包含重组人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的组合物和制剂及其制备方法【专利摘要】本发明公开了包含重组艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)的组合物。所述IDS组合物的糖基化模式和甲酰甘氨酸含量不同于Elaprase，并且所述IDS组合物具有更好的药效且与常规药剂相比更安全，因此可有效地用于治疗亨特综合征(Hunter?syndrome)。【专利说明】包含重组人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的组合物和制剂及其制备方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及用于治疗亨特综合征(Huntersyndrome)的组合物(其包含重组人艾杜糖醒酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase,下文中称为“IDS”))、包含所述组合物的制剂、以及用于制备所述组合物和制剂的方法。[0002]更特别地，根据本发明的用于治疗亨特综合征的组合物包含具有SEOIDNO:1所示氨基酸序列的IDS作为活性成分，其中位于SEOIDNO:1之IDS氨基酸序列中第59位的半胱氨酸残基以65%或更高的摩尔比、优选以75%或更高的摩尔比、更优选以80%或更高的摩尔比转化为甲酰甘氨酸(FGly:2_氨基-3-氧代丙酸)。此外，包含在用于治疗亨特综合征的组合物中的IDS含有量为2.0至4.0摩尔(优选量为2.3至3.5摩尔，更优选量为2.5至3.0摩尔)/摩尔IDS的甘露糖-6-憐酸(mannose-6-phosphate)。[0003]用于制备根据本发明的用于治疗亨特综合征之组合物的方法包括:[0004](I)对用编码由SEOIDNO:1所示之IDS的基因转化的重组细胞株进行培养，并获得培养物；和[0005](2)通过阴离子交换色谱、疏水色谱、阳离子交换色谱和亲和色谱对该培养物进行，[0006]其特征在于，所述重组细胞株是在水解产物存在下进行培养，并且所述阳离子交换色谱使用PH4.0至6.0的洗脱缓冲液来进行。[0007]由于与常规产品相比在安全性和药效方面具有优势，所以包含IDS的治疗组合物以及包含所述组合物的制剂可有效地用于治疗亨特综合征。【
背景技术：
】[0008]亨特综合征或黏多糖忙积症II型(mucosaccharidosistypeII)是溶酶体忙积症(lysosomalstoragedisease,LSD),其中黏多糖(也称为糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG))因IDS缺乏而未正确分解并在身体内累积。随着GAG继续在身体各处细胞中累积，亨特综合征的多种征兆变得更加明显。患有亨特综合征的一些人的身体表现包括明显的面部特征和大的头部。亨特综合征中具有代表性的症状是由于肝肿大或脾肿大而增大的腹部、耳聋、瓣膜性心脏病(valvularheartdisease)、阻塞性呼吸道疾病(obstructiveairwaydisease)以及睡眠呼吸暂停。此外，亨特综合征可影响主要关节,导致关节僵硬和运动受限。在亨特综合征的一些病例中，中枢神经系统受牵连导致发育延缓和神经系统问题。已知亨特综合征的发生率为I/162，000并且是染色体X-连锁的隐性形式的遗传病，因此给患者及家人带来极大痛苦。[0009]因此，关于亨特综合征的治疗已经进行了多种试验，包括骨髓移植、酶替代和基因治疗。虽然骨髓移植能够终止大多数症状，但是难以找到与所有患者匹配的HLA(人白细胞抗原)。此外，骨髓移植是伴随有若干副作用的外科大手术，这样的副作用包括如果HLA不是匹配的，则患者的生命将处于高风险中。用于亨特综合征的基因治疗借助于病毒载体(例如腺病毒或反转录病毒)或非病毒载体将正常的IDS基因递送到体内。然而,基因治疗仍只是实验技术，并没有在临床上应用。至于用于亨特综合征的酶替代治疗，其施用在外部产生的IDS并且优势是简单。然而，酶替代必须持续进行，这会带来高费用。使用重组DNA技术生产的Elaprase?(shirePharmaceuticalsGroup)被FDA批准作为用于亨特综合征的酶替代治疗剂。然而，该药物非常昂贵且存在效果和安全性差的缺点。[0010]如上所述，尽管已经开发了多种用于亨特综合征的治疗，但是仍迫切需要表现出高疗效及高安全性的新治疗和药剂(agent)。【
发明内容】[0011]技术问题[0012]本发明的一个目的是克服现有技术中遇到的问题并提供用于治疗亨特综合征的组合物和包含该组合物的制剂，所述组合物包含作为活性成分的重组IDS，所述重组IDS保证高的疗效和安全性并通过改进的培养和纯化过程来生产。[0013]本发明的另一个目的是提供用于制备用于治疗亨特综合征之组合物和包含所述组合物之制剂的方法。[0014]问题的解决方案[0015]为了实现上述目的，本发明提供用于治疗亨特综合征的组合物，其包含具有SEOIDNO:1所示氨基酸序列的重组IDS作为活性成分，其中在59位的半胱氨酸残基以65%或更高的摩尔比、优选以75%或更高的摩尔比、更优选以80%或更高的摩尔比转化为甲酰甘氨酸(FGly)。[0016]IDS(在本文中还称为艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶或I2S)在从人的肝、肾或胎盘分离和纯化时具有56kDa的分子大小(Bielicki,J等(1990)Biochem,J.,271:75~86)。IDS作为550个氨基酸的单体蛋白质而表达，并且在切割掉25个氨基酸的信号肽之后作为525个氨基酸的成熟活性蛋白质而分泌到培养基中。IDS的分子量随着糖基化而变化，并且发现在用内切糖苷酶F处理后范围为约60至90kDa，如通过SDS-PAGE所测量的。