包含抗胸苷酸合成酶的shRNA分子的脂质体及其用途

包含抗胸苷酸合成酶的shRNA分子的脂质体及其用途
【专利摘要】本发明提供以TS为靶的shRNA的体内递送方法。一种抗肿瘤药，其中包含通过RNAi作用可以抑制胸苷酸合成酶的表达的短发夹RNA(shRNA)和PEG修饰阳离子性脂质体，其中，该shRNA结合在该PEG修饰阳离子性脂质体的表面，并且在3’末端至少具有由2个核苷酸组成的突出端。
【专利说明】包含抗胸苷酸合成酶的shRNA分子的脂质体及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及以包含抗胸苷酸合成酶的shRNA分子的脂质体作为有效成分的抗肿瘤药及其用途、特别是其与化疗药联合使用的用途。
【背景技术】
[0002]近年来，引起RNA干扰(以下记作“RNAi”)的RNAi分子作为用于治疗肿瘤等的有用工具而受到关注，人们正在开发可以抑制肿瘤增殖的各种RNAi分子。本发明人以前报道过以参与DNA合成的胸苷酸合成酶(以下记作“TS”)为靶的RNAi分子，据报道，该RNAi分子通过显著抑制TS的表达而具有抗肿瘤效果；另外，其还增强5-FU类抗肿瘤药(特别是替加氟.吉美嘧啶.奥替拉西钾复方药)的抗肿瘤效果(专利文献I)。
[0003]但是，通常RNAi分子通过体内给药而迅速被分解。因此，向肿瘤递送足够量的RNAi分子是极其困难的。
[0004]为了解决该课题，目前，正在开发各种RNAi分子的递送方法。例如，可以列举:将编码RNAi分子(特别是具有短发夹结构的RNAi分子(shRNA))的DNA插入到适当的载体中，给予该载体的方法(专利文献I)。但是，在该方法中，必须将该载体直接注入到肿瘤内来进行给药，考虑到临床应用，希望有更容易的给药方法(例如，静脉内给药等)。另外，正在开发使用由RNAi分子和脂质体组成的复合体(Iipoplex)将RNAi分子递送到肿瘤细胞中的方法(非专利文献1-3)。但是，在上述Iipoplex的重复给药时，由于被给药的生物体内的免疫系统的作用，Iipoplex快速被排除，出现无法得到充分的效果、而且产生严重的副作用等问题。
[0005]因此，在该领域中，依然迫切希望有一种通过体内给药将RNAi分子有效率地递送到肿瘤中的方法。
[0006]现有技术文献 专利文献
专利文献 1:W02010/113844 ；
非专利文献
非专利文献 I:Qixin Leng 等人，Drug Future.2009 September ；34 (9):721 ；
非专利文献2:Sherry Y.Wu等人，The AAPS Journal,第 11 卷，N0.4,Decmber 2009 ； 非专利文献 3:B.0zpolat 等人，Journal of Internal Medicine 267 ;44_53 2009。

【发明内容】

[0007]发明所要解决的课题
本发明的目的在于: 提供一种以TS为靶的ShRNA的简易且有效率的体内递送方法。
[0008]解决课题的方法
本发明人为了解决上述课题反复进行了深入研究，结果发现:通过使可以抑制TS的表达的ShRNA以静电方式结合在进行了 PEG修饰的阳离子性脂质体表面，可以简易地将ShRNA递送到癌细胞中。另外还发现:通过将结合有shRNA的进行了 PEG修饰的阳离子性脂质体与化疗药、特别是5-FU类抗肿瘤药联合使用，可以提高对癌细胞的靶向性，可以显著增强其在癌细胞中的效果。进一步发现:通过将结合有shRNA的进行了 PEG修饰的阳离子性脂质体与具有TS抑制作用的化疗药(例如5-FU类抗肿瘤药或培美曲塞钠水合物)联合使用，可以提高癌细胞的对该化疗药的敏感性，可以增强抗肿瘤效果。本发明基于上述认知。
[0009]即，本发明如下。
[0010][1]抗肿瘤药，其包含通过RNA1作用可以抑制胸苷酸合成酶的表达的短发夹RNA (shRNA)和PEG修饰阳离子性脂质体，其中，该shRNA结合在该PEG修饰阳离子性脂质体的表面，并且在3’末端至少具有由2个核苷酸组成的突出端。
