Prame纯化的利记博彩app

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【专利摘要】本发明涉及用于PRAME的纯化的方法。具体而言，本发明涉及用于减少PRAME在从稀释剂A至稀释剂B的稀释剂交换过程中的聚集的方法，其包括：(i)在所述交换前或在所述交换的同时将聚阴离子化合物加入到稀释剂A中；和(ii)将蛋白从稀释剂A交换至稀释剂B。还提供了通过所述方法产生的组合物。
【专利说明】PRAME纯化
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于PRAME的纯化的方法。
[0002]背景
“黑素瘤中优势表达的抗原”(PReferentially expressed Antigen in MElanoma)或“PRAME”是由PRAME基因编码的肿瘤抗原。
[0003]PRAME是在许多类型的肿瘤(包括黑素瘤、肺癌和白血病)中超表达的抗原(Ikeda等人,Immunity 1997, 6 (2) 199-208)。已报道了多种实体瘤和血液恶性肿瘤中的高水平的PRAME表达，所述实体瘤包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌和黑素瘤、髓母细胞瘤、肉瘤、头和颈癌、成神经细胞瘤、肾癌和肾母细胞瘤(Wilms’ tumour)，所述血液恶性肿瘤包括急性成淋巴细胞性白血病和急性髓细胞性白血病(ALL和AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、霍奇金病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和套细胞淋巴瘤(MCL)。
[0004]PRAME还以非常低水平表达于少数正常组织中，例如睾丸、肾上腺、卵巢和子宫内膜。
[0005]PRAME代表重要的抗癌免疫治疗剂。在免疫治疗中,癌抗原通常作为疫苗(例如包含蛋白或其抗原片段)引入患者，其刺激患者的免疫系统以杀死表达相同抗原的肿瘤。
[0006]生产包含癌 抗原(在这种情况下为PRAME)的疫苗需要显著量的癌抗原，这进而需要抗原的大规模表达和纯化。
[0007]发明概述
PRAME在大肠杆菌(￡ co7i)中超表达，它在其中形成包涵体。为了从包涵体中溶解PRAME，必须将其暴露于需要阴离子去污剂和尿素的强溶解条件下。然而，这样的条件并不适合将PRAME最终配制成用于向患者注射的组合物，并且纯化的PRAME必须转移到另一种稀释剂。
[0008]本申请的发明人已经意识到，将PRAME从包含用于溶解它的阴离子去污剂的稀释剂中转移到基本上无阴离子去污剂的稀释剂中导致PRAME的聚集。该聚集随时间持续并最终导致PRAME从溶液中沉淀出来。由于该聚集(抗原大小发展)不适合在免疫治疗组合物中的应用，因此，本领域中需要用于PRAME的纯化的改进方法。
[0009]本文提供了减少PRAME聚集的方法和工艺，以及通过这些方法和工艺产生的化合物。在一个实施方案中，提供了减少蛋白在从稀释剂A至稀释剂B的稀释剂交换过程中的聚集的方法，其包括:(i)在所述交换前向稀释剂A加入聚阴离子化合物；和(ii)将蛋白从稀释剂A交换至稀释剂B，其中所述蛋白为PRAME。在一个实施方案中，提供了聚阴离子组合物用于减少蛋白在从稀释剂A至稀释剂B的稀释剂交换过程中的聚集的用途，其中所述蛋白为PRAME。在一个实施方案中，在所述稀释剂交换前加入聚阴离子化合物。在一个实施方案中，稀释剂A包含去污剂。在另一个实施方案中，所述去污剂是阴离子去污剂。在另一个实施方案中，所述去污剂选自:SDS、多库酯钠和十二烷基肌氨酸钠(lauryl sarcosyl)。
[0010]在一个实施方案中，稀释剂B基本上不含去污剂。
[0011]在一个实施方案中，所述聚阴离子化合物是寡核苷酸。在一个实施方案中，所述寡核苷酸的长度为5-200个核苷酸。在一个实施方案中，所述寡核苷酸包含CpG。最多在一个实施方案中，所述寡核苷酸选自:
TCC ATG ACG TTC CTG
