抗备解素抗体和其应用的利记博彩app

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【专利摘要】本发明涉及利用抗备解素抗体的补体系统旁路途径(AP)的选择性抑制。具体地，本发明涉及通过使个体与抗备解素抗体接触而治疗个体中AP-介导的病理学或AP-介导的状况的方法。
【专利说明】抗备解素抗体和其应用
[0001]发明背景
[0002]补体系统提供对侵入病原体的第一道宿主防御。补体还在人类炎性疾病中起致病作用。补体系统的激活通过三种不同途径发生:经典途径(CP)、凝集素途径(LP)和旁路途径(AP)。CP由抗原抗原-抗体结合启动。当甘露糖-结合凝集素(MBL)与微生物上的表面糖分子相互作用时，LP被触发。两条途径的激活导致CP C3转变酶C4b2a的装配，虽然还可发生MBL-相关的丝氨酸蛋白酶引起的C3的直接分裂。AP是自我放大环路，由AP C3转变酶，C3bBb驱动。AP激活可继发于CP或LP激活而发生，或独立启动。在后者的情况中，低水平自发的C3 ‘空转(tick-over)’产生最初的C3bBb，其在缺少足够调节的情况下迅速传播AP。因此，通常假定非自我表面上没有或具有不足量负调控的AP激活被认为是省缺(default)过程，而自体细胞通常在多种膜结合和流体相补体抑制蛋白的帮助下避免该结果。在某些情况下，改变的、损坏的或应激的自体细胞和组织还可激活AP和引起炎性损伤。
[0003]与众多抑制蛋白的存在不同，血浆蛋白备解素是唯一已知的补体激活级联的正调节子。备解素是大约53kDa的血衆糖蛋白，估计的血液浓度为5-10μ g/ml。它大部分作为固定比率的二聚体、三聚体和四聚体以头尾构象存在。目前对备解素功能持有的观点是其通过延长新生的C3bBb转变酶的半衰期而促进AP激活。根据该观点，备解素在AP激活中起促进但不是必需的作用。由于CP和LP的激活将不变地触发AP放大环路，所以期望备解素还将间接促进CP-和LP-介导的补体激活。因此，基于本发明之前的普遍知识，不可能将备解素视为有吸引力的抗补体治疗靶，因为它缺少特异性并且不是补体激活必不可少的。
[0004]虽然所有三种补体激活途径都有助于宿主对抗微生物感染，但是最近的研究已显示人类中补体-介导的病理学，如年龄相关的黄斑变性、非典型溶血性尿毒性综合征、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、风 湿性关节炎、变应性哮喘和缺血再灌注损伤，主要由AP介导。因此，本领域仍然对抗补体组合物和通过选择性地抑制AP同时不影响CP和LP以对抗病原体和保护宿主不受感染来治疗人类炎性疾病的方法存在需求。目前的发明实现该需求。
[0005]概述
[0006]本发明涉及抗备解素抗体和利用抗备解素抗体抑制补体旁路途径(AP)的方法。
[0007]在一个实施方式中，本发明是包括特异地结合备解素的抗体的组合物。在优选实施方式中，备解素是人备解素。在一些实施方式中，本发明的抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，本发明的抗体是人源化抗体。在一些实施方式中，本发明的抗体是嵌合抗体。
[0008]在一个实施方式中，本发明的抗体包括选自以下的至少一个⑶R =VH-OTRl:SEQ IDNO:3 ;VH-CDR2:SEQ ID N0:4 ;VH_CDR3:SEQ ID NO:5 ；VL-CDRl:SEQ ID NO:8 ;VL_CDR2:SEQID NO:9 JPVL-CDR3:SEQ ID NO: 10。在另一个实施方式中，本发明的抗体包括重链——包括SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明的抗体包括轻链——包括SEQ IDN0:7的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本发明的抗体包括重链——包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列一和轻链一包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明的抗体特异地结合这样的表位，其包括SEQ ID NO:52的至少一个氨基酸。
[0009]在一个实施方式中，本发明的抗体包括选自以下的至少一个⑶R =VH-OTRl =SEQID NO: 13 ;VH-CDR2:SEQ ID NO: 14 ;VH_CDR3:SEQ ID NO: 15 ;VL_CDR1:SEQ ID NO: 18 ；VL-CDR2:SEQ ID NO: 19 ;和VL-CDR3:SEQ ID N0:20。在另一个实施方式中，本发明的抗体包括重链——包括SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明的抗体包括轻链——包括SEQ ID N0:17的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本发明的抗体包括重链——包括SEQ ID NO: 12的氨基酸序列——和轻链——包括SEQ ID NO: 17的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明的抗体特异地结合这样的表位，其包括SEQ ID N0:53的至少一个氨基酸。
[0010]在一个实施方式中，本发明的抗体包括选自以下的至少一个⑶R=SEQID NO: 23 ；VH-CDR2:SEQ ID NO: 24 ;VH_CDR3:SEQ ID NO: 25 ;VL_CDR1:SEQ ID NO: 28 ；VL-CDR2:SEQ ID NO:29 ;和VL-CDR3:SEQ ID N0:30。在另一个实施方式中，本发明的抗体包括重链——包括SEQ ID N0:22的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明的抗体包括轻链——包括SEQ ID N0:27的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本发明的抗体包括重链——包括SEQ ID NO: 22的氨基酸序列——和轻链——包括SEQ ID NO: 27的氨基酸序列。
[0011]在一个实施方式中，本发明的抗体包括选自以下的至少一个⑶R=SEQID NO: 33 ；VH-CDR2:SEQ ID NO: 34 ;VH_CDR3:SEQ ID NO: 35 ;VL_CDR1:SEQ ID NO: 38 ；VL-CDR2:SEQ ID NO:39 ;和VL-CDR3:SEQ ID N0:40。在另一个实施方式中，本发明的抗体包括重链——包括SEQ ID N0:32的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明的抗体包括轻链——包括SEQ ID N0:37的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本发明的抗体包括重链——包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列——和轻链——包括SEQ ID NO: 37的氨基酸序列。
[0012]在一个实施方式中，本发明的抗体包括重链——包括SEQ ID N0:42的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本发明的抗体包括重链——包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明的 抗体包括轻链——包括SEQ ID N0:47的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明的抗体包括重链——包括SEQ ID N0:42的氨基酸序列——和轻链——包括SEQ ID N0:47的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本发明的抗体包括重链——包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列——和轻链——包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列。
[0013]在一个实施方式中，本发明的抗体包括重链——包括SEQ ID N0:49的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明的抗体包括轻链——包括SEQ ID NO: 51的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本发明的抗体包括重链——包括SEQ ID N0:49的氨基酸序列——和轻链——包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
[0014]在一个实施方式中，本发明的抗体包括重链——包括SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:63的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明的抗体包括轻链——包括SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:64的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本发明的抗体包括重链——包括SEQ
ID NO: 2和SEQ ID NO:63的氨基酸序列-和轻链-包括SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO:64
的氨基酸序列。
[0015]在一个实施方式中，本发明的抗体包括重链——包括SEQ ID NO: 12和SEQ IDN0:63的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明的抗体包括轻链——包括SEQ ID NO: 17和SEQ ID N0:64的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本发明的抗体包括重链——包括
SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 63的氨基酸序列-和轻链-包括SEQ ID NO: 17和SEQ ID
NO:64的氨基酸序列。[0016]在一个实施方式中，本发明的抗体包括重链——包括SEQ ID N0:22和SEQ IDNO:63的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明的抗体包括轻链——包括SEQ ID NO:27和SEQ ID N0:64的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本发明的抗体包括重链——包括
SEQ ID NO: 22和SEQ ID NO: 63的氨基酸序列-和轻链-包括SEQ ID NO: 27和SEQ ID
NO:64的氨基酸序列。
[0017]在一个实施方式中，本发明的抗体包括重链——包括SEQ ID NO:32和SEQ IDNO:63的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明的抗体包括轻链——包括SEQ ID NO:37和SEQ ID N0:64的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本发明的抗体包括重链——包括 SEQ ID NO: 32和SEQ ID NO:63的氨基酸序列-和轻链-包括SEQ ID NO: 37和SEQ ID
NO:64的氨基酸序列。
[0018]在一个实施方式中，本发明的抗体是这样的抗体，其结合备解素并与至少一种本文描述的抗备解素抗体的结合竞争。在另一个实施方式中，本发明的抗体是这样的抗体，其结合备解素并与称作mAbl9.1的抗体与备解素的结合竞争。在另一个实施方式中，本发明的抗体是这样的抗体，其结合备解素并与称作mAb25的抗体与备解素的结合竞争。在另一个实施方式中，本发明的抗体是这样的抗体，其结合备解素并与称作mAb22.1的抗体与备解素的结合竞争。在另一个实施方式中，本发明的抗体是这样的抗体，其结合备解素并与称作mAb30的抗体与备解素的结合竞争。
[0019]在另一个实施方式中，本发明是治疗个体中旁路途径(AP)-介导的病理的方法，包括向所述个体施用本文描述的至少一种抗备解素抗体。在各种实施方式中，旁路途径(AP)-介导的病理至少选自以下:黄斑变性、缺血再灌注损伤、关节炎、风湿性关节炎、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)综合征、非典型溶血性尿毒症(aHUS)综合征、哮喘、器官移植败血病、炎症、肾小球肾炎、狼疮、和其组合。在一些实施方式中，抗备解素抗体选择性地抑制旁路途径，但不抑制经典途径和凝集素途径。在一些实施方式中，抗备解素抗体不影响经典途径和凝集素途径的AP放大环路。在一些实施方式中，抗备解素抗体抑制C3bBb蛋白的产生。
[0020]在一个实施方式中，本发明是表达人类备解素(例如，SEQ ID NO:67 ；SEQ IDNO:54)但不表达鼠备解素的转基因小鼠。
[0021]附图简述
[0022]当结合附图阅读时，前面的概述以及下面的本发明优选实施方式的详细描述将被更好地理解。为了说明本发明的目的，附图中显示优选呈现的实施方式。然而，应当理解，本发明不限于附图中显示的实施方式的精确排列和手段。在附图中:
[0023]图1是补体途径的示意图。补体可通过三条途径激活:经典途径、凝集素途径和旁路途径。当Clq结合与抗原连接的抗体时，经典途径被激活，激活分裂C4和C2的Clr和Cls0当甘露糖-结合凝集素(MBL)遇到保守的致病碳水化合物模序时，凝集素途径被激活，激活MBL-相关的丝氨酸蛋白酶(MASPs)并再次分裂C4和C2。C4和C2分裂产物形成经典和凝集素途径C3转变酶，C4bC2a，其将C3分裂成C3b和C3a。C3b的第二分子可联合C4bC2a,形成经典和凝集素途径的C5转变酶，C4bC2aC3b。当C3经历自发水解并形成最初的AP C3转变酶——C3 (H20) Bb时，旁路途径(AP)被激活，在存在因子B和D的情况下，导致另外的C3分裂以及AP C3转变酶(C3bBb)和AP C5转变酶(C3bBbC3b)的最终形成。备解素通过稳定AP转变酶而促进AP激活。所有三条途径在转变酶的形成中达到顶点，这依次产生补体系统的主要效应物:过敏毒素(C4a/C3a/C5a)、膜攻击复合物(MAC)和调理素(例如C3b)。过敏毒素是衍生自C4、C3和C5分裂的有效的促炎分子。MAC是补体成分C5b至C9的晚期装配体，其可直接裂解靶向的表面。C3b引起受调理素作用靶的吞噬作用并且还用于通过AP放大补体激活。
[0024]图2描述显示由mAb 19.1、22.1、25和30引起的LPS引起的AP补体激活的剂量依赖性抑制的实验结果。当以5 μ g/ml的终浓度加入到50%正常人血清(NHS)中时，所有4个mAb克隆都有效地抑制AP补体激活。加入EDTA的样品(NHSEDTA)充当阴性对照(EDTA阻断补体激活)。未加mAb (OAb)的样品充当基线AP补体激活。实验在GVB-EGTA-Mg++缓冲液中进行。将ELISA板用LPS包被过夜。在加入板之前将NHS与mAb预温育。AP补体激活通过测量板上C3沉积的量(0D450)来检测。
[0025]图3描述显示抗人备解素mAbs抑制由fH和DAF功能失调引起的人红细胞(RBC)裂解的实验结果。人RBC在缺少人血清(只有Eh)的情况下不被裂解。它们还抵抗在缺少fH19-20——其为防止fH与自体细胞(0fhl920)相互作用的重组fH片段——的情况下人血清(50%)引起的裂解。然而，当将人RBCs与50%人血清在30 μ M fH19_20和7.5 μ g/ml功能阻断抗衰变加速因子(DAF，膜补体调节子)mAb (fhl920+AntiCD55)存在的情况下温育时，约70%的RBCs裂解。该裂解被5 μ g/ml的4种抗备解素mAbs (19.1,22.1、25、30)中的每种完全抑制。用蒸馏水(Eh+DDW)处理的RBC样品引起完全裂解和充当阳性对照。用EDTA (NHSEDTA)处理的正常人血清中的RBC样品充当阴性对照(没有裂解，因为EDTA阻断补体激活)。裂解试验在Mg++-EGTA GVB++缓冲液中进行以只允许AP补体激活。
[0026]图4描述评价在缺少或存在5 μ g/ml抗备解素mAbs的情况下与50%正常人血清(NHS)温育的抗体-致敏的绵羊RBCs的实验结果。没有加入人血清(只有ShEs)的RBCs样品没有显示裂解；与没有加入抗备解素mAb的50%NHS温育的RBCs显示完全裂解(50%NHS)；与50%NHS和5 μ g/ml的mAbsl9.1,22.1、25或30温育的RBCs也被完全裂解，显示mAbs对致敏的绵羊RBCs的经典途径-介导的补体裂解没有抑制作用。在EDTA存在(NHSEDTA)的情况下与50%NHS温育的RBCs没有裂解，显示裂解由补体介导；用蒸馏水(Es+DDW)处理的绵羊RBCs充当100%裂解对照。