[0017]IDS包含两个二硫键和八个N-连接的糖基化位点，并且在经过翻译后修饰之后作为糖蛋白而产生，在上述翻译后修饰中，N-连接的糖基化位点在真核生物中被复合的、杂合的和高甘露糖型寡糖链所占据。IDS一旦分泌到培养基中，就可以在经过典型分离和纯化过程之后作为药物使用。IDS可以是具有多种糖基化模式的糖蛋白形式，这取决于多种因素，包括例如，IDS基因重组、转化(例如，所使用的细胞系)、培养和纯化技术。[0018]在本发明中，公开了甘露糖-6-磷酸(M6P)的含量和CyS-59向FGly的转化率对IDS的疗效和安全性具有重大影响。甘露糖-6-磷酸(M6P)残基的存在允许酶与细胞表面的M6P受体特异性结合，导致酶的细胞内化，溶酶体的靶向和积聚的GAG的后续分解代谢。IDS的生物活性还取决于保守的半胱氨酸(第59位)向甲酰甘氨酸的后修饰。[0019]除非另有说明，否则本文使用的术语“IDS”是指与碳水化合物相连的IDS蛋白质，SP，糖基化IDS。本发明的IDS优选地具有SEQIDNO:1的氨基酸序列，但不限于此。对于本领域中具有普通知识的那些人(下文中称为“普通技术人员”)而言应显而易见的是，只要使IDS保留期望的活性，那么其中在SEQIDNO:1的氨基酸序列的一些氨基酸残基上发生突变(例如插入、缺失和替换)的任何氨基酸序列均落入本发明的范围内。[0020]本文使用的术语IDS的“糖基化模式”是指与所得IDS的8个糖基化位点结合的寡糖的特征(例如，寡糖的糖基化位点和种类)。[0021]在一个实施方案中，包含在根据本发明用于治疗亨特综合征之组合物中的IDS具有与已知的(SEQIDNO:1)相同的氨基酸序列，但是具有不同的糖基化模式和不同的第59位半胱氨酸向甲酰甘氨酸的转化率，如上所述(参照实施例1-5和1-6)。[0022]换言之，在根据本发明的用于治疗亨特综合征之组合物中使用的IDS具有SEQIDNO:1的氨基酸序列，其在第59位的半胱氨酸以65%或更高的摩尔比、优选以75%或更高的摩尔比、更优选以80%或更高的摩尔比向甲酰甘氨酸(FGly)转化，而Elaprase的转化率为约50%(GenetMed2006:8(8):465-473)。已知甲酰甘氨酸密切参与IDS降解底物的能力(即IDS的活性)。因此，因为本发明的组合物不同于常规药剂Elaprase，所以根据本发明的组合物和制剂因在IDS氨基酸序列第59位的半胱氨酸向甲酰甘氨酸的较高转化率而可以对亨特综合征表现出与常规药剂Elaprase可表现出之疗效相比更高的疗效。[0023]此外，在根据本发明的用于治疗亨特综合征之组合物或制剂中使用的IDS含有量为2.0至4.0摩尔(优选量为2.3至3.5摩尔、更优选为2.5至3.0摩尔)/摩尔IDS的甘露糖-6-磷酸。M6P在IDS的细胞内化和后续向细胞内溶酶体的靶向中发挥重要作用。因此，包含具有高含量M6P的IDS的本发明的制剂保证了对于该酶之受体介导的吸收机制和靶向溶酶体的高性能，从而引起积聚的GAG的有效分解代谢。[0024]根据本发明的包含IDS的用于治疗亨特综合征的制剂可通过将本发明的组合物与可药用载体(pharmaceuticallyacceptablecarrier)配制成合适的形式来制备。[0025]本文使用的术语“可药用”载体是指无毒的与活性成分在生理上相容的载剂，其适于被动物摄取，没有不当毒性、不相容性、不稳定性、刺激性、变态反应等。[0026]根据本发明的组合物可根据所采用的施用途径与合适的载剂一起配制。根据本发明的制剂可经口或肠胃外施用，但并不限于此。就肠胃外施用而言，可采用选自以下的途径:经皮、鼻内、腹膜内、肌内、皮下或静脉内途径。[0027]就经口施用而言，药物组合物可使用本领域中已知的方法与合适的经口载剂组合配制成散剂、颗粒剂、片剂、丸剂、锭剂(troche)、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、混悬剂和囊剂(wafer)。可用于所述制剂中的合适载剂的实例包括:糖类，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇以及麦芽糖醇；淀粉类，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素类，例如纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基甲基纤维素；以及填充剂，例如明胶和聚乙烯吡咯烷酮。任选地，所述制剂还可包含崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸或藻酸钠。此外，还可使用抗凝结剂、润滑剂、芳香剂、乳化剂和防腐剂。[0028]此外，本发明的组合物可使用本领域公知的方法与肠胃外载剂组合配制成肠胃外剂型，例如注射制剂、经皮制剂或鼻内吸入剂。为了用于注射，所述制剂必须无菌并且被保护以免受微生物(例如细菌和真菌)污染。适合用于注射的载剂的实例可包括但不限于:水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其组合和/或含植物油的溶剂或分散介质。更优选地，所述载剂可以是等张溶液，例如汉克溶液(Hank’solution)、林格溶液(Ringer’solution)、含三乙醇胺的PBS(磷酸缓冲盐水)或注射用无菌水、10%乙醇、40%丙二醇以及5%葡萄糖。为了保护注射制剂免受微生物污染，其还可包含抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等。此外，注射制剂在大多数情况下还可包含等张剂，例如糖或氯化钠。这些制剂公开在药学领域中公知的文献中(Remington’sPharmaceuticalScience,第15版，1975,MackPublishingCompany,Easton,Pennsylvania)。