的发生率显著升高(**ρ=0.0080)。与Αβ免疫的Tg/+小鼠相比，PBS Tg/+小鼠的TJ破坏的发生率也显著升高(*Ρ=0.0188)。在(b)海马中，与PBS+/+相比，用PBS免疫的Tg/+小鼠中TJ破坏发生率显著升高(****p=0.0006)。与Αβ免疫的Tg/+小鼠相比，PBS Tg/+小鼠的TJ破坏的发生率也显著升高(#*Ρ=0.0009)。数值表示为均值土标准误。PBS+/+，n=3 ；PBSTg/+, η=4 ；Αβ +/+, η=3 ；Αβ Tg/+, η=3。
[0024]图7:与PBS免疫的对照组相比，用A β治疗性免疫4个月的Tg2576小鼠中紧密连接异常减少。对用PBS或Αβ治疗性免疫的Tg2576 (Tg/+)和野生型(+/+)小鼠的(a)皮层及(b)海马的TJ异常的发生率进行了定量比较。图表通过ZO-1的表达类型示出了 TJ表达异常血管的百分比。在(a)皮层中，与PBS+/+相比，用PBS免疫的Tg/+小鼠中TJ破坏的发生率显著升高(#p=0.0046)。与Αβ免疫的Tg/+小鼠相比，PBS Tg/+小鼠的TJ破坏的发生率也显著升高(*Ρ=0.0028)。在(b)海马中，与PBS+/+相比，用PBS免疫的Tg/+小鼠中TJ破坏发生率显著升高(##p=0.0115)。与Αβ免疫的Tg/+小鼠相比，PBS Tg/+小鼠的TJ破坏的发生率也显著升高(#*ρ=0.0083)。数值表示为均值土标准误。PBS+/+，n=3 ；PBS Tg/+, η=4 ；Αβ +/+，n=3 ；AβTg/+, n=3。
[0025]图8:用Αβ免疫的Tg2576小鼠整体上降低了血管渗漏。示出了用A β预防性免疫的Tg2576小鼠的脑血管中，免疫标记ZO-1 (红色)小鼠白蛋白(mAlb，绿色)或Αβ (绿色)的代表性共聚焦显微图像。微血管(a)通常有正常的ZO-1表达，并没有显示白蛋白漏出。白色箭头指向两个正常和独立的表达ZO-1的微血管。白蛋白渗漏通常与更大的血管相关(b)，其显示出TJ异常。远离血管的类似梯度扩散的染色表示泄漏(白箭头)。(C)TJ异常表达的大血管(空心白色箭头)包含Αβ的血管沉积。结果是在3个独立试验中每组3只小鼠中的代表性结果。比例尺为20微米。
[0026]图9:用Αβ免疫的Tg2576小鼠中活化的caspase-3染色减少。示出了用咬合蛋白(occlu,红色)TJ染色的活化的caspase-3 (casp3,绿色)的代表性共聚焦显微图像(20倍)。Ca)在用PBS治疗性免疫的Tg2576小鼠皮层中，活化的caspase-3染色围绕TJ环。
(b)用Αβ预防性免疫的野生型小鼠海马中，活化的caspase-3染色。丝状结构可能对应于神经元，可以看到为绿色。在咬合蛋白或ZO-1标记的血管中，没有看到重叠或共染色。(C)在用Αβ治疗性免疫的Tg2576小鼠的皮层中，活化的caspase-3染色。在脑的这个区域可以看到有限的caspase-3染色。结果是在3个独立试验中每组3只小鼠中的代表性结果。比例尺为20微米。
[0027]图10:与对照组相比，在用Αβ免疫的Tg2576小鼠中微血管密度减少。在用Αβ或PBS预防性或治疗性免疫的Tg2576 (Tg/+)和野生型(+/+)小鼠的脑血管系统中，通过AD105染色对MVD定量。(a)与用PBS免疫的+/+小鼠相比，用PBS预防性免疫的Tg/+小鼠中MVD显著升高(*p〈0.000，t-检验)。与用PBS免疫的Tg/+小鼠相比，用Αβ免疫的Tg/+小鼠中 MVD 显著降低(**ρ〈0.0001，t-检验)。PBS+/+, n=4 ；PBS Tg/+, η=4 ;Αβ +/+，η=4 ；Αβ Tg/+，η=4。(b)与用PBS治疗性免疫的+/+小鼠相比，用PBS治疗性免疫的Tg/+小鼠中MVD显著增加(***p=0.0001，t-检验)。与用PBS治疗性免疫的+/+小鼠相比，用Αβ治疗性免疫的Tg/+小鼠中MVD显著降低(##Ρ〈0.0001，t-检验)。PBS+/+, n=5 ；PBS Tg/+,η=4 ；Αβ +/+, η=4 ；Αβ Tg/+, η=3。数值表示为均值±标准误。
[0028]图11:用Αβ免疫的Tg2576小鼠的TJ形态正常。示出了用Αβ或PBS免疫的(预防性和治疗性)+/+和Tg/+小鼠的脑血管中，免疫标记ZO-1 (红色)并复染DNA (蓝色)的代表性共聚焦显微图像。在用PBS免疫的+/+ (Α和B)、用Αβ免疫的+/+ (C和D)及用Αβ免疫的Tg/+ (G和H)中可见正常的ZO-1表达为很强的、连续的、线性的染色类型。在横向(H)断面血管中，正常的ZO-1呈现出近平行线。在用PBS免疫的Tg/+的小血管(Ε和F)和用Αβ免疫的Tg/+的大血管(I和J)中可见异常ZO-1染色类型出现点状、中断或不连续的(白色箭头)。比例尺为20微米。
[0029]图12:用Αβ免疫的Tg2576小鼠中异常的紧密连接减少。与用Αβ免疫的Tg/+和用PBS免疫的+/+小鼠相比，用PBS免疫的Tg/+小鼠中异常ZO-1表达类型血管的比例显著增加。这些发现与免疫疗法、(a和b)预防性和(c和d)治疗性、以及脑区中(a和c)皮层或(b和d)海马是一致的。在预防性疗法中:+/+，PBS, n=3 ；Tg/+, PBS, η=4 ；Αβ，+/+，n=3 ；Τ6/+,Α β ,n=30 在治疗性疗法中:+/+，PBS，n=4 ;Tg/+，PBS η=3 ;+/+，Αβ，n=4 ;Tg/+，A β , n=4。*p〈0.05, **p〈0.01, ***p〈0.001。
[0030]图13:用Αβ免疫的Tg2576小鼠中微血管密度降低。示出了不论Z0-1 (红色)异常(白箭头)(a)不存在或(b)存在，普遍存在的CD105 (绿色)脑血管系统染色的代表性图像。比例尺为20微米。与用Aβ免疫的Tg/+和用PBS免疫的+/+小鼠相比，用PBS免疫的Tg/+小鼠中MVD显著升高。这些发现与在(c)预防性(各组η=4)和(d)治疗性(+/+，PBS, n=4 ;Tg/+，PBS, n=3 ;+/+，Αβ，n=4 ;Tg/+，Αβ ；n=4)免疫疗法一致。小鼠平均大脑与体重比值在(e)预防性免疫(+/+，PBS, n=5 ；Tg/+, PBS, n=4 ;+/+，Αβ，n=5 ;Tg/+，Αβ，n=3)或(f)治疗性免疫(+/+，？85，11=4 ;Tg/+，PBS，n=4 ;+/+，Αβ，n=5 ;Tg/+，Aβ，n=5)小鼠不具有显著性。*ρ〈0.05，***ρ〈0.001。
[0031]图14:在用Αβ免疫的Tg2576小鼠中Αβ沉积的改变。代表性图像示出了在(a和b)治疗性或(c和d)预防性免疫方面，与(a和c)用PBS免疫的Tg/+小鼠相比，(b和d)用Αβ免疫的Tg/+小鼠示出了 Αβ沉积的普遍减少。
[0032]发明详述
[0033]降低BBB完整性促进了阿尔茨海默氏病的其他病症，如淀粉样蛋白斑，因此，在阿尔茨海默氏病的治疗和/或预防中保持或重建血脑屏障的完整性是有用的。本发明涉及以下发现，BBB完整性的降低是由于在大脑中血管生成。特别地，在脑中的血管生成导致维持BBB的紧密连接的破坏。抑制血管生成允许紧密连接的恢复，转而减少血脑屏障的“泄漏”。此外，Αβ肽的接种已经示出了会导致血管复原和紧密连接的恢复。
[0034]因此，在一些实施方案中，本发明提供了通过抑制脑内的血管生成来治疗和/或延迟阿尔茨海默氏病病理发生的方法。在一些实施方案中，本发明提供了通过抑制大脑内血管生成和/或恢复脑血管的紧密连接从而维持和/或恢复BBB完整性的方法。在一些实施方案中，这些方法包括施用一种或多种抗血管生成剂；一种或多种能促进脑内Αβ清除的试剂；一种或多种抑制淀粉样变性的试剂；一种或多种恢复脑血管紧密连接的试剂；或是它们的组合。一些实施方案提供了通过单独施用Αβ或与其他一种或多种治疗性试剂联合(如一种或多种抗血管生成剂)施用，促进阿尔茨海默氏病受试者的脑内血管复原的方法。
[0035]在一些实施方案中，本发明提供了鉴定用于预防和/或治疗阿尔茨海默氏病的试剂的方法，该方法包括对候选试剂的在脑中抑制血管生成的能力进行测试；对候选试剂的维持或恢复BBB完整性和/或使脑血管紧密连接复原的能力进行测试。
[0036]本发明的一些实施方案提供了一种对有风险发展成阿尔茨海默氏病的或患有早期阿尔茨海默氏病的受试者进行鉴定的诊断方法，包括在受试者脑中检测血管生成、在受试者脑中检测紧密连接(TJ)的破坏、和/或检测血脑屏障破坏。 [0037]定义
[0038]除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。
[0039]术语“疗法”(therapy)和“治疗”(treatment),在本文中可互换使用，是指改善受试者的状态所进行的干预。改善可以是主观的，也可以是客观的，是指被治疗的疾病的有关症状的减轻、防止疾病的发展，或病理状况的改变。因此，所用的术语“疗法”和“治疗”具有其最广泛的含义，并且包括对疾病的不同阶段的防止(预防)、缓和、减轻、以及治愈。防止受试者状况的恶化也包括在该术语的含义内。因而需要治疗的受试者包括已经患有该疾病，以及那些容易罹患该疾病，或有风险发展成该疾病的那些主体，以及那些打算预防该疾病的主体。
[0040]本文所用术语“受试者”和“患者”是指需要治疗的动物，如哺乳动物或人。
[0041]本文所用术语“约”是指与一个给定的值有大约+/-10%的变化。但是应当理解的是，对于本文所提供的任何给定值，无论是否被具体提及，这种变化总是包括在内的。
[0042]治疗方法
[0043]本发明的的一个方面提供了一种治疗或延缓阿尔茨海默氏病发生的方法，所述方法通过单独使用抗血管生成剂、和/或能防止A β淀粉样蛋白形成的试剂和/或能促进A β肽从大脑中除去的试剂，或是与其他治疗剂一起使用。在一些实施方案中，提供了预防和/或治疗阿尔茨海默氏病的方法，所述通过使用抗血管生成剂和/或能恢复TJ完整性的试剂和/或防止Αβ淀粉样蛋白生成的试剂和/或促进Αβ清除的试剂，维持和/或恢复血-脑屏障(BBB)的完整性和/或恢复紧密连接(TJ)完整性。根据本发明，这样的试剂包括传统的小分子药物；以及生物制剂，如核酸分子，重组载体，寡核苷酸抑制剂(核酸适体、反义和siRNA)、肽、蛋白质、抗体等。
[0044]抗血管生成剂包括但不限于HDAC抑制剂，丙戊酸；抗血管生成趋化因子(例如IP-10、PF-4和MIP)、西妥昔单抗、帕尼单抗、PI3K/Akt/mT0R信号途径抑制剂、MAPK-法尼基转移酶的Rho和Ras抑制剂、埃罗替尼、贝沙罗汀、帕唑帕尼(VOTRIENT ? )；依维莫司(Afinitor?);贝伐单抗(阿瓦斯丁贫)、伊马替尼、索拉非尼、受体酪氨酸激酶抑制剂，2-甲氧基雌二醇、舒尼替尼、来氟米特(SUlOI)、米哚妥林(PKC412)、伐他拉尼(PTK787/ZK222584), AG013736、AZD2171、CP547632、CP673451、RP1.4610、VEGF Trap、ZD6474、YM359445、SU5416、西罗莫司(驮瑞塞尔? )、巴马司他、马立马司他、新伐司他、普马司他、羧基酰氨基三唑、烟曲霉素、TIMP, TNP-470、CMlOl、IFN- a、IL-12、血小板因子-4、苏拉明、SU5416、凝血栓蛋白、血管抑素、内皮抑素、萨利多胺、四硫钥酸盐、替可加兰、雷佐生、白藜芦醇；i sthmin ；Met/VEGF双受体2激酶抑制剂E7050 ;盐酸石蒜碱和白藜芦醇。