[0011][2] [1]的抗肿瘤药，其中，ShRNA包含由SEQ 1D NO:1所表示的核苷酸序列组成的有义链和与该有义链在严格条件下杂交的反义链。
[0012][3] [1]或[2]的抗肿瘤药，其中，shRNA包含由SEQ 1D NO:1所表示的核苷酸序列组成的有义链和由SEQ 1D NO: 2所表示的核苷酸序列组成的反义链。
[0013][4] [1]~[3]中任一项所述的抗肿瘤药，其中，shRNA由SEQ 1D NO: 8所表示的核苷酸序列组成。
[0014][5] [1]~[4]中任一项所述的抗肿瘤药，其中，PEG修饰阳离子性脂质体包括由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰甘油磷酰胆碱(POPC)、胆固醇(CHOL)和0，0’_双十四酰基-Ν-(σ-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺氯化物(DC-6-14)构成的阳离子性脂质体。
[0015][6] [5]的抗肿瘤药，其中，以3:2:3:2的摩尔比包含DOPE、POPC、CHOL和DC-6-14。
[0016][7] [1]~[6]中任一项所述的抗肿瘤药，其中，抗肿瘤药的粒径为200~300nm。
[0017][8] [1]~[7]中任一项所述的抗肿瘤药，进一步地，可以抑制选自参与肿瘤细胞增殖的基因的基因表达的s1RNA或shRNA结合在PEG修饰阳离子性脂质体的表面。
[0018][9] [8]的抗肿瘤药，其中，参与肿瘤细胞增殖的基因是选自编码VEGF、EGFR、roGF、HGF、W1nt、Bcl-2、存活素、核苷酸还原酶、DNA聚合酶的基因中的一种或多种基因。
[0019][10] [1]~[9]中任一项所述的抗肿瘤药，该抗肿瘤药与用于治疗肿瘤的化疗药联合使用。
[0020][11]组合物，该组合物包含[1]~[10]中任一项所述的抗肿瘤药和用于治疗肿
瘤的化疗药。
[0021][12] [10]的抗肿瘤药和[11]的组合物，其中，用于治疗肿瘤的化疗药为具有TS抑制作用的抗肿瘤药。
[0022][13] [12]的抗肿瘤药或组合物，其中，具有TS抑制作用的抗肿瘤药为5-FU类抗肿瘤药或培美曲塞钠水合物。
[0023][14] [13]的抗肿瘤药或组合物，其中，5-FU类抗肿瘤药为替加氟.吉美嘧啶.奥替拉西钾复方药。
[0024]本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本国专利申请2011-114946号的说明书和/或附图中记载的内容。
[0025]发明效果本发明的以包含抗胸苷酸合成酶的shRNA分子的脂质体作为有效成分的抗肿瘤药，其通过体内给药可以抑制表达TS的肿瘤的增殖。
【专利附图】

【附图说明】
[0026]图1是显示人结肠直肠癌株DLD-1 (A)和DLD_1/FU(B)中的、以TS为靶的siRNA和shRNA的TS表达抑制效果的特性图。各泳道分别表示用下述的siRNA或shRNA进行了处理的样品。1:未处理；2:siCont IOnM ；3:siTS InM ；4:siTS 5nM ；5:siTS IOnM ；6:shTSInM ；7:shTS 5nM ；8:shTS IOnM ；
图2是显示人结肠直肠癌株DLD-1中的、以TS为靶的SiRNA(A)和shRNA⑶在5-FU的存在或不存在下的TS表达抑制效果的特性图。(C)显示添加新的培养基96小时后的各样品中的细胞成长抑制率(%)；
图3是显示人结肠直肠癌株DLD-1/FU中的、以TS为靶的siRNA (A)和shRNA⑶在5-FU的存在或不存在下的TS表达抑制效果的特性图。(C)显示添加新的培养基96小时后的各样品中的细胞成长抑制率(%)；