[0027]图5——包括图5A-5C——描述针对mAb 19.1和25的表位作图以及人备解素(fP)缺失突变体的产生的结果。图5a描述推论的人备解素的氨基酸序列(SEQ ID NO:54)。将信号肽加下划线。成熟蛋白质始于残基28。图5b描述人备解素的7个血小板反应蛋白重复(TSR)结构域的氨基酸序列。它们如下:TSRO (SEQ ID NO: 55)、TSRl (SEQ ID NO: 56)、TSR2 (SEQ ID NO: 57)、TSR3 (SEQ ID NO: 58)、TSR4 (SEQ ID NO: 59)、TSR5 (SEQ ID NO: 60)、TSR6 (SEQ ID N0:61)。图5c描述对mAb 19.1和25的表位作图以及人备解素(fP)缺失突变体的产生的结果。人备解素(fP)由编号为O至6的7个血小板反应蛋白重复(TSR)结构域组成。已将单个TSR结构域(并且在在一些实例中两个TSR结构域)缺失并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达突变体蛋白。所有的TSR缺失突变体以预期的大小表达，除了TSR5缺失突变体——其基本上小于所预期的大小。可能TSR5缺失突变体进行了蛋白水解。TSR5缺失的大小与TSR5+6·缺失突变体相似，提示TSR5缺失突变体中TSR6可能已被蛋白水解地去除。利用多克隆山羊抗人fP抗体，通过蛋白质印迹分析CHO细胞裂解物。M:分子量(MW)标记。[0028]图6描述针对mAbl9.1和25的表位作图以及结合人备解素缺失突变体的mAbl9.1和25的ELISA测定的结果。将CHO细胞裂解物包被到ELISA板上并用mAbl9.1或25检测。将结合于19.1和25的不同表位的第三mAb29.3用作对照以证实蛋白表达。结果显示mAbl9.1和25均与下面的缺失突变体反应:dTSR0、dTSRl、dTSR2、dTSR3、dTSR4。因此，可以得出结论，针对mAbl9.1和25的表位没有位于TSR0-4中。另外，mAbl9.1丧失与dTSR5和dTSR5+6的结合，但保留与dTSR6的结合，提示其表位位于TSR5中。mAb25丧失与dTSR5、dTSR5+6和dTSR6的结合，提示其表位位于TSR5-6中。然而，因为dTSR5已经经历了蛋白水解的降解，其导致可能的TSR6去除(图5)，所以针对mAb25的表位可能位于TSR6中。HuP指全长人备解素转染物，其用作阳性对照。Con指未转染的CHO细胞裂解物，其用作缺乏结合的阴性对照。所有的突变体蛋白在C-端含有6XHis标签。
[0029]图7描述表位作图的结果，显示mAbl9.1的表位被定位到TSR5的C-端一半，具有以下氨基酸序列:RGRTCRGRKFDGHRCAGQQQDIRHCYSIQHCP(SEQ ID NO: 52)。因为 TSR0_4(gp，dTSR5+6)不与mAbl9.1反应，而TSRO-5 (即，dTSR6)与19.1反应(图6)，进一步产生缺失突变体:TSR0-4+l/4TSR5、TSR0-4+l/2TSR5 和 TSR0-4+3/4TSR5。突变体，但不是完整的备解素蛋白在它们的C-端含有6XHis标签。利用抗人fP和抗His tag抗体的蛋白质印迹分析显示TSR0-4+3/4TSR5没有充分表达。其它两个突变体TSR0-4+1/4TSR5和TSR0-4+1/2TSR5被证实表达，但没有一个被mAbl9.1识别，提示它们已丧失针对mAbl9.1的表位。因此,可以得出结论，针对mAbl9.1的关键表位残基位于TSR5的C-端一半内(SEQ ID N0:52)。
[0030]图8——包括图8A和8B——描述显示mAb25的表位的表位作图结果。在图8A中，数据指示定位到TSR6的C-端四分之一部分的表位，具有氨基酸序列:LVVEEKRPCLHVPACKDPEEEEL (SEQ ID NO: 53)。因为 TSRO-5 (即，dTSR6)丧失与 mAb25 的结合，所以得出结论，TSR6构成mAb25的至少部分表位。产生TSR6的另外的突变体如下:TSR0-5+1/4TSR6、TSR0-5+1/2TSR6和TSR0-5+3/4TSR6。突变体，但不是完整的备解素蛋白在它们的C-端含有6 XHis标签。如用抗人fP和抗His标签抗体的蛋白质印迹所显示的，所有三种突变体都被成功表达。ELISA结合实验显示所有三种突变体都丧失与mAb25的结合。作为阳性对照，所有突变体蛋白都与mAbl9.1反应。该结果提示TSR6的最后四分之一部分(具有SEQ ID NO: 53指定的序列)构成mAb25表位的关键部分。HuP指全长(完整的)人fP转染的CHO细胞，作为阳性对照；ConLySate指未转染的CHO细胞，作为结合的阴性对照。在图8B中，数据指示mAb25的表位依赖TSR6中的两个半胱氨酸残基(SEQ ID NO:61，如图5B所示)。这些是TSR6的半胱氨酸62 (C62)和半胱氨酸78 (C78)。全长人备解素中C62或C78的丙氨酸(A)的单个突变没有消除mAb25结合，但是C62A和C78A的双重突变消除了 mAb25结合。作为突变体蛋白表达的阳性对照，mAbl9.1显示对所有样品的反应性。该结果提示TSR6的最后四分之一部分(具有SEQ ID NO:53指定的序列)内的C78以及位于SEQ ID N0:53外侧但在TSR6(SEQ ID:61)内的C62构成mAb25表位的两个关键残基。利用转染的CHO细胞的匀浆，在ELISA板上进行Absl9.1和25的结合测定。HuP指全长(完整的)人fP转染的CHO细胞，作为阳性对照；Con指未转染的CHO细胞，作为结合的阴性对照。其它样品是用含有单个或两个C62A和C78A突变的突变人fP cDNA转染的CHO细胞。
[0031]图 9 描述mAb 19.1 的重链(SEQ ID NO:1 ；SEQ ID NO: 2)和轻链(SEQ ID NO: 6 ；SEQID NO:7)可变区序列的核苷酸和氨基酸序列，包括CDRs (VH-CDR1:SEQ ID NO: 3 ;VH_CDR2:SEQ ID NO:4 ；VH-CDR3:SEQ ID NO: 5 ;VL_CDR1:SEQ ID N0:8 ;VL_CDR2:SEQ ID N0:9 ；VL-CDR3:SEQ ID NO:10)。
[0032]图 10 描述mAb25 的重链(SEQ ID NO: 11 ；SEQ ID NO: 12)和轻链(SEQ ID NO: 16 ；SEQ ID NO: 17)可变区序列的核苷酸和氨基酸序列，包括⑶Rs (VH-⑶Rl:SEQ ID NO: 13 ；VH-CDR2:SEQ ID NO: 14 ；VH-CDR3:SEQ ID NO: 15 ；VL-CDRl:SEQ ID NO: 18 ；VL-CDR2:SEQ IDNO: 19 ;VL-CDR3:SEQ ID NO:20)。
[0033]图 11 描述mAb22.1 的重链(SEQ ID NO:21 ；SEQ ID NO:22)和轻链(SEQ ID NO:26 ；SEQ ID N0:27)可变区序列的核苷酸和氨基酸序列，包括CDRs(VH-CDRl:SEQ ID NO:23 ；VH-CDR2:SEQ ID NO:24 ；VH-CDR3:SEQ ID NO:25 ；VL-CDRl:SEQ ID NO:28 ；VL-CDR2:SEQ IDNO:29 ;VL-CDR3:SEQ ID NO:30)。
[0034]图12 描述mAb30 的重链(SEQ ID NO:31 ；SEQ ID NO:32)和轻链(SEQ ID NO:36 ；SEQ ID NO:37)的可变区序列的核苷酸和氨基酸序列，包括CDRs (VH-CDR1:SEQ ID NO: 33 ；VH-CDR2:SEQ ID NO:34 ;VH_CDR3:SEQ ID NO:35 ；VL-CDRl:SEQ ID NO:38 ；VL-CDR2:SEQ IDNO:39 ;VL-CDR3:SEQ ID NO:40)。
[0035]图13描述利用两个人种系VH序列(人VH4-59-01 (SEQ ID NO:41)；人VH3-66-04(SEQ ID NO:43))的CDR移植之后mAbl9.1重链可变区的人源化氨基酸序列(人源化的 19.lVH-4-59-01(SEQ ID NO:42);人源化的 19.1VH-3-66-04(SEQ ID N0:44))。
[0036]图14 描述利用人种系 VL 序列(人 VL4-1-01 (SEQ ID NO: 45)；人 JK2 (SEQID NO:46))的CDR移植之后mAbl9.1轻链可变区的人源化氨基酸序列(人源化
19.lVL-4-l-01(SEQ ID ·N0:47))。
[0037]图15描述利用人种系VH序列(人VH1-69-06 (SEQ ID NO:48))的CDR移植之后mAb25重链可变区的人源化氨基酸序列(人源化25-VH-1-69-06 (SEQ ID N0:49))。
[0038]图16描述利用人种系VL序列(人VL1-69-06 (SEQ ID NO:50))；人Jk3 (SEQ ID NO:62)的⑶R移植之后mAb25轻链可变区的人源化氨基酸序列(人源化25-VL-1-69-06(SEQ ID NO:5I))。
[0039]图17——包括图17A和17B——描述评价重组嵌合和人源化19.1mAbs的实验结果。图17A描述人IgG4重链恒定区的氨基酸序列，其中丝氨酸229突变为脯氨酸(SEQ IDN0:63)，和人轻链K恒定区(SEQ ID N0:64)。这些序列用于构建嵌合(小鼠可变区+人恒定区)和人源化(人源化小鼠可变区+人恒定区)抗备解素抗体。图17B描述评价重组嵌合和人源化19.1mAbs表达的实验结果。重组嵌合19.1mAb和两个人源化19.1mAbs的SDSPAGE分析。嵌合19.1重链的构建通过连接19.1的VH区与人IgG4重链恒定区而获得。嵌合19.1轻链的构建通过连接19.1的VL区与人K链恒定区而获得。人源化19.1重链和轻链以相同方式构建，即将人源化VH区与人IgG4重链恒定区连接，将人源化轻链与人K链恒定区连接。用重链和轻链cDNAs共转染CHO细胞并且通过药物部分建立稳定的谱系。对于两种人源化mAbs，将两条人源化重链中的每条与相同的人源化轻链配对用于转染。通过蛋白G亲和柱从CHO细胞培养基纯化表达的mAbs。
[0040]图18描述利用Biacore测量19.1、嵌合19.1和人源化19.1mAbs的抗原结合亲和性的实验结果。利用胺偶联方法将纯化的人fP偶联到CM4芯片。Biacore分析在Biacore-2000仪器上进行。利用50mM NaOH，在每次结合之间使芯片再生。
[0041]图19描述测量mAb25、22.1和30的抗原结合亲和性的实验结果，如Biacore分析所测定的。利用胺偶联方法将纯化的人fP偶联到CM4芯片上。Biacore分析在Biacore-2000仪器上进行。利用50mM NaOH，在每次结合之间使芯片再生。
[0042]图20描述评价19.1、嵌合19.1和人源化19.1mAbs在阻断LPS引起的人AP补体激活中的相对活性的实验结果。将ELISA板用LPS包被过夜，加入在GVB-Mg++-EGTA中稀释的50%正常人血清(NHS)并在37°C温育lhr，然后利用抗C3抗体检测C3沉积。没加抗体的NHS充当阳性对照(NHS)，加入EDTA的NHS充当阴性对照(NHSEDTA)。对于19.1mAb,5 μ g/ml和10 μ g/ml的浓度足以抑制补体激活。对于嵌合和两种人源化19.1mAbs, 5 μ g/ml的浓度不足以抑制补体激活。然而，10 μ g/ml和20 μ g/ml的浓度对阻断AP补体激活是有效的。
[0043]图21描述评价19.1、嵌合19.1和人源化19.1mAbs在fH和DAF功能失调的情况下在通过人AP补体阻断人RBC裂解中的相对活性的实验结果。将人RBCs与50%正常人血清在存在--19-20(30μΜ)和抗DAF抗体(7.5 μ g/ml)的情况下温育。将人血清在GVB-Mg++-EGTA中稀释，并且在37°C进行温育lhr。在加入到RBCs之前，将人血清与渐增浓度的19.1、嵌合19.1和人源化19.1mAbs (1-15 μ g/ml)在4°C预温育lhr。所有4种mAbs都具有RBC裂解的剂量依赖性抑制。然而，嵌合和人源化19.1mAbs的EC50高于19.1mAb。该结果与图20中显示的数据一致。
[0044]图22描述评价19.1、嵌合19.1和人源化19.1mAbs在阻断LPS引起的罗猴AP补体激活中的相对活性的实验结果。将ELISA板用LPS包被过夜，加入在GVB-Mg++-EGTA中稀释的50%正常罗猴血清(NRS)并在37°C温育lhr，然后利用抗人C3抗体检测C3沉积。没加抗体的NRS充当阳性对照(NRS)，加有EDTA的NRS充当阴性对照(NRSEDTA)。对于19.1和嵌合19.1mAbs, 10-40 μ g/ml的浓度足以抑制罗猴补体激活。对于两种人源化19.1mAbs,30或40 μ g/ml的浓度有效抑制补体激活。10或20 μ g/ml的浓度也基本上抑制罗猴AP补体激活。
[0045]图23描述评价19.1、嵌合19.1和人源化19.1mAbs在阻断LPS引起的食蟹猴AP补体激活中的相对活性的实验结果。将ELISA板用LPS包被过夜，加入在GVB-Mg++-EGTA中稀释的50%正常食蟹猴血清(NCS)并且在37°C温育lhr，然后利用抗人C3抗体检测C3沉积。没加抗体的NCS充当阳性对照(NCS)，加入EDTA的NCS充当阴性对照(NCSEDTA)。对于19.1mAb，10-40 μ g/ml的浓度足以抑制食蟹猴AP补体激活。对于嵌合19.1mAb，20-40 μ g/ml的浓度足以抑制食蟹猴AP补体激活，但是10 μ g/ml的浓度也显著抑制补体激活。对于两种人源化19.1mAbs, 30或40 μ g/ml的浓度有效抑制食蟹猴补体激活。然而,20 μ g/ml的浓度也基本上抑制食蟹猴AP补体激活。10 μ g/ml的浓度还部分抑制食蟹猴AP补体活性。
[0046]图24描述评价mAbl9.1、25和人源化19.1对PNH患者红细胞酸化血清裂解的抑制(Ham’ stest，哈姆氏试验)的实验结果。将来自阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)患者的RBCs在存在或不存在mAbs的情况下进行哈姆氏酸化血清试验。将RBCs与自体血清(终浓度83%)在37C温育2hr并通过测量上清液的0D405来计算裂解百分数，标准化至由蒸馏水完全裂解的RBCs样品 (Eh DDff)。温育混合物由以下组成:240 μ I血清、25 μ 11/6Ν HCL(或25μ I盐水用于阴性对照)、12.5μ 150%(v/v)RBC悬浮液、10μ I盐水中的mAb。将与非酸化自体血清(NHS) —起温育的RBCs样品用作阴性对照(背景裂解)。在不存在mAbs的情况下,约50%RBCs通过酸化血清裂解。该裂解由8 μ g/ml和更大浓度的mAbl9.1、20 μ g/ml浓度的人源化19.1mAb (#459)以及8 μ g/ml和更大浓度的mAb25完全抑制。 [0047]图25——包括图25A-25E——描述备解素人源化小鼠的产生。人fP表达载体如图25A中示意图所示而构建，利用具有CVM-1E增强子的鸡β-肌动蛋白启动子和兔β -球蛋白聚腺苷酸尾用于cDNA在真核细胞中的稳定表达。将该质粒线性化并显微注射进C57BL/6小鼠的受精卵以产生人fP转基因建立者小鼠(founder mice)。通过PCR筛选(利用对人 fP 特异的引物 5’ -ATCAGAGGCCTGTGACACC-3，(SEQ ID NO:65)和 5’ -CTGCCCTTGTAGCTCCTCA-3’ (SEQ ID NO: 66))，鉴定阳性建立者小鼠(显示约 800bp 的人 fP cDNA片段)。40只分析的小鼠中，五只(#15、20、24、27和32)是阳性的(图25B，红色箭头)。进行ELISA测定以检测转基因阳性小鼠中的人fP (图25C)。将板用抗人fP的非阻断mAb (克隆8.1)包被。与稀释的血清(10%) —起温育之后，利用HRP-结合的山羊抗人fP抗体，通过ELISA检测人fP。正常人血清(NHS)用作阳性对照。可以看出，人fP在NHS中和5个转基因小鼠的血清中检测到，但在正常(即非转基因的)小鼠血清(WS)、转基因阴性(#29)中或在fP+小鼠血清中未检测到。将建立者小鼠#32与WT小鼠一起繁殖并将幼崽如上面所描述的通过PCR筛选。将三只代表性的Fl小鼠一一只PCR-阴性(F1-429)和两只PCR-阳性(F1-430和F1-431)——通过ELISA检测它们的血清中人fP的存在(图25D)。如所显示的，人fP在两只PCR-阳性小鼠中检测到，但未在PCR-阴性小鼠中检测到。来自NHS和建立者亲本(#32)的血清用作阳性对照。该结果提示转基因是稳定的并且可通过种系传递。然后将建立者小鼠#32与fP+小鼠一起繁殖以产生fP+_人fP转基因+小鼠。LPS引起的AP补体激活试验显示fP+_人fP转基因+小鼠而不是fP+小鼠具有与WT小鼠不能区别的血清AP补体活性(图25E)，提示转基因表达的人fP能援救fP+小鼠的表型。用EDTA处理的WT血清用作阴性对照。该结果证实产生了备解素人源化小鼠品系。