[0045]抑制血管生成的肽包括但不限于SPARC肽；来源于胞外基质蛋白的肽(如西仑吉肽(EMD121974)；靶向RGD ；ATN-161 ;肿瘤抑素肽；肿瘤抑素片段；Pentastatin-l ；内皮抑素肽；内皮抑素片段IV、IVox ;内皮抑素肽片段I (180-199) ；C16Y ；C16S)；来源于生长因子或其受体的肽(如VEGF衍生肽D (LPR)或KSVRGKGKGQKRKRKKSRYK ；FGF-衍生肽Ac-ARPCA ；P144TSLDASIIffAMMQN ;参与凝血级联的蛋白衍生的肽(如 B9870 ；HPRG 衍生的(HHPHG)4 ;A_779 ；KV11 ；KPSSPPE ;纤维蛋白原衍生 ARPAKAAATQKKVERKAPDA));从趋化因子衍生的肽(如 PF4 衍生的(NGRKISLDLRAPLYKKIIKKLLES)；Chemokinostatin-1 ；Anginex);来源于TSPl结构域的含有蛋白质的肽(如D1-TSPa ；ABT-510 ；ABT-526 ；Properdistatin);来源于丝氨酸蛋白的肽(如 PEDF-TGA 片段；PEDF34-聚体片段 PEDF P18 ；Sv0rth-2) ；pTnI ；RC-3940-1I；PAMP12-20 ；IM862 ；Αβ ；Tetrastatin-1 (LPVFSTLPFAYCNIHQVCHY) ；Tetrastatin-3 (AAPFLECQGRQGTCHFFAN)；Pentastatin-3 (SAPFIECHGRGTCNYYANS)；Thrombostatin con-3 (SPWSPCSGNCSTGKQQRTR)；Chemokinostatin-7 (DGRKICLDPDAPRIKKIVQKKL) ；Chemokinostatin-8 (DGRELCLDPKENffVQRVVEKFLK) ;Semastatin-5A.1 (GPffERCTAQCGGGIQARRR) ;Semastatin_5B(TSWSPCSASCGGGHYQRTR) ；Properdistatin (GPWEPCSVTCSKGTRTRRR) ；Scospondistatin(GPWEDCSVSCGGGEQLRSR) ；Chemokinostatin-l (NGRKACLNPASPIVKKIIEKMLNS)；Chemokinostatin-3 (NGKKACLNPASPMVQK11EKI L) ； Chemokinostatin-5(NGKEICLDPEAPFLKKVIQKILD) ；Chemokinostatin-6 (NGKQVCLDPEAPFLKKVIQKILDS)；Semastatin-5A.2 (SPffTKCSATCGGGHYMRTR)；Nephroblastostatin (TEffTACSKSCGMGFSTRV)；Wispostatin-1 (SPWSPCSTSCGLGVSTRI) ；Thrombostatin con-1 (QPffSQCSATCGDGVRERRR)；Netrinstatin-5C (TEffSVCNSRCGRGYQKRTR) ；Thrombostatin con-6,环状 Cys4 和Cys8 (WTRCSSSCGRGVSVRSR) ；ffispostatin-2 (TAffGPCSTTCGLGMATRV) ；ffispostatin-3(TKffTPCSRTCGMGISNRV) ；Papilostatin-1 (GPWAPCSASCGGGSQSRS)；Papilostatin-2(SQWSPCSRTCGGGVSFRER) ;Hexastatin_2 (YCNINEVCHYARRNDKSYffL) ；Spondinstatin-l(SEWSDCSVTCGKGMRTRQR) ；Connectostain (TEffSACSKTCGMGISTRV) ；Cyrostatin(TSffSQCSKTCGTGISTRV) ；Netrinstatin-5D (TEffSACNVRCGRGffQKRSR) ；Fibulostatin-6.1(SAWRACSVTCGKGIQKRSR) ；Fibulostatin-6.2 (ASffSACSVSCGGGARQRTR) ；Fibulostatin-6.3(QPffGTCSESCGKGTQTRAR) ；Cartilostatin-1 (SPffSKCSAACGQTGVQTRTR) ；Cartilostatin-2(GPWGPCSGSCGPGRRLRRR) ；Adamtsostatin-4 (GPWGDCSRTCGGGVQFSSR) ；Adamtsostatin-16(SPffSQCTASCGGGVQTR) ；Adamtsostatin-18 (SKffSECSRTCGGGVKFQER) ；Adamtsostat1-like4(SPWSQCSVRCGRGQRSRQVR) ；Complestatin-C6 (TQffTSCSKTCNSGTQSRHR) ；Tetrastatin-2(YCNIHQVCHYAQRNDRSYffL) ;Hexastatin_3 (LPRFSTMPFIYCNINEVCHY)；(综述参见 Rosca 等，Curr Pharm Biotechnol.2011Augustl;12 (8):1101 - 1116)。
[0046]—些实施方案提供了治疗阿尔茨海默氏病的方法，所述方法通过使用抑制VEGF、FGF、FGF受体、EGF、EGF受体、TGFP (包括但不限于TGFP I)、VEGF受体、血小板衍生生长因子、PDGF受体、一氧化氮合成酶、白细胞介素_6、白细胞介素_8、白细胞介素-1 β、MMP, TNFa或血管生成素_2的试剂。这类试剂包括但不限于贝伐单抗(阿瓦斯丁? )、伊马替尼、索拉非尼、舒尼替尼、来氟米特(SU101)、米哚妥林(PKC412)、伐他拉尼(ΡΤΚ787/ΖΚ222584)、AG013736、AZD2171、CP547632、CP673451、RP1.4610、VEGF Trap、ZD6474、YM359445、英夫利昔单抗和白藜芦醇。一些实施方案提供了通过施用刺激Y-分泌酶的活性和/或刺激Notch靶基因表达的试剂治疗阿尔茨海默氏病的方法。
[0047]也可以包括通过包括使用SiRNA或反义技术的遗传学方法抑制血管生成分子的表达。也可以包括使用肽、抗体抑制血管生成分子的活性，所述抗体包括由载体表达的单链抗体。
[0048]一些实施方案提供了通过给予抑制神经纤毛蛋白I或巢蛋白(这两者已显示出在血管生成中发挥作用)治疗阿尔茨海默氏病的方法。例如可溶性神经纤毛蛋白-1可以减少血管生成。
[0049]如本文所述，脑微血管系统中A β肽的移除导致血管复原和TJ的恢复。因此，在一个实施方案中，促进血管复原的方法包括施用可以除去Αβ肽的试剂，例如能选择性结合Αβ或Αβ本身的抗体或其它化合物。本发明的一些实施方案提供了针对Aβ肽的内源性抗体的刺激产生。一些实施方案提供了在患有阿尔茨海默氏病或有风险发展成阿尔茨海默氏病的受试者的脑中促进血管复原的方法，所述方法通过向单独施用Αβ肽或与另一治疗剂(如抗血管生成剂)联合使用。
[0050]已知在阿尔茨海默氏病中血脑屏障的破坏先于其他病状。因此，在一些实施方案中，通过施用抗血管生成剂或恢复脑血管的紧密连接的试剂，恢复患者血脑屏障完整性，从而延迟发病或预防与阿尔茨海默氏病相关的一种或多种病状。在一些实施方案中，提供了使用这些药剂缓解疾病的结局的方法。
[0051]本领域已知，一些试剂能作用于恢复BBB和/或TJ完整性。本发明的一些实施方案提供了包括使用这些试剂的治疗方法。这类试剂包括但不限于苔藓抑素-1、丁酸钠、白藜芦醇、槲皮素、前胡素和凝聚素。也已证实糖皮质类固醇能恢复BBB完整性(Marchi等，2011, Cardiovascular Psychiatry and Neurology, Vol.201, Article ID48241),并在本发明的治疗方法中被考虑使用。
[0052]阿尔茨海默氏病中BBB和TJ的破坏显示与发生在湿性黄斑变性中的血-视网膜屏障(BRB)的破坏并行。因此，本发明的一个实施方案提供了用于治疗或研究用于治疗湿性黄斑变性的试剂在治疗阿尔茨海默氏病中的用途，所述试剂包括例如血管内皮生长因子抑制剂和抗氧化剂。这类试剂的实例包括但不限于雷珠单抗(Lucentis?),
贝伐单抗(阿瓦斯丁?)、哌加他尼钠(Macugen?)、VEGF Trap、贝伐西尼、帕唑帕尼(V0TRIENT?)、RTP8011-14//PF-655、AGN-745/SIRNA-027、维甲酰酚胺、iSONEP? 和Evizon?。
[0053] 已知血-脑屏障和紧密连接的破坏发生在多发性硬化症(MS)中，并且已经研发了很多能改善血脑屏障的完整性的试剂来治疗MS。因此，本发明的一个实施方案提供了用于治疗或研究用于治疗多发性硬化症的试剂在治疗阿尔茨海默氏病中的用途。其例子包括但不限于干扰素β-1a(例如Avonex?，利比?，CinnoVex?)和干扰素β-1b (例如贝他费隆?、倍泰龙?、Extavia ?、Ziferon ?)。在一些实施方案中，使用其他
MS的治疗,如醋酸格拉替雷(Copaxone?)、那他珠单抗(Tysabri的?)和/或芬戈莫
德(Gilenya ?)，也包括在本发明的治疗方法中，尽管这些化合物对血脑屏障的完整性的影响语焉不详。
[0054]本发明的一些实施方案中也包括使用抗血管生成剂的组合，如抗血管生成剂与其他治疗形式的组合，如糖皮质激素、抗氧化剂、消炎药、免疫治疗剂等。本发明的一些实施方案提供了使用抗血管生成剂和Aβ肽免疫接种组合。
[0055]在一些实施方案中，患者或受试者不知道与阿尔茨海默氏病相关的风险因素或未被证实有与阿尔茨海默病相关的风险因素。在其它实施方案中，患者或受试者被证实具有与阿尔茨海默氏病相关的一个或多个风险因素。这些风险因素包括但不限于静态生活方式、动脉粥样硬化、糖尿病、湿性黄斑变性、中风、高胆固醇血症、脑淀粉样血管病、脑血管疾病、高血压、低 血压、脑震荡、外科手术、化疗、麻醉剂暴露、代谢障碍或代谢综合征、唐氏综合症、白内障(cataracs)、嗅觉和味觉的丧失、门控状态的改变、认知/记忆执行的改变和MRI检查确定的脑容量(更小或大小改变)。
[0056]诊断方法
[0057]本发明的的一个方面提供了确定受试者有风险发展成阿尔茨海默氏病、或具有早期阿尔茨海默氏病的诊断方法，包括在受试者的脑中检测血管生成、TJ破坏和/或血脑屏障破坏。血管生成、TJ破坏和/或血脑屏障破坏可以通过如下方式检测，例如通过使用本领域已知的医学成像技术，对来自受试者的生物样品检验指示血管生成、TJ破坏和/或血脑屏障破坏的生物学标志物。
[0058]在本发明的上下文中，生物样品是包含一种生物材料的样品。具体的非限制性实例包括血液、血清、血衆和脑脊液。生物样品还包括活组织检查，例如脑组织。
[0059]可用于检测血管生成的生物学标志物包括，例如循环血管生成因子如VEGF、FGF-2、MMP-9、IL-8、IL-6 和 HGF ;内皮细胞衍生分子如 sVEGFRl、sVEGFR2、sVEGFR3、sTie-2和VCAM-1 ;以及其他循环蛋白质或肽，如内皮抑素和肿瘤抑素。
[0060]可用于检测TJ破坏的生物学标志物包括，例如IL-8、扣带蛋白(cingulin)、Z0_l、Z0-2、咬合蛋白、紧密连接蛋白-6、Lfc和E-钙粘素、包括这些蛋白质的可溶形式或片段。
[0061]可在血液中检测到的指示血脑屏障破坏的生物学标志物是通常在脑脊液(CSF)中发现的蛋白质。这样的生物学标志物的包括，例如转甲状腺素蛋白(参见Marchi等，2003，J.Neuroscience, 23 (5): 1949-1955)、S-100 β 和可溶性连接粘附分子 _3 (sJAM-3)(参见 Zrabquer 等，2010，J.1mmunol.，185 (3): 1777-1785)。
[0062]在样品中，在蛋白质或DNA/RNA水平检测这些生物学标志物的方法是本领域已知的，这些方法包括，例如ELISA、蛋白质印迹、蛋白质组学、各种基于PCR的技术，以及各种阵列技术(参见例如 Ausubel 等，(1994&updates) Current Protocols in MolecularBiology, Wiley&Sons, New York，NY，and Current Protocols in Protein Science, ed.Coliganj J.E.等，Wiley&Sons，New York，NY)。
[0063]合适的医疗成像技术通常包括施用(如通过静脉注射或鞘内注射)增强血管结构的造影剂或示踪剂。使用所选择的成像方法，在施用造影剂之前以及之后以适当的时间间隔获取图像，例如磁共振成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)、计算机断层扫描(CT)或超声波。造影剂和示踪物的实例包括但不限于:钆螯合物示踪剂，基于碘的示踪剂，H215O示踪剂和微泡，以及与针对血管的单克隆抗体或肽偶联的示踪剂。
[0064] 本发明的一个实施方案还提供了监测指定治疗的效力的方法。效力可以通过以下方式评价，例如通过在治疗前以及治疗后的不同时间点从受试者中采集样品，并检验这些样品中如上所述的指示血管生成、TJ破坏和/或BBB破坏的生物学标志物，从而评价所述治疗对血管生成、TJ破坏和/或BBB破坏的影响。可供替代的是，通过在治疗前以及治疗后的不同时间点通过医学成像技术来检验受试者体内如上所述的指示血管生成、TJ破坏和/或血脑屏障破坏的生物学标志物，从而评价所述治疗对血管生成、TJ破坏和/或血脑屏障破坏的影响。