图4是显示人结肠直肠癌株DLD-1带瘤小鼠中的、以TS为靶的shRNA在S-1的存在或不存在下的肿瘤生长抑制效果(A)和体重的增减(B)的特性图；
图5是显示人结肠直肠癌株DLD-1带瘤小鼠中的、以TS为靶的shRNA在TS-1的存在或不存在下的肿瘤生长抑制效果的照片。1:对照(给与蔗糖)；2:S-l;3:TS-shRNA脂质体；4:S-l+TS-shRNA 脂质体；
图6显示在人恶性胸膜间皮瘤株MSTO 211 H中培美曲塞钠水合物、以TS为靶的shRNA、或培美曲塞钠水合物和以TS为靶的shRNA引起的细胞成长抑制率(%)随时间的变化；
图7是显示在人恶性胸膜间皮瘤株MSTO 211 H带瘤小鼠中以TS为靶的shRNA在培美曲塞钠水合物的存在或不存在下的肿瘤生长抑制效果的特性图。
【具体实施方式】
[0027]本发明中的可以抑制胸苷酸合成酶(以下记作“TS”)的表达的短发夹RNA(以下记作“shRNA”)通过以胸苷酸合成酶的mRNA部分为靶，可以TS特异性地发挥RNAi作用，可以显著抑制TS的表达。这里，本发明的RNAi分子“以mRNA部分为靶”是指，下述所详述的shRNA的反义链可以与靶mRNA部分在严格条件下杂交。
[0028]严格的条件可以根据按照常规方法形成杂交瘤的核酸的熔解温度(Tm，也称解链温度)来求得。例如，作为可以维持杂交状态的清洗条件，通常可以列举“1XSSC、0.1%SDS、37°C”程度的条件，严格而言是指“0.5XSSC、0.1% SDS、42°C ”程度的条件，进一步严格而言是指“0.1XSSC、0.1%SDS、65°C”程度的条件。
[0029]本发明中的shRNA包含具有编码TS的ORF的核苷酸序列或与其一部分同一的(identical)核苷酸序列的有义链、和与该有义链在严格条件下杂交的反义链。这里，“0RF的核苷酸序列或与其一部分同一的核苷酸序列”是指，将ORF的核苷酸序列中的胸腺嘧啶取代成尿11密唳来表不的核苷酸序列或与其一部分同一的核苷酸序列。
[0030]该有义链由15~25个核苷酸、优选19个核苷酸组成。有义链的核苷酸序列优选为与编码TS的ORF的核苷酸序列同一，但实质上可以是同一、即相同的序列。即，有义链的核苷酸序列可以是在ORF的核苷酸序列中有I个或多个、即I~3个核苷酸、优选I~2个核苷酸、更优选I个核苷酸的取代、缺失、插入和/或添加。
[0031]该反义链具有可以与有义链在严格的条件下杂交的核苷酸序列。反义链只要可以在严格的条件下杂交即可，可以是具有包含I~3个核苷酸、优选I~2个核苷酸、更优选I个核苷酸的取代、缺失、插入和/或添加的错配的反义链。优选反义链由与有义链完全互补的核苷酸序列组成。
[0032]有义链和反义链的核苷酸序列可以根据编码TS的公知的核苷酸序列(GenBank:CR601528.1)来选择。作为选择这些核苷酸序列的方法，已知有各种方法，例如可以采用siRNA设计支持系统(Takara Bio株式会社)等。
[0033]在本发明中，作为有义链，可以列举由下述核苷酸序列组成的有义链，但并不限于这些:5’-GUAACACCAUCGAUCAUGA-3’ (SEQ ID NO:1) ;5’-GAAUACAGAGAUAUGGAAU-3’ (SEQ IDNO:3) ;5’-CGAUCAUGAUGUAGAGUGU-3’(SEQ ID NO:5) ;5’_GGGUGUUU UGGAGGAGUUGTT-3’(SEQID NO:11)。
[0034]优选本发明中的shRNA 包含:有义链 5’ -GUAACACCAUCGAUCAUGA-3’ (SEQID NO:1)和反义链 5’ -UCAUGAUCGAUGGUGUUAC-3’ (SEQ ID NO: 2)；有义链5’-GAAUACAGAGAUAUGGAAU-3，(SEQ ID NO: 3)和反义链 5’-AUUCCAUAUCUCUGUAUUC(SEQID NO: 4);或有义链 5’ -CGAUCAUGAUGUAGAGUGU-3’ (SEQ ID NO: 5)和反义链5，-ACACUCUACAUCAUGAUCG-3，(SEQ ID NO: 6);有义链5，-GGGUGUUUUGGAGGAGUUGTT-3，(SEQID NO: 11)和反义链 5’ -AACAACUCCUCCAAAACACCC-3’ (SEQ ID NO: 12)。