就吸入而言,根据本发明的制剂可使用合适的抛射剂(例如二氯氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷)、二氧化碳或合适的气体从压缩包或喷雾器以气雾剂喷雾的形式方便地递送。在压缩的气雾剂的情况下，剂量单位大小可通过用于递送计量量的阀来确定。例如，用于吸入器(inhaler)或吹入器(insufflator)中的明胶胶囊和药筒(cartridge)可配制成包含化合物与合适的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物以用于这些系统。[0029]其他合适的药用载剂描述于Remington’sPharmaceuticalSciences,第19版，MackPublishingCompany,Easton,PA,1995中。[0030]此外，根据本发明的制剂还可包含一种或更多种缓冲剂(例如，盐水或PBS)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、稳定剂(亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或者抗坏血酸)、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂(例如，EDTA或谷胱甘肽)、辅药(例如，氢氧化铝)、助悬剂、增稠剂和/或防腐剂(苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇)。[0031]此外，本发明的组合物可配制成向哺乳动物施用之后允许迅速、持续或延迟释放活性成分的剂型。如此制备的制剂的有效量可通过多种途径(包括经口、经皮、皮下、静脉内和肌内途径)施用。本文使用的术语“有效量”是指当向患者施用时允许追踪发生诊断或治疗作用的IDS的量。根据本发明的制剂的剂量可根据多种因素而改变，其包括施用的途径、待治疗对象的类型、待治疗疾病的类型、施用途径、疾病的严重程度、以及患者的年龄、性别、体重、状况和健康状态。根据本发明的包含IDS的制剂可以以如下剂量使用:每剂量0.1至110mg/kg,优选0.5至1.0mg/kg。[0032]根据本发明的用于制备治疗组合物的方法包括:[0033](1)对用编码SEOIDNO:1所示IDS的基因转化的重组细胞株进行培养，并获得培养物；和[0034](2)通过阴离子交换色谱、疏水色谱、阳离子交换色谱和亲和色谱对该培养物进行纯化，[0035]其中，所述重组细胞株是在水解产物存在下进行培养，并且所述阳离子交换色谱使用PH4.0至6.0的洗脱缓冲液进行。[0036]更特别地，根据本发明用于制备治疗组合物的方法包括:[0037](1)用带有IDS基因的表达载体转化宿主细胞以获得重组细胞株[0038](2)在水解产物存在下于无血清培养基中培养重组细胞株并获得培养物；[0039](3)通过阴离子交换色谱、疏水色谱、阳离子交换色谱和亲和色谱从该培养物中纯化IDS，所述阳离子交换色谱使用pH4.0至6.0的洗脱缓冲液进行；以及[0040](4)将纯化的IDS与可药用载体相组合。[0041]在所述方法中，步骤(1)涉及通过将带有IDS基因的表达载体引入宿主细胞以建立重组细胞株。IDS的氨基酸序列和编码IDS的基因是本领域中已知的。优选编码具有SEQIDNO:1之氨基酸序列的IDS的基因，但不作为限制性实例而提供。如果氨基酸序列保留旨在通过本发明带来的IDS活性，则即使在SEQIDNO:1的氨基酸序列上的一些氨基酸残基通过插入、缺失和/或替换而突变，其基因也可用于本发明中。带有基因的表达载体可使用本领域已知的典型方法来构建。此外，表达载体可包含允许鉴定基因之引入的标记基因。标记基因的实例包括二氢叶酸还原酶基因(dihydrofolatereductasegene,dhfr),但不限于此。优选的是pJK-dhfr-0r2-1DS载体(图2)。[0042]可用于步骤(1)的宿主细胞可以是动物细胞并且其实例包括但不限于:中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞7(C0S7)和NSO细胞，优选CHO细胞。CHO细胞系是在生物医药产品的生产中使用最广泛的细胞系之一，这是由于其高细胞生长速率和生产率、易于基因操作、在大规模悬浮培养中快速增殖以及对于无蛋白质培养基的高适应性。步骤(1)中的转化可根据本领域中已知的方案进行。[0043]在所述方法中，步骤(2)涉及在无血清的培养基中培养其中锚定IDS表达载体的重组细胞株。培养可在培养基中并且在优化用于该种宿主细胞的条件下进行。优选无血清培养基。由于不含血清(例如，牛血清)，这样的培养基避免引发与血清相关的副作用或风险的可能性。[0044]在本发明的一个实施方案中，用IDS表达载体转化的重组细胞株的培养可进一步扩大规模。例如，本发明的重组细胞株可在摇瓶中培养然后在生物反应器中扩大规模到数百至数千升。培养步骤在水解产物存在下进行，该水解产物对甲酰甘氨酸含量的确定具有重要影响。优选地，水解产物以形成0.1~10.0g/L之终浓度的量添加。可用于本发明的水解产物可以是通过水解动物或植物材料获得的那些。更特别地，水解产物可通过水解选自(但不限于)大豆、马铃薯、小麦胚芽和酵母中的至少一种来获得。[0045]在所述方法中，步骤(3)涉及通过阴离子交换色谱、疏水色谱、阳离子交换色谱和亲和色谱从细胞培养物中纯化IDS。[0046]优选地，上述四种色谱过程可以按上述顺序进行。然而，对于本领域普通技术人员而言应显而易见的是，如有必要该顺序可以改变。连同所述色谱过程的顺序，树脂和洗脱缓冲液的PH值一起在确定IDS的糖基化模式和甲酰甘氨酸含量中是重要的。[0047]阴离子交换色谱旨在从细胞培养物中除去染料和多种杂质，并且其使用pH5.5至7.5的洗脱缓冲液在用QSepharose"树脂填充的柱上进行。