ACG TT (CpG 1826) (SEQ ID NO:1); TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)(SEQ (D NO:2); ACC GAT OAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG (SEQ IDNO:3):1TCG TCG TTIT TGT CGT TTT GITC GTT (CpG 2006/CpG7909) (SEQ IDNO:4); TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT《GpG 1668) (SEQ ID NO:5);或 TCG ACG
TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456) (SEQ ID NO:6)。
[0012]在一个实施方案中，所述稀释剂交换通过透析、渗滤或尺寸排阻层析实现。
[0013]在一个实施方案中，所述方法进一步包括步骤(iii):将蛋白配制到稀释剂C中。在一个实施方案中，稀释剂C包含Tris、硼酸盐、蔗糖、泊洛沙姆和CpG。
[0014]本发明还提供如通过本发明的方法产生的包含在稀释剂C中的PRAME的组合物。
[0015]本发明还提供 包含PRAME和寡核苷酸的组合物，其中所述PRAME具有10_30nm之间的颗粒大小。在另一个实施方案中，PRAME具有15-25nm之间的颗粒大小。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸包含CpG。在进一步的实施方案中，所述颗粒大小通过动态光散射测定。
[0016]本发明还提供了用于生产药学上可接受的PRAME组合物的方法，其包括步骤:(a)按照本发明的方法进行稀释剂交换；(b)将蛋白配制到稀释剂C中；和(C)将步骤(b)中产生的制剂灭菌。在另一个实施方案中，该方法包括额外的步骤(d):将步骤(C)中产生的制剂冷冻干燥。在另一个实施方案中，步骤(C)通过过滤实现。
[0017]附图简述
图1/21:用Malvern ZetaSizer Nano ZS设备对PRAME纯化抗原的电泳迁移率测量和Zeta电位计算。
[0018]图2/21:通过 SEC-MALLS 分析对在制出时(at release)的 GMP 批次 DPRAAPA003测定的光散射(LS)、折射率(RI)和摩尔质量(MM)分布。
[0019]图3/21:通过SEC-MALLS分析对在制出时的GMP批次DPRAAPA004测定的光散射(LS)、折射率(RI)和摩尔质量(MM)分布。
[0020]图4/21:通过SEC-MALLS分析对在制出时的GMP批次DPRAAPA005测定的光散射(LS)、折射率(RI)和摩尔质量(MM)分布。
[0021]图5/21:通过对在制出时的GMP批次DPRAAPA003 (蓝线)、DPRAAPA004 (红线)和DPRAAPA005 (绿线)的SV-AUC分析获得的沉降系数分布c (s)。注意通过SV-AUC获得的原始数据已经使用Sedfit软件进行处理。波形曲线是由于该信号处理而引起，并因此是人为的。
[0022]图6/21:在还原性条件下在4-12% Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶考马斯蓝R250染色上的SDS-PAGE分析(每泳道上样5 Pg蛋白)一在ASA (山梨醇)中重构的最终容器产品(Final Container) 一在25°C下重构动力学的跟踪。泳道从左向右编号。
[0023]图7/21:针对PRAME抗原的蛋白质印记分析。在ASA (山梨醇)缓冲液或水中重构的最终容器产品。在25°C下重构动力学的跟踪。每泳道上样0.3Pg蛋白，在IOOV下在硝酸纤维素膜上转移I小时，碱性磷酸酶(NBT-BCIP)检测。泳道1:在T0，在注射用水中重构的最终容器产品(FC) —未离心的样品；泳道2:同I 一离心的样品(上清液)；泳道3:在T0，在ASA缓冲液中重构的最终容器产品(FC) —未离心的样品；泳道4:同3 —离心的样品(上清液)；泳道5:在T 4h 25°C，在ASA缓冲液中重构的最终容器产品(FC) —未离心的样品；泳道6:同5 —离心的样品(上清液)；泳道7:在T24h 25°C，在ASA缓冲液中重构的最终容器产品(FC) —未离心的样品；泳道8:同7 —离心的样品(上清液)。
[0024]图8/21:对应于CpG7909向PRAME溶液中逐步注射的等温滴定量热法谱图。CpG与PRAME的结合导致信号的特征性顺序，直至达到饱和。