[0035]进一步优选，本发明中的shRNA包含由SEQ ID NO:1所表示的核苷酸序列组成的有义链和由SEQ ID NO: 2所表示的核苷酸序列组成的反义链。
[0036]有义链和反义链经由接头部分进行连接，通过该接头部分形成环而折叠，该反义链与该有义链杂交，形成双链部分。shRNA分子中所含的接头部分只要能够连接有义链和反义链形成茎环结构即可，可以是多核苷酸接头，也可以是非多核苷酸接头，没有特别限定，优选本领域技术人员所公知的2~22个核苷酸的多核苷酸接头。具体而言，可以例示UAGUGCUCCUGGUUG(SEQ ID NO: 7)、UUCAAGAGA、CCACC、CUCGAG、CCACACC、UUCAAGAGA、AUG、CCC 和 UUCG，优选 UAGUGCUCCUGGUUG (SEQ ID NO: 7)。
[0037]本发明中的shRNA在3’末端至少具有由2个核苷酸组成的突出端。
[0038]在本发明中，突出端是指添加在反义链的3’末端的核苷酸，是指在有义链所对应的位置不存在能够互补性结合的核苷酸的核苷酸。反义链的3’末端不具有突出端时，与具有突出端时相比，在使用下述所详述的PEG修饰阳离子性脂质体的转染中，shRNA所产生的TS表达抑制程度降低约40~60%。对该突出端的核苷酸的种类、数目没有限定，例如可以列举:由I~5个、优选I~3个、进一步优选I或2个核苷酸组成的序列，例如可以列举TTT、UU或TT。优选为UU。
[0039]本发明中，作为优选的shRNA，是由SEQ ID NO: 8所表示的核苷酸序列组成的单链RNA。
[0040]另外，根据需要，有义链或反义链的5’末端可以被磷酸化，在5’末端可以结合有三磷酸(PPP)。[0041]本发明中的PEG修饰阳离子性脂质体，是在阳离子性脂质体的表面共价键合一个或多个聚乙二醇分子(PEG)而形成，由此可以增加阳离子性脂质体在体内的血中滞留性。
[0042]阳离子性脂质体可以根据公知的方法、例如薄膜振荡法(Bangham法)来制作(A.D.Bangham 等人，J.Mol.Biol., 13,238-252 (1965) ；A.D.Bangham 和 R.ff.Horne, J.Mol.Biol.,8, 660-668 (1964)) ο即，在烧瓶等容器内将至少一种磷脂溶解于氯仿等有机溶剂中，使该有机溶剂挥发，在容器底部形成脂质膜，之后向其中加入缓冲液等水溶液，进行搅拌，从而可以得到含有脂质体的悬浮液。
[0043]本发明中的阳离子性脂质体，具有由选自以下的一种以上的磷脂形成的一层或多层膜:二油酰磷脂酰乙醇胺(以下记作“DOPE”)、棕榈酰油酰甘油磷酰胆碱(以下记作“P0PC”)、胆固醇(以下记作“0101/’)、0，0’ -双十四酰基-Ν-(σ-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺氯化物(以下记作“DC-6-14”)、氢化纯化卵黄磷脂酰胆碱、氢化纯化大豆磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱和1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱。[0044]优选本发明中的阳离子性脂质体由DOPE、POPC、CHOL和DC-6-14组成。阳离子性脂质体中的DOPE、POPC和DC-6-14的含有比(摩尔比)为DOPE:P0PC:CH0L:DC_6_14 =2~4:4~1:3~1:1~4，优选为3:2:3:2。