[0065]筛选方法
[0066]本发明的的一个方面提供了通过测试候选试剂恢复脑血管中紧密连接和/或促进血管复原的能力，从而识别用于治疗阿尔茨海默氏病的药物的方法。在一些实施方案中，该方法被用来筛选已知的抗血管生成剂，从而获得能恢复脑血管中紧密连接和/或促进血管复原的能力的试剂。
[0067]本筛选方法可以在体外适当的细胞培养、或在体内适当的动物模型中进行。
[0068]对于体外试验，合适的细胞系培养物可用能破坏TJ的试剂处理，所述细胞系例如脑毛细血管内皮细胞、永生化的人脑内皮细胞株HCMEC/D3、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)O^生化人微血管内皮细胞株HMEC-1，它们可以提供血脑屏障的功能性体外模型；所述破坏TJ的试剂例如血清或来源于血清的因子(如溶血磷脂酸(LPA)和血管内皮生长因子)、IL-2、或干扰素Y。之后，培养物与候选试剂接触，并在适当的间隔之后测量TJ恢复的程度。TJ的恢复可以通过(例如)免疫组化的方法来确定TJ蛋白的定位，所述TJ蛋白如Z0-1、咬合蛋白和claudin，通过在显微镜下目视检查或通过跨内皮电阻(TER)进行评估。
[0069]使用适当的动物模型来进行体内测试。阿尔茨海默氏病的各种动物模型是本领域已知的(参见例如 Handbook of Animal Models in Alzheimer’s Disease, Ed.G.Casadesus, 2011, IOS Press, Inc., Fairfax, VA)。合适的小鼠模型包括在本文提供的实施例所述的 Tg2576 小鼠模型，以及 fc1-wt-Abetal-42A、PDAPP, APP-London, APPNLh/NL\C3-3、R.1.40、APP23、Tg_CRDN8、APPDutch、Tg-SweD1、Tg-ArcSwe、APParc、PSAPP、3xTg_AD、5xFAD、APP/PSlKl 和 TBA2。
[0070]—般而言，在体内试验中，试验动物被分成组，包括测试组和不接受候选药剂的对照组。根据需要，可以包括接受已知的恢复TJ完整性的试剂的阳性对照组。对试验组施用候选药剂，对动物进行定期监测，例如检查作为治疗结果的任何外在表现的变化。经过适当的一段时间后，将动物处死，通过标准技术评估脑血管中TJ的完整性。例如，免疫组织化学方法可用于确定TJ蛋白(如Z0-1,咬合蛋白和claudins)的定位,或在显微镜下进行目视检查活检样品。血脑屏障对伊文思蓝染料渗透性的测量可用于评价如上所述的候选试剂对BBB或TJ完整性的生物学标志物的作用。
[0071]在本发明的一些实施方案中，提供了通过测定候选药剂抑制血管生长的能力，确定对于阿尔茨海默氏病的预防和/或治疗可能有用的药剂的方法。例如，可以测试该试剂抑制内皮细胞增殖或毛细管形成的能力。在一些实施方案中，提供了通过测试候选试剂抑制基因表达(编码血管生成蛋白)或增强的基因表达(编码血管生成抑制剂)的能力，确定试剂可以用于阿尔茨海默氏病的预防和/或治疗的方法。报告基因的检验将目的基因启动子与报告基因(如荧光蛋白)连接在一起，所述报告基因是本领域已知的。在一些实施方案中，还提供了测试候选试剂抑制血管生成的能力的方法。在测试方法的具体的实施方案中，测试候选试剂抑制Αβ或淀粉样蛋白诱导血管生成的能力的测试方法。抑制血管生成的方法是本领域已知的，并且包括但不限于内皮细胞增殖检验、毛细管形成检验、CAM检验和角膜袋检验。
[0072]为了更好地理解本文所描述的发明，阐述了下述实施例。应当理解，这些例子是用来描述本发明的示意性实施方案，并且不以任何方式限制本发明的应用范围。
实施例
[0073]例1:阿尔茨海默氏病的病理生理学中血管生成和血脑屏障紧密连接破坏同时发生 [0074]概要:
[0075]实施例1中进行的研究用于对Tg2576AD模型小鼠中脑血管完整性进行定性，其通过检查紧密连接(TJ)蛋白、咬合蛋白和ZO-1的表达，连同凋亡和血管生成的标志物，所述小鼠发现于瑞典家族，其过表达含有双错义突变的人类淀粉样前体蛋白(APP)，其引起早发性AD。与年龄一致的野生型同窝小鼠及两种基因型的幼龄小鼠相比，在老龄AD小鼠表现出了显著增多的突变TJ蛋白，这与微血管密度的增加而不是细胞凋亡有直接联系。这有力地支持了 Αβ (淀粉样蛋白-β肽)引发的血管过多是BBB破坏的基础。通过对AD病人和对照组的脑组织的验尸检查，证实人类AD病人中存在血管过多。上述结果表明，由于新生血管生成引起A β介导的BBB破坏，导致维持血脑屏障的TJ的重新分布。
[0076]本研究的目的是通过研究Tg2576AD小鼠中TJ的形态来描述A β和血脑屏障完整性之间的关系，并发现可以解释AD病人中BBB破坏的机制。本研究的结果表明，Tg2576小鼠有显著TJ异常，这和与血管生成增加有关的血管密度增加有直接关系。
[0077]材料与方法:
[0078]实验用鼠
[0079]本研究使用了 Tg2576转基因(Tg/+)小鼠。这些小鼠表达含有瑞典错义突变(K670N/M671L) [Hsiao 等，(1996) Science274:99_102]的人类 APP695，其受到仓鼠朊蛋白启动子(Taconic)的控制。
[0080]通过Tg2576公鼠和C57B16/SJL Fl母鼠的杂交，保持小鼠的混合C57B16/SJL背景。野生型(+/+)同窝小鼠作为对照。老龄小鼠为18至24个月大，而幼龄小鼠为五个月大。小鼠喂食任意的标准实验室饲料和水，并保持12小时光照/黑暗周期。
[0081]人脑组织的分类
[0082]死后皮层和海马脑组织的详尽参考标准得自英属哥伦比亚大学(加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市)的Kinsmen Laboratory Brain Bank。使用了健康和AD病人大脑的参考标准。在[Jantaratnotai 等,(2010)Curr Alzheimer Res7:625-636]中描述了相应病人的临床和疾病史的分类。
[0083]组织准备[0084]小鼠用阿佛丁( 0.02mL/1g)麻醉致死。迅速切除脑，去除嗅球后，在4°C下的4%多聚甲醛中固定脑四天。然后将脑包埋在石蜡中并以5微米等距离切片。石蜡包埋、切片和脱腊是由Wax-1t Histology Services公司(加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市)进行的。对于免疫印迹，迅速切除脑，使用 Hagihara 等[Hagihara 等,(2009) J Vis Exp.33:piil543]描述的方法从两个脑半球分离海马和新皮层。
[0085]免疫染色
[0086]使用常规高压锅，含有0.7mM EDTA的20mM Tris缓冲液(pH9.0)全蒸汽2分钟，对脱蜡的石蜡切片进行抗原修复。然后在室温下，冷却的切片在封闭缓冲液(25%常规山羊血清；3%BSA ；0.3%的Triton X-100, Sigma)中孵育I小时。所用的一抗包括兔抗-Z0-1 (1:200, Invitrogen)、小鼠抗-Z0-1 (1:200, Invitrogen)、兔抗咬合蛋白(1:200,Invitrogen)、兔抗活化的 caspase-3 (1:1000, Imgenex)和鼠抗人 CD105 (1:20,DAK0)。在4°C下在染色缓冲液(10%常规山羊血清；3%BSA ；0.3%的Triton X_100)中过夜进行一抗染色。在用山羊一抗染色时使用了常规驴血清。所用的二抗是与一抗是互补的，带有AlexaFluor染料488或568 (1:500, Invitrogen)。在室温下在染色缓冲液中进行二抗染色I小时。T0T0-3( 1:10000，Invitrogen)被用于细胞核复染。在染色步骤之间，切片用含有0.1%Tween-20 (Sigma)的PBS洗漆三次，每次5分钟。染色的切片用Fluoromount-G (SouthernBiotech公司)盖玻片盖住，并避光过夜风干。
[0087]人脑组织使用由[Ujiie(2003)等,MicrocirculationlO: 463-470]描述的方法染色。简言之，自由浮动的30μηι厚的切片用抗层粘连蛋白一抗(1:100,兔,Sigma)进行免疫染色。然后，切片用适当的生物素化的二抗(1:1000 ；DAK0)在室温下处理I小时，接着用亲和素-生物素化的辣根过氧化物酶复合物(1:1000 ;ABC Elite, Vector Labs)孵育。用 0.01%的3，3- 二氨基联苯胺溶液(DAB ；Sigma)孵育，目测过氧化物酶标记。当出现暗紫色/黑色时，洗涤切片，固定在载玻片上、风干，并用Entellan (EMD Biosciences)盖上。
[0088]紧密连接蛋白形态的共聚焦和定量分析
[0089]腊块中每五片取出一片脑切片进行分析。用Zeiss LSM510Meta (蔡司，德国)拍摄图像，拍摄时使用了 16片，平均四次，在Z-平台上使用40x/l.3油浸Plan-Neoflaur物镜。复合投影图像以600dpi导入Adobe Photoshop中，并对对比度和亮度进行优化。对紧密连接蛋白形态的定量分析是根据Plumb等[Brain Pathol 12:154-169]提出的方法进行的。共聚焦数据集表示来自幼龄和老龄的Tg2576小鼠和同窝小鼠对照组在额叶皮层和海马区的约100个脑血管。单个血管按照Z0-1表达标记为正常(I)或异常(0)。正常的Z0-1表达表现出强的、连续的、密集的和线性的染色。与此相反，异常的Z0-1的表达表现出弱的、点状及/或不连续的染色。异常Z0-1血管的表达和正常对照的正常血管或患病大脑中的正常血管进行了对比。为了尽量减少不完整或起伏的血管由于Z0-1染色中出现“间隔”而被标记为异常，在图像中寻找了血管连续性的证据。例如，染色的细胞核的存在(含有T0T0-3)或点状或弥漫Z0-1的残存被用于定位血管束异常间隙。紧密连接的破坏的发生率被定义为在脑的特定区域中示出异常紧密连接形态的血管的平均百分比。
[0090]小鼠组织中微血管密度的定量
[0091]使用Guo等[Angiogenesis4:187-191]中描述的方法稍作修改,通过共聚焦显微镜定量微血管密度(MVD)。使用CD105作为脑血管生成的标志[Holley等，(2010) NeurosciLett470:65-70]，使用蔡司LSM510Meta分析软件获取并分析了最佳荧光强度的图像。脑切片中含有高密度(“热点”)[Weidner等，(1991)N Engl J Med324:1_8]CD105染色的区域使用前述的共聚焦参数和20x/0.45N-Achroplan物镜成像。使用软件针对每个热点的总荧光面积(TFA，μ m2为单位)减去背景后求和。从每只小鼠的四个不同的热点的平均TFA进行定量。TFA作为由⑶105抗体染色的总微血管的定量表示。成像区域中MVD表示为TFA和图像的总面积的比。
[0092]人体组织中微血管密度的定量
[0093]使用热点法对MVD进行定量，类似于小鼠的MVD的定量。简单地说，脑切片中含有高密度(“热点”)[Holley(2010)等，Neurosci Lett470:65-70]层粘连蛋白染色的区域使用装备了 DVC相机(Diagnostic Instruments)的Zeiss Axioplan-2光学显微镜成像，物镜为 Olympus LCPlanFL20x/0.40。使用 ImageJ(Rasband, W.S.，ImageJ vl.44p, U.S.National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.1nf0.nih.gov/ij/, 1997-2011)进行MVD定量。背景阈值水平最初由一个8位灰度决定，从不含一抗的对照组载玻片的原始黑白图像得出。然后，将高于对应阈值的具有染色密度的像素百分比与由层粘连蛋白染色的每个热点所占面积的百分比求和。从每个患者的每个脑区域中的4个不同的热点中，对由层粘连蛋白染色占据的平均面积百分比进行定量。成像区域的MVD表示为由层粘连蛋白染色占图像总面积的面积百分比。