[0048]疏水色谱旨在除去阴离子交换色谱之后剩余的染料和杂质。该色谱使用pH5.0至7.0的洗脱缓冲液在用苯基Sepharose"树脂填充的柱上进行。[0049]阳离子交换色谱旨在选择高的甲酰甘氨酸含量并且除去剩余杂质。该色谱使用PH4.0至6.0的洗脱缓冲液在用阳离子交换树脂填充的柱上进行。可用于本发明的阳离子交换树脂的实例可包括快流速CM琼脂糖凝胶、快流速SP琼脂糖凝胶、快流速S琼脂糖凝胶和CaptoMMC,所有均来自GEHealthcare，但不限于此。优选地，洗脱缓冲液的pH为4.0至6.0。[0050]亲和色谱旨在除去用于阳离子交换色谱的甘油并且浓缩洗脱液体积。该色谱使用pH6.0至8.0的洗脱缓冲液在用BlueSepharose?树脂填充的柱上进行。[0051]每种类型的色谱的条件可由本领域普通技术人员最佳地修改。关于具体的色谱条件，可参照下述实施例1-5。[0052]根据本发明用于制备包含作为活性成分的IDS的组合物的方法还可包括灭活可并入该组合物中的病毒。灭活可通过多种方式进行，优选地通过将培养物在PH3.0~4.0或在高PH条件下保持预定的时间。灭活过程可在纯化过程期间完成，优选地在色谱期间，更优选地在疏水色谱与阳离子交换色谱之间。[0053]在色谱过程之后，可以将如此得到的活性级分浓缩和过滤以提供IDS，其可用作药物组合物的活性成分。[0054]所述组合物可以与可药用载体混合并配制成合适的剂型。[0055]通过根据本发明的方法制备的包含IDS的组合物与常规IDS组合物相比具有以下优势:1)该组合物由于较高的甲酰甘氨酸含量而发挥较高的药效；2)该组合物可更有效地分解代谢积聚在溶酶体中的GAG；3)该组合物不合动物来源的血清，因而是安全的；以及4)该组合物由于其99.9%或更高的纯度而是安全且有效的。[0056]发明的有利效果[0057]根据本发明的包含重组IDS的组合物和包含所述组合物的制剂在药效和安全性方面优于常规药剂Elaprase，因而可有效地用于治疗亨特综合征。[0058]附图简述[0059]图1是例示构建用于构建IDS表达载体的pJK-dhfr-1DS-Sl载体之方案的视图。[0060]图2是例示由图1的pJK-dhfr-1DS-Sl构建IDS表达载体pJK-dhfr-0r2_IDS之方案的视图。[0061]图3是例示从经转化的CH0-DG44中分离和纯化IDS的流程图。[0062]图4是示出用于分析N-末端序列的IDS的SDS-PAGE结果之照片，其中标记跑在泳道M，糖基化IDS在泳道1，PNGaseF在泳道2，去糖基化IDS在泳道3。[0063]图5是例示IDS氨基酸序列之分析过程的流程图。[0064]图6是示出通过MALD1-MS/MS和LC-ES1-MS/MS分析的本发明IDS之氨基酸序列的视图。[0065]图7是示出IDS中的二硫键位置的未还原的和还原的IDS样品的RP-HPLC色谱图。[0066]图8是示出通过MALD1-MS分析的本发明IDS中的二硫键位置的视图。[0067]图9是示出通过MALD1-MS/MS分析的本发明IDS中的二硫键位置的视图。[0068]图10是示出通过MALD1-MS/MS获得的本发明IDS中的二硫键位置的视图。[0069]图11是示出在用多种糖苷水解酶处理之后通过SDS-PAGE运行IDS以检查本发明IDS之糖基化的照片。[0070]图12是示出本发明IDS中的甘露糖-6-磷酸含量的HPAEC-PAD色谱图。[0071]图13是示出本发明IDS之纯度的尺寸排阻色谱图。[0072]图14是示出本发明IDS在天然底物上的催化活性的离子色谱图。[0073]图15是示出IDS的细胞吸收量相对于添加至正常成纤维细胞中的IDS量的比值的双倒数作图(Lineweaver-Burkplot)。[0074]图16是示出内化到正常人成纤维细胞和患有亨特综合征之患者的细胞中的本发明IDS之量的图。[0075]图17是示出本发明IDS中甲酰甘氨酸含量之测量的视图。[0076]图18是示出在阳离子交换色谱之前和之后的本发明IDS的IEF(等电点聚焦)点的视图，其中M跑在M泳道，阳离子交换色谱加载的样品在泳道1，阳离子交换色谱的洗脱液在泳道2，阳离子交换色谱之后的再生溶液在泳道3。[0077]本发明实施方式[0078]通过以下实施例可获得对本发明的更好理解，但给出以下实施例仅用于举例说明，而不应被解释为限制本发明。[0079]实施例1:1DS的制备[0080]〈1-1>某闵获取[0081]按照先前所述[S.Beckebaum等，Immunology,2003,109:487_495]从人血液中分离外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)。根据先前所述的方案[M.J.Holland等，Clin.Exp.1mmunol.，1996，105:429-435]从PBMC中提取总RNA。为了由总RNA构建cDNA文库,借助于单链合成试剂盒(Boehringermannheim)使用oligo-(dT)引物来合成单链cDNA。就此而言，将经DEPC处理的蒸馏水添加至含有IygSRNA的微量离心管(eppendorftube)中，以形成12.5μI的终体积。然后，将Iμg的20pmololigo(dT)引物添加至管中，接着在70°C孵育2分钟并冷却。向该反应混合物中添加4μg的反应缓冲液、Iμg的dNTP、lμg的RNase抑制剂和Iμg的反转录酶，然后于42°C反应I小时以合成单链cDNA。在SEQlDNO:2至4的引物存在下以cDNA为模板进行PCR以扩增人IDS基因。在该情况中，将各引物设计成包含限制酶识别位点以用于基因克隆。[0082]<1~2>表汰载体的构律[0083]A.DTK-dhfr-1DS-Sl载体的构律[0084]将抗体的轻链信号序列(来源于人IgG轻链的一部分)作为非编码序列引入通过实施例〈1-1>在PCR之前获取的IDS基因的5’-末端。