[0045]结合在阳离子性脂质体表面的PEG从分子量处于500~5000的范围的PEG中选择，优选分子量为2000左右。PEG与阳离子性脂质体的结合可以按照公知的方法来进行，没有特别限定，可以采用后插入法(post insertion method)来进行。即，在形成上述阳离子性脂质体后，将由磷脂和PEG组成的复合分子和该阳离子性脂质体在适当的条件下(例如30~60°C、30分钟~3小时)下培养，从而可以以复合分子的脂质部分暴露在阳离子性脂质体外侧的磷脂膜中、PEG暴露在阳离子性脂质体表面的形态插入。此时，相对于上述阳离子性脂质体的总脂质，所用复合分子的量为3~10%(摩尔比)、优选为5%。在本发明中，作为由可以利用的磷脂和PEG形成的复合分子，可以列举mPEG2_-DSPE，但并不限于此。
[0046]本发明中的PEG修饰阳离子性脂质体，其粒径为80~200nm，优选为约100nm。本发明中的PEG修饰阳离子性脂质体，其Zeta电位为10~40mV，优选为约25mV。
[0047]上述shRNA通过共价键或非共价键结合在上述PEG修饰阳离子性脂质体的膜表面。上述shRNA与上述PEG修饰阳离子性脂质体结合时，优选将包含上述shRNA和上述PEG修饰阳离子性脂质体的混合液剧烈搅拌I~15分钟、优选10分钟左右。通过增加搅拌，可以将所得的具备shRNA的PEG修饰阳离子性脂质体的粒径调整至数百nm的大小(Barichel lo, J.M.等人，Int.J.Pharm.(2011),doi:10.1016/j.1 jpharm.2011.03.001)。另外，通过进行搅拌，可以使上述ShRNA均匀分散在PEG修饰阳离子性脂质体上并结合，可以防止由shRNA的不均匀结合造成的组织的PEG修饰阳离子性脂质体摄取的不均匀性。
[0048]在本发明中，具备shRNA的PEG修饰阳离子性脂质体的粒径为120~600nm，优选为200~300nm。另外，在本发明中，具备shRNA的PEG修饰阳离子性脂质体的Zeta电位为5~30mV，优选为约10~25mV。由于具备shRNA的PEG修饰阳离子性脂质体的表面电荷更接近中性、并且存在由PEG产生的立体障碍(steric hindrance),所以其与血清蛋白结合少，因此可以防止其被肺胞捕捉，可以增加血中滞留性。
[0049]本发明中的具备shRNA的PEG修饰阳离子性脂质体，除了包含上述shRNA外，还可以包含以在肿瘤细胞中表达的其他基因为靶的siRNA或shRNA。“肿瘤细胞中表达的其他基因”可以列举:编码参与肿瘤细胞增殖的因子、例如VEGF、EGFR、PDGF, HGF、Wint、Bcl_2、存活素等的增殖调节因子组，以及编码核苷酸还原酶、DNA聚合酶等核酸合成相关酶组等的基因，但并不限于这些。上述shRNA和以在肿瘤细胞中表达的其他基因为靶的siRNA或shRNA可以和同一的PEG修饰阳离子性脂质体结合，也可以分别和不同的PEG修饰阳离子性脂质体结合。
[0050]需要说明的是，在本说明书中，有时将具备shRNA的PEG修饰阳离子性脂质体称作“PEG 修饰 lipoplex”。[0051]如下述实施例中所详述，通过体内给药，上述具备shRNA的PEG修饰阳离子性脂质体可以抑制肿瘤细胞的增殖，可以作为用于治疗癌症的抗肿瘤药来使用。
[0052]作为使用本发明的抗肿瘤药可以治疗的癌症，可以列举高度表达TS的癌症，没有特别限定，例如可以列举:结肠.直肠癌、肝癌、肾癌、头颈部癌、食道癌、胃癌、胆道癌、胆囊.胆管癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫体癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸肿瘤、骨?软部肉瘤、白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、皮肤癌、脑肿瘤、恶性胸膜间皮瘤等。优选为结肠.直肠癌、胃癌、头颈部癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胆道癌、肝癌、恶性胸膜间皮瘤，特别优选为结肠.直肠癌、恶性胸膜间皮瘤。