[0048]图26描述检查“备解素人源化”小鼠中mAb25的体内活性和动力学的实验。给备解素人源化小鼠(fP+-人fP转基因+)注射0.5mg(1.P.)mAb25。在注射之前(Ohr)采集血清样品，然后在注射之后的多个时间点采集血清样品，并检测LPS引起的AP补体激活。如所显示的，在fP+小鼠血清中或在用EDTA处理的WT血清中不存在AP补体活性。相比之下，在WT血清中和在时间Ohr (mAb处理之前)在fP人源化小鼠血清中检测到AP补体活性。人源化小鼠中AP补体活性在mAb处理之后8、24和48hr依然未检测到，但在72、96和120hr可检测到。这些结果提示在0.5mg/小鼠的剂量，mAb25能够在体内抑制AP补体活性持续48hr。
[0049]图27描述显示抗人备解素mAbl9.1防止血管外溶血(EVH)的实验结果。在该EVH模型中，给备解素人源化小鼠(每个实验组n=4)输注来自Crry/DAF/C3三重敲除(TKO)小鼠的红细胞(RBC)。在RBC转移之前，用mAbl9.1 (2mg/小鼠，1.p.)或对照小鼠IgGlmAb (M0PC,从MoPC31C杂交瘤纯化，来自ACTT)处理受体小鼠(备解素人源化小鼠)6hr。在注射(通过尾静脉)进受体小鼠之前，根据先前公开的程序(Miwa etal.，2002，Blood99:3707-3716)，从供体TKO小鼠收获RBCs，在PBS中洗涤并用CFSE标记。每只受体小鼠接受等于100 μ I血的RBCs0在RBC输注之后5分钟和6、24、48、72、96、120小时，受体小鼠被抽血，分析RBCs以测定循环中剩余的CFSE-标记的(即输注的)RBCs数。将每只受体中CFSE-标记的RBCs数标准化(为％)到5min时间点检测到的RBCs数。在对照IgG(MOPC)处理的受体小鼠中，TKO RBCs通过EVH被迅速消除，与先前的发现一致(Miwaet al.，2002，Blood99:3707-3716)。然而，在用抗人备解素19.1mAb处理的受体小鼠中，没有出现EVH，并且输注的RBCs存留，显示抗备解素mAb有效防止EVH。
[0050]图28描述用于产生人备解素转基因小鼠的人备解素cDNA的核酸序列(SEQ IDNO:67)。
[0051]发明详述
[0052]本发明涉及利用抗备解素抗体的补体旁路途径(AP)的抑制。在各种实施方式中，本发明涉及通过使个体接触抗备解素抗体来治疗个体中AP-介导的病理或AP-介导的状况的组合物和方法。可用本发明的组合物和方法治疗的AP-介导的病理和状况包括，但不限于，黄斑变性、缺血再灌注损伤、关节炎、风湿性关节炎、哮喘、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)综合征、非典型的溶血性尿毒症(aHUS)综合征、败血病、器官移植、炎症(包括，但不限于，与心肺旁路手术和肾透析相关的炎症)、肾小球肾炎(包括，但不限于，抗嗜中性粒细胞细胞质抗体(ANCA)-介导的肾小球肾炎、狼疮、和其组合。
[0053]定义
[0054]除非另外限定，本文使用的所有的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意思。虽然与本文描述的相似或相等的任何方法和材料可用于本发明的实施或测试中，但是描述了优选的方法和材料。
[0055]如本文所用，下面术语中的每个具有与该部分中其相关的意思。
[0056]冠词“a (—个)”和“an (—个)”用于本文指冠词的一个或超过一个(即，至少一个)的语法对象。作为实例，“一个元件(an element)”意指一个元件或超过一个元件。
[0057]如本文所用，术语“inhibit (抑制)”和“inhibition (抑制)”意即相对于对照值减少、抑制、减小或阻断活性或功能至少约10%。优选，与对照值相比，活性被抑制或阻断50%，更优选75%和甚至更优选95%。
[0058]术语“有效量”和“药学有效量”指提供期望的生物学结果的剂的足够量。该结果可以是疾病或病症的体征、症状或原因的减少和/或减轻，或生物系统的任何其它期望的改变。在任何个体情况中适当的有效量可由本领域普通技术人员利用常规实验测定。
[0059]术语“患者”、“对象”、“个体”等在本文可互换地使用，并且指任何动物，优选哺乳动物，最优选人，其具有补体系统，包括需要治疗、或易受状况或其后遗症影响的人。个体可包括，例如，狗、猫、猪、母牛、绵羊、山羊、马、大鼠、猴、和小鼠以及人。
[0060]当用于生物体、组织、细胞或其组分的背景中时，术语“异常”指在至少一个可观察的或可检测的特性(例如，年龄、处理、天的时间等)区别于显示“正常的”(期望的/稳态的)各自特性的那些生物体、组织、细胞或其组分的那些生物体、组织、细胞或其组分。对于一个细胞、组织类型或对象正常的或期望的特性对于不同的细胞或组织类型可能是异常的。
[0061]“疾病”是这样的动物健康状态，其中动物不能保持保持稳态，并且其中如果疾病没有改善，那么动物的健康持续恶化。
[0062]相反，动物中的“病症”是这样的健康状态，其中动物能保持稳态，但是其中动物的健康状态较在没有该病症的情况下较不利。不治疗，病症不会必然引起动物健康状态的进一步降低。
[0063]如果疾病或病症的体征或症状的严重性，患者经历的这样的体征或症状的频率，或二者减少，那么疾病或病症“减轻”。
[0064]化合物的“有效量”或“治疗有效量”是足以提供给化合物施用对象有益效果的化合物的量。
[0065]如本文所用，“指导材料”包括可用于显示试剂盒中本发明的化合物、组合物、载体或递送系统用于实现本文描述的多种疾病或病症减轻的有效性的出版物、记录、图表或任何其他表达介质。任选地或可选地，指导材料可描述一种或多种减轻哺乳动物细胞或组织中疾病或病症的方法。本发明试剂盒的指导材料可，例如，附于含有鉴定的本发明的化合物、组合物、载体或递送系统的容器或与含有鉴定的化合物、组合物、载体或递送系统的容器一起运输。可选地，指导材料可以与容器分开运输，目的是指导材料和化合物由接受者合作地使用。
[0066]“治疗(therapeutic)”处理是施加给显示病理学体征的对象的处理，用于减小或消除那些体征的目的。 [0067]如本文所用，“治疗疾病或病症”意即由患者经历减少疾病、病症或病理的体征和/或症状的频率和/或严重性。疾病、病症和病理在本文可互换地使用。
[0068]如本文所用，短语“生物样品”意欲包括可检测核酸或多肽的表达的任何样品——包括细胞、组织或体液。这样的生物样品的实例包括但不限于血液、淋巴、骨髓、活组织检查和涂片。天然就是液体的样品在本文称作“体液”。生物样品可通过许多种技术获自患者，包括，例如，通过刮或抹一个区域或通过利用针以获得体液。采集多种身体样品的方法在本领域是众所周知的。
[0069]术语“抗体”，如本文所用，指能特异结合抗原的特定表位的免疫球蛋白分子。抗体可以是源自天然来源或源自重组来源的完整的免疫球蛋白并可以是完整的免疫球蛋白的免疫反应部分。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括，例如，多克隆抗体、单克隆抗体、细胞内抗体(“胞内抗体“)、Fv、Fab、Fab’、F(ab)2和F(ab’ )2,以及单链抗体(scFv)、重链抗体如骆骑抗体(camelid antibodies)和人源化抗体(Harlow etal.，1999，Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress,NY;Harlow et al.，1989，Antibodies:A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor, New York;Houston et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883;Bird etal.，1988，Science242:423-426)。
[0070]术语“合成抗体”，如本文所用，意指利用重组DNA技术产生的抗体，如，例如，由噬菌体表达的抗体，如本文所描述的。该术语还应被解释为指这样的抗体，其已通过编码抗体的DNA分子的合成而产生，并且其DNA分子表达抗体蛋白，或确定的抗体的氨基酸序列，其中所述DNA或氨基酸序列已利用在本领域可获得和众所周知的合成DNA或氨基酸序列技术而获得。
[0071]如本文所用，术语“重链抗体(heavy chain antibody)”或“重链抗体(heavychain antibodies)”包括源自骆驼物种的免疫球蛋白分子，或者通过用肽免疫并随后分离血清，或通过克隆和表达编码这样的抗体的核酸序列。术语“重链抗体”进一步包括从具有重链疾病的动物分离，或通过克隆和表达来自动物VH(可变重链免疫球蛋白)基因而制备的免疫球蛋白分子。
[0072]“嵌合抗体”指这样类型的工程抗体，其含有源自供体抗体的天然存在的可变区(轻链和重链)联合源自受体抗体的轻链和重链恒定区。
[0073]“人源化抗体”指这样类型的工程抗体，其具有源自非人供体免疫球蛋白的⑶Rs，分子的其余来自免疫球蛋白源部分衍生自一个(或多个)人免疫球蛋白(或多个)。此外，框架支持残基可被改变以保持结合亲和力(参见，例如，1989，Queen et al., Proc.Natl.Acad Sci USA, 86:10029-10032; 1991, Hodgson et al.，Bio/Technology, 9:421)。合适的人受体抗体可以是利用与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列同源性从常规数据库，例如，KABAT数据库、Los Alamos数据库和Swiss蛋白数据库选择的抗体。由与供体抗体的框架区同源性(在氨基酸的基础上)表征的人抗体可适合提供重链恒定区和/或重链可变框架区用于供体CDRs的插入。能够贡献轻链恒定或可变框架区的合适的受体抗体可以以相似的方式选择。应当注意，受体抗体重链和轻链不需要源于相同的受体抗体。现有技术描述了几种产生这样的人源化抗体的方法(参见例如EP-A-0239400和EP-A-054951)。
[0074]术语“供体抗体”指这样的抗体(单克隆和/或重组的)，其将其可变区、CDRs或其它功能片段的氨基酸序列或其类似物贡献给第一免疫球蛋白配偶体，以提供改变的免疫球蛋白编码区和产生的表达的改变的抗体——具有供体抗体的抗原特异性和中和活性特性。
[0075]术语“受体抗体”指与供体抗体异源的抗体(单克隆和/或重组的)，其将所有的(或任何部分，但在一些实施方式中所有的)编码其重链和/或轻链框架区和/或其重链和/或轻链恒定区的氨基酸序列贡献给第一免疫球蛋白配偶体。在某些实施方式中，人抗体是受体抗体。
[0076]“CDRs”被定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，其是免疫球蛋白重链和轻链的高变区°参见，例如，Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4thEd.，U.S.Department o·f Health and Human Services, National Institutes ofHealth(1987)。在免疫球蛋白的可变部分有三个重链和三个轻链⑶Rs (或⑶R区)。因此，“⑶Rs”如本文所用指所有三个重链⑶Rs或所有三个轻链⑶Rs (或所有的重链和所有的轻链CDRs两者，如果适当的话)。抗体的结构和蛋白折叠可以指其它残基被认为是抗原结合区的部分并将被技术人员理解是这样。参见例如Chothia et al., (1989)Conformationsof immunoglobulin hypervariable regions;Nature342, ρ877_883。
[0077]如本文所用，“免疫测定”指利用能够特异结合靶分子的抗体以检测和定量靶分子的任何结合测定。
[0078]术语“特异结合”，如本文关于抗体所用，指识别特定抗原，但基本上不识别或结合样品中其它分子的抗体。例如，特异地结合一个物种的抗原的抗体还可结合来自一个或多个物种的抗原。但是，这样的交叉物种反应性自身没有将抗体的分类改变为特异的。在另一个实例中，特异地结合抗原的抗体还可结合抗原的不同等位基因形式。然而，这样的交叉反应性自身没有将抗体的分类改变为特异的。
[0079]在一些实例中，术语“特异结合(specificbinding 或 specifically binding)”可参考抗体、蛋白质或肽与第二化学种类相互作用使用以指该相互作用依赖于化学种类上的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)；例如，抗体通常识别并结合特定的蛋白结构而不是蛋白质。如果抗体对表位“A”是特异的，那么在含有标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A(或游离的、未标记的A)的分子的存在将减少结合抗体的标记的A的量。
[0080]基因的“编码区”由基因编码链的核苷酸残基组成，基因非编码链的核苷酸分别与基因转录产生的mRNA分子的编码区同源或互补。
[0081]mRNA分子的“编码区”也由mRNA分子的核苷酸残基组成，该核苷酸残基在mRNA分子翻译期间与转移RNA分子的抗密码子区匹配，或其编码终止密码子。编码区可因此包括这样的核苷酸残基，其包括不存在于mRNA分子编码的成熟蛋白中的氨基酸残基(例如，蛋白质输出信号序列中的氨基酸残基)的密码子。
[0082]如本文所用，指核酸的“互补”是指两条核酸链的区域之间或相同核酸链的两个区域之间序列互补性的广泛概念。已知如果残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶，那么第一核酸区的腺嘌呤残基能和与第一区反向平行的第二核酸区的残基形成特定的氢键(“碱基配对”)。相似地，已知如果残基是鸟嘌呤，那么第一核酸链的胞嘧啶残基能和与第一链反向平行的第二核酸链的残基形成碱基配对。如果核酸的第一区与相同或不同核酸的第二区互补，那么当两个区以反向平行方式排列时，第一区的至少一个核苷酸残基能与第二区的残基碱基配对。优选，第一区包括第一部分，第二区包括第二部分，借此，当第一和第二部分以反向平行方式排列时，第一部分至少约50%和优选至少约75%，至少约90%或至少约95%的核苷酸残基能与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。更优选，第一部分的所有核苷酸残基能与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。
[0083]术语“DNA”如本文所用，被定义为脱氧核糖核酸。
[0084]“编码”指多核苷酸如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特定序列的固有性质，充当生物学过程中其它聚合物和大分子合成的模板——具有限定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列和从中产生的生物学性质。因此，如果对应基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，那么该基因编码蛋白。编码链——其核苷酸序列与mRNA序列相同并通常在序列表中提供——和用作基因或cDNA的转录模板的非编码链均可称作编码蛋白质或该基因或cDNA的其它产物。
[0085]除非另外指定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式并编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可包括内含子，在这个意义上，编码蛋白质的核苷酸序列可在一些形式中含有内含子(一个或多个)。
[0086]“分离的”指从自然状态改变的或去除的。例如，在活的动物中在其正常环境中天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然环境的共存材料部分或全部分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或可存在于非天然的环境如，例如，宿主细胞。
[0087]“分离的核酸”指已与以天然存在状态位于其两侧的序列分离的核酸段或片段，即，已从正常邻近该片段的序列一即，其天然存在的基因组中邻近该片段的序列一除去的DNA片段。该术语还应用于已基本上从其它组 分纯化的核酸，该其它组分天然伴随该核酸，即，RNA或DNA或蛋白质，其在细胞中天然伴随它。该术语因此包括，例如，重组DNA，其掺入载体，掺入自主复制质粒或病毒，或掺入原核生物或真核生物的基因组，或其作为单独分子(即，作为cDNA或基因组或通过PCR或限制性酶消化产生的cDNA片段)存在，独立于其它序列。它还包括重组DNA——其是编码另外的多肽序列的杂合基因的部分。
[0088]在本发明的上下文中，使用下面的针对通常存在的核酸碱基的缩写。“A”指腺苷，“C”指胞嘧啶，“G”指鸟苷，“T”指胸苷和“U”指尿苷。
[0089]术语“多核苷酸”如本文所用，被定义为核苷酸的链。另外，核酸是核苷酸聚合物。因此，如本文所用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有一般知识，核酸是多核苷酸，其可被水解成单体的“核苷酸”。单体的核苷酸可被水解成核苷。如本文所用，多核苷酸包括，但不限于，通过本领域可用的方法一没有限制地包括，重组方法，即，利用通常的克隆技术和PCR从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列，和类似方法一和通过合成的方法获得的所有的核酸序列。