将由此获得的PCR产物通过电泳在凝胶上运行，然后使用凝胶提取试剂盒来分离人IDS基因。用EcoRV和ApaI消化分离的IDS基因和pJK-dhfr-0r2载体(Aprogen)并在16°C彼此连接20小时。将如此构建的重组载体转化到大肠杆菌(DH5a)中，然后将其涂布在含有SOyg/mi氨苄青霉素的LB平板上并孵育过夜。选择并培养在该平板上生长的菌落以从其中分离质粒(图1)。[0085]B.重鉬人IDS表汰质粒的构律[0086]为了将上面构建的质粒的非编码序列变为信号序列，将重组人IDS亚克隆到pJK-dhfr-or2载体中。为此，用EcoRV和ApaI消化pJK-dhfr-1DS-Sl载体以提供部分IDS基因(1233bp)，然后将其插入先前用相同限制酶处理的PJK-dhfr-0r2载体以构建pJK-dhfr-1DS-S2载体。为了向5’-末端引入非编码序列和信号序列，将IDSNI正向引物(SEQIDNO:5)和IDS4反向引物(SEQIDNO:7)用于PCR，其中pJK-dhfr-1DS-Sl载体作为模板。在以94°C开始运行5分钟之后，PCR以94°C进行I分钟、55°C进行30秒以及72°C进行40秒运行30个循环，并且通过在72°C延伸10分钟而完成。[0087]该PCR扩增提供了448bp的部分IDS基因。将该基因用作模板用于PCR，在与上述相同的条件下，在IDSN2正向引物(SEQIDNO:6)和IDS4反向引物(SEQIDNO:7)存在下再次进行所述PCR。其导致476bp长的DNA片段的合成。[0088]随后，用EcoRV分别消化pJK-dhfr-1DS_S2载体和重组人IDS基因片段(476bp)。通过电泳在凝胶上分离消化物以得到载体和476bp长的IDS片段。在T4DNA连接酶的存在下将这些载体和插入片段于16°C连接12小时以构建pJK-dhfr-0r2-1DS质粒。这些过程在图2中例示。[0089]为了确认IDS表达质粒的构建，用pJK-dhfr-0r2_IDS转化DH5并在含有氨苄青霉素(50yg/mL)的LB平板上培养24小时。从如此形成的菌落中分离并消化质粒以测量插入片段的大小。此外，使用T7引物(SEQIDNO:8)来进行碱基测序。[0090]<1-3>重鉬人IDS表汰株的诜择[0091]A.CH0-DG44的转染[0092]将CH0-DG44用作用于表达本发明IDS的宿主细胞。突变中国仓鼠卵巢细胞CH0-DG44带有双缺失的内源性dhfr(二氢叶酸还原酶)基因，该基因编码DHFR酶。DHFR酶参与叶酸从二氢叶酸(FH2)到四氢叶酸(FH4)的转化，四氢叶酸(FH4)参与核酸的从头合成。细胞中dhfr的水平取决于MTX的浓度。MTX结构上类似于叶酸，是DHFR的底物，与叶酸竞争地结合二氢叶酸还原酶，所以大多数二氢叶酸还原酶在MTX存在下失去其活性。因此,如果细胞不扩增足够量的dhfr,则其会由于不能合成生命必需的核酸而死亡。相反,如果该扩增是足够的，则细胞因为其相对丰富的dhfr可在高浓度的MTX下存活。该系统可应用于动物细胞以选择转染的细胞系，这样的细胞系可扩增dhfr基因，因此可以扩增目的结构基因。[0093]为此，将dhfr基因作为扩增标记引入到构建于实施例1-2的IDS表达载体PJK-dhfr-0r2-1DS中，并使用MTX和dhfr基因进行基因扩增。[0094]就此而言，将DG44细胞系(获自Chaisin博士，ColumbiaUniversity)悬浮在IOml的DMEM/F12(补充有核苷酸和核苷，以及10%胎牛血清(FBS))并通过以1000rpm旋转5分钟而收获。将细胞接种到在T-175瓶中的50ml的培养基中并在5+1%CO2培养箱中于37±1°C孵育。在转染前一天，从T-175瓶中取出用于DG44细胞的培养基，将细胞用PBS清洗两次并通过胰蛋白酶消化而脱离(detach)。然后，将其以5X105个细胞的密度接种于T-25瓶中并在5+1%CO2培养箱中于37±1°C培养24小时。在光学显微镜下检查细菌或真菌污染同时进行PCR-ELISA以检查细胞是否被支原体污染。[0095]用在实施例1-2中构建的IDS表达载体PJK-dhfr-0r2-1DS使用脂质转染胺(Lipofectamine)试剂盒来转染无菌DG-44细胞。就此而言,将5μg的表达载体和50μg的脂质转染胺分别稀释到800μgOpt1-MEMI中，小心混合以免形成泡沫，并且在室温下放置15分钟。同时，将DG44细胞用无菌PBS清洗一次并用Opt1-MEMI清洗3次。向DG44细胞中小心地添加DNA脂质转染胺混合物，接着加入6.4ml的Opt1-MEM，然后在5+1%CO2培养箱中于37±1°C孵育5小时。此后，在补充有8ml的DMEM/F12和1.6ml的FBS的培养基中另外进行48小时的孵育以促进细胞膜恢复和细胞生长。[0096]B.遗传霍素(G418)杭件细朐株的诜择[0097]用0.25%的胰蛋白酶使培养的细胞脱离、计数、并以5XIO3个细胞/孔的密度接种于含100μgMEM-α培养基(补充有10%的经透析的FBS和550μg/mLG418)的96-孔板的各孔中。次日，加入IOOyg/孔量的相同培养基，并将细胞培养2至3周以形成菌落。当细胞生长到50%汇合(confluency)时,将培养基更换为新鲜培养基。维持3天之后，收集培养基用于酶分析。[0098]每隔3天将培养基更换为200μg的新鲜培养基。培养3~4天之后，当用光学显微镜观察时，观察到未转染的细胞(即对遗传霉素没有抗性的细胞)开始从96孔板底部脱离。培养选择的克隆同时按顺序依次从96孔板转移到24孔板、6孔板和IOOmm培养皿中。当细胞在IOOmm培养皿中生长到80~90%汇合度，再次测量表达水平。用0.25%的胰蛋白酶使细胞脱离、计数并以5XIO5个细胞/孔/3mL的密度平板接种到6孔板中，保持3天并计数。