[0094]定量蛋白质印迹分析
[0095]使用QIAGEN TissueLyser II工具，分离的新皮层和海马组织在1%NP_40的裂解缓冲液(20mM Tris-base(pH8.8), 2mM EDTA, 150mM NaCl, 1%NP_40 以及蛋白酶抑制剂(Roche))中在19Hz下进行20分钟的匀浆。为了剪切基因组DNA，匀浆样品通过21号针头10次，然后在冰上放置30分钟。匀浆液在4°C下以14000xg的速度离心30分钟。通过BCA测定法(Pierce)确定上清液中的蛋白质浓度，并且调节样品至每泳道30 μ g的终浓度。根据标准做法将蛋白质在10%SDS-PAGE凝胶中进行解析。使用兔抗咬合蛋白(1: 1000，Invitrogen)、小鼠抗人⑶105( 1:1000, DAK0)和小鼠抗 β -肌动蛋白(1:1000,Santa Cruz)在硝酸纤维素膜(Pall)中进行了免疫印迹处理。使用Alexa Fluor680偶联的抗兔IgG(Invitrogen)和IRDye800偶联的抗小鼠IgG (Rockland)作为二抗。所有抗体稀释液都在乳蛋白溶液中制备。信号强度通过Odyssey红外图像系统(LICOR)进行分析。
[0096]统计分析
[0097]所有实验一式三份进行至少三次。老龄及幼龄的Tg2576AD小鼠和野生对照同窝小鼠的数据使用Student’s t检验或双因子ANOVA分析,非配对的值用Bonferroni事后检验法。所有统计分析使用 GraphPad Prism (v5.0lfor Windows, GraphPad Software, SanDiego California USA, www.graphpad.com)讲行。p值小于0.05被认为是显著的结果。结果以平均值土标准误表示。
[0098]结果:
[0099]Tg2576小鼠的脑血管紧密连接形态的异常发生率较高。
[0100] 为了评估TJ蛋白形态的改变，使用共聚焦显微镜检查两个有效的TJ标志物-咬合蛋白和Z0-1的染色样本。对野生型和Tg2576小鼠的几个脑区的TJ形态进行了观察，包括新生皮层、海马区和脉络丛。几乎所有观察到的血管被纵向剖开。横向血管是罕见的。脑血管中咬合蛋白和ZO-1的强的、持续的和线性染色模式被认为是正常的，这在皮层或海马区、以及在所有年龄和基因型中是没有区别的[图1^工4和幻。经核复染增强的淡淡的血管痕迹，使得异常连接容易被发现。与对照组相比，Tg2576小鼠的咬合蛋白[图1:B和F]和ZO-1 [图1:D和H]分别在脑皮层和海马中表现出更高的点状染色发生率。脉络丛是大脑中不受AD影响的区域，在所有小鼠中这一区域的咬合蛋白和ZO-1的TJ都表现出正常的形态(数据未示出)。
[0101]通过计算血管显示形态异常的平均百分比来对TJ破坏进行量化。与野生型同窝小鼠(平均10%)相比，老龄Tg2576小鼠的脑皮层的TJ破坏显著增加(30.50 + 1.94% ；***p〈0.001，双因子AN0VA)[图2:A]。在老龄Tg2576和幼龄Tg2576小鼠中，TJ破坏发生的几率差别显著(*Ρ〈0.05，双因子AN0VA)[图2:Α]。
[0102]类似的结果在海马也出现了。与野生型同窝小鼠(平均10%)相比，老龄Tg2576小鼠的TJ破坏显著增加(24.75±2.32%;*#p〈0.001，双因子AN0VA)[图2:C]。相比于幼龄的Tg2576小鼠，老龄Tg2576小鼠的TJ破坏发生率显著增加(*p〈0.05，双因子AN0VA)[图2:C]。无论在皮层还是海马中，两种基因型的幼龄小鼠中TJ破坏大约为10%，并且在统计学上不显著。
[0103]在老龄Tg2576小鼠的脑皮层和海马中，使用免疫印迹检查咬合蛋白水平。与野生型小鼠(6.81±0.80，#p=(X 0072，t检验)相比，转基因小鼠(3.78±0.49)的皮层中咬合蛋白对β_肌动蛋白的比值下降了将近一半[图2:Β]。与野生型小鼠(10.31 ± 1.15，**ρ=0.0076，t检验)相比，老龄Tg2576小鼠(5.89±0.76)在海马中表现出类似的咬合蛋白对β_肌动蛋白的比值的减少[图2:D]。
[0104]老龄Tg2576的大脑有限的凋亡信号并且脑血管血管生成信号增加
[0105]为解释老龄Tg2576小鼠中观察到的脑血管TJ异常的可能机制，对细胞凋亡和血管生成进行了探讨。活化的caspase-3作为细胞凋亡的标志物[图3:C_E]。在所有检查的部分中，内皮细胞中没有活化的caspase-3免疫反应性。在其他细胞类型中，注意到活化的caspase-3染色，并且具有丝状样形态。在幼龄和老龄野生型小鼠中，在新皮层中有非常有限的活化caspase-3的染色[图3:C]。皮层和海马的血管表现出TJ异常[图3:D]，有直接与血管相邻的或与血管重叠的神经元样染色[图3:D (白色箭头)]。所有小鼠在海马CA1、CA2、CA3和DG区有不同程度的活化的caspase-3染色。与皮层相比，幼龄Tg2576和野生型(幼龄和老龄)的海马内显著增高的活化的caspase-3染色密度。与老龄Tg2576小鼠相t匕，幼龄Tg2576和野生型(所有年龄段)的caspase-3的海马染色的整体密度较低。然而，在趋于围绕可能斑块位置的新皮层和海马中，老龄Tg2576小鼠有显著的活化的caspase-3染色。
[0106]为了评估血管生成，使用确立的内皮标记物-⑶105 [Duff等，(2003) FASEBJ17:984-992]。⑶105对所有血管均匀染色，不分年龄和基因型。然而，与年龄一致的野生型同窝和两个基因型的幼龄小鼠相比，老龄Tg2576染色⑶105的血管的比例较高[图3:B] ο
[0107]老龄Tg2576小鼠的微血管密度增加。
[0108]之前指出，⑶105染色的老龄Tg2576小鼠的血管比例较高。对幼龄和老龄Tg2576小鼠、以及年龄一致的野生型同窝的脑微血管密度(MVD)通过⑶105染色进行了定量。该MVD被定义为TFA与成像区域总面积的比值，并且MVD用作血管生成测量的替代方法。与野生型相比，老龄Tg2576小鼠有显著更高的MVD。老龄Tg2576小鼠的平均MVD 值(0.4453±0.0146 ;_ρ〈0.001，双因子 ANOVA)超过野生型(0.1882±0.0010)两倍多[图4:Α]。与幼龄Tg2576小鼠相比，老龄Tg2576中MVD超过1.5倍(*ρ〈0.05，双因子ANOVA)。与野生型(0.2321 ±0.0110)相比，幼龄Tg2576小鼠有平均MVD更高的趋势(0.2674±0.0161)，但差异没有显著不同[图4:A]。
[0109]通过蛋白印迹法，对老龄Tg2576和野生型小鼠的脑皮层和海马的⑶105蛋白表达水平进行定量。与野生型(2.52±0.27，***ρ〈0.001，t_检验)相比，Tg2576小鼠皮层中的⑶105(4.57±0.27)对β -肌动蛋白的比例几乎是双倍[图4:Β]。与野生型(3.53±0.46，*ρ〈0.05，t检验)相比，在老龄Tg2576小鼠海马的⑶105对β -肌动蛋白的比例有相同的升高(5.66±0.62)，[图 4:C]。
[0110]在人体组织的初步检查中，对来自英属哥伦比亚大学的Kinsmen LaboratoryBrain Bank的经过仔细验证的病例中未患有疾病(ND)和AD患者的脑中的层粘连蛋白染色的进行定量。将这些样品用作尸检的内侧皮层和海马脑组织[Jantaratnotai等，(2010)Curr Alzheimer Res7:625-636]的参考标准，以便为将脑血管的密度增加从AD的动物模型延伸到临床人类疾病的提供支 持。以AD参考标准的皮层中，与ND(7.25±1.25%)相比，平均MVD所占的百分比面积将近2倍(12.23 + 1.28%，*ρ〈0.05，t检验)[图4:D]。类似的，与ND参考(7.10 ±0.23%)相比，AD参考标准的海马中平均MVD显示加倍(11.35 ±0.60%，***ρ〈0.001，t-检验)[图4:E]。与ND对照患者相比[图4:F]，在AD患者层粘连蛋白染色代表性图像中可以直观地看出大脑皮层血管密度增加的程度[图4:G]。AD与ND患者海马组织表现为相似的染色类型(数据未示出)。
[0111]讨论:
[0112]之前已经建立了通过量化使用伊文思蓝染料的方法，Tg2576AD模型鼠的血脑屏障被破坏，通过用Αβ免疫可以挽救这种破坏[Ujiie等，(2003)MicrocirculationlO:463-470 ;Dickstein 等，(2006)FASEBJ20:426-433]。血脑屏障完整性的降低早于其他AD神经病理(如淀粉样蛋白斑块)，这提供了脑血管和阿尔茨海默氏病(AD)之间的密切联系。然而，目前的观点认为，在AD患者血脑屏障泄露可能是由于血管退化和凋亡引起。实施方案I中描述的研究的目的是为了检测该假设，即在AD患者中血管生成和高度血管化是血管通透性增加的基础。血脑屏障的完整性通过检查Tg2576AD小鼠的TJ形态来完成，所述Tg2576AD小鼠发现于瑞典家族，其过表达含有双错义突变的人类淀粉样前体蛋白(APP)，引起早发性AD。测试两个不同的年龄组的小鼠:5月龄(发病前)和18+月龄(发病后)。与对照组相比，老龄Tg2576小鼠中发现有显著的异常TJ表达，这与恶性的血管生成密切相关。总的来说，在Tg2576小鼠中，在TJ的水平上，受Αβ影响的血管生成似乎引起了血脑屏障的破坏。
[0113]最近有人开始质疑:是否大型的聚集的胞外Αβ斑块(AD病理的一个标志)直接导致AD的神经退行性变化。现在我们相信可溶性A β寡聚物越小，毒性更强，可溶性A β寡聚物直接启动疾病(综述参见Sakono Μ, Zako T (2010) FEBS J277:1348-1358)。这些有毒的寡聚物的存在可以影响内皮细胞存活和TJ表达。若干体外研究通过Αβ探索内皮功能障碍。Marco等人研究[Neurosci Lett401:219-224]表明，Αβ-42刺激的内皮细胞培养诱导TJ蛋白(包括claudin、咬合蛋白、和Z0-1)的异常表达。Gonzalez等[Gonzalez-Velasquez等，(2008)J Neurocheml07:466-477]表明，较小的Αβ-40的聚集诱导了血管内皮细胞的通透性和ZO-1在细胞质中的重定位。血脑屏障泄漏的潜在原因中排除了 Αβ诱导的活性氧(R0S)，这是由于ROS解毒酶的存在并不影响Αβ诱导的损伤[Nagababu等，(2009)JAlzheimers Disl7:845-854]。然而,细胞骨架蛋白的重建被认为直接影响血脑屏障的完整性[Nagababu等，同上]。虽然Αβ涉及活性氧的产生的观点目前正在修订，其他来源的ROS (来自包括小胶质细胞活化和炎症以及血清渗出)仍可能对血脑屏障的完整性产生影响[Pun 等，(2009)Free Radic Res43:348-364]。
[0114]具体的剧毒十二聚体56kDa的Αβ寡聚体已经直接涉及Tg2576小鼠的记忆丧失，称为 “Αβ *56” [Lesne 等，(2006) Nature440:352-357]。该寡聚物出现在 6 月龄 Tg2576 小鼠中，此时记忆障碍刚刚显现，但不存在于幼龄的小鼠中[Lesne等，同上]。在本研究中，5月龄小鼠中异常血管TJ有逐步增加的趋势。然而，Tg2576小鼠早在4月龄开始显示出血脑屏障完整性的破坏[Ujiie等，(2003)MicrocirculationlO:463-470] ?在此期间,较小的毒性较低的低聚物的集聚可能开始影响小鼠BBB的完整性。到达6月龄，可以假设是有毒的Αβ*56的存在引起了 Tg2576小鼠中一连串相关的病理事件。虽然，从6至13月之间的时间段，Tg2576小鼠中Aβ *56的相对水平保持恒定[Lesne等，同上]。在这段时间内，斑块和营养不良的神经元的最终累积足以在该小鼠中引起进一步的病理损害。这可以解释在老龄Tg2576小鼠中异 常的脑血管TJ表达的戏剧性的存在。
