用于成像或治疗的包含反式环辛烯亲双烯体和二烯的预靶向试剂盒的利记博彩app
【专利摘要】描述了用于靶向的医学成像和/或治疗的预靶向方法和相关的试剂盒，其中使用显示出彼此生物正交反应性的非生物反应性化学基团。本发明涉及[4+2]逆电子需求(逆)狄尔斯-阿尔德化学反应在提供预靶向探针和效应物探针之间的偶联中的用途。为此，这些探针中的一个包含缺电子的四嗪或其它合适的二烯，且另一个是由于至少两个环外键的位置而具有展平结构的E-环辛烯。
【专利说明】用于成像或治疗的包含反式环辛烯亲双烯体和二烯的预靶
向试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于靶向的医学成像和/或治疗的预靶向方法，其中使用彼此显示出生物正交(bio-orthogonal)反应性的非生物(abiotic)反应性化学基团。本发明还涉及包含至少一种预祀向探针和至少一种效应物(effector)探针的预祀向试剂盒(kit),其中所述预祀向探针包含初级祀向部分(primary targeting moiety)和第一生物正交反应性基团，且其中所述效应物探针包含效应物部分，例如标记物或药学活性化合物，和第二生物正交反应性基团。本发明还涉及在上述方法和试剂盒中使用的预靶向试剂。本发明特别地涉及核成像和放射疗法。
【背景技术】
[0002]在医学诊断和治疗的许多领域中，希望选择性地将试剂，例如治疗剂(药物)或诊断(例如成像)剂递送到受试者(例如患者)体内的特定位点或有限区域。
[0003]器官或组织的活性靶向通过所希望的活性部分(例如对比增强剂或细胞毒性化合物)与靶向结构的直接或间接结合实现，所述靶向结构与细胞表面结合或促进在感兴趣的靶位点处或附近的细胞摄取。用于靶向此类试剂的靶向部分通常是对细胞表面靶(例如膜受体)、结构蛋白(例如淀粉样斑)或细胞内靶(例如RNA、DNA、酶、细胞信号传导通路)具有亲和力的结构。这些部分可以是抗体(片段)、蛋白质、适体(aptamers)、寡肽、寡核苷酸、寡糖以及肽 、拟肽(peptoids)和已知在特定疾病或障碍处积累的有机药物化合物。此外，对比/治疗剂可以靶向代谢途径，其在疾病(例如感染或癌症)期间表达升高，例如DNA、蛋白质和膜合成和碳水化合物摄取。在患病组织中，上述标志物可以将患病细胞从健康组织区分并提供早期检测、特异性诊断和(靶向的)治疗的独特可能性。
[0004]通常对于成功的分子成像/治疗剂和特别对于核成像/治疗剂的一个重要标准是它们呈现高靶摄取，同时显示出从非靶组织和从血液的快速清除(通过肾脏和/或肝胆系统)。但是，这经常存在问题:例如，人体中的成像研究已经显示，在肿瘤位置处经放射标记的抗体在24小时内可达到最大浓度，但需要另外几天在循环中的所述经标记的抗体的浓度才下降到低至足以进行成功成像的水平。
[0005]在靶组织中的缓慢或不充分的积累以及从非靶区域缓慢清除所带来的这些问题(特别是对于核成像和治疗)已经导致预靶向方法的应用。
[0006]预靶向是指在靶向方法中的步骤，其中向初级靶(例如细胞表面)提供预靶向探针。后者包括次级靶，其最后将通过装备有次级靶向部分的其它探针(所述效应物探针)进行靶向。
[0007]因此，在预靶向中，将预靶向探针结合到初级靶。所述预靶向探针还携带次级靶，其促进对诊断(成像)和/或治疗剂(所述效应物探针)的特异性结合。在形成所述预靶向探针的结构已经定位在靶位点处之后(花费时间例如24小时)，如果自然清除不充分，则可以使用清除剂从血液除去过量的部分。在第二温育步骤(优选采取较短的时间，例如1-6小时)中，所述效应物探针通过它的次级靶向部分结合到所述(预)结合的预靶向探针。所述次级靶(存在于所述预靶向探针上)和所述次级靶向部分(存在于所述效应物探针上)应该以高特异性和高亲和力快速结合，并且在体内应该是稳定的。
[0008]对于成像，预靶向的一般概念在图1中绘出。在这里，所述效应物探针是包含用于成像模式的可检测标记物的成像探针。所述效应物探针通过其次级靶向基团结合到所述(预)结合的预靶向探针。