[0025]图9/21:上图表示SDS-PAGE凝胶银染后可见的PRAME蛋白分布。下图表示IEX-HPLC-UV测定后随梯度的CpG分布。级分I等同于SDS-PAGE凝胶的对应泳道上标注的下部级分。类似地，级分12等同于上部级分，并且级分w等同于管洗涤液泳道。红色方框用于描绘其中CpG与抗 原相互作用的级分(在对照实验中，仅在上部级分中发现单独的CpG)。
[0026]图10/21:显示与三个不同的重复批次的PRAME抗原结合的CpG的量的比较数据。蓝色柱对应于冷冻干燥材料的处理前(ex-tempo)重构(左半图为500 Kg剂量,右半图为100 Pg剂量)。绿色柱对应于超速离心前在25°C下预孵育24小时的样品。红紫色菱形对应于CpG/Ag质量比例，并应从右侧轴读数。
[0027]图11/21 = SEC-HPLC方法开发。SEC柱选择。纯化抗原在不同的TSK柱上获得的UV谱。
[0028]图12/21 = SEC-HPLC方法开发。SEC柱选择。混有CpG溶液(1050 μδ/πι1)的纯化抗原在不同的TSK柱上获得的UV谱。
[0029]图13/21:在5 mM硼酸盐缓冲液pH 9.8 — 3.15%蔗糖(=纯化抗原的缓冲液)中平衡的TSK G4000 Pffxl + G6000 PWxl柱(+保护柱)上，以0.5 ml/min的流速和用220nm处UV检测的SEC-HPLC分析一单独的纯化抗原或混有浓度提高的CpG后的纯化抗原获得的UV谱。CpG对抗原层析谱的影响。注意，Vo =柱的空体积，即树脂珠之外的体积。
[0030]图14/21:在5 mM硼酸盐缓冲液pH 9.8 — 3.15%蔗糖(=纯化抗原的缓冲液)中平衡的TSK G4000 Pffxl + G6000 PWxl柱(+保护柱)上，以0.5 ml/min的流速和用220nm处UV检测的SEC-HPLC分析一从10 μδ/πι1直至1050 μδ/πι1的CpG水溶液获得的UV谱。
[0031]图15/21:对于混有赋形剂的或无赋形剂的，并在22°C下储存24小时的纯化抗原样品经动态光散射(来自Malvern的ZetaNano?)的大小分析(当通过目测发现抗原沉淀时，不进行大小测量)。
[0032]图16/21:对于混有所选的赋形剂候选物，并在+4°C下储存14天的纯化抗原样品经动态光散射(来自Malvern的ZetaNano?)的大小分析。
[0033]图17/21:在+4°C下14天后，对于混有所选的赋形剂候选物的纯化抗原样品的浊度测量(HACH 2100AN IS?)。
[0034]图18/21:ASA (山梨醇)与离子型去污剂的相容性一经动态光散射(来自Malvern的ZetaNano?)的大小分析。[0035]图19/21:DLS测量的图示。
[0036]图20/21:无CpG的样品(R19/1)和UF前在HA-FT中混有lOOPg/ml CpG的样品(运行R26/1)的目视分析。
[0037]图21/21:DLS测量的图示。
[0038]发明详述
本发明人已经令人惊奇地发现在稀释剂交换前向包含PRAME的稀释剂中加入聚阴离子化合物减少了 PRAME的聚集。
[0039]聚集
如上所述，本发明的方法减少了 PRAME在稀释剂交换过程中的聚集。聚集是指单个PRAME分子与其他PRAME分子结合以形成多聚体。
[0040]聚集可以通过目测或使用本领域熟知的动态光散射技术观察到。
[0041]PRAME
如上所述，PRAME是在许多类型的肿瘤(包括黑素瘤、肺癌和白血病)中超表达的抗原(Ikeda 等人，Immunity 1997，6 (2) 199-208)。PRAME 蛋白具有 509 个氨基酸(SEQ IDNO: 7)。该抗原描述于美国专利号5，830，753中。PRAME还以下述的检索号见于经注释的人基因数据库(Annotated Human Gene Database) H-1nv DB 中:
U65011.1, BC022008J, AK129783.1, BC014974.2, CR608334J , AF025440.1,CR591755.1, BC03Q731.1、CR623010.1, CR611321 太 CR618501J, CR804772.1,
CR456549.1, 和CR620272.1。如本文所用，术语PRAME包括全长野生型PRAME蛋