[0090]如本文所用，术语“肽”、“多肽”、和“蛋白质”可互换地使用，并指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可组成蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括任何肽或蛋白——包括通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸。如本文所用，该术语指短链——其在本领域也通常称作例如肽、寡肽和寡聚体，和更长的链——在本领域通常称作蛋白质，其有许多种类。“多肽”包括，例如，生物学上有活性的片段，基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然的肽、重组肽、合成的肽、或其组合。
[0091]术语“后代(progeny)”如本所用指后代(descendent或offspring),并包括哺乳动物的后代，并还包括来自亲本细胞的分化或未分化的后代细胞(decedent cell)。在一个用法中，术语后代(progeny)指遗传上与亲本相同的后代细胞(descendent cell)。在另一个应用中，术语后代(progeny)指遗传上和表型上与亲本相同的后代细胞。在另一个用法中，术语后代(progeny)指已从亲本细胞分化的后代细胞。
[0092]术语“RNA”如本文所用 被定义为核糖核酸。
[0093]术语“重组DNA ”如本文所用被定义为通过连接不同来源的DNA碎片而产生的DNA。
[0094]术语“重组多肽”如本文所用被定义为通过利用重组DNA方法产生的多肽。
[0095]如本文所用，“连接的”指一个分子与第二个分子的共价连接。
[0096]当该术语用于本文时，“变体”是在序列上分别与参考核酸序列或肽序列不同，但保持参考分子的必要生物学性质的核酸序列或肽序列。核酸变体序列的改变可以不改变参考核酸编码的肽的氨基酸序列，或可导致氨基酸置换、添加、缺失、融合和截断。肽变体序列的改变通常受限制或保守的，以便参考肽和变体的序列总体上非常相似，并且在许多区域相同。变体和参考肽可以在氨基酸序列上以任何组合的一个或多个置换、添加、缺失而不同。核酸或肽的变体可以是天然存在的如等位基因变体，或可以是这样的变体，其不是已知天然存在的。非天然存在的核酸和肽的变体可通过诱变技术或同直接合成而制备。
[0097]术语“繁殖”用于本文指物种的繁殖，结果是至少一个后代。
[0098]术语“自然繁殖”用于本文指通过性结合的物种繁殖。
[0099]术语“近亲繁殖动物”用于本文指这样的动物，其已与相同物种的其它相似动物进行品种间杂交以保持和固定某些特性或防止其它特性引入繁殖群体。
[0100]术语“远亲繁殖动物”用于本文指与相同物种的任何其它动物繁殖而不考虑保持某些特性的动物。
[0101]范围:遍及本公开，本发明的各个方面可以以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅是为了方便和简洁，并不应被解释为对本发明范围的僵硬限制。相应地，范围的描述应被视为已具体公开所有可能的亚范围以及该范围内的单个数值。例如，范围如I至6的描述应被理解为已具体地公开了亚范围如I至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等以及该范围内的单个数，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不论范围的宽度如何这是适用的。[0102]
[0103]本发明涉及利用抗备解素抗体抑制补体旁路途径(AP)。在一个实施方式中，本发明涉及通过使个体与抗备解素抗体接触来治疗个体中AP-介导的病理或AP-介导的状况的方法。
[0104]在一个实施方式中，本发明是治疗个体中AP-介导的病理的方法，包括给所述个体施用抗备解素抗体，由此抑制C3bBb蛋白复合物的产生的步骤。可利用本发明方法治疗的补体-介导的病理的实例包括，但不限于，黄斑变性、缺血再灌注损伤、关节炎、风湿性关节炎、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)综合征、非典型的溶血性尿毒症(aHUS)综合征、哮喘、炎症、肾小球肾炎、狼疮、器官移植败血病、或其组合。
[0105]免疫系统区分“自己”和“非己”抗原的能力对免疫系统作为对侵入微生物的特异防御起作用极其重要。“非己”抗原是进入或呈现在身体中的物质上的那些抗原，其是与动物自己的组分可检测地不同或异质的，而“自己”抗原是健康动物中与其自己的组分没有可检测地不同或异质的那些抗原。在本文描述的方法的各种实施方式中，被抑制的AP激活是由以下至少一种触发的激活:微生物抗原、非生物的异质表面、改变的自身组织、或其组合。非生物的异质表面的一个实例是输血管如用于心肺旁路手术或肾透析的输血管。改变的自身组织的实例包括凋亡、坏死和缺血应激组织和细胞、或其组合。
[0106]在一些实施方式中，本发明的抗备解素抗体选择性地抑制AP，但不抑制经典途径(CP)或凝集素途径(LP)。通常，CP由抗原-抗体复合物启动，LP由凝集素与微生物表面上的糖分子的结合而激活，而AP以低水平组成性地活化，但是由于缺少调节蛋白，可在细菌、病毒和寄生物细胞表面上被迅速放大。宿主细胞通常被保护，免于调节蛋白引起的AP补体激活。但是在一些情形中，如当调节蛋白缺损或丧失，AP还可在在宿主细胞上无法控制地激活，导致补体-介导的病理。·CP由成分C1、C2、C4组成并在C3激活步骤与AP会合。LP由甘露糖-结合凝集素(MBLs)和MBL-相关的丝氨酸蛋白酶(Masps)组成并与CP共有成分C4和C2。AP由成分C3和几个因子如因子B、因子D、备解素和流体相调节子因子H组成。补体激活由三个阶段组成:(a)识别；(b)酶激活和(c)导致细胞死亡的膜攻击。CP补体激活的第一时期始于Cl。Cl由三种不同的蛋白质组成:识别亚基，Clq，和丝氨酸蛋白酶亚成分Clr和Cls——其在钙依赖的四聚体复合物中结合在一起，Clr2s2。完整的Cl复合物是Cl产生生理学激活必需的。当完整的Cl复合物结合与抗原复合的免疫球蛋白时，激活发生。该结合激活Cls，其然后分裂C4和C2蛋白，产生C4a和C4b，以及C2a和C2b。C4b和C2a片段组合，形成C3转变酶，C4b2a，其反过来分裂C3，形成C3a和C3b。LP的激活通过结合靶表面上某些糖的MBL而启动，并且这触发Masps的激活，其然后以类似于CP的Cls活性的方式分裂C4和C2，导致C3转变酶——C4b2a——的产生。因此，CP和LP由不同机制激活，但是它们共有相同的成分C4和C2，并且两条途径均导致相同的C3转变酶一C4b2a——的产生。C4b2a引起的C3分裂成C3b和C3a是针对两个原因的补体途径的中心事件。它启动AP放大环路，因为表面沉积的C3b是AP的主要中间体。C3a和C3b均是生物学上重要的。C3a是促炎的，并且与C5a —起被称作过敏毒素。C3b和其进一步的分裂产物还结合呈现在中性白细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞上的补体受体，由此促进C3b-调理的颗粒的吞噬和清除。最后，C3b可与C4b2a联合，形成CP和LP的C5转变酶，激活末端补体序列，导致C5a——有效的促炎介质——的产生和裂解的膜攻击复合物(MAC)——C5-C9——的装配。
[0107]因为CP和AP在宿主防御中具有关键作用，并且许多依赖补体的人病理由AP介导，期望在这种人病理的治疗中选择性地抑制AP。相应地，在本文描述的方法的优选实施方式中，保持CP和LP提供的免疫，同时选择性地抑制AP。因此，在各种实施方式中，用于本文描述的方法的抗备解素抗体不抑制CP和LP。在某些实施方式中，本文描述的抗备解素抗体与先前开发的抑制AP和CP的抗备解素抗体不同。
[0108]因为C3自然水解形成C3 (H20)，所以认为AP以低水平组成性地有活性。C3 (H20)表现得象C3b，它可与fB联合，这使fB易受fD分裂和激活的影响。生成的C3 (H20) Bb然后分裂C3，产生C3b和C3a，从而通过形成AP的C3转变酶——C3bBb——启动AP级联。随着最初的C3转变酶产生渐增量的C3b，建立放大环路。应当注意，因为CP和LP也产生C3b，其中C3b可结合因子B和参与AP，所以一旦这些途径被激活，AP放大环路也参与CP和LP。因此，AP由两个功能实体组成:与CP或LP无关的独立的补体激活途径以及确实参与和促进CP和LP的完全表现(manifestation)的放大过程。在一个实施方式中，用于本文描述的方法的抗备解素抗体选择性地抑制AP激活过程，并且不干扰CP和LP的AP放大环路。
[0109]备解素在结构上由N-端结构域和六个血小板反应蛋白I型重复(TSR)结构域组成。在生理条件下，它作为环状聚合物(二聚体、三聚体、四聚体)存在于血浆中，通过单体的头尾联合而形成。人备解素在X染色体的短臂上编码，其缺乏，尤其当与C2、MBL或IgG2缺乏组合时，构成致命的奈瑟球菌感染的危险因子。
[0110]似乎在AP启动中对备解素的需要是可变的并且依赖于激活表面的性质。作为非限制的实例，备解素似乎对LPS-和LOS引起的AP激活以及对AP-介导的自体组织损伤如Crry-缺乏小鼠红细胞的血 管外溶血是必不可少的(参见美国专利申请号2010/0263061)。本文描述的发明公开了备解素对在fH和DAF功能失调/阻断的背景下人AP补体介导的红细胞裂解是必要的(图3)。本文描述的发明还公开了备解素对PNH红细胞的自体血清裂解是必要的(图24)。另一方面，酵母多糖引起的AP激活被备解素缺乏适度地损害，并且备解素似乎没有在CVF-和CP-触发的AP放大中起重要作用(参见美国专利申请号2010/0263061)。给定表面上的AP激活可代表通过C3bBb稳定的备解素依赖的促进和C3‘空转’的因子H(fH)依赖的抑制之间的平衡。AP激活剂一备解素对其不是必要的一可以与fH具有有限的相互作用，作为缺少足够的fH-依赖的抑制的结果，自发的C3激活和放大可作为省缺过程发生，无需备解素的辅助。因此，在本文描述的发明的各种实施方式中，通过本发明的抗备解素抗体的备解素功能的抑制提供几个优势，包括:它不危害CP和LP的AP放大环路，使这些途径对宿主防御是完全有活性的；它没有完全消除AP补体激活，因为不是所有的AP激活剂(即病原体)需要备解素来触发该途径，当与AP抑制如抗fB和抗fD抗体的其它方法相比时，这减少宿主防御中损害的程度。
[0111]在一个实施方式中，利用发明的方法抑制的AP活性是选自以下的至少一种引起的AP激活:脂多糖(LPS)、脂寡糖(LOS)、病原体-相关分子模式(PAMPs)和危险-相关的分子模式(DAMPs)。在另一个实施方式中，利用发明的方法抑制的AP活性是C3bBb蛋白复合物的产生。在另一个实施方式中，利用发明的方法抑制的AP活性是备解素依赖的。
[0112]在一些实施方式中，本发明的方法保持个体通过CP和LP抗击感染的能力。在一个实施方式中，本发明是抑制个体中由细菌脂寡糖(LOS)引起的AP激活的方法，包括以下步骤:给所述个体施用抗备解素抗体；和由此抑制个体中细菌LOS引起的AP激活。在另一个实施方式中，本文提供抑制由细菌LPS引起的AP激活的方法。在某些实施方式中，AP激活由伤寒沙门氏菌(S.typhosa) LPS引起，并且用于本文提供的方法的抑制剂不抑制由明尼苏达沙门氏菌(S.minneSota)LPS或大肠杆菌(E.coli)LPS引起的AP活性。在各种实施方式中，本发明的抗备解素抗体选择性地抑制AP，但是不抑制CP-触发的补体激活、LP-触发的补体激活、酵母多糖-引起的激活、或眼镜蛇毒因子-引起的激活。 [0113]在一个实施方式中，本文提供抑制个体中病原体-相关分子模式-介导的AP激活的方法，包括以下步骤:给所述个体施用抗备解素抗体，由此抑制个体中PAMP-介导的AP激活。PAMPs—其AP激活可通过本发明方法抑制一的实例包括，但不限于，胞壁酰二肽(MDP)、来自细菌DNA的CpG基序、双链病毒RNAs、肽聚糖、脂磷壁酸质、来自伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的外表面蛋白A、合成的支原体巨卩遼细胞-激活脂蛋白-2、三棕榈酰-半胱氨酰-丝氨酰-(Iysyl) 3-赖氨酸(P3CSK4)、二棕榈酰-CSK4 (P2-CSK4)、单棕榈酰-CSK4 (PCSK4)、两性霉素B、三酰化或二酰化细菌多肽、和其组合。
[0114]在一个实施方式中，本发明是抑制个体中AP激活启动的方法，包括以下步骤:给所述个体施用抗备解素抗体，由此抑制个体中AP激活的启动。在另一个实施方式中，本文提供抑制个体中AP激活放大的方法，包括以下步骤:给所述个体施用AP的抑制剂，由此抑制个体中AP激活的放大。这些实施方式的实例是遭受AP补体-介导的溶血的PNH患者和遭受AP补体-介导的aHUS、哮喘、缺血/再灌注损伤、风湿性关节炎和ANCA-介导的肾疾病的个体。在本发明各种实施方式中，可利用本发明的组合物和方法治疗的疾病和病症包括，但不限于，AP补体-介导的溶血、AP补体-介导的aHUS、哮喘、缺血/再灌注损伤、风湿性关节炎和ANCA-介导的肾疾病。
[0115]在各种实施方式中，本文提供识别对AP具有抑制效应的潜在的抗体的方法，包括以下步骤:a)给个体施用抗备解素抗体；b)测量产生的个体表型；和c)将产生的个体表型与备解素+敲除动物的表型(参见美国专利申请号2010/0263061)进行比较。在另一个实施方式中，用于本文提供的方法的抗备解素抗体利用备解素+敲除动物通过选择潜在的治疗化合物的方法而被识别(参见美国专利申请号2010/0263061)。
[0116]在多种其它实施方式中，本文提供识别对AP具有抑制效应的潜在的抗备解素抗体的方法。一个这样的方法包括以下步骤:a)用脂多糖(LPS)包被板；b)洗涤板以去除未结合的LPS ；c)加入磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的牛血清白蛋白(BSA) ；d)洗涤板以去除未结合的BSA ；e)加入混合入人血清的候选抗备解素抗体化合物的混合物；f)洗涤板；g)加入抗人C3抗体；h)洗涤板以去除未结合的抗体；i)加入TMB底物试剂；j)加入硫酸以终止反应；k)测量在450nm的光密度；1)将含有候选抗备解素抗体化合物的板的光密度与阳性比较对照和阴性比较对照的光密度进行比较；其中当与阳性比较对照相比光密度减少时，抗备解素抗体被识别。
[0117]抗备解素抗体
[0118]在一些实施方式中，本发明包括组合物——包括特异地结合备解素的抗体。在一个实施方式中，抗备解素抗体是多克隆抗体。在另一个实施方式中，抗备解素抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，抗备解素抗体是嵌合抗体。在进一步的实施方式中，抗备解素抗体是人源化抗体。在优选实施方式中，备解素是人备解素。
[0119]在一个实施方式中，抗备解素抗体包括至少一个选自以下的⑶Rs =VH-OTRl =SEQID NO:3 ；VH-CDR2:SEQ ID N0:4 ;VH_CDR3:SEQ ID NO:5 ;VL_CDR1:SEQ ID NO:8 ；VL-CDR2:SEQ ID N0:9 ;和VL-CDR3:SEQ ID N0:10o在另一个实施方式中，抗备解素抗体包括所有以下的 CDRs:VH-CDRl:SEQ ID NO:3 ；VH-CDR2:SEQ ID NO:4 ；VH-CDR3:SEQ ID NO:5 ；VL-CDRl:SEQ ID NO:8 ;VL_CDR2:SEQ ID NO:9 ;和 VL-CDR3:SEQ ID NO: 10。
[0120]在一些实施方式中，抗备解素抗体包括重链——包括SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。在其它实施方式中，抗备解素抗体包括轻链——包括SEQ ID N0:7的氨基酸序列。在另一个实施方式中，抗备解素抗体是称作mAbl9.1的单克隆抗体。称作mAbl9.1的单克隆抗备解素抗体包括重链——包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列——和轻链——包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方式中，称作mAbl9.1的单克隆抗备解素抗体被人源化。
[0121]在一些实施方式中，本发明的抗备解素抗体结合包括TSR5 (SEQ ID NO: 60)的至少一个氨基酸的表位。在一些实施方式中，本发明的抗备解素抗体特异地结合包括氨基酸序列 RGRTCRGRKFDGHRCAGQQQDIRHCYSIQHCP(SEQ ID NO:52)的至少一个氨基酸的表位。在一些实施方式中，特异地结合包括SEQ ID NO: 52的至少一个氨基酸的表位的抗备解素抗体是称作mAb 19.1的mAb。在一些实施方式中，抗备解素抗体是与称作mAb 19.1的抗体竞争结合的抗体。在各种实施方式中，本发明的抗体可结合的表位是线性表位或构象表位。