[0009]次级靶/次级靶向部分对的一般例子是生物素/链霉亲和素或抗体/抗原系统。为了有效，所述效应物探针必须快速从体内排出(例如通过肾脏)以提供所希望的具有相对低的非靶积累的高肿瘤积累。因此，这些探针通常很小。
[0010]在核成像和放射疗法中，预靶向的概念具有进一步的益处，因为耗费时间的预靶向步骤可以不必使用放射性核素实施，而使用放射性核素的次级靶向步骤能够更快地实施。后者使得能够使用较短寿命的放射性核素，优点是将对患者的放射剂量最小化，并且例如使用PET试剂代替SPECT试剂。结合多齿配体系统(链霉亲和素、树枝状聚合物)在MRI中使用预靶向方法能够在靶位点处提供信号放大。此外，一般而言，该方法有利于通用对比剂的使用。
[0011]通常在生物学中(如抗体-抗原)和特别在预靶向中(生物素-链霉亲和素、抗体/半抗原、反义寡核苷 酸)实施高度选择性相互作用的实体非常大。因此，使用肽和小有机部分作为初级靶向基团的预靶向，以及代谢成像和细胞内靶成像，由于次级靶的尺寸使得小初级基团的使用毫无意义而仍然无法实现。
[0012]而且，现有的预靶向系统被与它们的生物特性相关的因素所限制。生物素是内源分子，并且它的缀合物能够通过血清酶生物素酶断开。当使用反义预靶向时，所述寡核苷酸会受到RNA酶和DNA酶的攻击。蛋白质和肽也经历自然分解途径。这些相互作用可被它们的非共价和动态特性以及有限的靶上驻留时间进一步削弱。而且，内源性生物素与生物素缀合物竞争链霉亲和素结合。最后，链霉亲和素是高度免疫原性的。
[0013]近来的一个发展是避免与仅基于天然/生物靶向结构(即生物素/链霉亲和素、抗体/半抗原、反义寡核苷酸)的预靶向相关的缺点。
[0014]这方面的一篇参考文献是WO 2010/051530，其中基于某些二烯(例如四嗪类)和亲双烯体(例如反式-环辛烯醇(TCO))之间的反应性对预靶向进行了讨论。
[0015]尽管在这些系统的基础上能够获得相对快速的反应，但这还远不如上述生物素-链霉亲和素系统的反应性。因此，避免后者的缺点，却牺牲了所述反应的主要要求，即速度。因此，希望提供一种系统，其不以如上讨论的生物分子为基础，并且还具有理想的快速反应速率。
【发明内容】
[0016]为了更好地满足上述愿望，在一个方面，本发明提供了用于靶向的医学成像和/或治疗的试剂盒，其包含至少一种预靶向探针和至少一种效应物探针，其中所述预靶向探针包含初级靶向部分和第一生物正交反应性基团，且其中所述效应物探针包含效应物部分(例如标记物或药学活性化合物)和第二生物正交反应性基团，其中所述第一和第二生物正交反应性基团中的任一个是亲双烯体(dienophile),且所述第一和第二生物正交反应性基团中的另一个是二烯，其中所述亲双烯体是反式-环辛烯部分，该部分包含至少两个被固定在相同平面中的环外键，且包含至少一个任选经由间隔体与所述预靶向探针或所述效应物探针的连接(linkage)。
[0017]在另一个方面，本发明提供了一种预靶向方法，以及其中使用的预靶向试剂，和其中使用该试剂盒的靶向的医学成像或疗法。
[0018]在另一个方面，本发明是用于动物或人类的预靶向方法中的包含8元非芳族环状单亚烯基部分(优选环辛烯部分，和更优选反式-环辛烯部分)的化合物，所述部分包含至少两个被固定在相同平面中的环外键。
[0019]在又一个方面，本发明涉及包含反式-环辛烯部分的化合物作为亲双烯体反应物在基于逆狄尔斯-阿尔德反应(retro Diels-Alder reaction)的预祀向方法中的用途,所述部分包含至少两个被固定在基本上相同平面中的环外键。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1描绘了如上所述的预靶向概念的一般方案；
图2提供了(3，6) - 二- (2-吡啶基)-S-四嗪和反式-环辛烯亲双烯体之间的[4+2]狄尔斯-阿尔德反应、接着是其中形成产物和分子氮的逆狄尔斯-阿尔德反应的反应方案。因为所述反式-环辛烯衍生物不像在经典狄尔斯-阿尔德反应中那样包含吸电子基团，所以这类狄尔斯-阿尔德反应与经典的狄尔斯-阿尔德反应不同，并且通常被称作“逆电子需求狄尔斯 _ 阿尔德反应(inverse electron demand Diels Alder reaction) ”。在下文中，两个反应步骤序列，即最初的狄尔斯-阿尔德环加成(通常是逆电子需求狄尔斯-阿尔德环加成)和后续的逆狄尔斯-阿尔德反应，将被简称为“逆狄尔斯-阿尔德反应”或“逆-DA”。