白。它还包括具有保守性取代的PRAME蛋白。在一个实施方案中，可以取代一个或多个氨基酸，即 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或更多。当与野生型 PRAME序列比较时，PRAME蛋白可以另外或可选地包含在氨基酸序列中的缺失或插入。在一个实施方案中，可以插入或缺失一个或多个氨基酸，即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19或更多。
[0042]在一个实施方案中，术语PRAME包括与全长野生型PRAME蛋白共有80%或更高的序列同一性的蛋白，即85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。
[0043]术语PRAME还包括包含PRAME蛋白的融合蛋白。PRAME可以与融合配偶体或载体蛋白融合或缀合。例如，融合配偶体或载体蛋白可以选自蛋白D、NSl或CLytA或其片段。例如，参见 W02008/087102。
[0044]在本发明的一个实施方案中，可以使用的免疫融合配偶体来源于蛋白D (即革兰氏阴性细菌流感嗜血菌B (Haemophilus influenza B)的表面蛋白(W091/18926))或其衍生物。蛋白D衍生物可以包含该蛋白的前1/3，或大约该蛋白的前1/3。在一个实施方案中，蛋白D的前109个残基可以用作融合配偶体。在可选的实施方案中，蛋白D衍生物可以包含N末端的前100-110个氨基酸或约或大约N末端的前100-110个氨基酸。在一个实施方案中，蛋白D或其衍生物可以是脂化的并且可以使用脂蛋白D。
[0045]在一个实施方案中，PRAME蛋白是融合蛋白，其包含:a) PRAME或其免疫原性片段，和b)来源于蛋白D的异源融合配偶体，其中所述融合蛋白不包括蛋白D的分泌序列(信号序列)。蛋白D的分泌或信号序列或分泌信号表示蛋白D的N末端19个氨基酸。因此，本发明的融合配偶体蛋白可以包含剩余的全长蛋白D蛋白，或可以包含大约蛋白D的剩余的N末端三分之一。例如，所述蛋白D的剩余的N末端三分之一可以包含大约或约蛋白D的氨基酸20-127。在一个实施方案中，所述蛋白D序列包含蛋白D的N末端氨基酸20-127。
[0046]在一个实施方案中，PRAME可以是蛋白D_PRAME/His，即从N末端至C末端包含以下的融合蛋白:氨基酸Met-Asp-PiO ;蛋白D的氨基酸20-127 ；PRAME ;任选的接头；和多组氨酸尾(His)。可以任选使用的接头和多组氨酸尾的实例包括例如:TSGHHHHHH ;LEHHHHHH或 HHHHHH。
[0047]如本发明中使用的PRAME的浓度通常在10-2000mg/ml之间，即
2,5,10,15,20、25,30? 35, 40,50 100、125, 150、175,200, 250,300,350,
400,450.500,550,600,650, TOO、750,800、850,900,950, 1000,1100、1200,
1300,1400,1500,2000mg/ml。
[0048]聚电解质和聚阴离子化合物
聚电解质是其重复单元具有电解质基团的聚合物。这些基团将在水溶液(水)中离解，使聚合物带电。因此，聚电解质性质类似于电解质(盐)和聚合物(高分子量化合物)二者，并且有时被称为聚盐。与盐类似，它们的溶液是导电的。与聚合物类似，它们的溶液常常是粘性的。[0049]如本文所指，聚阴离子化合物是具有总体负电荷的聚电解质。聚阴离子化合物的实例包括但不限于PLG和寡核苷酸。
[0050]可以通过任何合适的方法计算聚阴离子化合物在pH7.0的净负电荷。这可以是化合物的平均性质，并应该对所用的聚阴离子化合物的Mw来计算。例如，具有平均17个残基的PLG聚合物应具有为17个的净负电荷。在一个实施方案中，净负电荷应该为至少8个，或至少17个，优选8-100、10-80、12-60、14-40、16-20个之间，并且最优选约或正好17个。
[0051]在一个实施方案中，在pH 7.0，本发明的聚阴离子化合物每3个单体具有至少一个平均I个净负电荷，优选每3个单体至少2个净负电荷，并且最优选每30个单体至少平均I个净负电荷。电荷可以在化合物长度上是不均匀排列的，但优选均匀分布于化合物长度上。
[0052]技术人员将理解术语聚阴离子化合物可以包括聚阴离子去污剂。然而，当本发明涉及在从稀释剂A向稀释剂B的稀释剂交换前向稀释剂A加入聚阴离子化合物，其中稀释剂A包含阴离子去污剂时，该阴离子去污剂与加入稀释剂A中的聚阴离子化合物是不同的。