[0053]本发明的抗肿瘤药，在包含具备shRNA的PEG修饰阳离子性脂质体的同时，还可以包含药品制造中通常使用的赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、稀释剂、助溶剂、悬浮剂、等渗剂、pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、着色剂、矫味剂、矫臭剂、组氨酸等。
[0054]作为赋形剂，例如可以列举:乳糖、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、赤藓醇、木糖醇、麦芽糖醇、肌醇、葡聚糖、山梨醇、白蛋白、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素、硅酸、甲基纤维素、甘油、海藻酸钠、阿拉伯胶和它们的混合物等。作为润滑剂，例如可以列举:纯化滑石粉、硬脂酸盐、硼砂、聚乙二醇和它们的混合物等。作为粘合剂，例如可以列举:单糖浆、葡萄糖液、淀粉液、明胶溶液、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、虫胶、甲基纤维素、乙基纤维素、水、乙醇、磷酸钾和它们的混合物等。作为崩解剂，例如可以列举:干燥淀粉、海藻酸钠、琼脂末、昆布糖粉末、碳酸氢钠、碳酸钙、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、淀粉、乳糖和它们的混合物等。作为稀释剂，例如可以列举:水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、乙氧基化异硬脂醇、聚氧化异硬脂醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯类和它们的混合物等。作为稳定剂，例如可以列举:焦亚硫酸钠、乙二胺四乙酸、巯基乙酸、巯基乳酸和它们的混合物等。作为等渗剂，例如可以列举:氯化钠、硼酸、葡萄糖、甘油和它们的混合物等。作为PH调节剂和缓冲剂，例如可以列举:枸橼酸钠、枸橼酸、乙酸钠、磷酸钠和它们的混合物等。
[0055]本发明的抗肿瘤药可以通过口服给药或胃肠外给药(例如，静脉内给药、动脉内给药、局部注射给药、腹腔或胸腔给药、皮下给药、肌肉内给药、舌下给药、经皮吸收或直肠内给药等)来进行给药。优选本发明的抗肿瘤药进行静脉内给药、腹腔内给药或胸腔内给药。
[0056]另外，本发明的抗肿瘤药，根据给药途径，可以制成适当的剂型。具体而言，可以制备成注射剂、悬浮剂、乳化剂、软膏剂、霜剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、细粒剂、糖锭、直肠给药剂、油脂性栓剂、水溶性栓剂等各种制剂形式。[0057]本发明的抗肿瘤药的效果，可以通过对来自上述癌症的细胞或组织、以及罹患上述癌症的个体给予该抗肿瘤药，将肿瘤的大小与未给予该抗肿瘤药的(或给药前的)细胞或组织、以及个体的肿瘤的大小进行比较，以肿瘤缩小或消灭为指标进行评价。作为可用于评价本发明的抗肿瘤药的效果的癌细胞，只要其表达TS即可，对癌症种类没有特别限定，例如可以列举:人结肠直肠癌细胞株DLD-1、DLD-1/5FU (5-FU抗性DLD-1株)、KM12C/5FU (5-FU 抗性 KMl2C 株)、HT29/5FU (5-FU 抗性 HT29 株)、人胃癌细胞株NUGC-3/5FU(5-FU抗性NUGC-3株)、人恶性胸膜间皮瘤细胞株(MSTO 211H)等。