[0115]在实施例1所示的研究中，针对活化的caspase-3的抗体未能发现内皮凋亡事件。然而，幼龄(5月龄)和老龄(18-24月龄)的Tg2576和相应的野生型小鼠表现出活化的caspase-3的表达与海马内非内皮染色为主。这些数据与广泛的内皮细胞死亡的缺失相一致。虽然本研究中未观察到内皮细胞凋亡，但是体外证据确实显示出Αβ，特别是含有Dutch突变体的突变，已被证明能诱导培养的内皮细胞的凋亡[ossati S等，(2010)FASEBJ24:229-241 ;Miravalle 等，(2000) J Biol Chem275:27110_27116 ;Paris 等，(2005)BrainRes Mol Brain Resl36:212-230]。
[0116]检验血管生成作为脑血管内皮细胞TJ破坏的另一种潜在的机制。一些证据表明血管生成发生在AD的过程中。首先，神经炎症是AD的一种病理特征[Streit WJ, MrakRE, Griffin WS (2004) J NeuroinfIammationl: 14],并与增加的细胞因子，如 IL-1 β 相关，其能够诱导血管生成[Pogue Al, Lukiw WJ (2004) Neuroreportl5:1507-1510]。促血管生成生长因子VEGF也被这些细胞因子诱导[Schultheiss等，(2006) Angiogenesis9:59-65],在 AD 患者中增加[Tarkowski 等，(2002)Neurobiol Aging23:237-243]。血管内皮生长因子直接刺激内皮细胞增殖[Shibuya M(2009)FEBS J276:4636-4643]。Αβ肽本身也被证明具有血管生成的特性[Boscolo 等，(2007) Int J Mol Medl9:581-587]。
[0117]在本文描述的研究中，⑶105被用于在TJ标记物标记的脑血管中检测血管生成。该抗体染色无法分辨那些TJ有或无异常的血管[Duff等，(2003) FASEB J17:984-992]。在该研究中，CD105的表观泛内皮染色是非常有用的，因为它允许CD105染色的密度定量，从而可以在整个脑中对微血管密度(MVD)的定量。MVD是用作组织部分的特定区域内的存在血管生成数量的替代标记。血管密度越大，认为已经发生越多的血管生成。MVD的测量也不是没有限制的，其中包括缺乏标准化和对操作员的依赖，从而使导致客观损失的偏见最小化[Goddard等，(2002)Angiogenesis5:15-20]。尽管如此,相比于年龄一致的野生型小鼠，年老的Tg2576小鼠有近两倍的MVD。幼龄的Tg2576小鼠表现出在MVD无显著差异，但与对照组相比微血管密度有增加的趋势。
[0118] Tg2576小鼠的血管生成是有争议的。Paris等[Neurosci Lett366:80_85]注意到Tg2576小鼠有有限的血管生成。泛血管内皮标记物PECAM被用来量化17月龄小鼠的血管生成作用。虽然在文献中，关于哪一个是“最好的”抗体并没有达成共识，但与CD105相比，作为血管生成的标记PECAM并不被看好[El-Gohary等，(2007)Am J ClinPatholl27:572-579]，这是由于血浆和炎症细胞中PECAM也是典型的免疫标记，并不限于泛内皮表达[Giatromanolaki 等,(1999) Oncol Resll: 205-212]。另一方面，CD105 与内皮细胞的反应一致[El-Gohar等，同上]，特别是那些正处于血管生成，并且不与基质或炎症细胞反应[萨阿德等反应[Saad 等，(2003) J Gynecol Pathol22:248-253 ;Saad 等,(2004)Mod Pathol 17:197-203]。文中所提供的数据表明，CD105相关的MVD的增加间接证明Tg2576小鼠中的血管生成和TJ异常是相关的。Tg2576小鼠中检测到促血管生成信号。在20月龄Tg2576小鼠皮层组织中，VEGF的升高[Burger等，(2009) IntJ DevNeurosci27:517-523]支持了在该AD模型中发生了血管生成的假设。最后，已经在人类AD脑中观察到了与脑血管的血管生成相关标志物表达水平的升高:[Jantaratnotai (2010)Curr Alzheimer Res7:625-636](层粘连蛋白或 vonWillerbrand 因子表达)；[Desai 等，
(2009)J Neural Transml 16:587-597] (integrin α V-β 3 表达)；并且在 AP233AD 小鼠模型(β 3-整合素亚基表达)中业观察到与脑血管的血管生成相关的标志物表达水平的升高。然而，从这些研究得出的结论指出血管生成是血管重构的结果，其是导致血管损伤和死亡的神经验证的结果。
[0119]在本研究中，并没有发现Tg2576小鼠脑血管死亡的的证据，相反，在两个Tg2576小鼠中都发现了新生血管生成的大量增加的证据。此外，尸检内侧皮层和海马脑组织的被充分了解的正常和AD参考标准的预检表明，这些组织在AD中也表现出明显的血管过多(图4F-G)。
[0120]总之，本研究表明，在Tg2576小鼠中TJ的破坏显著增加，并且这些破坏与年龄、疾病的严重程度相关。这些数据支持这样的模型，TJ破坏来源于AD极度新生血管形成时的血管通透性增加，通过Αβ产生的增加而引发。这些深远的、严重的病理生理特点似乎出现在疾病发展的早期，而竞争性的tau蛋白和Αβ是AD的特征标志。
[0121]实施例2:用Αβ免疫的阿尔茨海默病小鼠中血管过度增生和紧密连接的破坏被解决
[0122]概要:
[0123]实施例2所述的研究通过检查紧密连接(TJ)蛋白(咬合蛋白和Ζ0-1)以及与凋亡和血管生成的标志物来对Tg2576AD模型小鼠中的脑血管密度定性。在老龄阿尔茨海默病小鼠中，紧密连接破坏发生率的显著增加与微血管密度的增加而不是凋亡有直接关系，这有力地支持血管过度增生是血脑屏障功能障碍的基础。通过免疫接种Αβ肽，血管过度增生、TJ组织及血脑屏障的再密封都得到了解决。
[0124]该研究表明，在用活性Αβ免疫的AD小鼠模型中，血脑屏障紧密连接的完整性与Αβ的存在有关。从脑实质内取出Αβ消除了与微血管相关的TJ病理，并解决了血管生成的问题。此外，在人类免疫试验观察到的与微出血相关的CAA可以用受影响的血管中TJ减少来解释。本研究将血管重建与AD连接起来，并且该重新定义可能导致AD患者治疗方式的改善。
[0125]材料与方法
[0126]实验用鼠
[0127]如例I所述。
[0128]Αβ 接种
[0129]使用Schenk等人(Nature400，173-177)提出的方案来描述如何进行Αβ接种(Dickstein等，(2006)FASEB J20，426-433)。简言之，实施了两种单独的接种疗法，治疗性的和预防性的。免疫前，将小鼠从隐静脉放血并收集血清。在预防性疗法中，在小鼠6周龄时开始接种，在12个月时将其处死。在治疗行疗法中，小鼠接种开始于11月龄，在15个月时处死。每一组注射用的Αβ肽都是由冻干粉新鲜制备的。对于免疫接种，将2毫克的Αβ (人Αβ 1-40，Bachem公司)加入到0.9毫升的去离子水中并充分混合。然后加入lOOyLlOXPBS以获得IX PBS的终浓度。将该溶液涡旋并放置于37°C过夜，直到第二天使用。第一次免疫时，将Αβ 1-40 (每次注射100微克抗原)或PBS (对照组)与弗氏完全佐剂(CFA)按1:1 (V/V)混合。然后在第2周时将A β 1-40 (100微克)或PBS与弗氏不完全佐剂(ICFA)按1:1混合(体积/体积)并于此后每月进行加强。从第五次免疫开始,直接注射PBS或Αβ。采用腹腔内注射。 [0130]组织准备
[0131]最后用氯胺酮/甲苯噻嗪(100毫克/千克，10毫克/千克)将小鼠麻醉致死。将脑迅速切除，取出嗅球并在4°C下用4%多聚甲醛固定4天。然后将脑包埋在石蜡中，并以5微米连续切片。石腊包埋、切片和脱腊由Wax-1t Histology Services公司(温哥华)进行。
[0132]免疫染色
[0133]使用常规高压锅，含有0.7mM EDTA的20mM Tris缓冲液(pH9.0)全蒸汽2分钟，对脱蜡的石蜡切片进行抗原修复。然后在室温下，冷却的切片在封闭缓冲液(25%常规山羊血清；3%BSA ；0.3%的Triton X-100, Sigma)中孵育I小时。所用的一抗包括兔抗-Z0-1 (1:200, Invitrogen)、小鼠抗-Z0-1 (1:200, Invitrogen)、兔抗咬合蛋白(1:200,Invitrogen)、兔抗活化的 caspase-3 (1:1000, Imgenex)和鼠抗人 CD105 (1:20,DAK0)。在4°C下在染色缓冲液(10%常规山羊血清；3%BSA ；0.3%的Triton X_100)中过夜进行一抗染色。在用山羊一抗染色时使用了常规驴血清。所用的二抗是与一抗是互补的，带有AlexaFluor染料488或568 (1:500, Invitrogen)。在室温下在染色缓冲液中进行二抗染色I小时。T0T0-3( 1:10000，Invitrogen)被用于细胞核复染。在染色步骤之间，切片用含有0.1%Tween-20 (Sigma)的PBS洗漆三次，每次5分钟。染色的切片用Fluoromount-G (SouthernBiotech公司)盖玻片盖住，并避光过夜风干。
[0134]紧密连接形态的共聚焦和定量分析
[0135]腊块中每五片取出一片脑切片进行分析。用Zeiss LSM510Meta (蔡司，德国)拍摄图像，拍摄时使用了 16片，平均四次，在Z-平台上使用40x/l.3油浸Plan-Neoflaur物镜。复合投影图像以600dpi导入Adobe Photoshop中，并对对比度和亮度进行优化。对紧密连接蛋白形态的定量分析是根据Plumb等[Brain Patholl2:154-169]提出的方法进行的。共聚焦数据集表示来自幼龄和老龄的Tg2576小鼠和同窝小鼠对照组在额叶皮层和海马区的约100个脑血管。单个血管按照ZO-1表达标记为正常(I)或异常(O)。正常的ZO-1表达表现出强的、连续的、密集的和线性的染色。与此相反，异常的ZO-1的表达表现出弱的、点状及/或不连续的染色。异常ZO-1血管的表达和正常对照的正常血管或患病大脑中的正常血管进行了对比。为了尽量减少不完整或起伏的血管由于ZO-1染色中出现“间隔”而被标记为异常，在图像中寻找了血管连续性的证据。例如，染色的细胞核的存在(含有T0T0-3)或点状或弥漫ZO-1的残存被用于定位血管束异常间隙。紧密连接的破坏的发生率被定义为在脑的特定区域中示出异常紧密连接形态的血管的平均百分比。
[0136]微血管密度定量
[0137]使用Guo等[Angiogenesis4:187-191]中描述的方法稍作修改,通过共聚焦显微镜定量微血管密度(MVD)。使用CD105作为脑血管生成的标志[Holley等，(2010) NeurosciLett470:65-70]，使用蔡司LSM510Meta分析软件获取并分析了最佳荧光强度的图像。脑切片中含有高密度(“热点”)[Weidner等，(1991)N Engl J Med324:1_8]CD105染色的区域使用前述的共聚焦参数和20x/0.45N-Achroplan物镜成像。使用软件针对每个热点的总荧光面积(TFA，μ m2为单位)减去背景后求和。从每只小鼠的四个不同的热点的平均TFA进行定量。TFA作为由⑶105抗体染色的总微血管的定量表示。成像区域中MVD表示为TFA和图像的总面积的比。
[0138]统计分析
[0139]所有实验一式三份进行至少三次。老龄及幼龄的Tg2576AD小鼠和野生对照同窝小鼠的数据使用Student’s t检验或双因子ANOVA分析,非配对的值用Bonferroni事后检验法。所有统计分析使用 GraphPad Prism (v5.0lfor Windows, GraphPad Software, SanDiego California USA, www.graphpad.com)讲行。p值小于0.05被认为是显著的结果。结果以平均值土标准误表示。
[0140]结果:
[0141]免疫的Tg2576小鼠表现出脑血管紧密连接减少的病理
[0142]紧密连接(TJ)形态学和病理学特征体现在用Αβ或PBS免疫的Tg2576和野生型小鼠的皮层和海马中。图5a和b中脑血管系统中咬合蛋白和Z0-1中的牢固、连续和线性的染色模式被认为是正常的，无论在皮层还是海马，这点是一致的、没有区别的，与基因型、免疫疗法或药剂无关。图5c和d中脑血管系统中咬合蛋白和Z0-1中不牢固的、点状和或不连续的染色模式被认为是不正常的(白箭头)。在所有小鼠的皮层和海马中，TJ异常表达是一致的，并没有什么区别，与基因型、免疫疗法或药剂无关。在用Αβ免疫的Tg2576小鼠中，观察到的微血管大多数都有如图5a和b所示的正常TJ，而显示TJ异常的血管是罕见的。然而，无论是预防性或治疗性接种Αβ的Tg2576小鼠中，较大的血管与毛细血管相比好像具有较大比例的图5e和f所示的异常TJ表达(白色箭头)。