[0053]聚L谷氨酸(PLG)
聚L谷氨酸是用于稳定包含生物分子的稀释剂的L-谷氨酸的聚合物。在一个实施方案中，使用低分子量PLG (小于6000 Mw，优选640-5000)(例如，具有平均17个残基的Mw为2178的PLG)。PLG是在每个重复单元中具有突出的游离y_羧基的完全可生物降解的聚氨基酸(PKa 4.1)，并且在pH7时是带负电的，这使得这种均聚物为水溶性的，并赋予它聚阴离子结构。可以使用常规肽合成技术生产PLG。它还可以从Sigma-Aldrich, St.Louis,MO, USA获得，为相对多分散形式(例如，具有约2.6的多分散性的17聚体)，或从法国斯特拉斯堡Neosystem获得，为相对单分散形式(例如，具有接近I的多分散性的8、16、24或32聚体)。[0054]如本发明中使用的PLG的浓度通常在10_200(^g/ml之间，即
2,5,10,15、20, 25、30, 35,40,50、75,.100, 125% 150? 175,200,250,300,350,
400,450,500?550.600,650,700,750,800,850* 900,950? 1000、1100、1200,
1300,1400,1500,1750.Λ 2000mg/ml。
[0055]寡核苷酸
用于本发明中的寡核苷酸可以由核糖核酸、脱氧核糖核酸或本领域中已知的任何化学修饰的核酸构成。然而，本发明中利用的寡核苷酸通常为脱氧核苷酸。寡核苷酸可以包含嘌呤或嘧啶的任何序列。
[0056]在一个实施方案中，所述寡核苷酸包含CpG。CpG是存在于DNA中的胞嘧啶-鸟苷二核苷酸基序的缩写。历史上，观察到BCG的DNA部分能够发挥抗肿瘤作用。在进一步的研究中，显示来源于BCG基因序列的合成寡核苷酸能够诱导免疫刺激作用(体外和体内均可以)。这些研究的作者得出结论，即某些回文序列(包括中心CG基序)具有这种活性。随后，CG基序在免疫刺激中的核心作用在Krieg的出版物(Nature 374，p546 1995)中得到阐明。详细分析已经显示CG基序必须在特定的序列背景中，并且这样的序列在细菌DNA中是常见的，但在脊椎动物DNA中是罕见的。免疫刺激性序列通常是:嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中二核苷酸CG基序没有甲基化，但已知其他非甲基化的CpG序列为免疫刺激性的，并且可以用于本发明中。
[0057]在六个核苷酸的某些组合中，存在回文序列。这些基序中的几个，其作为一个基序的重复或者不同基序的组合，可以存在于同一寡核苷酸中。一条或多条包含这些免疫刺激性序列的寡核苷酸的存在可以活化多种免疫亚群，包括天然杀伤细胞(其产生干扰素Y并具有细胞溶解活性)和巨噬细胞(Wooldrige等人，Vol 89 (n0.8)，1977)。尽管现已显示不具有该共有序列的含非甲基化CpG的其他序列是免疫调节性的。
[0058]在本发 明的一个实施方案中，所述寡核苷酸包含由至少三个、优选至少六个或更多个核苷酸分隔开的两个或多个二核苷酸CpG基序。本发明的寡核苷酸通常为脱氧核苷酸。在优选的实施方案中，所述寡核苷酸中的核苷酸间键为二硫代磷酸酯键，或更优选为硫代磷酸酯键，尽管磷酸二酯键和其他核苷酸间键也在包括具有混合的核苷酸间键的寡核苷酸的本发明的范围内。
[0059]优选的寡核苷酸的实例具有以下序列。所述序列优选包含硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键合。
【权利要求】
1.减少蛋白在从稀释剂A至稀释剂B的稀释剂交换过程中的聚集的方法，其包括: (i)在所述交换前或者在所述交换的同时向稀释剂A加入聚阴离子化合物；和 (?)将蛋白从稀释剂A交换至稀释剂B， 其中所述蛋白为PRAME。
2.聚阴离子组合物用于减少蛋白在从稀释剂A至稀释剂B的稀释剂交换过程中的聚集的用途，其中所述蛋白为PRAME。
3.权利要求1或2的方法或用途，其中在所述稀释剂交换前加入所述聚阴离子化合物。
4.前述权利要求中任一项的方法或用途，其中稀释剂A包含去污剂。
5.权利要求4的方法或用途，其中所述去污剂是阴离子去污剂。
6.权利要求5的方法或用途，其中所述去污剂选自:SDS、多库酯钠和十二烷基肌氨酸钠。