[0021]图3 (a和b)描绘了利用逆狄尔斯-阿尔德化学反应的预靶向的一般方案。
[0022]图4和图5描绘了在实施例中提及的化合物的反应方案和化学结构。
[0023]图6描绘了(A)天然CC49、每个分子被(B) 0.4或(C) 5.2当量的内-TCO部分
(6)修饰的CC49、以及每个分子被(D) 0.7或(E) 8.9当量的外-TCO部分(7)修饰的CC49的SEC-HPLC色谱图(在260 nm的UV曲线)。
[0024]图7描绘了 CC49-TC0构建体的SDS-PAGE分析。泳道1_5分别含有天然CC49、被0.4和5.2的内-TCO部分6修饰的CC49、以及被0.7和8.9的外-TCO部分7官能化的CC49(全长凝胶，分子量标准品在左侧)。
[0025]图8描绘了用于TCO定量的反应混合物的SDS-PAGE分析，所述TCO定量使用在实施例2中描述的mLu-DOTA-四嗪滴定(A:凝胶放射摄影术；B:蛋白染色)。泳道1_3含有CC49-TC0-6和mLu-DOTA四嗪(相对于mAb而言10、12和14当量)的混合物；泳道4_6含有CC49-TC0-7和mLu-DOTA-四嗪(相对于mAb而言10、12和14当量)的混合物。
[0026]图9描绘了在实施例3中描述的动力学测定的结果。在mLu-DOTA-四嗪8 (0.67nM)和(A) CC49-TC0-6或(C) CC49-TC0-7 (4种不同的mAb浓度)之间的时间依赖性的反应收率，以及Ktjbs相对于(B) TC0-6或(D) TC0-7浓度的图。
[0027]图10描绘了如在实施例4中描述的、与CC49缀合的TCO 6和7的体内稳定性。条代表平均值，且误差棒代表1个标准偏差(n = 3)。
[0028]图11描绘了在实施例5中描述的(E-主要)-4-((环辛-4-烯基氧基)甲基)苯甲酸2，5- 二氧代吡咯烷-1-基酯12的合成。
[0029]图12描绘了在实施例6中描述的41,45- 二氧代-45-((6-(6-(吡啶-2-基)_1，2，4，5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)氨基)_4，7，10，13，16，19，22，25，28,31,3
4,37-十二氧杂-40-氮杂四十五烧-1-酸2，5- 二氧代吡咯烧-1-基酯16的合成。
[0030]图13描绘了在实施例7中描述的半乳糖-白蛋白-四嗪22的合成。
[0031]图14描绘了在实施例8中描述的⑶-2-(10-氧代-9-氮杂双环[6.2.0]癸-4-烯-9-基)乙酸2，5-二氧代吡咯烧-1-基酯(26)的合成。
[0032]图15 描绘了在实施例 9 中描述的{E)~l,2, 3,4, 4a, 5,6,9, 10，IOa-十氢 _1，4_ 桥亚甲基苯并[8]轮烯-11-醇(32)的合成。
[0033]图16描绘了在实施例10中描述的(E)-3，3a，4，5，9，9a_六氢-1H-环辛[d]咪唑-2(8H)_酮(40)的合成。
[0034]图17描绘了在实施例11中描述的2，2’，2’ '-(10-(2-氧代_2_(6_氧代-6-(646-(吡啶-2-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)吡啶_3_基氨基)己基氨基)乙基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三基)三乙酸(47)和2，2，，2，，-(10-(2-氧代-2-(11-氧代-1 1-(6- (6-(吡啶-2-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)吡啶-3-基氨基)十一烷基氨基)乙基)-1, 4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三基)三乙酸(48)的合成。