[0143]对免疫小鼠中脑血管紧密连接病理的定量评估
[0144]在用Αβ或PBS治疗性或预防性免疫的Tg2576小鼠中，通过共聚焦显微镜对TJ病理的发生率定量评估。TJ病理的发病率被定义为显示异常TJ形态的血管的平均百分比。如图6a所示，用PBS预防性免疫的Tg2576小鼠的皮层中TJ表达破坏百分比(29.00 ± 4.02 %;**?〈0.05，双因子4勵￥么)明显比？85野生型(约10%)更高。用Αβ免疫的Tg2576小鼠皮层中异常血管TJ表达的百分比(11.33±2.40% ;*p〈0.05，双因子ANOVA)明显低于PBS的转基因对应小鼠。海马TJ破坏的发生反映了预防性免疫小鼠的皮层。如图6b所示，用PBS免疫的Tg2576小鼠TJ破坏率(29.75± 1.89% ;_*ρ〈0.05，双因子ANOVA)明显高于PBS小鼠(约10%)。如图6b所示，用Αβ免疫的Tg2576小鼠的海马TJ破坏(11.91±1.73%，***p〈0.05，双因子AN0VA)比用PBS免疫的Tg2576小鼠显著降低。
[0145]治疗性免疫的小鼠显示出与预防性小鼠的血管TJ破坏类似的事件。如图7a所示，在治疗性免疫接种PBS的Tg2576小鼠的皮层中TJ表达破坏的百分比(28.67 ±4.91%;**p〈0.05，双因子AN0VA)明显高于PBS野生型(约10%)。如图7a所示，用Αβ免疫的Tg2576小鼠皮层中异常血管TJ表达的百分比(10.40±0.81%,*p<0.05，双因子ANOVA)明显低于PBS的转基因对应物。海马TJ破坏的发生反映了治疗性免疫小鼠的皮层。如图7b所示，用PBS免疫的Tg2576小鼠的中断率(27.33±4.06% ;_*ρ〈0.05，双因子ANOVA)明显高于PBS野生型小鼠(约10%)。如图7b所示，用Αβ免疫的Tg2576小鼠的海马TJ破坏(11.00±2.26%，***ρ〈0.05，双因子ANOVA)比用PBS免疫的Tg2576小鼠明显降低。
[0146]用Αβ免疫的Tg2576的脑血管渗漏全面降低
[0147]用Αβ或PBS预防性或治疗性免疫的Tg2576和野生型小鼠，通过共聚焦显微镜评估脑血管渗漏和TJ异常。如图SB (白箭头)所示，小鼠白蛋白用作血管渗漏的标记物，并显现为远离大血管的梯度扩散染色。不考虑免疫疗法或试剂，所有野生型小鼠均没有血管渗漏和产生类似于图8a的染色类型。无论是用PBS预防性或治疗性免疫的Tg2576小鼠，在皮层和海马均未显示血管渗漏的任何明显的迹象。用PBS免疫的Tg2576小鼠的血管渗漏与TJ异常(未示出)相关，是用咬合蛋白和ZO-1染色确定的。
[0148]用Αβ免疫的Tg2576小鼠微血管内有很少或几乎没有血管渗漏(图8a所示)。然而，用Αβ免疫的Tg2576小鼠的大血管确实有周期性的血管渗漏，图8b (白箭头)。咬合蛋白(未示出)和ZO-1 (图Sb)异常表达的TJ与在有血管渗漏的大血管中看到的一致。为评估用Αβ免疫的Tg2576小鼠的大血管是否有与血管的A β沉积相关的TJ破坏的病理，对TJ和Αβ进行了双染，图8c。在预防性和治疗性用Αβ免疫的Tg2576小鼠中，轻度血管Αβ沉积被认为只在较大的血管中可见。如图Sc所示，有Αβ血管沉积的大血管也有TJ的病理，咬合蛋白(未示出)和ZO-1 (空心白色箭头)都有。在用Αβ免疫的Tg2576小鼠中没有发现脑毛细血管中Αβ的沉积。经处理的野生型小鼠没有血管Αβ。用PBS处理了一年或4个月的Tg2576小鼠有非常有限的血管A β。
[0149]免疫的Tg2576小鼠脑中血管生成和细胞凋亡
[0150]在用Αβ或PBS预防性或治疗性免疫的Tg2576小鼠中，通过共聚焦显微镜，对细胞凋亡和血管发生的事件进行了检查。活化的caspase-3抗体作为细胞凋亡的标记物，图
9。在所有检查的部分中，活化的caspase-3并没有直接对内皮细胞染色。在类似的染色类型中，注意到在老龄和幼龄Tg2576小鼠中，活化的caspase-3可以在被推测为神经元的丝状神经元样细胞体中看到。尽管含量不同，所有免疫的小鼠海马在CA1、CA2、CA3和DG区表现出活化的caspase-3染色。用PBS预防性和治疗性免疫的Tg2576小鼠，皮层和海马内围绕可能的Αβ斑块有显著的活化的caspase-3染色(未示出)，图9a。用Αβ和PBS免疫的野生型和用Αβ免疫的Tg2576小鼠的海马中显示出有限的caspase-3染色，图9b。这些小鼠中活化的caspase-3染色的总体密度被指出比在用Αβ处理的Tg2576小鼠中低。无论是用Αβ预防性和治疗性免疫的皮层，Tg2576小鼠有有限的caspase-3染色，图9c。用Αβ免疫的Tg2576小鼠皮层中活化的caspase-3染色似乎与野生型变种类似。这些结果在所有观察的小鼠中是一致的。
[0151]CD105染色用作血管内皮细胞标记物，然而，在TJ异常存在或不存在的所有脑血管系统中均可见⑶105染色。由⑶105染色的微血管密度(MVD)，可以在用A β或PBS治疗性或预防性免疫的小鼠中通过共聚焦显微镜进行量化。MVD被定义为TFA与成像区域的总面积的比值，并且MVD用作血管生成测量的替代方法。与用PBS免疫的野生型小鼠相比(0.1951±0.0123)，用 PBS 预防性免疫一年的 Tg2576 小鼠的平均 MVD (0.4560±0.0072 ；*p〈0.000，t-检验)显著升高，图10a。与用PBS免疫的转基因小鼠相比，用Αβ预防性免疫的Tg2576小鼠的MVD显著降低(0.1972±0.0075 ;**p〈0.0001，t_检验)，图10a。治疗性免疫小鼠的MVD与预防性免疫组类似。与用PBS免疫的野生型小鼠相比(0.2044 土 0.0222 )，用PBS治疗性免疫四个月的Tg2576小鼠的平均微血管密度(0.4939±0.0077 ;*#p=0.0001，t-检验)显著升高，图10b。与用PBS免疫的转基因小鼠相比，用Αβ治疗性免疫的Tg2576小鼠的 MVD 显著降低(0.2180±0.0130 ;*_ρ〈0.0OOlt-检验)，图 10b。
[0152]讨论:
[0153]之前已经表明，无论是用Αβ预防性或治疗性免疫的小鼠，引起对所述肽的免疫应答，这通过抗Αβ抗体滴度的增加测得(Dickstein等，(2006)FASEB J20，426-433)。在病理上，这些用Αβ免疫的Tg2576小鼠的斑块负担和小神经胶质细胞已经显著减少。这些发现与以前使用类似的阿尔茨海默病小鼠模型和免疫治疗方法所公开的结果是一致的，表明在用Αβ免疫后的Tg2576小鼠血脑屏障的总体的完整性显著提高。
[0154]在本研究中所解决的问题是，对血脑屏 障的改善是否延伸到TJ的水平。用Αβ免疫的Tg2576小鼠均表现在微血管系统中TJ病理有显著降低。TJ病理的减少主要出现在新皮层和海马，这通常在AD过程中受到严重影响(Hsiao等，(1996) Science274，99-102 ；Braak&Braak, E.(1991)Acta Neuropathol82, 239-259)。用 Αβ 免疫的 Tg2576 小鼠的微血管的血清白蛋白漏出是最小的。然而，在较大的血管中发现小鼠白蛋白漏出增加，表现为TJ异常和Αβ轻度血管沉积。虽然在该研究中对轻度血管的Aβ沉积和血清泄漏定性说明，Wilcock等(J Neuroinflammationl, 24)描述了在同一个AD小鼠品系中被动免疫中CAA和CAA相关的微出血显著增加。这种差异很可能是归因于在各自的疫苗接种研究中使用小鼠的年龄。在目前的研究中，预防性免疫的小鼠在一年时被处死。治疗性免疫的小鼠在15月龄时被处死。在Tg2576小鼠中，血管沉积被认为是在15个月中相当“中间”(Domnitz等，(2005) J Neuropathol Exp Neurol64, 588-594)。上述的Wilcock等研究中免疫的Tg2576小鼠在23月龄时开始接种,而那时CAA被认为是“普遍”的(Domnitz等，(2005) J NeuropatholExp Neurol64，588-594)。总而言之，脑血管系统TJ破坏与A β的存在直接相关，从而防止Αβ的积聚能使微血管系统修复任何损坏。
[0155]已经提出来几种假设解释Αβ免疫治疗的机制。简言之，最主流的机制是小胶质细胞去除Αβ斑块、催化分解和外围下沉假说。小胶质细胞去除Αβ的机制已经被总结(Morgan, D.(2009) CNS Neurol Disord Drug Targets8, 7-15)。简言之，外周循环抗 A β 抗体进入脑并促进斑块的调理。小胶质细胞(常驻的脑巨噬细胞)通过Fe受体介导的吞噬作用清除斑块。催化分解涉及外周循环抗Aβ抗体结合并通过破坏斑块的三级结构来破坏破坏Αβ 聚集(Solomon等，(1997)Proc Natl Acad Sci U S A94, 4109-4112)。最后的机制是外围下沉假说(DeMattos 等，(2001)Proc Natl Acad Sci U S A98, 8850-8855)。在该机制中，循环的抗Αβ抗体结合并隔离血浆Αβ，破坏Αβ通过血脑屏障排出和流入的平衡。净结果是从脑中清除Αβ。这种机制最近获得青睐，这是由于在Aβ免疫疗法的人体试验中CAA及相关的微出血发生的增加(Masliah 等，(2005) Neurology64, 129-131 ；Nicoll 等，(2006)J Neuropathol Exp Neurol65, 1040-1048 ;Nicoll 等，(2003)Nat Med9, 448-452 ；Ferrer等，(2004)Brain Patholl4，11-20)。CAA是一种独立的疾病，其中Aβ在血管系统中沉积，导致脑动脉的增厚，并被描述为蛋白-消除故障动脉病(Weller等，(2009) Alzheimers ResTherl, 6)0 Αβ (作为免疫治疗的结果从脑中清除)沉积在动脉上，从而使所观察到的与免疫疗法相关的CAA剧增(Weller等，同上)。是否这些机制在A β的减少或清除中发挥了突出的作用是值得商榷的。然而，这三个机理的组合是可能的。
[0156]在失败的临床A β免疫试验中观察到的副作用是CAA相关的脑微出血(Boche，D., Zotova, E., Weller, R.0., Love, S., Neal, J.W., Pickering, R.M., Wilkinson, D., Holmes, C., and Nicoll1J.A.(2008)Brainl31, 3299-3310)。一些研究已经指出在主动(Wilcock 等，(2007)Neurosciencel44, 950-960 ;Petrushina 等,(2008)J Neuroinflammation5，42 ;Wilcock 等,(2009) J Neurosci29, 7957-7965)和被动免疫(Pfeifer 等，(2002) Science298, 1379 ;Racke 等，(2005) J Neurosci25, 629-636 ；ffilcock等，(2004) J Neuroinflammationl, 24)中各种AD鼠模型的脑血管系统中发生微出血。该脑血管系统TJ的破坏确实可以解释外围下沉假说相关的副作用。提出了下面的Αβ去除模型。在免疫之前，Αβ的充裕影响了血脑屏障内皮细胞的完整性，导致TJ完整性的破坏。随后发生微血管渗漏。在 免疫过程中，包括小胶质细胞清除和抗体解聚的不同Αβ清除机制被激活。随着Αβ斑块溶解，可溶性的Αβ沿血管周围的排出路线从脑实质中移除(Weller等，(2009)Alzheimers Res Therl, 6)。由于未知的原因,Αβ的的血管周围排出停止,并在脑动脉中沉积，导致CAA。在CAA影响的脑血管中发现的主要Aβ种类是更可溶的Αβ 1-40,被认为是神经元起源的(Herzig等，(2006)Brain Patholl6, 40-54)。Αβ的沉积损害周围的内皮TJ，导致可以观察到的微出血，其可以由Αβ介导而诱导来自NADPH-氧化酶的ROS(Park等，(2005) J Neurosci25, 1769-1777)。这种模式似乎也出现在失败的人AD用A β免疫试验中(Boche 等，(2008)Brainl31, 3299-3310)。