[0122]在一个实施方式中，抗备解素抗体包括至少一个选自以下的⑶Rs =VH-OTRl =SEQID N0:13 ;VH-CDR2: SEQ ID NO: 14 ;VH_CDR3:SEQ ID NO: 15 ;VL_CDR1:SEQ ID NO: 18 ；VL-CDR2:SEQ ID NO: 19 ;和VL-CDR3:SEQ ID N0:20。在另一个实施方式中，抗备解素抗体包括所有以下的 CDRs:VH-CDRl:SEQ ID NO: 13 ;VH_CDR2:SEQ ID NO: 14 ;VH_CDR3:SEQ IDNO: 15 ;VL-CDRl:SEQ ID NO: 18 ;VL_CDR2:SEQ ID NO: 19 ;和 VL-CDR3:SEQ ID N0:20。
[0123]在一些实施方式中，抗备解素抗体包括重链——包括SEQ ID N0:12的氨基酸序列。在其它实施方式中，抗备解素抗体包括轻链一包括SEQ ID NO: 17的氨基酸序列。在另一个实施方式中，抗备解素抗体是称作mAb25的单克隆抗体。称作mAb25的单克隆抗备解素抗体包括重链——包括SEQ ID NO: 12的氨基酸序列——和轻链——包括SEQ ID NO: 17的氨基酸序列。在一些实施方式中，称作mAb25的单克隆抗备解素抗体被人源化。
[0124]在一些实施方式中，本发明的抗备解素抗体结合包括TSR5 (SEQ ID NO: 60)和/或TSR6 (SEQ ID NO: 61)的至少一个氨基酸的表位。在一些实施方式中，本发明的抗备解素抗体特异地结合包括氨基酸序列LVVEEKRPCLHVPACKDPEEEEL(SEQ ID NO:53)的至少一个氨基酸的表位。在一些实施方式中，本发明的抗备解素抗体特异地结合包括存在于SEQ IDNO:61的半胱氨酸62(C62)的表位。在一些实施方式中，本发明的抗备解素抗体特异地结合包括存在于SEQ ID NO: 53的半胱氨酸78 (C78)的表位。在一些实施方式中，特异结合包括SEQ ID NO:53的氨基酸的表位的抗备解素抗体是称作mAb25的mAb。在一些实施方式中，抗备解素抗体是与称作mAb25的抗体竞争结合的抗体。在各种实施方式中，本发明的抗体可结合的表位是线性表位或构象表位。
[0125]在一个实施方式中，抗备解素抗体包括至少一个选自以下的⑶Rs =VH-OTRl =SEQID N0:23 ;VH-CDR2:SEQ ID NO: 24 ;VH_CDR3:SEQ ID NO: 25 ;VL_CDR1:SEQ ID NO: 28 ；VL-CDR2:SEQ ID NO:29 ;和VL-CDR3:SEQ ID N0:30。在另一个实施方式中，抗备解素抗体包括所有以下的 CDRs:VH-CDR1:SEQ ID NO:23 ；VH-CDR2:SEQ ID NO:24 ；VH-CDR3:SEQ IDNO:25 ;VL-CDRl:SEQ ID NO:28 ;VL_CDR2:SEQ ID NO:29 ;和 VL-CDR3:SEQ ID NO:30。
[0126]在一些实施方式中，抗备解素抗体包括重链——包括SEQ ID N0:22的氨基酸序列。在其它实施方式中，抗备解素抗体包括轻链一包括SEQ ID NO: 27的氨基酸序列。在另一个实施方式中，抗备解素抗体是称作mAb22.1的单克隆抗体。称作mAb22.1的单克隆抗备解素抗体包括重链——包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列——和轻链——包括SEQ IDNO:27的氨基酸序列。在其它实施方式中，抗备解素抗体是与称作mAb22.1的抗体竞争结合的抗体。在一些实施方式中，称作mAb22.1的单克隆抗备解素抗体被人源化。
[0127]在一个实施方式中，抗备解素抗体包括至少一个选自以下的⑶Rs =VH-OTRl =SEQID N0:33 ;VH-CDR2:SEQ ID NO: 34 ;VH_CDR3:SEQ ID NO: 35 ;VL_CDR1:SEQ ID NO: 38 ；VL-CDR2:SEQ ID NO:39 ;和VL-CDR3:SEQ ID N0:40。在另一个实施方式中，抗备解素抗体包括所有以下的 CDRs:VH-CDRl:SEQ ID NO:33 ;VH_CDR2:SEQ ID NO:34 ;VH_CDR3:SEQ IDNO:35 ;VL-CDRl:SEQ ID NO:38 ;VL_CDR2:SEQ ID NO:39 ;和 VL-CDR3:SEQ ID NO:40。
[0128]在一些实施方式中，抗备解素抗体包括重链——包括SEQ ID N0:32的氨基酸序列。在其它实施方式中，抗备解素抗体包括轻链一包括SEQ ID NO: 37的氨基酸序列。在另一个实施方式中，抗备解素抗体是称作mAb30的单克隆抗体。称作mAb30的单克隆抗备解素抗体包括重链——包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列——和轻链——包括SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在其它实施方式中，抗备解素抗体是与称作mAb30的抗体竞争结合的抗体。在一些实施方式中，称作mAb30的单克隆抗备解素抗体被人源化。
[0129]在其它实施方式中，抗备解素抗体包括人源化重链——包括SEQ ID N0:42的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗备解素抗体包括人源化重链——包括SEQ ID N0:44的氨基酸序列。仍在其它实施方式中，抗备解素抗体包括人源化轻链一包括SEQ ID N0:47的氨 基酸序列。在一些实施方式中，抗备解素抗体包括人源化抗体，其包括重链-包括SEQ ID
N0:42的氨基酸序列——和轻链——包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列。在其它实施方式中，抗备解素抗体包括人源化抗体,其包括重链——包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列——和轻链——包括SEQ ID N0:47的氨基酸序列。在进一步的实施方式中，抗备解素抗体是与本文描述的人源化抗体竞争结合的抗体。
[0130]在一些实施方式中，抗备解素抗体包括人源化重链——包括SEQ ID N0:49的氨基酸序列。在其它实施方式中，抗备解素抗体包括人源化轻链——包括SEQ ID N0:51的氨基
酸序列。在一些实施方式中，抗备解素抗体包括人源化抗体，其包括重链-包括SEQ ID
N0:49的氨基酸序列——和轻链——包括SEQ ID NO: 51的氨基酸序列。在进一步的实施方式中，抗备解素抗体是与本文描述的人源化抗体竞争结合的抗体。
[0131]在一些实施方式中，抗备解素抗体包括嵌合重链——包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列和人重链恒定区，如，作为非限制的实例，人IgG4恒定区——包括SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在其它实施方式中，抗备解素抗体包括嵌合轻链——包括SEQ ID N0:7的氨基酸序列和人轻链恒定区，如，作为非限制的实例，人K轻链恒定区——包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列。在某个实施方式中，抗备解素抗体包括嵌合重链——包括SEQ ID NO:2和SEQ ID N0:63的氨基酸序列——和嵌合轻链——包括SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:64的氨
基酸序列。
[0132]在一些实施方式中，抗备解素抗体包括嵌合重链——包括SEQ ID NO: 12的氨基酸序列和人重链恒定区，如，作为非限制的实例，人IgG4恒定区——包括SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在其它实施方式中，抗备解素抗体包括嵌合轻链——包括SEQ ID NO: 17的氨基酸序列和人轻链恒定区，如，作为非限制的实例，人K轻链恒定区——包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列。在某个实施方式中，抗备解素抗体包括嵌合重链——包括SEQ ID NO: 12和SEQ ID N0:63的氨基酸序列——和嵌合轻链——包括SEQ ID NO: 17和SEQ ID N0:64的氨基酸序列。
[0133]在一些实施方式中，抗备解素抗体包括嵌合重链——包括SEQ ID NO: 22的氨基酸序列和人重链恒定区，如，作为非限制性实例，人IgG4恒定区——包括SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在其它实施方式中，抗备解素抗体包括嵌合轻链——包括SEQ ID N0:27的氨基酸序列和人轻链恒定区，如，作为非限制的实例，人K轻链恒定区——包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列。在某个实施方式中，抗备解素抗体包括嵌合重链——包括SEQ ID NO: 22和SEQ ID N0:63的氨基酸序列——和嵌合轻链——包括SEQ ID N0:27和SEQ ID N0:64的氨基酸序列。
[0134]在一些实施方式中，抗备解素抗体包括嵌合重链——包括SEQ ID NO: 32的氨基酸序列和人重链恒定区，如，作为非限制的实例，人IgG4恒定区——包括SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在其它实施方式中，抗备解素抗体包括嵌合轻链——包括SEQ ID N0:37的氨基酸序列和人轻链恒定区，如，作为非限制的实例，人K轻链恒定区——包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列。在某个实施方式中，抗备解素抗体包括嵌合重链——包括SEQ ID NO: 32和SEQ ID N0:63的氨基酸·序列——和嵌合轻链——包括SEQ ID N0:37和SEQ ID N0:64的氨基酸序列。
[0135]筛诜试齡
[0136]本发明在多种筛选试验中具有应用，包括，测定候选抗备解素抗体是否能抑制AP。
[0137]在一些实施方式中，将在存在候选抗备解素抗体的情况下AP活性水平与阳性比较对照中检测的AP活性进行比较。阳性比较对照包括在没有加入的测试化合物情况下的AP激活。在一些实施方式中，当在存在候选抗备解素抗体的情况下AP活性小于约70%的阳性比较对照中检测的AP活性时，候选抗备解素抗体被鉴定为AP抑制剂；这与在存在测试化合物的情况下大于约30%的AP活性抑制相对应。在其它实施方式中，当在存在候选抗备解素抗体的情况下AP活性小于约80%的阳性比较对照中检测的AP活性时，候选抗备解素抗体被鉴定为AP抑制剂；这与在存在测试化合物的情况下大于约20%的AP活性抑制相对应。仍在其它实施方式中，当在存在候选抗备解素抗体的情况下AP活性小于约90%的阳性比较对照中检测的AP活性时，候选抗备解素抗体被鉴定为AP抑制剂；这与在存在测试化合物的情况下大于约10%的AP活性抑制相对应。在一些实施方式中，将候选抗备解素抗体的AP抑制的水平与阴性比较对照中检测的抑制水平进行比较。
[0138]许多种免疫测定形式，包括竞争性和非竞争性免疫测定形式、抗原捕获试验、双抗体夹心试验和三抗体夹心试验，都是本发明的有用方法(Self et al., 1996, Curr.0pin.Biotechnol.7:60-65)。本发明不应被解释为受限于任何一种类型的已知或迄今为止的未知试验，只要该试验能检测AP抑制。
[0139]溶血试验包括在本发明的方法中。在各种实施方式中，红细胞(RBCs)获自正常(健康)个体或获自显示疾病或病症的体征或症状如，例如，PNH的个体。在各种实施方式中，将RBCs在存在重组fH片段——包括fH的补体对照蛋白(CCP)重复19和20(fH19-20，5-50 μ Μ)——和抗DAF中和抗体(3-20 μ g/ml)的情况下用5%至75%正常人血清(NHS)裂解。在一些实施方式中，将来自显示疾病或病症的体征或症状如PNH的个体的RBCs用酸化血清裂解。在一些实施方式中，溶血试验在GVB++-Mg++-EGTA缓冲液中进行以只允许AP补体激活，但是技术人员将理解可使用其它合适的缓冲液，只要缓冲液只允许AP补体激活。在一个实施方式中，裂解的程度通过测量温育混合物上清液的0D410来计算，作为血红蛋白释放进溶液的测量。在各种实施方式中，以约I μ g/ml至约50 μ g/ml的浓度，加入至少一种抗备解素抗体，并与血清预温育，测量和RBCs溶血抑制的程度。
[0140]酶联免疫吸附试验(ELISAs)用于本发明的方法。酶如，但不限于，辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或尿素酶可被连接到，例如，抗C3抗体或第二抗体，用于本发明的方法。辣根过氧化物酶检测系统可以，例如，与生色底物四甲基联苯胺(TMB) 一起使用，其在过氧化氢存在的情况下产生在450nm可检测的可溶产物。其它方便的酶联系统包括，例如，碱性磷酸酶检测系统，其可以与生色底物P-硝基苯基磷酸盐一起使用，产生在405nm容易检测的可溶产物。相似地，β _半乳糖苷酶检测系统可以与生色底物O-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(galactopyranoside) (ONPG) 一起使用，产生在410nm可检测的可溶产物。可选地，尿素酶检测系统可与底物如尿素-溴甲酚紫(SigmaImmunochemicals, St.Louis, MO) 一起使用。有用的酶联初级和第二抗体可获自任何数目的商业来源。 [0141]化学发光检测也用于检测AP抑制。化学发光的第二抗体可获自任何数目的商业来源。
[0142]荧光检测也用于检测AP抑制。有用的荧光染料包括，但不限于，DAP1、荧光素、Hoechst33258、R-藻青蛋白、B-藻青蛋白、R-藻红蛋白、罗丹明、德克萨斯红和丽丝胺_突光素-或罗丹明标记的抗体。
[0143]放射免疫测定(RIAs)也用于本发明的方法。这样的测定在本领域是中众周知的并由例如 Brophy 等人(1990, Biochem.Biophys.Res.Comm.167:898-903)和 Guechot 等人(1996，Clin.Chem.42:558-563)描述。放射免疫测定，例如，利用碘-125-标记的初级抗体或第二抗体进行(Harlow et al.，见前，1999)。
[0144]分析从可检测的抗体发出的信号，例如，利用分光光度计检测来自生色底物的颜色；利用辐射计数器检测辐射，如Y计数器用于碘-125的检测；或利用荧光计在存在某个波长的光的情况下检测荧光。使用酶联测定时，利用分光光度计进行定量分析。应当理解，本发明的测定可手动进行，或者，如果期望，可自动化，从多个样品发出的信号可同时在许多商业上可得的系统中检测。
[0145]本发明的方法还包括基于毛细管电泳的免疫测定(CEIA)的使用，如果期望，其可自动化。免疫测定还可以与激光引起的荧光一起使用，如，例如，Schmalzing等人(1997，Electrophoresis18:2184-2193)和 Bao (1997, J.Chromatogr.B.Biomed.Sc1.699:463-480)所描述的。根据本发明的方法，也可使用脂质体免疫测定，如流动注射脂质体免疫测定和脂质体免疫传感器(Rongen et al., 1997, J.1mmunol.Methods204:105-133)。白
[0146]定量的蛋白质印迹也可用于测定本发明方法中的AP抑制的水平。蛋质印迹利用众所周知的方法如扫描光密度测定法来定量(Parra et al.，1998，J.Vase.Surg.28:669-675)。
[0147]施用方法
[0148]本发明的方法包括将治疗有效量的至少一种抗备解素抗体施用给被确定为具有AP-介导的病理的个体。在优选实施方式中，个体是具有AP系统的哺乳动物。在更优选的实施方式中，个体是人。
[0149]本发明的方法可包括施用至少一种本文描述的抗备解素抗体的任一种，但是本发明应决不被解释为受限于本文描述的抗备解素抗体，而是应被解释为包括减小或降低AP激活的任何抗备解素抗体——已知和未知的。
[0150]本发明的方法包括给个体施用治疗有效量的至少一种抗备解素抗体，其中包括抗备解素抗体或其组合的本发明的组合物单独使用或与其它治疗剂组合使用。本发明可与其它治疗形式，如，例如抗炎治疗等组合使用。可与本发明的方法组合使用的抗炎治疗的实例包括，例如，利用甾体药物的治疗，以及利用非甾体药物的治疗。
[0151]药物组合物和治疗
[0152]本发明的治疗方法中抗备解素抗体的施用可以利用本领域已知的方法以多种不同方式实现。本发明的治疗和预防方法因此包括药物组合物——包括抗备解素抗体——的使用。用于实施本发明的药物组合物可被施用以递送lng/kg/天和100mg/kg/天之间的剂量。在一个实施方式中，本发明预想施用导致个体中I μ M和10 μ M之间的本发明抗备解素抗体浓度的剂量。在另一个实施方式中，本发明预想施用导致个体血浆中I μ M和ΙΟμΜ之间的本发明抗备解素抗体浓度的剂量。