[0058]与以TS的mRNA为靶的本领域技术人员所公知的以RNAi分子作为有效成分的抗肿瘤药相比，本发明的抗肿瘤药的效果可以具有2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、或其以上的抗肿瘤效果。
[0059]以往，向靶细胞中进行shRNA的体内递送，利用的是包含编码shRNA的DNA的病毒载体(W02010/113844)，利用该病毒载体注入时的水压或病毒感染，编码该shRNA的DNA转移到细胞内，shRNA在核内表达。所表达的shRNA与内源性的shRNA —样，与被称作切酶(dicer)的酶接触，切出茎环结构，成为由互补性的双链RNA形成的siRNA，发挥RNAi作用。另一方面，本发明的抗肿瘤药通过口服或胃肠外给药，将担载在PEG修饰阳离子性脂质体上的shRNA递送到肿瘤细胞中。递送至肿瘤细胞中的shRNA通过内吞作用向细胞内移动。即，与上述现有技术不同，本发明中的shRNA并不在靶细胞中表达。如上所述，从细胞外导入的shRNA在体内并没有被分解，而是发挥RNAi作用，可以抑制在靶细胞中表达的内源性基因的表达，这是由本发明人首次发现的。
[0060]另外，在PEG修饰阳离子性脂质体上担载siRNA时，在其制备过程中，有可能仅担载未形成互补性双链的有义链或反义链。这样的仅担载有义链或反义链的PEG修饰阳离子性脂质体可以说是杂质，从药品的观点考虑并不优选。另一方面，通过使shRNA担载在PEG修饰阳离子性脂质体上，产生上述杂质的可能性低，从药品的观点考虑可谓是优选的。
[0061]本发明的抗肿瘤药可以和现有的化疗药一同使用。作为现有的化疗药，可以列举具有TS抑制作用的抗肿瘤药。
[0062]作为“具有TS抑制作用的抗肿瘤药”，只要能够抑制TS的功能即可，没有特别限定，例如可以列举:5-FU类抗肿瘤药、培美曲塞钠水合物、雷替曲塞(Tomudex)、甲氨蝶呤(MTX)、0S1-7904L (0SI 公司)等。
[0063]有人报道了 TS的表达量与5-FU类抗肿瘤药的敏感性的关系(Patrick G.Johnston 等人，Cancer Res 1995 ；55:1407-12.和 Kun-Huei Yeh 等人，Cancer 1998 ；82:1626-31)。即使在癌症患者中，TS的表达较低的癌症患者，5-FU类抗肿瘤药也显著奏效，另一方面，即使在癌症患者中，TS的表达比较亢进的癌症患者中大多数对5-FU类抗肿瘤药具有抗性。通过给予本发明的抗肿瘤药，可以抑制肿瘤组织内的TS的产生，可以提高该肿瘤组织的5-FU类抗肿瘤药的敏感性。另外，当上述PEG修饰阳离子性脂质体与5-FU类抗肿瘤药联合使用时，其选择性地蓄积在肿瘤内(Yusuke Doi等人，Cancer Sci, November, 2010,第 101 卷，n0.11,2470-2475)。
[0064]根据上述效果，与5-FU类抗肿瘤药联合使用时，包含该PEG修饰阳离子性脂质体的本发明的抗肿瘤药可以将上述shRNA有效率地递送到肿瘤中，与单独使用5-FU类抗肿瘤药或本发明的抗肿瘤药时相比，可以得到2倍、3倍、4倍、5倍或其以上的显著高的抗肿瘤效果O
[0065]作为“5-FU类抗肿瘤药”，可以列举:5_FU和活性代谢物为5_FU的5_FU衍生物。作为5-FU衍生物，例如可以列举含有替加氟的物质。作为5-FU衍生物，优选为含有替加氟的复方药，具体而言，可以例示:替加氟.尿嘧啶复方药(例如UFT(注册商标)(大鹏药品工业株式会社))、替加氟?吉美嘧啶?奥替拉西钾复方药等。其中，特别优选下述所详述的替加氟?吉美嘧啶?奥替拉西钾复方药、例如TS-1 (注册商标)(大鹏药品工业株式会社)。需要说明的是，在本说明书中，有时将5-FU类抗肿瘤药记作“S-1”、“TS-1”，这些用语可以彼此互换使用。