定量分析蛋白质的表达水平。根据分析结果，选择出15个克隆。[0099]C.具有高表达能力的IDS表达株的选择[0100]将15个所选择的克隆于提高浓度的MTX中培养以选择IDS在其中扩增的细胞株。[0101]在这种情况中，将细胞以IXlO6个细胞/IOOmm培养皿/IOmL含MTX的培养基的密度接种并培养至80~90%汇合。将细胞培养物的十分之一体积再次接种到IOOmm培养皿/IOml中。将该传代培养过程重复两次。使细胞经历至少三次传代以使其充分适应提高的MTX浓度。MTX的浓度从5nM(对于在最初三天进行分析之后选择的克隆)提高至20nM。在每一步中，将适应于提高的MTX浓度的克隆培养三天以测量细胞生长速率。测量IDS表达水平以选择IDS基因发生扩增的细胞株(即重组IDS在其中高速表达的细胞株)。在所选择的细胞株中，将NI4用于后续实验中，因为其具有最高表达水平。[0102]P.通讨极限稀释诜择单个菌株[0103]菌株NI4有可能已变得与其他菌株混合。因此，将该菌株分离成单一菌株。通过极限稀释对在20nMMTX的条件下存活下来的NI4克隆进行亚克隆以选择出期望的细胞株。[0104]首先，将NI4以0.5个细胞/孔的密度接种在96孔板中的IMDM培养基(GibcoBRL,Cat#12200)中，并用每隔三天用经补充的培养基进行培养。第三天，在显微镜下观察板以排除每孔中形成两个或更多个克隆的孔。选择每孔中只形成一个克隆的孔并继续进行培养。培养15天之后，将细胞传代培养于96孔板，并且当细胞生长到90%汇合时，补充新鲜培养基。[0105]从NI4菌株中共鉴定了263个单个菌株。其中，发现菌株S46具有最高的IDS活性并将其命名为NI4-S46。[0106]〈1-4〉细朐培养[0107]A.摇瓶培养[0108]将NI4-S46菌株大规模培养以产生本发明的IDS。将该菌株接种到125ml的培养瓶中的EX-细胞302无血清培养基(含有谷氨酰胺、硫酸葡聚糖、以及普流尼克(pluronic)F-68)中，并在5+1%CO2培养箱中于37+l°C培养。随后，使用摇瓶以每两至三天1:5~1:8的比率进行细胞传代。传代后，培养物体积逐渐提高至约2，400ml。在许多摇瓶中，将细胞培养到充足的水平以接种到发酵罐中。[0109]B.在30L发酵罐中培养(工作体积20L)[0110]当摇瓶中的细胞密度达到1.3XIO6个细胞/mL时，将其接种到30L发酵罐中。在细胞培养期间，培养条件保持在10%或更高的溶解氧含量、37+l°C的培养温度和7.0+0.2的pH。如有必要，取出细胞样品并在显微镜下观察。检查细胞培养物以分析细胞数、细胞活力、pH、葡萄糖浓度和谷氨酰胺浓度。在分析结果的基础上，当判定细胞充分地生长时，将其接种到150L发酵罐中。[0111]C.在150L发酵罐中培养(工作体积100L)[0112]当在30L发酵罐中的细胞达到0.9XIO6个细胞/mL或更高的密度时，将其接种到150L发酵罐中。在细胞培养期间，培养条件保持在10%或更高的溶解氧含量，37+l°C的培养温度和7.0+0.2的pH。如有必要，取出细胞样品并在显微镜下观察。检查细胞培养物以分析细胞数、细胞活力、pH、葡萄糖浓度和谷氨酰胺浓度。在分析结果的基础上，当判定细胞充分地生长时，将其接种到650L发酵罐中。[0113]C.在650L发酵罐中培养(工作体积500L)[0114]当在150L发酵罐中的细胞达到0.9XIO6个细胞/mL或更高的密度时，将其接种到650L发酵罐中。在细胞培养期间，培养条件保持在10%或更高的溶解氧含量、34+l°C的培养温度和6.9+0.2的pH，保持三天，然后在32+1°C的培养温度和6.9+0.2的pH下保持。如有必要，取出细胞样品并在显微镜下观察以分析细胞数、细胞活力、pH、葡萄糖浓度和谷氨酰胺浓度。根据分析结果，调整葡萄糖和谷氨酰胺浓度以使细胞继续生长。在发酵期间，添加水解产物以提高甲酰甘氨酸转化。[0115]<1~5>IDS的钝化[0116]使用一系列的以下四种色谱过程从细胞培养物中分离IDS。[0117]A.培养基的收获和过滤[0118]在接种到650L发酵罐中后，当细胞活力保持在80~85%范围内10天时，停止培养。使用MilliporePOD过滤器系统和DOHC过滤器(Millipore)在0.9巴或更小的压力下从培养物收获细胞。除去细胞后，通过预滤器(MiIIipore,0.5+0.2μm)和0.45+0.2μm的过滤器过滤上清液并回收到一次性无菌乙烯塑料袋(vinylbag)中。将收获的培养液在2~8°C储存。[0119]B.浓缩和渗滤[0120]使用超滤系统(切向流过滤膜系统，TangentialFlowFiltrationMembraneSystem)将A中回收的滤液浓缩约10倍。用WFI(waterforinjection,注射用水)以20~25L/分钟的流量清洗安装在超滤系统内部的膜(截断:30K，Pall)，然后用含有20mM磷酸钠(磷酸二氢钠一水合物和磷酸氢钠七水合物)的缓冲液(PH7.0~8.0)平衡。平衡之后，使滤液流到膜中同时回收未通过膜的级分。一旦回收体积变为滤液初始体积的约I/10，就停止浓缩过程。缓冲液以该浓缩物三至四倍的体积连续交换。如果传导率和PH落在标准范围内，则停止该过程[标准-传导率:=5.0mS/cm,pH7.0~8.0]。[0121]C.阴离子交换色谱[0122]为了从B中回收的浓缩物中除去染料和多种杂质，在用Q琼脂糖凝胶树脂(GEHealthcare)填充的柱(GEHealthcare)上进行阴离子交换色谱。用含20mM磷酸钠(磷酸二氢钠一水合物和磷酸氢钠七水合物)的平衡缓冲液(PH7.0~8.0)平衡该柱。通过0.45+0.2μm过滤器(Sartorius)过滤在B中获得的浓缩物并以100~120cm/h的流速加载到经平衡的柱中。加载完成后，首先用平衡缓冲液清洗该柱，然后用含有氯化钠的清洗缓冲液(PH5.5~7.5)清洗。