[0035]图18描绘了在实施例15中描述的mLu-DOTA-四嗪8 (26.6 nM)和CC49-TC0 (12)(3种不同的mAb浓度)之间的时间依赖性的反应收率，以及Ktjbs相对于TCO 12浓度的图。
[0036]图19描绘了在实施例15中描述的mLu-DOTA-四嗪8 (1.73 nM)和CC49-TC0 (26)(3种不同的mAb浓度)之间的时间依赖性的反应收率，以及Ktjbs相对于TCO 26浓度的图。
[0037]图20描绘了在实施例16中描述的与CC49缀合的TCO 12的体内稳定性。条代表平均值，且误差棒代表1个标准偏差(n = 3)。
[0038]图21描绘了在实施例17中描述的在mAb注射后29 h，1251-CC49_TC0 (7)和1251-CC49-TC0 (12)在荷瘤小鼠中的生物分布。将数据表示为％ID/g，误差棒=1个标准偏差(n=4)。
[0039]图22描绘了在实施例17中描述的用CC49-TC0(7)和CC49_TC0(12)预处理过的小鼠中的177Lu-四嗪8 (注射后3 h)的生物分布。将数据表示为％ID/g，误差棒=1个标准偏差(n=4)。
[0040]图23描绘了在实施例18中描述的通过建模软件实现的三维结构表示(字母x、y和z分别代表X-轴、y-轴和Z-轴)。
[0041]发明详述
一般而言，本发明是基于下述认识:在使用反式-环辛烯部分作为亲双烯体的系统中，如果迫使8元环部分成为展平结构(flattened structure),可以得到反应速率的大幅增加。
[0042]根据本发明， 通过向反式-环辛烯部分提供至少两个被固定在基本上相同平面中的环外键，审慎地达到该展平结构。
[0043]在下文中，为了清晰起见，将该8元环部分定义为反式-环辛烯部分，或缩写为“TC0”部分。应该理解，重点在于该8元环充当亲双烯体的可能性。技术人员熟知下述事实:亲双烯体活性不一定依赖于所有碳原子在环中的存在，因为也已知杂环单亚烯基8元环具有亲双烯体活性。
[0044]因而，一般而言，本发明不严格限于反式-环辛烯。有机化学技术人员会意识到，存在其它基于8元环的亲双烯体，其包含与反式-环辛烯相同的环内双键，但是其可以具有在环内别处的一个或多个杂原子。即，本发明一般地涉及包含至少两个被固定在相同平面中的环外键的8元非芳族环状亚烯基部分，优选环辛烯部分和更优选反式-环辛烯部分。
[0045]与例如药物活性物质(其中微小结构变化经常会改变体内作用)的情况不同，本发明首先且最重要的是，要求正确的化学反应性。因而，可能的结构扩展至技术人员熟知它们作为亲双烯体的反应性的那些结构。
[0046]有机化学技术人员会理解，术语“被固定在基本上相同平面中”表示这样的键合理论:根据该理论，通常认为键是被固定在相同平面中。在相同平面中的这种固定的典型例子包括双键和具有张力的(strained)稠合环。例如，所述至少两个环外键可以是与氧形成的双键的两个键(即C=O)。所述至少两个环外键还可以是在两个邻近碳原子上的单键，前提条件是，这些键一起形成呈现基本上展平结构的稠合环的一部分(即与TCO环稠合)，由此将所述两个单键固定在 基本上一个和相同的平面中。后者的例子包括张力环例如环丙基和环丁基。
[0047]在另一个实施例中，组合前述可能性，所述稠合环是芳族环。在该情况下，所述至少两个键所连接的TCO碳原子是sp2碳原子，且所述键是稠合环的一部分。应该理解，所述键参与芳族稠合环的杂交。
[0048]不希望受理论的约束，本发明的发明人基于该发现认为，至少两个环外键在相同平面中的存在将导致TCO环的至少部分展平，并且该展平又会提供满足在基于逆狄尔斯-阿尔德反应的预靶向中对较高反应性的要求的关键。TCO环的部分展平是两个被固定在相同平面中的环外键存在的固有结果，并且至少代表与环内双键(即碳原子5和6)相对的部分。不论这两个环外键是位于与(4，5)邻近的碳原子5和6处，还是位于碳原子3和4处，都是如此。