[0157]内皮细胞的凋亡(可以通过活化的caspase-3染色进行测量)并没有通过活化的caspase-3染色在任何小鼠中发现。所有免疫的小鼠、野生型和Tg2576在海马中有广泛的活化的caspse-3染色，似乎是神经元样。在野生型和Tg2576小鼠海马中，活化的caspase-3 的存在与先前的研究一致(Niu 等，(2010)Neurosci Bull26, 37-46)。然而,用PBS免疫的Tg2576小鼠中，整个皮层和海马有广泛的神经元状活化的caspase-3。大部分的caspase染色是集中在斑块相关的TJ (特别是Z0-1)晕。用Αβ免疫的Tg2576 (缺乏斑块病理)只在海马中有caspase-3的染色。虽然AD过程中发生的细胞死亡的确切性质还存在争议，但认为在阿尔茨海默氏症中细胞凋亡发挥显著作用(Rohn，T.T.，and Head, Ε.(2008)Caspase activation in Alzheimer’s disease:early to rise and late to bed.Rev Neuroscil9, 383-393)。此外，不知Tg2576小鼠是否表现出神经元损失(Irizarry等，(1997) J Neuropathol Exp Neurol56, 965-973)。在对照处理的 Tg2576 小鼠皮层中，活化的caspse-3的出现暗示，存在细胞凋亡信号的增加，这可能是由于Αβ。一旦Αβ被去除，推测细胞凋亡信号降低。
[0158]在经处理的小鼠中，用Αβ免疫似乎也能调节血管生成信号。可以通过⑶105在脑内的平均微多孔状染色密度对血管生成进行定量(Holley等，(2010)NeurosciLett470, 65-70 ;Barresi 等，(2007) Acta Neuropathol114, 147-156)。血管生成的相对量可以通过⑶105染色的MVD进行定量。与野生型小鼠和Αβ处理的Tg2576小鼠相比，PBS预防性和治疗性处理的Tg2576小鼠的血管密度显著更高。这意味着，Αβ去除时血管生成信号减少。据推测，神经炎症减少是免疫淀粉样蛋白的结果。小神经胶质细胞被认为是在神经退行性疾病中神经炎症的的一个重要原因(Perry等，(2010)Nat Rev Neurol6，193-201)。神经炎症和A β两者的减少可能直接或间接地减少与两者有关的血管生成信号(Pogue，A.1., and Lukiw,ff.J.(2004)Neuroreportl5, 1507-1510 ；Naldini, A., and Carraro,F.(2005)Curr Drug Targets Inflamm Allergy4, 3-8 ；Boscolo 等，(2007)Int J MolMedl9, 581-587)。与目前的研究相反，使用APP+PS1小鼠的被动免疫检查到了血管生成相关的神经生成(Biscaro等，(2009) J Neurosci29，14108-14119)。在被动免疫的转基因AD小鼠后，在海马中通过BrdU染色发现血管生成增加，BrdU染色可以标记处于DNA修复的细胞(Schmitz 等，(1999)Acta Neuropathol97, 71-81),而不是血管生成(复制)的血管。
[0159]实施例3:阿尔茨海默氏症用A β免疫后的血管复原
[0160]阿尔茨海默氏病(AD)是一种难治愈的神经退行性疾病，是导致老年人患老年痴呆症的主要原因(Castellani等，Dis Μοη56, 484-546 (2010) )。AD的一个重要病理特点是存在由β淀粉样肽(Α β )组成的细胞外神经炎性斑块(CastelIani等，Dis Μοη56，484-546 (2010))。最近的研究将神经血管功能障碍(Zlokovic，NatRev Neuroscil2, 723-738(2011))与血管危险因素(Dickstein 等，Mt Sinai JMed77, 82-102 (2010)) 联系起来在AD的发病机制中共同产生作用。在阿尔茨海默病转基因小鼠模型中，Αβ接种可以显著减少淀粉样蛋白沉积，防止记忆力减退。最近，我们提出了，在AD中淀粉样蛋白促进大量的新血管生成，导致血管通透性增加随后血管过度生成(Biron等，PLoS 0ΝΕ6，e23789 (2011))。这里，我们检验了这个假说，免疫法可以解决AD的这个病理生理特征。我们证明了在AD小鼠模型中，活化的Αβ免疫分解了导致血管生成的斑块负担并中和了淀粉样蛋白，并且逆转了血管过度形成。这些数据支持了在AD中新血管生成是斑块形成的基本关键步骤的结论。这似乎是在各种干预治疗下血管修复的首个例子，这也支持新血管生成调制在AD脑中可以修复损伤的结论。
[0161]由于成功地治疗了各种AD小鼠模型(Golde等，CNS Neurol Disord DrugTargets8, 31-49 (2009) )，A β免疫治疗作为一种改良治疗AD的疗法得到相当的重视(Morgan, J Intern Med269, 54-63 (2011))。补充发现，我们之前已经表明，在AD小鼠模型中活化的A β免疫可以恢复血脑屏障(BBB)的完整性(Dickstein等，FASEBJ20，426-433 (2006))。临床前对Αβ免疫的动物研究的整体积极影响鼓舞了 Elan/Wyeth在 1999年底进行临床人体试验(Wilcock&Colton, J Alzheimer’s Disl5, 555-569(2008))。不完全的临床试验结果好坏参半，包括斑块病状下降但持续存在tau病理和神经炎症(Masliah等,Neurology64, 129-131 (2005))。意想不到的副作用见于人类早期临床试验表明，我们对A β和AD发病机制的了解是不完全的。[0162]方法:
[0163]小鼠:如实施例1所述。
[0164]Αβ接种:如实施例2所述。
[0165]组织制备:如前所述，按照Dickstein等(FASEB J20, 426-433(2006))所述的方法制备组织。用氯胺酮/甲苯噻嗪(100毫克/千克，10毫克/千克)将小鼠麻醉致死，并用PBS灌注5分钟。然后迅速取出脑，把嗅球和小脑去掉，称重，在4°C下用4%多聚甲醛固定四天。然后将脑包埋在石蜡中，并以5微米连续切片。石蜡包埋、切片和脱蜡由Wax-1tHistology Services公司(温哥华)进行。采用脑与体重的比率进行比较免疫小鼠之间的平均脑重量。
[0166]免疫荧光染色:使用常规高压锅，含有0.7mM EDTA的20mM Tris缓冲液(pH9.0)全蒸汽2分钟，对脱蜡的石蜡切片进行抗原修复。然后在室温下，冷却的切片在封闭缓冲液(25%常规山羊血清；3%BSA ；0.3%的Triton X-100, Sigma)中孵育I小时。所用的一抗包括兔抗-Z0-1 (1:200, Invitrogen)、小鼠抗-Z0-1 (1:200, Invitrogen)、兔抗咬合蛋白(1:200, Invitrogen)、兔抗活化的 caspase-3 (1:1000, Imgenex)和鼠抗人 CD105 (1:20,DAK0)。在4°C下在染色缓冲液(10%常规山羊血清；3%BSA ；0.3%的Triton X-100)中过夜进行一抗染色。在用山羊一抗染色时使用了常规驴血清。所用的二抗是与一抗是互补的，带有Alexa Fluor染料488或568( 1:500, Invitrogen)。在室温下在染色缓冲液中进行二抗染色I小时。T0T0-3 (1:10000, Invitrogen)被用于细胞核复染。在染色步骤之间，切片用含有0.1% Tween_20(Sigma)的PBS洗漆三次,每次5分钟。染色的切片用Fluoromount-G(Southern Biotech公司)盖玻片盖住，并避光过夜风干。
[0167]紧密连接形态的共聚焦和定量分析:蜡块中每五片取出一片脑切片进行分析。用Zeiss LSM5IOMeta (蔡司，德国)拍摄图像，拍摄时使用了 16片，平均四次，在Z-平台上使用40χ/1.3油浸Plan-NeofIaur物镜。复合投影图像以600dpi导入Adobe Photoshop中，并对对比度和亮度进行优化。对紧密连接蛋白形态的定量分析是根据Plumb等[BrainPatholl2:154-169]提出的方法进行的。共聚焦数据集表示来自幼龄和老龄的Tg2576小鼠和同窝小鼠对照组在额叶皮层和海马区的约100个脑血管。单个血管按照Z0-1表达标记为正常(I)或异常(0)。正常的Z0-1表达表现出强的、连续的、密集的和线性的染色。与此相反，异常的Z0-1的表达表现出弱的、点状及/或不连续的染色。异常Z0-1血管的表达和正常对照的正常血管或患病大脑中的正常血管进行了对比。为了尽量减少不完整或起伏的血管由于Z0-1染色中出现“间隔”而被标记为异常，在图像中寻找了血管连续性的证据。例如，染色的细胞核的存在(含有T0T0-3)或点状或弥漫Z0-1的残存被用于定位血管束异常间隙。紧密连接的破坏的发生率被定义为在脑的特定区域中示出异常紧密连接形态的血管的平均百分比。Αβ用Zeiss LSM710激光扫描成像。
[0168]微血管密度定量:使用前述的Biron等所描述的激光共聚焦显微镜方法进行定量(Biron 等，PLoS 0ΝΕ6, e23789 (2011))。使用 CD105 作为脑血管生成的标志[Holley 等，
(2010)Neurosci Lett470:65-70]，使用蔡司LSM510Meta分析软件获取并分析了最佳荧光强度的图像。脑切片中含有高密度(“热点”)[Weidner等，(1991)N Engl J Med324:l-8]⑶105染色的区域使用前述的共聚焦参数和20x/0.45N-Achroplan物镜成像。使用软件针对每个热点的总荧光面积(TFA，μ m2为单位)减去背景后求和。从每只小鼠的四个不同的热点的平均TFA进行定量。TFA作为由CD105抗体染色的总微血管的定量表示。成像区域中MVD表示为TFA和图像的总面积的比。
[0169] 统计分析:在不同的免疫疗法中，用PBS或Αβ免疫的Tg2576 (TG/+) AD小鼠和野生型(+/+)对照组同窝个体之间的数据统计比较采用双因子ANOVA分析，非配对的值用Bonferroni事后检验法。
[0170]所有实验一式三份进行至少三次。在不同的免疫疗法中，用PBS或Αβ免疫的Tg2576 (TG/+)AD小鼠和野生型(+/+)对照组同窝个体之间的数据统计比较采用双因子ANOVA分析,非配对的值用Bonferroni事后检验法。所有统计分析使用GraphPad Prism(v5.0lfor Windows, GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com)进行。P值小于0.05被认为是显著的结果。结果以平均值土标准误表示。
[0171]免疫的Tg2576小鼠表现出脑血管紧密连接减少的病理:Αβ免疫是否可以恢复TJ完整性？在用Αβ或PBS免疫的Tg2576和野生型同窝小鼠的皮层和海马的脑血管中，评价Z0-1的表达模式。正常TJ表达是强的、连续不间断的染色模式。异常表达是弱的、点状和/或不连续的染色。除了脑区，用Αβ和PBS免疫的+/+小鼠难以辨认有正常的Ζ0-1的染色模式(图lla-d)。在Αβ预防性和治疗性免疫的Tg/+小鼠中，在脑血管表现出类似于+/+小鼠的正常Ζ0-1表达(图1lg和h)。罕见但正常的横切血管会有常见的短的平行(图1lh)或辐射(未示出)的Z0-1表达。接受PBS的Tg/+小鼠有显着的TJ病理(图1le和f)。有趣的是，Αβ免疫的Tg/+小鼠表现一些异常的TJ病理，主要是在较大的血管中(图1li和j)。在Αβ免疫的Tg/+小鼠中，Ζ0-1表现出从毛细管到大血管的病理移位似乎模拟了其它AD免疫治疗模型和临床观察中表现的CAA增加的病理表现(综述参见Vasilevko等，Annals of the New York Academy of Sciencesl207, 58-70 (2010))。