此后，用含有氯化钠的洗脱缓冲液(pH5.5~7.5)洗脱目标蛋白质。[0123]P.疏水色谱[0124]为了除去阴离子交换色谱后剩余的染料和杂质，在用苯基琼脂糖凝胶树脂(GEHealthcare)填充的柱(GEHealthcare)上进行疏水色谱。用含有氯化钠的平衡缓冲液(pH5.0~7.0)来平衡该柱。通过0.45+0.2μm过滤器(Sartorius)过滤C中获得的洗脱液并以70~100cm/h的流速加载到经平衡的柱中。加载完成后，用平衡缓冲液清洗该柱。此后，用含有甘油的洗脱缓冲液(PH5.0~7.0)洗脱目标蛋白质。[0125]E.通过低pH使病毒灭活[0126]通过低pH条件对可来源于宿主细胞或所实施过程中所使用的任何材料的病毒进行灭活。就此而言，将D中获得的洗脱液在pH3.0~4.0(用25%的乙酸来调节其酸性)下维持2小时。此后，用0.5M氢氧化钠将洗脱液的pH提高至4.0~5.0以用于下一过程。通过低PH的灭活是在12+2°C下进行的。[0127]F.阳离子交换色谱[0128]IDS是具有寡糖的糖蛋白，并且作为异构体存在，该异构体根据聚糖链末端的唾液酸含量而具有不同的等电点。作为带负电荷的寡糖，唾液酸根据其含量在与阳离子交换树脂结合的程度方面示出不同。利用该特征，进行阳离子交换色谱以获得示出具有高唾液酸含量的高活性(高甲酰甘氨酸含量)的IDS，并除去其他杂质[产物杂质(聚合的IDS、经加工的IDS)、工艺杂质(宿主细胞蛋白质)]。具体地，使用添加甘油的平衡缓冲液(PH4.0~5.0)来平衡填充有阳离子交换Capto?MMC树脂(GEHealthcare)的柱。通过0.45+0.2μm过滤器(Sartorius)过滤E中获得的经灭活洗脱液并以100~120cm/h的流速加载于平衡的柱上。其后，用平衡缓冲液清洗该柱，随后用添加甘油的洗脱缓冲液(PH4.0~6.0)洗脱以得到具有高唾液酸含量(等电点3.5或更小)、高活性(甲酰甘氨酸含量:80±15%)以及高纯度(SE-HPLC，98%或更高)的IDS。[0129]G.亲和色谱[0130]进行亲和色谱(蓝色琼脂糖凝胶(BlueSepharose),GEHealthcare)以除去用在阳离子交换色谱中的甘油并降低洗脱液体积。通过0.45+0.2μm过滤器(Sartorius)过滤F中获得的洗脱液，并以100~120cm/h的流速加载到蓝色琼脂糖凝胶树脂填充柱(GEHealthcare)上，该柱事先用添加甘油的平衡缓冲液(pH4.5~5.5)平衡。加载完成后，用清洗缓冲液(PH4.5~5.5)清洗该柱并用洗脱缓冲液(pH6.0~8.0)洗脱目标蛋白质。[0131]H.浓缩和缓冲液交换[0132]使用超滤系统(切向流过滤膜系统)来调节在G中获得的洗脱液的蛋白质浓度以及用配制缓冲液(Formulationbuffer)与经纯化蛋白质的缓冲液交换。用WFI(注射用水)以450~650L/分钟的流量清洗安装在超滤系统内部的膜(截断:10K，Pall)，然后用不含聚山梨醇酯20的配制缓冲液(2.25g/L的磷酸二氢钠一水合物，0.99g/L磷酸氢钠七水合物，8g/L的氯化钠，pH6.0~7.0)进行平衡，接着浓缩目标蛋白质。以该浓缩物三至四倍的体积连续交换缓冲液。如果传导率和PH落在标准内，则停止该过程[标准-传导率:15.0±3.0mS/cm,pH6.0~7.0]。调节浓缩液的含量至4.0±0.5mg/mL。[0133]1.纳米讨滤[0134]使用纳米过滤器(NFP,Millipore)进行纳米过滤以除去可能来自宿主细胞或任何所使用材料的病毒。在用注射用水清洗纳米过滤器之后进行过滤器完整性测试。一旦纳米过滤器通过完整性测试，就用IL不含聚山梨醇酯20的配制缓冲液(2.25g/L的磷酸二氢钠一水合物，0.99g/L磷酸氢钠，8g/L的氯化钠，pH6.0~7.0)进行平衡。平衡完成后，将H中获得的浓缩物在约2巴的压力下通过过滤器来产生纳米过滤物。过滤完成后，用配制缓冲液(后清洗液(postwashsolution))来清洗过滤器。合并纳米过滤液和后清洗液之后，测量蛋白质含量。[0135]T.药物物质[0136]用不含聚山梨醇酯20的配制缓冲液调节在I中获得的滤液的蛋白质浓度。在添加聚山梨醇酯后，通过0.2μm过滤器过滤溶液以生产药物物质。将药物物质分装并储存在深冻冰箱(deepfreezer)(_70±10°C)直到使用。[0137]K.药物产品(填充、贴标签、包装)[0138]将储存在深冻冰箱中的储液(stock)于维持在28±I°C的水浴中解冻并用配制缓冲液(2.25g/L的磷酸二氢钠一水合物，0.99g/L磷酸氢钠七水合物，8g/L的氯化钠，0.23g/L的聚山梨醇酯20，pH6.0~7.0)稀释为蛋白质浓度为约2.05+0.2mg/mL。此后，通过0.2μm过滤器来过滤稀释液以产生最终本体溶液(finalbulksolution)。采用自动填充以约3.3g将最终本体溶液填充到6ml小瓶中。一旦小瓶通过检查测试，就将小瓶包装以生产药物产品。[0139]图3中例示了从菌株培养到最终产品生产的过程。[0140]对比实施例1:Elaprase的制备[0141]将Elaprasc1(市售的重组ids)用作对比实施例。[0142]实验实施例1:本发明的IDS的结构分析和表征[0143]〈1-1>氨基酸测序-内部测序[0144]通过SDS-PAGE来分离去糖基化IDS，接着进行凝胶切片。然后，使用MALD1-MS/MS和LC-ES1-MS/MS来分析由用多种内切蛋白酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、AspN、胰凝乳蛋白酶/胰蛋白酶、AspN/胰蛋白酶、GluC和GluC/胰蛋白酶)处理产生的消化物(图5)。结果，共鉴定了525种氨基酸序列。这些氨基酸序列与人IDS的理论序列相一致(图6)。