[0153]通常，可在本发明的方法中施用给动物，优选人的剂量是每千克动物体重0.5yg至约50mg。而施用的精确剂量将取决于任何数目的因素而变化，该因素包括但不限于，动物种类和正被治疗的疾病状态类型、动物年龄和施用途径。优选，化合物的剂量将在每千克动物体重约I μ g至约IOmg之间变化。更优选，剂量将在每千克动物体重约3 μ g至约Img之间变化。
[0154]化合物可频繁地一天几次施用给动物，或其可不太频繁地施用，如一天一次、一周一次、每两周一次、一月一次或甚至更不频繁，如每几个月一次或甚至一年一次或更不频繁。剂量频率对技术人员来说将是明显的并且取决于任何数目的因素，如，但不限于，正被治疗的疾病种类和严重性、动物种类和年龄等。本文描述的药物组合物制剂可通过药理学领域中已知或将来开发的任何方法来制备。一般而言，这样的制备方法包括以下步骤:使有效成分与载体或一种或多种其它助剂结合，然后，如果需要或期望，使产物成型或包装进期望的单剂量单位或多剂量单位。
[0155]虽然本文提供的药物组合物的描述主要涉及适合伦理上施用给人的药物组合物，但是技术人员将 理解，这样的组合物通常适合施用给所有种类的动物。充分理解的是，修饰适合施用给人的药物组合物以使组合物适合施用给各种动物，并且熟练的兽医药理学家可以利用，如果有的话，仅仅普通的实验来设计和进行这样的修饰。本发明的药物组合物的施用考虑的个体包括，但不限于，人和其它灵长类、哺乳动物——包括商业上相关的哺乳动物如非人灵长类、牛、猪、马、绵羊、猫和狗。
[0156]用于本发明的方法的药物组合物可以以适合以下施用途径的制剂进行制备、包装或出售:眼的、□的、直肠的、阴道的、肠胃外的、局部的、肺的、鼻内的、颊的施用途径。其它考虑的制剂包括设计的纳米颗粒、脂质体制剂、含有有效成分的重新包封的红细胞、和基于免疫的制剂。
[0157]本发明的药物组合物可以以大量、作为单一单位剂量、或作为多个单一单位剂量而被制备、包装或出售。单位剂量是包括预定量的有效成分的药物组合物的个别量。有效成分的量通常等于将施用给个体的有效成分的剂量或这样的剂量的方便的部分如，例如，这样的剂量的一半或三分之一。
[0158]本发明的药物组合物的有效成分的相对量、药学可接受的载体和任何另外成分将根据治疗的个体的特征、大小和状况，并进一步根据组合物将被施用的途径而变化。作为实例，组合物可包括0.1%和100% (w/w)之间的有效成分。
[0159]除了有效成分，本发明的药物组合物可进一步包括一种或多种另外的药学上有活性的药剂。
[0160]本发明的药物组合物的受控或持续释放的制剂可利用常规技术制备。
[0161]药物组合物的肠胃外施用包括任何施用途径，其特征在于物理破坏个体组织和通过组织中的裂口施用药物组合物。肠胃外施用因此包括，但不限于，通过注射组合物的药物组合物施用、通过外科切口的组合物施用、通过非外科创伤的组织穿透的组合物施用等。特别地，考虑肠胃外施用包括，但 是不限于静脉内、眼内、玻璃体内、皮下、腹膜内、肌肉内、胸骨内注射、和瘤内。
[0162]适合肠胃外施用的药物组合物制剂包括与药学上可接受的载体，如无菌水或无菌等渗盐水组合的有效成分。这样的制剂可以适合推注施用或连续施用的形式被制备、包装或出售。可注射的制剂可以以单位剂量形式，如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中被制备、包装或出售。肠胃外施用的制剂包括，但不限于，悬浮液、溶液、油状或水性载体中的乳剂、糊剂、和可植入的持续释放或可生物降解的制剂。这样的制剂可进一步包括一种或多种另外的成分，其包括，但不限于，悬浮剂、稳定剂、或分散剂。在肠胃外施用的制剂的一个实施方式中，有效成分以干燥(即粉末或粒状)形式提供用于在重构组合物的肠胃外施用之前用合适的载体(例如无菌无热原的水)进行重构。
[0163]药物组合物可以以无菌可注射的水性或油状悬浮液或溶液的形式被制备、包装或出售。该悬浮液或溶液可根据已知技术配制，并可包括，除有效成分外的另外成分，如本文描述的分散剂、润湿剂或悬浮剂。这样的无菌可注射的制剂可利用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂，如，例如水或1，3-丁二醇而制备。其它可接受的稀释剂和溶剂包括，但不限于，林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和不挥发性油如合成的甘油一酯或甘油二酯。其它有用的肠胃外可施用的制剂包括这样的那些制剂，其包括脂质体制剂中微晶形式的有效成分，或作为可生物降解的聚合物系统的组分。用于持续释放或植入的组合物可包括药学上可接受的聚合或疏水材料如乳剂、离子交换树脂、略溶的聚合物或略溶的盐。
[0164]本发明的药物组合物可以以适合经口腔而肺部施用的制剂进行制备、包装或出售。这样的制剂可包括干燥颗粒，其包括有效成分并且其具有约0.5至约7纳米和优选约I至约6纳米范围内的直径。这样的组合物方便利用装置——包括推进剂流可被引导到的干粉储存器以分散粉末一或利用自推进溶剂/粉末分散容器如包含溶解或悬浮于密封容器内低沸腾推进剂中有效成分的装置以干粉形式施用。优选，这样的粉末包括颗粒，其中至少按重量计98%的颗粒具有大于0.5纳米的直径，至少按数量计95%的颗粒具有小于7纳米的直径。更优选，至少按重量计95%的颗粒具有大于I纳米的直径，至少按数量计90%的颗粒具有小于6纳米的直径。干粉组合物优选包括固态细粉稀释剂如糖并方便地以单位剂量形式提供。
[0165]低沸腾推进剂通常包括液体推进剂——在大气压下具有低于65° F的沸点。通常，推进剂可组成组合物的50至99.9%(w/w)，有效成分可组成组合物的0.1至20%(w/w)。推进剂可进一步包括另外的成分如液体非离子或固体阴离子表面活性剂或固体稀释剂(优选具有与包括有效成分的颗粒相同级的粒度)。
[0166]配制的用于肺部递送的本发明的药物组合物还可提供溶液或悬浮液微滴形式的有效成分。这样的制剂可作为水性或稀释的醇溶液或悬浮液——任选地无菌的，包括有效成分——而被制备、包装或出售，并可方便地利用任何喷雾或雾化装置施用。这样的制剂可进一步包括一种或多种另外的成分——包括，但不限于，调味剂如糖精钠、挥发油、缓冲剂、表面活性剂、或防腐剂如羟苯甲酯。该施用途径提供的微滴优选具有约0.1至约200纳米范围内的平均直径。
[0167]用于肺部递送的本文描述的制剂还用于本发明的药物组合物的鼻内递送。
[0168]另一适合鼻内施用的制剂是粗粉末，其包括有效成分并具有约0.2至500微米的平均颗粒。这样的制剂以粉末吸剂(snuff)采用的方式施用，即，通过鼻道从接近鼻孔拿着的粉末容器快速吸入。
[0169]适合鼻施用的制剂可,例如，包括约小至0.l%(w/w)和多至100%(w/w)的有效成分，并可进一步包括一种或多种本文描述的另外的成分。
[0170]本发明的药物组合 物可以以适合口腔施用的制剂而被制备、包装或出售。这样的制剂可以，例如，是以利用常规方法制备的片剂或锭剂的形式，并可具有，例如，0.1至20%(w/w)有效成分，余量包括经口可溶解或可降解的组合物和，任选地，一种或多种本文描述的另外成分。可选地，适合口腔施用的制剂可包括含有效成分粉末或雾化溶液或悬浮液。当分散时，这样的粉末状、雾化(aerosolized)或雾化(aerosolized)制剂优选具有约0.1至约200纳米范围内的平均颗粒或微滴大小，并可进一步包括一种或多种本文描述的另外的成分。
[0171]如本文所用，“另外的成分”包括，但不限于，以下一种或多种:赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；粒化和崩解剂；粘合剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂;防腐剂；生理学上可降解的组合物如明胶；水性载体和溶剂；油状载体和溶剂；悬浮剂；分散或润湿剂；乳化剂、缓和剂；缓冲剂；盐；增稠剂；填充剂；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；和药学可接受的聚合或疏水材料。可包括在本发明的药物组合物中的其它“另外的成分”在本领域已知被，例如在Remington’s PharmaceuticalSciences (1985, Genaro, ed., Mack Publishing C0., Easton, PA)中被描述，其通过引用被并入本文。
[0172]人备解素小鼠
[0173]本发明还包括转基因小鼠，其表达人备解素而不表达小鼠备解素。为了建立转基因小鼠，可将编码人备解素蛋白的核酸掺入以适合人备解素蛋白在宿主细胞中表达的形式的重组表达载体。术语“以适合在宿主细胞中表达融合蛋白的形式”意欲指这样的重组表达载体，其包括一种或多种调节序列一其以允许核酸转录成mRNA和mRNA翻译成人备解素蛋白的方式可操作地连接到编码人备解素蛋白的核酸。术语“调节序列”是本领域所承认的并意欲包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调节序列是本领域技术人员已知的并在1990，Goeddel, Gene Expression Technology:Methodsin Enzymologyl85, Academic Press, San Diego, Calif 中被描述。应当理解,表达载体的设计可取决于象将被转染的宿主细胞的选择和/或待表达人备解素蛋白的量这样的因素。
[0174]转基因小鼠可如下产生，例如，通过将编码人备解素蛋白的核酸(通常连接到适当的调节元件，如组成性或组织特异的增强子)引入卵母细胞，例如，通过显微注射，并允许卵母细胞在雌性养育小鼠中发育。内含子序列和多腺苷酸化信号也可包括在转基因中以提高转基因表达的效率。产生转基因动物，特别地动物如小鼠的方法已在本领域变得常规，并在，例如，美国专利号 4，736，866 和 4，870，009 和 1986，Hogan 等人，A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory 中被描述。转基因建立者小鼠可用于繁殖携带转基因的另外的动物。可将携带编码本发明的备解素蛋白的转基因的转基因小鼠进一步繁殖成携带其它转基因的其它转基因小鼠，或繁殖成其它敲除小鼠，例如，不表达鼠备解素基因的敲除小鼠，如美国专利申请号2010/0263061中描述的那些。应当理解，除了转基因小鼠，本文描述的系统可用于产生其它人备解素表达动物。
[0175]在一个实施方式中，本发明的转基因小鼠从具有CVM-1E增强子的鸡β-肌动蛋白启动子表达人备解素，但是技术人员将理解，本发明的转基因小鼠包括从其它启动子和增强子表达人备解素。用于本发明的启动子的实例包括，但不限于，DNA pol II启动子、PGK启动子、泛素启动子、白蛋白启动子、球蛋白启动子、卵清蛋白启动子、SV40早期启动子、鲁斯肉瘤病毒(RSV)启动子、反转录LTR和慢病毒LTR。用于本发明的启动子和增强子表达系统还包括可诱导的和/或组织特异的表达系统。
·[0176]在一些实施方式中，插入小鼠基因组的人备解素包括SEQ ID Ν0:67的核酸序列和SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
[0177]试剂盒
[0178]本发明还包括试剂盒，其包括本发明的抗备解素抗体、或其组合，和指导材料——其描述，例如，将抗备解素抗体或其组合施用给个体，作为如本文其它地方描述的治疗性治疗或非治疗应用。在一个实施方式中，该试剂盒进一步包括适合在将抗体施用给个体之前溶解或悬浮治疗组合物——包括例如，本发明的抗备解素抗体或其组合——的(优选无菌的)药学上可接受的载体。任选地，试剂盒包括施用抗体的涂药器。
[0179]实骀实施例
[0180]本发明现在参考下面的实施例描述。这些实施例仅为了说明的目的而提供，本发明应决不被解释为受限于这些实施例，而应被解释为包括由于本文提供的教导而变得明显的任何和全部改变。
[0181]无需进一步的描述，相信本领域技术人员利用先前的描述和下面的说明性实施例可制备和利用本发明的化合物和实施要求保护的方法。下面的工作实施例因此具体指出本发明的优选实施方式，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。[0182]实施例1
[0183]抗人备解素单克隆抗体利用Kohler et al.(1975，Nature, 256:495)首先描述的
杂交瘤方法-具有一些修改-而产生。将备解素敲除小鼠(fP+) (8周龄)用50 μ g(在
100 μ I PBS中)以100 μ I Titermax佐剂(来自Sigma)乳化的纯化人备解素(CompTechInc)腹膜内免疫。在14天和21天,将小鼠再次用50μ g以Titermax佐剂乳化的纯化的人备解素免疫。一周之后，检测小鼠血清抗备解素滴度。将具有1:10,000或更高的抗体滴度的小鼠用于杂交瘤融合实验。融合实验之前两天，对小鼠再次用50 μ g纯化的人备解素(在100 μ I PBS中)注射(1.P)。将小鼠通过颈脱位法处死，分离脾用于通过机械破碎制备单细胞悬浮液。将脾细胞悬浮液用HYB-SFM(Invitrogen)+10%FBS培养基洗涤一次，并将细胞计数，与X63-Ag8.653骨髓瘤细胞(ATCC)以2:1的比率混合。将细胞混合物再次用HYB-SFM培养基洗涤，并通过离心(1000rpmX5min)制备细胞沉淀物。将细胞沉淀物轻轻搅动和松散，然后通过缓慢加入聚乙二醇(PEG1500) (3X 108细胞，1.5ml PEG)引起细胞融合。将细胞置于37°C lmin，然后将20ml HYB-SFM培养基在3min内(第一分钟1ml，第二分钟3ml，第三分钟16ml)加入细胞。将混合物以1000rpm离心5min，并将细胞铺在24孔板HAT培养基(500ml HYB-SFM 培养基中 IOml HAT [Sigma H0262]、5ml 青霉素 / 链霉素、500 μ I 庆大霉素和10%FBS)中。2周之后,从具有可见克隆的孔中取上清液,用于通过ELISA筛选与纯化的人备解素的反应性。挑取阳性克隆并通过有限稀释法铺在96孔板中，通过ELISA进行第二轮筛选之后获得单克隆。将阳性克隆在HT-培养基(500ml HYB-SFM培养基中IOml HT、5ml青霉素/链霉素500 μ I庆大霉素和10%FBS)中扩大。抗体收集之前，将杂交瘤细胞转移到无血清培养基(HYB-SFM)持续2-3天。收集细胞培养物用于通过蛋白G亲和层析纯化mAb ο
[0184]为了克隆抗备解素mAbs的cDNAs,通过TRizol试剂(Sigma)从杂交瘤细胞分离总RNA。利用寡核苷酸(dT)引物通过反转录合成第一链cDNA。为了扩增重链cDNA (对于IgGl、IgG2a/b)，下面的引物用于 PCR 反应:5’ -GAGGTGAAGCTGGTGGAG (T/A) C (T/A) GG-3’ (SEQ IDNO:68)和 5’-GGGGCCAGTGGATAGAC-3’ (SEQ ID N0:69)。为了扩增 κ 轻链，使用下面的引物:4 个上游引物的混合物:5’-CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGACTCCA-3’ (SEQ ID NO:70)；5’-CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCA-3’ (SEQ ID NO:71) ;5’-CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA-3’ (SEQ ID NO:72) ; 5 ’-CCAGTTCCGAGCTCGTGATGACACAGTCTCCA-3’ (SEQ IDNO:73);下游引物:5’-GTTGGTGCAGCATCAGC-3’ (SEQ ID NO:74) ? 将 PCR 扩增子克隆进 pCRTOPO TA2.1载体(Invitrogen)并进行测序。为了获得mAbs的信号肽(前导)序列，利用来自Invitrogen的试剂盒(GeneRacer),使用5’-RACE方法。利用从5’-RACE和最初的测序数据确定的特异引物扩增完整的可变区cDNA。
[0185]实施例2
[0186]检测mAb 19.1、22.1、25和30对LPS引起的AP补体激活的剂量依赖性抑制。当以5 μ g/ml的终浓度加入到50%正常人血清(NHS)中时，所有4个mAbs克隆都有效地抑制AP补体激活(参见图2)。将ELISA板(96-孔，Nunc)用50 μ I LPS溶液(在磷酸盐缓冲盐水[PBS]中40 μ g/ml)包被在4°C过夜。第二天，将板用含有0.05%Tween_20的PBS (PBS-T)洗涤3次，并加入已与1-5 μ g/ml抗备解素mAb于4°C温育I小时的50 μ 150%正常人血清(NHS)。将 NHS 用 GVB-EGTA-Mg++(含有 IOmM EGTA 和 2.5mM Mg++ 终浓度)稀释。将板置于37°C温育I小时，用PBS-T洗涤3次，然后加入50 μ I HRP结合的山羊抗人C3抗体(1:4000, Cappel)，并将板置于室温I小时。将板用PBS-T洗涤3次，然后利用BD PharmingenΑ+Β试剂显影。用2Ν H2S045min之后反应终止。通过测量板上C3沉积的量检测(0D450)AP补体激活。加入EDTA的样品(NHSEDTA)充当阴性对照(EDTA阻断补体激活)。未加mAb的样品(OAb)充当基线AP补体激活。