[0049]应当指出，根据命名法的选择，TCO亲双烯体也可以被称作E-环辛烯。就常规命名法而言，应该理解，由于环辛烯环上的取代，取决于取代基的位置和分子量，相同的环辛烯异构体形式上可以变成表示为Z-异构体。在本发明中，本发明的任何取代变体，无论是否形式上是“E”或“Z”，或“顺式”或“反式”异构体，都将被认为是未被取代的反式-环辛烯或未被取代的E-环辛烯的衍生物。术语”反式-环辛烯”(TCO)以及E-环辛烯可以互换使用，并且对于根据本发明的所有亲双烯体，以及对于取代基形式上将需要相反命名的情况，都适用。即，本发明涉及其中如下编号的碳原子I和6位于或反式位置的环辛烯。
【权利要求】
1.用于靶向的医学成像和/或治疗的试剂盒，其包含至少一种预靶向探针和至少一种效应物探针，其中所述预靶向探针包含初级靶向部分和第一生物正交反应性基团，且其中所述效应物探针包含效应物部分，例如标记物或药学活性化合物，和第二生物正交反应性基团，其中所述第一和第二生物正交反应性基团中的任一个是亲双烯体，并且所述第一和第二生物正交反应性基团中的另一个是二烯，其中所述亲双烯体是反式-环辛烯部分，该部分包含至少两个被固定在相同平面中的环外键，且包含至少一个任选经由间隔体与所述预革El向探针或所述效应物探针的连接。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述至少两个环外键是基本上展平的稠合环结构的一部分。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述至少两个环外键与反式-环辛烯环中的单个sp2碳连接。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述至少两个环外键是碳-至-杂原子双键的一部分。
5.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其中所述至少两个环外键是稠合的芳族环的一部分。
6.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所述反式-环辛烯部分满足式(I):
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中所述至少两个被固定在相同平面中的环外键选自:(a)稠合的环丙基环的单键，(b)稠合的环丁基环的单键，(C)稠合的芳族环的杂合键，(d)与氧形成的环外双键，和(e)与碳形成的环外双键。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的试剂盒，其中所述亲双烯体是选自下述结构的化合物:
9.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所述二烯选自如下定义的式(2)、(3)、⑷和(5)的化合物:
10.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所述预靶向探针包含作为初级靶向部分的抗体。
11.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所述效应物探针包含作为效应物部分的可检测标记物，优选用于成像系统的对比剂，所述可检测标记物选自:可MRI成像的试剂、自旋标记物、光学标记物、超声响应试剂、X-射线响应试剂、放射性核素、FRET型染料、(生物)发光或荧光分子或标记、生物素、顺磁成像试剂和超顺磁成像试剂。
12.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所述效应物探针包含作为效应物部分的药学活性化合物。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述药学活性化合物是选自下述的同位素:.24Na、32P、33P、47Sc、59Fe、67Cu、76As、77As、80Br、82Br、89Sr、90Nb、90Y、103Ru、105Rh、ici9PcU .111Ag、121 Sn、.127Te,1311,140La^141Ce,142Pr,143Pr,144Pr,149Pm,149Tb,151Pm,153Sm,159Gd,161Tb,165Dy,166Dy,166Ho,.169Er、172Tm、175Yb、177Lu、186Re、188Re、198Au、199Au、211At、211B1、212B1、212Pb、213B1、214M