[0172]对免疫小鼠中脑血管紧密连接病理的定量评估:用完整的与多孔的TJ相比得到的脑血管百分比进行打分来对TJ病变的发生率进行定量。与用PBS免疫+/+的小鼠相比，用PBS免疫的Tg/+小鼠的皮层和海马上(包括预防性和治疗性的)的TJ表达的破坏百分数有了显著提高(图12)。与我们之前的示出Αβ免疫在BBB病理学的优点的数据(Dickstein等，FASEB J.20，426-433 (2006))相符合，我们发现了从6周龄开始进行预防性A β免疫的TG/+小鼠的皮层和海马上异常血管TJ表达的百分数(平均10%;*ρ〈0.05，双因子AN0VA)比他们的PBS转基因对应小鼠有显著降低(图12a和b)。这些小鼠的TJ破坏水平与注射了 Αβ和PBS的+/+对照组相似。与用PBS免疫的Tg/+小鼠相比，在11月龄的用Aβ免疫治疗的Tg/+小鼠的皮层和海马中TJ病理(平均10% ;*ρ〈0.05，双因子AN0VA)显著下降(图12c和d)。此外，发病后用Αβ免疫能够使TJ蛋白表达恢复至类似+/+的水平(图12c和d)。重要的是注意到用PBS或Αβ处理+/+小鼠导致最少的TJ破坏。
[0173]经免疫的Tg2576脑的血管生成:老龄Tg2576AD模型小鼠的微血管密度(MVD)的增加(Biron等，PLoS 0NE6, e23789(2011))提示疾病的恶化和严重程度增加了血管发生。活化的Αβ免疫是否改变AD小鼠的血管密度？ MVD用⑶105来定量，MVD是一种已知的血管内皮标记物，在脑皮层和海马进行免疫荧光染色模式。无论TJ正常(图13a)或异常(图13b)，CD105染色普遍存在于脑血管中。与PBS+/+ (0.1951 ±0.0130)相比，用PBS预防性免疫接种(0.4560±0.0072 ;***P〈0.001，双因子ANOVA)的Tg/+小鼠中MVD超过两倍(图13c)。与此相反，Αβ预防性免疫的TG/+小鼠中得到的MVD与PBS作用于相同基因型相比有显著降低(0.1972±0.0075 ;*Ρ〈0.05，双因子ANOVA)(图13c)，并且在+/+动物中观察到类似的水平。治疗性治疗小鼠中MVD反映了预防性免疫小鼠的观察结果。发病后用PBS免疫的 Tg/+小鼠(0.4939±0.0077)与 PBS+/+小鼠(0.2044±0.0222 ;***P〈0.001，双因子AN0VA)相比MVD超出两倍(图13d)。如在发病前免疫的Tg/+中所见，发病后A β免疫Tg/+小鼠(0.2180±0.0130 ;*Ρ〈0.05，双因子ANOVA)与用PBS免疫Tg/+小鼠相比MVD也有显著降低(图13d)。血管密度的变化似乎与小鼠大脑的体积大小无关。无论基因型、免疫原或免疫疗法，平均大脑体重比无显著差异(图13e和f)。
[0174]在经免疫的Tg2576小鼠脑中Αβ沉积:如前所述(Dickstein等，FASEBJ20，426-433 (2006))，Aβ免疫的Tg/+小鼠脑实质的Aβ斑块显著减少(图14a_d)。在Αβ预防性免疫的Tg/+小鼠中发现Αβ斑块完整的消除(图14d)。然而，Αβ治疗性处理的Tg/+小鼠在Αβ斑块病状有显著下降(图14b)。
[0175]讨论:
[0176]Αβ免疫治疗作为AD的实验性治疗方法不断地被探索。在人类AD疫苗的早期临床试验中，意想不到的消极血管副作用证明了我们对Αβ和AD发病机制的了解是有限的。现有的模型并未整合这些可以解释现象的因素。该研究表明，在活化的Αβ免疫AD小鼠模型中，BBB TJ的完整性与淀粉样变性促使的血管生成有关。从脑实质中去除Αβ可以消除与TJ相关的微血管病状。此外，在人类的免疫试验种所观察到的与微出血相关的CAA可由受影响的血管中TJ的损失来解释。
[0177]BBB功能障碍最初是在AD动物模型中发现的(Ujiie等，MicrocirculationlO, 463-470 (2003))，后来被证实是AD患者的临床显著特点，但其原因不明(Farrall&ffardlaw, Neurobiol Aging30, 337-352 (2009))。最近，我们提出了一种新的假说:在AD中，淀粉样蛋白促进大量的新血管发生导致血管通透性增加紧接着血管过度增生，这与AD的BBB相关的体内数据相一致(Biron等，PLoS 0NE6，e23789 (2011))。在此，我们证明了在经治疗的Tg2576小鼠(过度表达含双重错义瑞典突变(K670N/M671L)的人APP695，其导致早发性AD)中，Αβ免疫调节血管生成信号。血管生成的相对量可以通过脑中CD105的平均微血管染色密度来定量(Holley等，Neurosci Lett470, 65-70(2010)；Barresi 等，Acta Neuropathol114, 147-156(2007) )? 与野生型小鼠和用 Αβ 处理的Tg2576小鼠比，在用PBS预防性和治疗性处理的Tg2576小鼠中血管密度显著升高。血管密度的变化似乎与小鼠脑的体积大小无关。这意味着，当去除Αβ时血管生成信号会下降。由此推测，神经炎症的减少是淀粉样蛋白的免疫治疗的结果。神经炎症和Αβ两者的减少可能直接或间接地导致与其相关的血管生成信号的下降(Boscolo等，Int J MolMedl9, 581-587(2007))。
[0178]在失败的临床Αβ免疫试验中观察到的副作用是CAA相关的脑微出血(Boche 等，fcainl31, 3299-3310(2008))，这也在主动(Wilcock 等，(2007)Neurosciencel44, 950-960 ；Petrushina 等，(2008)J Neuroinflammation5, 42 ；ffilcock等，(2009) J Neurosci29, 7957-7965)和被动免疫(Pfeifer 等，(2002) Science298, 1379 ；Racke 等，(2005) J Neurosci25, 629-636 ;Wilcock 等，(2004) J Neuroinflammationl, 24)中各种AD小鼠模型的脑血管系统中注意到。该脑血管系统TJ的破坏确实可以解释副作用。提出了下面的Αβ去除模型。在免疫之前，Αβ的充裕影响了血脑屏障内皮细胞的完整性，导致TJ完整性的破坏。随之发生的微血管渗漏允许外周淀粉样蛋白进入大脑，并且聚集成神经毒性淀粉样蛋白斑块。脑血管损伤通过A β诱导来自NADPH-氧化酶的ROS产生进一步恶化(Park, L.等，J Neurosci25, 1769-1777 (2005))。微出血是由TJ减弱(血管生成的结果)引起的，导致过度增生。在免疫过程中，包括小胶质细胞清除和抗体解聚的不同Αβ清除机制被激活。随着Αβ斑块溶解，可溶性的Αβ沿血管周围的排出路线从脑实质中移除(Weller等,(2009) Alzheimers Res Therl, 6)。因此,免疫法可以通过刺激针对A β的免疫反应来中和促血管生成信号，但是该疾病的其它方面一旦形成，可能免疫无法解决。基于已知的原因，Αβ的血管周围排出系统停止(可能是通过BBB再密封)，并在脑动脉沉积，导致CAA。但应注意的是，在CAA所影响的血管中沉积的A β主要种类是更可溶的A β ^40,这被认为是神经元的源(Herzig等,Brain Pathol 16，40-54(2006))中。这个模型显示了于失败的人 AD Αβ 免疫试验平行(Boche 等，Brainl31, 3299-3310(2008))
[0179]我们的目地是确定Αβ肽免疫是否可以解决在Tg2576AD小鼠中淀粉样变性引发的血管生成和血管过度增生。我们发现在接种Aβ后血管过度增生产生逆转。这是通过治疗使血管密度恢复到正常水平的血管复原第一例。这些数据也表明血管可塑性比之前的报道还大。我们可以设想不解决血管密度则血管生成停止，因此意味着淀粉样蛋白形成信号是保持血管过度增生所需要的。一旦去除信号，血管过度增生消退。这些数据显然成为AD病理生理学的血管生成模型的基础，并首次提供了在AD大脑中调节血管生成和损伤修复的证据。近来，一种抗增殖药物，贝沙罗汀(口服抗癌药)，已被证明能在AD动物模型中减少斑块负担，并提高其记忆力表现(http://www.sciencemag.0rg/content/early/2012/02/08/science.1217697)。该研究表明贝沙罗汀可作用于维甲类X受体以影响APOE运输，从而减少斑块堆积或转变，但在AD中其他作用方式也是可能。贝沙罗汀(Targretin)也被认为可增加细胞的凋亡，并改变细胞周期调控、分化、抗转移活性，最后是抗.血管牛.成活件(http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3120806/)0 它通过直接抑制内皮细胞的增殖、粘附、浸润和迁移抑制血管生成，并影响VEGF的表达(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/ pmc/articles/PMC3120806/)0 因此，这些数据以及本文提出的数据直接表明脑血管生成的逆转可作为一种新的AD治疗方法。
[0180]本发明参考的所有专利、出版物(包括公布的专利申请)以及数据库入口通过引用将其整体清楚地并入本文中，即通过引用将每个单独的专利、出版物和数据库入口都明确且逐一地标明并入本文中。
[0181]本发明已参照一些具体的实施方案，在不脱离本发明的主旨和范围的条件下对本发明进行的各种修改对本领域技术人员来说是显而易见的。本领域技术人员能显而易见的所有这样的修改均包括在随附的权利要求书的范围内。
【权利要求】
1.一种对患有阿尔茨海默氏病或有风险发展成阿尔茨海默氏病的患者进行治疗或延缓其发病的方法，包括向所述受试者施用有效量的抗血管生成剂。
2.一种使患有阿尔茨海默氏病或有风险发展成阿尔茨海默氏病的受试者维持和/或恢复血脑屏障(BBB)完整性的方法，包括向所述受试者施用有效量的抗血管生成剂和/或施用能防止Αβ淀粉样蛋白形成的药剂和/或施用能促进Αβ肽从大脑中除去的试剂。
3.一种促进患有阿尔茨海默氏病或有风险发展成阿尔茨海默氏病的受试者的脑血管复原的方法，包括向所述受试者施用有效量的抗血管生成剂和/或施用能促进Aβ肽从脑中除去的试剂。
4.权利要求1、2或3所述的方法，其中所述抗血管生成剂是贝沙罗汀、贝伐单抗(阿瓦斯丁?)、伊马替尼、索拉非尼、舒尼替尼、来氟米特(SU101)、米哚妥林(PKC412)、伐他拉尼(ΡΤΚ787/ΖΚ222584)、AG013736、AZD2171、CP547632、CP673451、RP1.4610、VEGFTrap、ZD6474、YM359445、SU5416、西罗莫司(驮瑞塞尔?)、巴马司他、马立马司他、新伐司他、普马司他、羧胺三唑、了咿-470、011101、正^0、IL-12、血小板因子-4、苏拉明、SU5416、凝血栓蛋白、血管抑素、内皮抑素、萨利多胺、四硫钥酸盐、替可加兰、雷佐生或白藜芦醇。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述能促进从脑中除去Αβ肽的试剂是Αβ肽或者是特异性结合Aβ肽的抗体。
6.一种对具有发展成阿尔茨海默氏病风险的或患有早期阿尔茨海默氏病的受试者进行鉴定的方法，包括在受试者脑中检测新血管生成、检测TJ破坏、和/或检测血脑屏障破坏。
7.一种识别能用于阿尔茨海默氏病的潜在治疗剂的方法，包括对候选试剂的使脑血管紧密连接得以恢复的能力进行测试或者对候选试剂的促进脑中血管复原的能力进行测试。
8.根据权利要求7所述的方法，包括以下步骤: 提供细胞系培养物，该细胞系能形成功能性的血脑屏障体外模型， 将所述培养物与破坏紧密连接的试剂接触， 将培养物与候选试剂接触， 对细胞培养物中的紧密连接进行评价， 其中与没有接受候选试剂的对照动物相比，使紧密连接的完整性增加的试剂即是一种潜在的治疗剂。
9.根据权利要求7所述的方法，其包括以下步骤: 将候选试剂给予阿尔茨海默氏病动物模型，以及 对脑血管中的紧密连接 的完整性进行评价， 其中与没有接受候选试剂的对照动物相比，使紧密连接的完整性增加的试剂即是一种潜在的治疗剂。
【文档编号】A61K39/395GK103974714SQ201280045676
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2012年7月18日 优先权日:2011年7月19日
【发明者】威尔弗雷德·杰弗里斯, 卡恩·E·拜伦, 达拉·L·迪克斯坦 申请人:威尔弗雷德·杰弗里斯, 卡恩·E·拜伦, 达拉·L·迪克斯坦