[0145]<1~2>二硫键分析[0146]在多肽中，二硫键是通常由半胱氨酸残基的两个SH基团偶联而得到的共价键，其在稳定蛋白质的高级结构中发挥重要作用。理论上，IDS的525个氨基酸包含六个半胱氨酸残基，其中四个形成二硫键。在该实施例中，鉴定了形成IDS的二硫键的半胱氨酸残基的位置。首先，通过用PNGaseF处理对IDS进行去糖基化以排除糖的干扰。为了防止不参与二硫键形成的半胱氨酸残基成为干扰因子，用4-乙烯基吡啶将IDS转化为未还原的样品以抑制SH基团随机形成S-S键。同时，通过DTT断裂二硫键，接着用4-乙烯基吡啶阻断以提供还原的样品。将基于实验实施例1-3的结果选择的胰蛋白酶和AspN应用于未还原的和还原的样品。通过RP-HPLC分离如此获得的肽片段。比较未还原的和还原的样品RP-HPLC色谱图以区分在见于未还原的样品而未见于还原的样品的峰(图7)。[0147]为了更准确的分析，通过另外用内切蛋白酶处理来减小所区分峰的大小，并使用MALD1-MS来分析包含二硫键的峰(图8)。[0148]使用MALD1-MS/MS(图9)再次对含二硫键的峰进行序列分析以检查在525个IDS氨基酸残基之间形成二硫键的半胱氨酸残基的位置。如图10所示，观察到二硫键形成在C146至C159之间和C397至C407之间。[0149]<1~3>甲酰甘氨酸含暈的分析[0150]IDS降解硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素，这二者都属于糖胺聚糖(GAG)类。该降解活性直到在活性位点第59位的半胱氨酸残基(Cys59)通过翻译后修饰转化为甲酰甘氨酸(FGly)才获得。因此，通过检查Cys59向FGly的翻译后修饰来分析IDS的降解活性。对于该分析，采用了基于MS(质谱法)的定量分析方法AQUA(绝对定量)，其中将放射性标记的合成底物(AQUA肽)掺入到样品中。为了定量分析Cys59位的甲酰甘氨酸，将一系列稀释的AQUA肽掺入到样品中并绘制校准曲线。通过LC-ES1-MS分析来测量FGly型肽与Cys型肽的比例，并应用于AQUA校准曲线以计算甲酰甘氨酸的含量。[0151]该分析确定了Cys59向FGly的转化率为80+15%。考虑到市售药剂Elaprase(ElapraseScienceDiscussion,EMEA,2007；GenetMed2006:8(8):465-473)的Cys59向FGly的转化速率为约50%，可预期包含本发明IDS的治疗组合物以及用该组合物制备的制剂与Elaprase相比具有高得多的治疗活性。[0152]<1~4>糖基化模式的鉴定[0153]进行测定以检查本发明的IDS是否糖基化，如果是的话则鉴定糖基化模式。为此，用多种糖苷水解酶处理IDS，通过SDS-PAGE分离消化物并且分析其运动模式。[0154]详细来说，用以下四种糖苷水解酶的组合来消化IDS样品并通过SDS-PAGE分离。[0155]表1糖切割酶的性质[0156]【权利要求】1.用于治疗亨特综合征的组合物，其包含具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的IDS作为活性成分，其中在所述IDS氨基酸序列中第59位的半胱氨酸残基以65%或更高的摩尔比转化为甲酰甘氨酸(FGly)。2.权利要求1所述的组合物，其中在所述IDS氨基酸序列中第59位的半胱氨酸残基以75%或更高的摩尔比转化为FGly。3.权利要求1所述的组合物，其中所述具有SEQIDNO:1氨基酸序列的IDS含有量为2.0至4.0摩尔/摩尔IDS的甘露糖-6-磷酸。4.权利要求3所述的组合物，其中所述具有SEQIDNO:1氨基酸序列的IDS含有量为2.5至3.0摩尔/摩尔IDS的甘露糖-6-磷酸。5.用于治疗亨特综合征的制剂，其包含权利要求1至4中任一项所述的组合物。6.权利要求5所述的制剂，其包含:可药用载体；和选自以下的物质:缓冲剂、碳水化合物、稳定剂、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂、辅药、助悬剂、增稠剂和防腐剂。7.用于制备用于治疗亨特综合征之组合物的方法，其包括:(1)对用编码SEOIDNO:1所示IDS的基因转化的重组细胞株进行培养，并获得培养物；和(2)通过阴离子交换色谱、疏水色谱、阳离子交换色谱、以及亲和色谱对所述培养物进行纯化。8.用于制备用于治疗亨特综合征之组合物的方法，其包括:(1)用带有IDS基因的表达载体转化宿主细胞以获得重组细胞株；(2)在水解产物存在下于无血清培养基中培养所述重组细胞株并获得培养物；(3)通过阴离子交换色谱、疏水色谱、阳离子交换色谱以及亲和色谱从所述培养物纯化IDS;以及(4)将经纯化的IDS与可药用载体相组合。9.权利要求7或8所述的方法，其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。10.权利要求7或8所述的方法，其中所述阳离子交换色谱使用pH为4.0至6.0的洗脱缓冲液来进行。11.权利要求7或8所述的方法，其中所述疏水色谱使用pH为5.0至7.0的洗脱缓冲液来进行。12.权利要求7或8所述的方法，其中所述亲和色谱使用pH为6.0至8.0的洗脱缓冲液来进行。13.权利要求7或8所述的方法，其中所述阴离子交换色谱使用pH为5.5至7.5的洗脱缓冲液来进行。14.权利要求7至8所述的方法，其还包括在3.0至4.0的pH下灭活病毒。15.用于制备用于治疗亨特综合征之制剂的方法，其包括配制根据权利要求7或8所述的方法制备的组合物。【文档编号】A61P31/12GK103635203SQ201280030629【公开日】2014年3月12日申请日期:2012年6月15日优先权日:2011年6月24日【发明者】陈东奎,郑尧景,白相勋,朴裕昌,徐辰旭,崔龙云,孙锺文,金龙哲申请人:株式会社绿十字,株式会社医用基因生物