14.化合物，选自下述结构:
15.预靶向试剂，其包含初级靶向部分和生物正交反应性基团，其中所述生物正交反应性基团是根据权利要求9中限定的式(2)-(5)中任意一个的二烯与权利要求1-8中任一项中限定的亲双烯体之间的[4+2]逆狄尔斯-阿尔德反应的反应配偶体。
16.成像探针，其包含可检测标记物和生物正交反应性基团，所述可检测标记物优选是选自下述的同位素:3H、nC、13N、150、18F、19F、51Cr、52Fe、52Mn、55CO、6°Cu、61Cu、62Zn、62Cu、63Zn、64Cu、66Ga、67Ga、68Ga、70As、71As、72As、74As、75Se、75Br、76Br、77Br、80Br、82Br、82Rb、86Y、88Y、89Sr、89Zr、97Ru、"Tc,110In,111In,113In,114In,117Sn, 1201 , 122Xe, 1231 , 1241 , 1251 , 166Ho,167Tm^169Yb,193Pt,195Pt^201Tl2°3Pb，其中所述生物正交反应性基团是根据权利要求9中限定的式(2)-(5)中任意一个的二烯与权利要求1-8中任一项中限定的亲双烯体之间的[4+2]逆狄尔斯-阿尔德反应的反应配偶体。
17.治疗探针,其包含药学活性化合物和生物正交反应性基团,所述药学活性化合物优选是选自下述的同位素:24Na、32P、33P、47SC、59Fe、67Cu、76AS、77AS、8°Br、82Br、89Sr、9°Nb、9°Y、103Ru,127Te,1311,140La^141Ce,142Pr,143Pr^144Pr,149Pm^149Tb,151Pm^153Sm,159GcU 161Tb、165Dy、166Dy、166Ho、169Er、172Tm, 175Yb、177Lu、186Re、188Re、198Au、199Au、211At、211B 1、212B 1、212Pb、213B1、214B1、223Ra和225Ac,其中所述生物正交反应性基团是根据权利要求9中限定的式(2)-(5)中任意一个的二烯与权利要求1-8中任一项中限定的亲双烯体之间的[4+2]逆狄尔斯-阿尔德反应的反应配偶体。
18.预靶向方法，其包括:向受试者给予根据权利要求15所述的预靶向试剂，并使所述试剂在所述受试者的系统中循环有效实现所述初级靶向部分与初级靶的结合的一段时间，接着从身体清除未结合的试剂。
19.成像方法，其包括:实施根据权利要求18所述的预靶向方法，接着给予根据权利要求16所述的成像探针，其中所述预靶向试剂和所述成像探针中的所述生物正交反应性基团一起形成所述[4+2]逆狄尔斯-阿尔德反应的反应配偶体。
20.在受试者中的靶向的医学治疗方法，其包括:实施根据权利要求17所述的预靶向方法，接着给予根据权利要求16所述的治疗探针，其中所述预靶向试剂和所述治疗探针中的所述生物正交反 应性基团一起形成所述[4+2]逆狄尔斯-阿尔德反应的反应配偶体。
21.用于根据权利要求17-19中任一项的方法的根据权利要求15所述的试剂。
22.用于动物或人类的预靶向方法的如权利要求1-8或14中任一项中限定的化合物。
23.如权利要求1-8或14中任一项中限定的反式环辛烯作为亲双烯体反应物在基于逆狄尔斯-阿尔德反应的预靶向方法中的用途。
【文档编号】A61K47/48GK103648533SQ201280034134
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年5月7日 优先权日:2011年5月9日
【发明者】M.S.罗比拉德, J.卢布, R.罗斯辛, S.M.范登博世, R.M.维斯蒂根 申请人:皇家飞利浦有限公司