[0187]实施例3
[0188]进行实验显示抗人备解素mAbs抑制由fH和DAF功能失调引起的人红细胞(RBC)裂解(参见图3)。将正常的人RBCs (5 X IO6细胞)与100 μ 150%NHS(用含有IOmM EGTA和2.5mM Mg++终浓度的GVB-EGTA-Mg++稀释)在存在30 μ M重组册9_20和7.5 μ g小鼠抗人 DAF(来自 AbD Serotec)的情况下于 37C 温育 20min(2006，Ferreira et al., JImmunol.177:6308-6316)。裂解反应通过加入200 μ I冰冷的PBS中的20mM EDTA而终止。将温育混合物以1500g离心5min，收集上清being测量0D420nm。加入RBC之前，将NHS与O或5 μ g/ml抗备解素抗体于4C预温育I小时。没有加入NHS或fH19_20，或加入EDTA的样品用作阴性裂解对照，用100 μ I蒸馏水完全裂解的RBCs样品用作阳性对照(100%裂解)，针对该阳性对照，将其它样品中的％裂解进行标准化。
[0189]实施例4
[0190]评价在缺少或存在5 μ g/ml抗备解素mAbs的情况下与50%正常人血清(NHS)温育的抗体-致敏的绵羊RBCs的实验(参见图4)。将抗体-致敏的绵羊RBCs (5 X IO6细胞，来自CompTech Inc)与100 μ 150%NHS (用GVB++缓冲液稀释)于37°C温育20min。在加入绵羊RBCs之前，将NHS与O或5 μ g/ml抗备解素抗体于4C预温育I小时。裂解反应通过加入200 μ I冰冷的PBS中的20mM EDTA而终止。将温育混合物以1500g离心5min，收集上清并测量0D420nm。没有加入NHS或加入EDTA的样品用作阴性裂解对照，用100 μ I蒸馏水完全裂解的绵羊RBCs样品用作阳性对照(100%裂解)，针对该阳性对照，将其它样品中的％裂解进行标准化。
[0191]实施例5
[0192]人备解素缺失突变体的产生和通过蛋白质印迹验证其在CHO细胞中的表达(参见图5)。人备解素(fP)由7个血小板反应蛋白重复(TSR)结构域组成，其被编号为O至6。利用pCMV载体(来自Origene)中全长人备解素cDNA (SEQ ID NO: 67)作为模板通过反转PCR使单个TSR结构域O 至 5(参见 SEQ ID NO:55、56、57、58、59 和 60)缺失(1989, Hemsley etal.,Nucleic Acid.5Res.17:6545)。为了缺失 TSR6 (SEQ ID N0:61)或 TSR5-6，利用正常 PCR方法，之后克隆进表达载体(使用pCAGGS载体)。利用Lipofectamine试剂(Invitrogen),在6孔板在Optimem培养基中将缺失突变体转染进CHO细胞。48小时之后，将细胞用含有150mM NaCl、10%甘油、ImM EDTA和蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和1%曲拉通(Triton)X-100 的 50mM Tris-HCL，ρΗ7.4 (250 μ I 每孔)裂解。将溶胞产物以 10，OOOrpm 离心 lOmin，蛋白浓度通过BCA蛋白测定方法来测定。来自每个样品的约100 μ g总蛋白用于SDS-PAGE分析。
[0193]实施例6
[0194]进行mAbl9.1和25结合人备解素缺失突变体的夹心ELISA测定，用于mAbl9.1和25的表位作图。(参见图6)。将ELISA板用50 μ 12 μ g/ml的有关mAb包被于4°C过夜。将板用PBS-T洗涤3次，然后将25 μ g (在50 μ I含有1%BSA的PBS中)CHO细胞裂解物蛋白加入孔中，并将板在室温温育I小时。将板用PBS-T洗涤3次，然后捕获的蛋白通过生物素化的山羊抗人备解素抗体和HRP-抗生物素蛋白系统检测。与19.1和25的不同表位结合的第三mAb29.3用作对照以验证突变蛋白表达。
[0195]实施例7
[0196]表位作图显示定位到TSR5的C-端一半的mAbl9.1的表位，具有下面的氨基酸序列:RGRTCRGRKFDGHRCAGQQQDIRHCYSIQHCP(SEQ ID NO:52)(参见图 7)。包括TSR0-4+1/4TSR5.TSR0-4+1/2TSR5 或 TSR0-4+3/4TSR5 的三种人备解素突变体通过常规 PCR产生。将它们克隆进PCAGGS并在CHO细胞中表达，如实施例5中所描述的。利用山羊抗人备解素抗体通过Western分析来验证蛋白表达。印迹被剥去并用小鼠抗His标签抗体(Qiagen)重新探测以证实C-端His标签存在(没有C-端蛋白水解)。如实施例6中所描述的，进行夹心ELISA测定以测定与mAbl9.1的反应性。与19.1不同的表位结合的mAb29.3用作对照以证实突变蛋白表达。 [0197]实施例8
[0198]表位作图显不定位到TSR6的C-端四分之一段的mAb25的表位具有下面的氨基酸序列:LVVEEKRPCLHVPACKDPEEEEL(SEQ ID NO:53)(参见图 8)。包括 TSR0-5+1/4TSR6、TSR0-5+1/2TSR6或TSR0-5+3/4TSR6的三种人备解素突变体通过常规PCR产生。将它们克隆进pCAGGS并在CHO细胞中表达，如实施例5中所描述的。利用山羊抗人备解素抗体通过Western分析来验证蛋白表达。将印迹剥去并用小鼠抗His标签抗体(Qiagen)重新探测以证实C-端His标签存在(没有C-端蛋白水解)。如实施例6中所描述的，进行夹心ELISA测定以测定与mAb25的反应性。与25不同的表位结合的mAbl9.1用作对照以证实突变蛋白表达。表位作图还显示mAb25的表位依赖于TSR6(SEQ ID N0:61，图5B所示)中两个半胱氨酸残基。这些是TSR6的半胱氨酸62(C62)和半胱氨酸78 (C78)。全长人备解素中C62或C78至丙氨酸(A)的单突变没有消除mAb25结合，但是C62A和C78A的双突变消除mAb25结合。作为突变蛋白表达的阳性对照，mAbl9.1显示对所有样品的反应性。该结果提示TSR6(具有SEQ ID NO: 53指定的序列)的最后四分之一段内的C78，以及位于SEQ IDN0:53外侧但是在TSR6(SEQ ID:61)内的C62构成mAb25的表位的两个关键残基。利用转染的CHO细胞匀浆在ELISA板上进行mAbsl9.1和25的结合测定。HuP指作为阳性对照的全长(完整的)人fP转染的CHO细胞；Con指作为结合的阴性对照的未转染CHO细胞。其它样品是用含有单个或双C62A和C78A突变的突变人fP cDNA转染的CHO细胞。
[0199]实施例9
[0200]进行实验评价CHO细胞中重组嵌合和人源化19.1mAbs的表达(参见图17)。利用EcoRI/Nhel位点通过将mAbl9.1可变区(SEQ ID NO:1)克隆进pFUSE_CHIg-hG4载体(来自InvivoGen，含有人IgG4重链恒定区，其中丝氨酸229突变成脯氨酸)来构建嵌合19.1重链cDNA。利用Agel/BsiWI位点，通过将mAbl9.1可变区(SEQ ID NO:6)克隆进pFUSE2_CLIg_hk载体(来自InvivoGen，含有人κ轻链恒定区)来构建嵌合19.1轻链cDNA。利用EcoRI/NheI位点，通过将19.1的人源化重链可变区(编码SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:44的cDNAs,由 Genescript 合成)克隆进 pFUSE_CHIg-hG4 载体(来自 InvivoGen,含有人 IgG4重链恒定区，其中丝氨酸229突变成脯氨酸)来构建人源化19.1重链cDNAs。利用AgeI/BsiWI位点，通过将19.1的人源化轻链可变区(cDNA编码SEQ ID NO:47，由Genescript合成)克隆pFUSE2-CLIg-hk载体(来自InvivoGen，含有人κ轻链恒定区)来构建人源化19.1轻链cDNA。利用脂质转染试剂(Lipofectamine reagent),用19.1的嵌合重链和轻链或19.1的人源化重链和轻链(两个人源化重链与相同的人源化轻链配对)共转染CHO细胞。转染之后，将CHO细胞用Geocine (lmg/ml)和灭痕素(Blastcidine) (10 μ g/ml)选择大约7天。挑取抗药的细胞集落，胰蛋白酶消化并在存在相同的选择药物的情况下在96孔板中进行有限稀释培养。细胞在96孔板中变得汇合之后，通过ELISA测试培养基与人备解素的反应性，并且扩大阳性克隆。为了抗体产生，将稳定转染的CHO细胞系在150cm培养瓶中在具有10%FBS的DMEM:F12培养基中生长，达到汇合之后，将它们转到无血清⑶-CHO培养基(Invitrogen)。3天之后,收集培养基并将mAbs通过蛋白G层析来纯化。纯化的mAbs的等分部分通过SDS-PAGE分析。
[0201]实施例10
[0202]进行实验测量mAb 19.1、嵌合 mAb 19.1、人源化 mAb 19.1、mAb25、mAb22.1和mAb30的抗原结合亲和性(参见图18和19)。利用BIAcore2000仪器(BiacoreAB, Uppsala, Sweden),使用表面等离子共振分析测量抗人备解素mAb与固定的人备解素结合的结合和解离速率常数。Biacore实验在25°C进行。CM4传感器芯片的羧化的葡聚糖基体用于通过胺偶联化学连接纯化的人备解素，获得200RU表面密度。将mAbs在HBSET (具有EDTA和Tween20的HEPES缓冲盐水)缓冲液中稀释成150,75,35.5、17.75,8.87和OnM，并将样品以30μ 1/π?η(60μ I注射)注射到备解素表面上持续120s，允许结合分析物的解离进行900s。数据通过BIA评价软件3.2假定的二价结合模型来分析。表面的再生通过注射 50 μ I 的 50mM NaOH (50 μ 1/min)获得。
[0203]实施例U [0204]进行实验以评价19.1、嵌合19.1和两个人源化19.1mAbs在阻断LPS引起的人AP补体激活中的相对活性(参见图20)。将ELISA板(96孔，Nunc)用50 μ I LPS溶液(PBS中40 μ g/ml,于4°C过夜)包被。第二天，将板用含有0.05%PBS-T的PBS洗涤3次，并加入已与0、5、10或20 μ g/ml抗备解素mAb在4°C温育I小时的50μ 150%NHS。将NHS用GVB-EGTA-Mg++(含有IOmM EGTA和2.5mM Mg++，终浓度)稀释。将板置于37°C I小时，用PBS-T洗涤3次，然后加入50 μ I HRP结合的山羊抗人C3抗体(1: 4000，Cappel)，并将板置于室温I小时。将板用PBS-T洗涤3次，然后利用BD Pharmingen Α+Β试剂显影。用2ΝH2S04之后5min反应停止。通过测量板上C3沉积的量(0D450)来检测AP补体激活。加入EDTA的样品(NHSEDTA)充当阴性对照(EDTA阻断补体激活)。没有加入mAb的样品(NHS)充当基线AP补体激活。
[0205]实施例12
[0206]进行实验以评价19.1、嵌合19.1和两个人源化19.1mAbs在阻断在fH和DAF功能失调的背景下人AP补体引起的人RBC裂解中的相对活性(参见图21)。将正常人 RBCs (5 X IO6 细胞)与 100 μ 150%NHS(用含有 IOmM EGTA 和 2.5mM Mg++ 终浓度的GVB-EGTA-Mg++稀释)在存在30 μΜ重组fH19_20和7.5 μ g小鼠抗人DAF (来自 ADB Serotec)的情况下在 37 °C 温育 20min (2006，Ferreira et al., JImmunol.177:6308-6316)。加入 RBCs 之前，将 NHS 与 1-15 μ g/ml 多种抗备解素 mAbs 在 4°C预温育I小时。裂解反应通过加入200 μ I冰冷的PBS中的20mM EDTA来终止。将温育混合物以1500g离心5min，收集上清并且测量0D420nm。没有加入NHS或fH19_20，或加入EDTA的样品用作阴性裂解对照，用100 μ I蒸馏水完全裂解的RBCs样品用作阳性对照(100%裂解)，针对该阳性对照，将其它样品中％裂解标准化。
[0207]实施例13
[0208]进行实验以评价19.1、嵌合19.1和两个人源化19.1mAbs在阻断LPS引起的罗猴和食蟹猴AP补体激活中的相对活性(参见图22和23)。将ELISA板(96孔，Nunc)用50 μ ILPS溶液(PBS中40 μ g/ml，于4°C过夜)包被。第二天，将板用含有0.05%PBS_T的PBS洗涤3次，并加入已与O、10、20、30或40 μ g/ml抗备解素mAb在4°C预温育I小时的50 μ 150%正常罗猴血清(NRS)或正常食蟹猴血清(NCS)。将NRS或NCS用GVB-EGTA-Mg++(含有IOmMEGTA和2.5mM Mg++,终浓度)稀释。将板置于37°C温育I小时，用PBS-T洗涤3次，然后加Λ 50 μ I HRP结合的山羊抗人C3抗体(1: 4000，Cappel，与猴C3交叉反应)，并将板置于室温I小时。将板用PBS-T洗涤3次，然后利用BD Pharmingen A+B试剂显影。用2NH2S04之后5min反应停止。通过测量板上C3沉积的量(0D450)来检测AP补体激活。加入EDTA的样品(NRSEDTA或NCSEDTA)充当阴性对照(EDTA阻断补体激活)。没有加入mAb的样品(NRS或NCS)充当基线AP补体激活。
[0209]实施例14
[0210]进行实验以评价mAbl9.1, 25和人源化19.1-459对PNH红细胞的酸化血清裂解的抑制(哈姆氏试验)(参见图24)。将来自阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)患者的RBCs在存在或不存在mAbs的情况下进行哈姆氏酸化血清试验。将RBCs与自体血清(终浓度83%)在37°C温育2hr，并通过测量上清液的0D405计算裂解百分数，标准化到蒸馏水完全裂解的RBCs样品(Eh DDff)。温育混合物由以下组成:240μ I血清、25μ 11/6N HCL(或25 μ I盐水用于阴性对照)、12.5口150%卜八)1?(:悬浮液、1(^1盐水中的mAb。与非酸化自体血清(NHS)温育的RBCs样品用作阴性对照(背景裂解)ο在不存在mAbs的情况下,约50%RBCs被酸化血清裂解。该裂解被8 μ g/ml和以上浓度的mAbl9.1、20 μ g/ml浓度的人源化19.1mAb (#459)和8 μ g/ml和以上浓度的mAb25 完全抑制。
[0211]实施例15
[0212]备解素人源化小鼠如下产生(参见图25)。人fP表达载体以pACGGS质粒构建，如图25A中示意图所示，利用具有CVM-1E增强子的鸡β-肌动蛋白启动子和兔球蛋白聚腺苷酸尾用于在真核细胞中稳定表达cDNA。人备解素cDNA序列和用于构建表达载体的其编码的蛋白序列显示在SEQ ID N0:67和SEQ ID N0:68中。通过限制性酶消化将质粒而线性化并显微注射进C57BL/6小鼠的受精卵以产生人fP转基因建立者小鼠。通过PCR筛选(利用对人 fP 特异的引物 5’-ATCAGAGGCCTGTGACACC-3’ (SEQ ID NO:65)和 5’-CTGCCCTTGTAGCTCCTCA-3’ (SEQ ID NO:66)和从小鼠尾分离的基因组DNAs)，阳性建立者小鼠(显示约800bp的人fP cDNA片段)可被鉴定。分析的40只小鼠中，五只(#15、20、24、27和32)是阳性(图25B，红色箭头)。进行夹心ELISA测定以检测转基因阳性小鼠中人fP (图25C)。将板用针对人fP的非阻断mAb (克隆8.1)包被。与稀释的小鼠血清(10%)温育之后，通过利用HRP结合的山羊抗人fP抗体检测人fP。正常人血清(NHS)用作阳性对照。通过该方法，人fP应在NHS中和在转基因阳性小鼠(例如15、20、24、27、32)的血清中检测到，但不应在正常(即非转基因的，例如29)小鼠或fP+-小鼠血清中检测到。然后将转基因阳性建立者小鼠与WT小鼠繁殖，建立种系传递。通过尾DNA的PCR检测转基因完成从这样交配的Fl小鼠的筛选，并通过夹心ELISA来检测其血清中的人备解素，如上面说描述的。证实种系传递之后，将建立者小鼠与fP+小鼠繁殖，产生fP+_人fP转基因+小鼠。fP+_人fP转基因+小鼠中AP补体活性的恢复通过LPS引起的AP激活测定来评价，如实施例2中所描述的。在该测定中，AP补体活性应在WT小鼠血清中和在人fP转基因阳性的fP+小鼠血清中被检测到，但不应在fP+小鼠血清中检测到。在该测定中，用EDTA处理的WT小鼠血清将用作AP补体激活的阴性对照。
[0213]实施例16