7.前述权利要求中任一项的方法或用途，其中稀释剂B基本上不含去污剂。
8.前述权利要求中任一项的方法或用途，其中稀释剂B包含pH9.8的5.0 mM硼酸盐、鹿糖 3.15% w/vo
9.前述权利要求中任一项的方法或用途，其中所述蛋白包含His标签。
10.前述权利要求中任一项的方法或用途，其中所述聚阴离子化合物具有至少8个的净负电荷。`
11.前述权利要求中任一项的方法或用途，其中所述聚阴离子化合物为寡核苷酸。
12.权利要求11的方法或用途，其中所述寡核苷酸的长度为5-200个核苷酸。
13.权利要求11或12的方法或用途，其中所述寡核苷酸包含CpG。
14.权利要求13的方法或用途，其中所述寡核苷酸选自:
TCC ATG ACG TTC CTG ACG TI (CpG 1828;) - SEQ IO NO:!
TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) - SEQ ID N0:2,
ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG — SEQ ID N0:3,
TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006/CpG7_ SEQ
ID N0:4,
TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1688) SEQ ID N0:5,
TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456} SEQ ID N0:6,
TCG TCG TTT TGT CGT (CpG 15 _体):SEQ ID NO: 9, ?I
TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TCG TCG (CpG 30 * 体 f SEQ ID 酿10。
15.前述权利要求中任一项的方法或用途，其中所述稀释剂交换通过透析或渗滤实现。
16.前述权利要求中任一项的方法或用途，其中所述方法进一步包括步骤(iii):将所述蛋白配制到稀释剂C中。
17.权利要求16的方法或用途，其中所述稀释剂C包含Tris、蔗糖、硼酸盐、泊洛沙姆和 CpG0
18.包含PRAME的组合物，其通过权利要求16-17中任一项的方法生产。
19.包含PRAME和寡核苷酸的组合物，其中PRAME具有10_30nm之间的颗粒大小。
20.权利要求19的组合物，其中PRAME具有15_25nm之间的颗粒大小。
21.权利要求19-20中任一项的组合物，其中所述颗粒大小通过动态光散射测定。
22.用于生产药学上可接受的PRAME组合物的方法，其包括步骤: (a)根据权利要求1、3-13中任一项的方法进行稀释剂交换；和 (b)将步骤(a)中产生的制剂灭菌。
23.权利要求22的方法，其包括额外步骤(b’):在步骤(b)之前将所述蛋白配制到稀释剂C中。
24.权利要求22或23的方法，其包括额外步骤(c):将步骤(b)中产生的制剂冷冻干燥。
25.权利要求22-24中任一项的方法，其中所述灭菌通过过滤实现。
26.用于生产药学上可接受的PRAME组合物的方法，其包括步骤: (a)进行PRAME从稀释剂A至稀释剂B的稀释剂交换，其中在所述稀释剂交换前或者在所述稀释剂交换过程中将聚阴离子化合物加入到稀释剂A或稀释剂B中；和 (b)获得包含PRAME的稀释剂B。
27.权利要求26的方·法，其包括额外步骤(C)，其选自: (i)将所述包含PRAME的稀释剂B灭菌；和 (?)首先将所述包含PRAME的稀释剂B配制成包含PRAME的稀释剂C，并且随后将所述包含PRAME的稀释剂C灭菌。
28.权利要求26或27的方法，其包括将所述PRAME组合物冷冻干燥的额外步骤。
【文档编号】A61K39/00GK103717613SQ201280036131
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2012年7月20日 优先权日:2011年7月22日
【发明者】O.C.格尔梅, S.A.格达尔特, P.G.哈尔文格特, A.拉南, O.P.勒布西, D.I.莱默伊内, L.多德 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司