[0214]进行实验以检查“备解素人源化”小鼠中mAb25的体内活性和动力学(图26)。将备解素人源化小鼠(fP+-人fP转基因+)注射以0.5mg(1.P.)mAb25。在注射(Ohr)之前和然后在注射之后各个时间点通过眶后流血采集血样(50-75 μ I)并制备血清。检测血清样品LPS引起的AP补体激活。为了该测定，将ELISA板(96孔，Nunc)用50 μ I LPS溶液(PBS中40 μ g/ml于4°C过夜)包被。第二天，将板用含有0.05%Tween-20的PBS (PBS-T)洗涤3次，向每孔加入50 μ I连续稀释的(始于1:10)小鼠血清。将小鼠血清用GVB-EGTA-Mg++(含有IOmM EGTA和2.5mM Mg++终浓度)稀释。将板置于37°C温育I小时，用PBS-T洗涤3次，然后加入50 μ I HRP结合的兔抗小鼠C3抗体(1: 2000，Cappel)，并将板置于室温I小时。将板用PBS-T洗涤3次，然后利用BD Pharmingen Α+Β试剂显影。用2Ν H2S04之后5min反应停止。通过测量板上C3沉积的量(0D450)检测AP补体激活。在该示例的实施例中，fP+小鼠血清或用EDTA处理的WT血清中不存在AP补体活性。相反，AP补体活性在WT血清中和在fP人源化小鼠血清中在Ohr (mAb25处理之前)被检测到。人源化小鼠中AP补体活性在mAb25处理之后8、24和48hr仍被抑制，但是在72、96和120hr开始检测到。这些结果显示以0.5mg/小鼠的剂量，mAb25能抑制体内AP补体活性至少48hr。
·[0215]实施例17
[0216]进行实验以评价抗人备解素mAbl9.1对血管外溶血(EVH)的作用。在该EVH模型中，给备解素人源化小鼠(每个实验组n=4)输注来自Crry/DAF/C3三重敲除(TKO)小鼠的红细胞(RBC)。在RBC转移之前，将受体小鼠(备解素人源化小鼠)用mAbl9.1 (2mg/小鼠，
1.p.)或对照小鼠IgGlmAb (M0PC,从MoPC31C杂交瘤纯化，来自ACTT)处理6hr。从供体TKO小鼠获取RBCs，在PBS中洗涤和在注射(通过尾静脉)进受体小鼠之前用CFSE标记，根据先前公开的程序(Miwa et al.，2002，Blood99:3707-3716)。每只受体小鼠接受等于100 μ I血液的RBCs。在RBC输注之后5分钟和6、24、48、72、96、120小时，使受体小鼠流血和分析RBCs以测定循环中剩余的CFSE-标记的(即输注的)RBCs数目。将每个受体中CFSE-标记的RBCs数目标准化(作为％)到5min时间点检测的。在对照IgG(MOPC)处理的受体小鼠中，TKO RBCs通过EVH被迅速排除，与先前的发现一致(Miwa et al., 2002, Blood99:3707-3716)。然而，在用抗人备解素19.1mAb处理的受体小鼠中，没有发生EVH，并且输注的RBCs存留，显示抗备解素mAb有效防止EVH(图27)。
[0217]各个和每个专利、专利申请的公开内容和本文引用的出版物在此以其全部通过引用被并入。
[0218]虽然本发明已参考【具体实施方式】被公开，但是明显的是其它实施方式和本发明的改变可由本领域技术人员想出而不背离本发明的真实精神和范围。所附权利要求意欲被解释为包括所有这样的实施方 式和相等的变化。
【权利要求】
1.组合物，包括特异地结合备解素的抗体。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述备解素是人备解素。
3.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
4.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体是人源化抗体。
5.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体是嵌合抗体。
6.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括至少一个选自以下的⑶Rs=VH-OTRl:SEQ ID NO: 3 ；VH-CDR2:SEQ ID NO:4 ；VH-CDR3:SEQ ID NO: 5 ;VL_CDR1:SEQ ID N0:8 ；VL-CDR2:SEQ ID NO:9 ;和 VL-CDR3:SEQ ID NO: 10。
7.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括⑶Rs:VH-⑶Rl:SEQ ID NO:3 ；VH-CDR2:SEQ ID N0:4 ;VH_CDR3:SEQ ID NO:5 ;VL_CDR1:SEQ ID NO:8 ;VL_CDR2:SEQ IDNO:9 ;和 VL-CDR3:SEQ ID NO:10。
8.权利要求1所述的组合物,其中所述抗体包括重链,所述重链包括SEQID NO: 2的氨基酸序列。
9.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括轻链，所述轻链包括SEQID NO: 7的氨基酸序列。
10.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括重链和轻链，所述重链包括SEQIDNO:2的氨基酸序列，并且所述轻链包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
11.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体特异结合包括SEQID NO:52的至少一个氨基酸的表位。
12.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括至少一个选自以下的⑶Rs=VH-OTRl:SEQ ID NO: 13 ;VH_CDR2:SEQ ID NO: 14 ;VH_CDR3:SEQ ID NO: 15 ;VL_CDR1:SEQ ID NO: 18 ；VL-CDR2:SEQ ID NO: 19 ;和 VL-CDR3:SEQ ID N0:20。
13.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括⑶Rs:VH-⑶Rl:SEQ ID NO: 13 ；VH-CDR2:SEQ ID NO: 14 ；VH-CDR3:SEQ ID NO: 15 ；VL-CDRl:SEQ ID NO: 18 ;VL_CDR2:SEQ IDNO: 19 ;和 VL-CDR3:SEQ ID NO:20。
14.权利要求1所述的组合物,其中所述抗体包括重链,所述重链包括SEQID NO: 12的氨基酸序列。
15.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括轻链，所述轻链包括SEQID NO: 17的氨基酸序列。
16.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括重链和轻链，所述包括SEQID NO: 12的氨基酸序列，所述轻链包括SEQ ID NO: 17的氨基酸序列。
17.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体特异结合包括SEQID NO:53的至少一个氨基酸的表位。
18.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括至少一个选自以下的⑶Rs=VH-OTRl:SEQ ID NO:23 ;VH_CDR2:SEQ ID NO:24 ;VH_CDR3:SEQ ID NO:25 ;VL_CDR1:SEQ ID NO:28 ；VL-CDR2:SEQ ID NO:29 ;和 VL-CDR3:SEQ ID N0:30。
19.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括⑶Rs:VH-⑶Rl:SEQ ID NO:23 ；VH-CDR2:SEQ ID NO:24 ；VH-CDR3:SEQ ID NO:25 ；VL-CDRl:SEQ ID NO:28 ;VL_CDR2:SEQ IDNO:29 ;和 VL-CDR3:SEQ ID NO:30。
20.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括重链，所述重链包括SEQID NO: 22的氨基酸序列。
21.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括轻链，所述轻链包括SEQID NO: 27的氨基酸序列。
22.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括重链和轻链，所述重链包括SEQIDNO:22的氨基酸序列，所述轻链包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
23.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括至少一个选自以下的⑶Rs=VH-OTRl:SEQ ID NO:33 ;VH_CDR2:SEQ ID NO:34 ;VH_CDR3:SEQ ID NO:35 ;VL_CDR1:SEQ ID NO:38 ；VL-CDR2:SEQ ID NO:39 ;和 VL-CDR3:SEQ ID N0:40。
24.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括⑶Rs:VH-⑶Rl:SEQ ID NO:33 ；VH-CDR2:SEQ ID NO:34 ；VH-CDR3:SEQ ID NO:35 ;VL_CDR1:SEQ ID NO:38 ；VL-CDR2:SEQ IDNO:39 ;和 VL-CDR3:SEQ ID NO:40。
25.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括重链，所述重链包括SEQID NO: 32的氨基酸序列。
26.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括轻链，所述轻链包括SEQID NO: 37的氨基酸序列。
27.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括重链和轻链，所述重链包括SEQIDNO:32的氨基酸序列，所述轻链包括SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
28.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括重链，所述重链包括SEQID NO: 42的氨基酸序列。
29.权利要求1所述的组合物,其中所述抗体包括重链,所述重链包括SEQID NO:44的氨基酸序列。
30.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括轻链，所述轻链包括SEQID NO:47的氨基酸序列。
31.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括重链和轻链，所述重链包括SEQIDNO:42的氨基酸序列，所述轻链包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列。
32.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括重链和轻链，所述重链包括SEQIDNO:44的氨基酸序列，所述轻链包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列。
33.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括重链，所述重链包括SEQID NO: 49的氨基酸序列。
34.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括轻链，所述轻链包括SEQID NO: 51的氨基酸序列。
35.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括重链和轻链，所述重链包括SEQIDNO:49的氨基酸序列，所述轻链包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
36.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括重链，所述重链包括SEQID NO:2和SEQ ID NO:63的氨基酸序列。
37.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括轻链，所述轻链包括SEQID NO:7和SEQ ID NO:64的氨基酸序列。
38.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括重链和轻链，所述重链包括SEQIDNO:2和SEQ ID NO:63的氨基酸序列，所述轻链包括SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:64的氨基酸序列。
39.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括重链，所述重链包括SEQID NO: 12和SEQ ID NO:63的氨基酸序列。
40.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括轻链，所述轻链包括SEQID NO: 17和SEQ ID NO:64的氨基酸序列。
41.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括重链和轻链，所述重链包括SEQIDNO: 12和SEQ ID NO:63的氨基酸序列，所述轻链包括SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO:64的氨基酸序列。
42.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括重链，所述重链包括SEQID NO: 22和SEQ ID NO:63的氨基酸序列。
43.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括轻链，所述轻链包括SEQID NO: 27和SEQ ID NO:64的氨基酸序列。
44.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括重链和轻链，所述重链包括SEQIDNO:22和SEQ ID NO:63的氨基酸序列，所述轻链包括SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:64的氨基酸序列。
45.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括重链，所述重链包括SEQID NO: 32和SEQ ID NO:63的氨基酸序列。
46.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括轻链，所述轻链包括SEQID NO: 37和SEQ ID NO:64的氨基酸序列。
47.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包括重链和轻链，所述重链包括SEQIDNO:32和SEQ ID NO:63的氨基酸序列，所述轻链包括SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:64的氨基酸序列。
48.组合物，包括抗体，所述抗体结合备解素并且与权利要求1所述的抗体与备解素的结合竞争。
49.组合物，包括抗体，所述抗体结合备解素并且与称作mAbl9.1的抗体与备解素的结合竞争。
50.组合物，包括抗体，所述抗体结合备解素并且与称作mAb25的抗体与备解素的结合竞争。
51.组合物，包括抗体，所述抗体结合备解素并且与称作mAb22.1的抗体与备解素的结合竞争。
52.组合物，包括抗体，所述抗体结合备解素并且与称作mAb30的抗体与备解素的结合竞争。
53.治疗个体中旁路途径(AP)-介导的病理的方法，包括给所述个体施用权利要求1所述的抗备解素抗体的步骤。
54.权利要求53所述的方法，其中 所述病理至少选自以下:黄斑变性、缺血再灌注损伤、关节炎、风湿性关节炎、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)综合征、非典型的溶血性尿毒症(aHUS)综合征、哮喘、器官移植败血病、炎症、肾小球肾炎、狼疮、和其组合。
55.权利要求53所述的方法，其中所述抗备解素抗体选择性地抑制旁路途径，但不抑制经典途径和凝集素途径。
56.权利要求53所述的方法，其中所述抗备解素抗体不影响经典途径和凝集素途径的AP放大环路。
57.权利要求53所述的方法，其中抗备解素抗体的施用抑制C3bBb蛋白的产生。
58.转 基因小鼠，其中所述转基因小鼠表达人备解素，其中所述人备解素的核酸序列是SEQ ID NO: 67，所述人备解素的氨基酸序列是SEQ ID NO: 54，并且其中所述转基因小鼠不表达鼠备解素。
【文档编号】A61K38/00GK103796664SQ201280042494
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年6月29日 优先权日:2011年7月1日
【发明者】W·宋 申请人:宾夕法尼亚大学董事会