[0066]另外，作为培美曲塞钠水合物，可以列举Alimta(注册商标)(日本Eli Lilly株式会社)。培美曲塞钠水合物也和上述5-FU类抗肿瘤药一样，通过将其与本发明的抗肿瘤药联合使用，可以将上述shRNA有效率地递送到肿瘤中；和/或与单独使用该培美曲塞钠水合物或本发明的抗肿瘤药时相比，可以得到2倍、3倍、4倍、5倍或其以上的显著高的抗肿瘤效果。
[0067]本发明的抗肿瘤药，除了与上述具有TS抑制作用的抗肿瘤药一同使用外，或者可以改成与其他现有的化疗药一同使用。作为这样的化疗药，可以列举:环磷酰胺、盐酸氧氮芥、异环磷酰胺、美法仑、白消安、二溴甘露醇、卡巴醌、塞替派、雷莫司汀、尼莫司汀、替莫唑胺、卡莫司汀、培美曲塞二钠、甲氨蝶呤、6-疏基嘌呤核苷、巯嘌呤、脱氧氟尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、阿糖胞嘧唳(cytarabine ocfosfate)、依诺他滨、吉西他滨、氟达拉滨、培美曲塞、顺钼、卡钼、奥沙利钼、紫杉醇、多西他赛、盐酸依立替康、卡培他滨等，可以使用从这些药中选择的一种或多种化疗药。这些化疗药也 和上述具有TS抑制作用的抗肿瘤药一样，通过与本发明的抗肿瘤药联合使用，可以将上述shRNA有效率地递送到肿瘤中；和/或与单独使用该化疗药或本发明的抗肿瘤药时相比，可以得到2倍、3倍、4倍、5倍或其以上的显著高的抗肿瘤效果。
[0068]本发明的抗肿瘤药和上述现有的化疗药只要是联合给药，就可以作为组合物来提供。
[0069]“组合物”可以是包含本发明的抗肿瘤药和上述现有的化疗药作为有效成分的复方药，还可以是将本发明的抗肿瘤药和上述现有的化疗药以适于联合给药的单一包装(试剂盒制剂)的形式制造.包装.流通的物质。
[0070]“联合给药”不仅包括将本发明的抗肿瘤药和上述现有的化疗药同时进行给药的情形，还包括将本发明的抗肿瘤药和上述现有的化疗药间隔着进行给药的情形。
[0071]本发明的抗肿瘤药的给药量和给药次数，可以根据患者的年龄、体重、疾病的重症度等因素而变化，以shRNA的量计，可以从每次每Ikg体重、0.0OOlmg~IOOmg的范围中选择适当的量，按照I天I~3次、每天或每I~21天来进行给药。本发明的抗肿瘤药中所含的上述具备shRNA的PEG修饰阳离子性脂质体，以由以往公知的RNAi分子和脂质体形成的复合体(lipoplex)相比，具有高的血中滞留性，所以可以避免频繁给药。由此，可以回避被给药的生物体内的免疫系统的异物识别。
[0072]上述现有的化疗药的给药量，可以根据作为有效成分的化学物质的种类、患者的年龄、体重、疾病的重症度等因素而变化,可以从每次每Ikg体重0.0OOlmg~1000mg的范围中选择适当的量，按照I天I~3次、每天或每I~14天来进行给药。例如，当现有的化疗药为5-FU类抗肿瘤药时，可以每天或每I~7天给予I天以替加氟计为60~160mg的量。与上述现有的化疗药单独使用时相比，可以以低用量且低频率进行给药。由此，可以抑制或延迟通过给予上述现有的化疗药而能够引起的副作用(例如，骨髓抑制、溶血性贫血、弥漫性血管内凝血综合征、重症肝炎、脱水症状、肠炎、间质性肺炎、口腔炎、消化道溃疡、消化道出血、消化道穿孔、急性肾功能不全、皮肤粘膜眼综合征、中毒性表皮坏死症、精神神经障碍、急性胰腺炎、横纹肌溶解症、嗅觉丧失等，并不限于这些)的发病。
[0073]本发明还涉及使用上述本发明的抗肿瘤药的癌症的治疗方法。作为利用该方法可以治疗的癌症，包括以上定义的癌症。另外，在该方法中，上述本发明的抗肿瘤药和现有的化疗药的用法和用量如上所述。
实施例
[0074]以下给出实施例，来进一步详细说明本发明。但本发明并不限于这些实施例。
[0075]实施例1:RNAi分子的制备
根据公知的常规方法，合成下述的siRNA和shRNA。
[0076](I)以 TS 为靶的 siRNA
以TS为靶的SiRNA根据已经确认到抗肿瘤效果的抗TS的siRNA (W02010/113844)来进行合成，其由下述的有义链和反义链组成。
[0077]有义链:
【权利要求】
1.抗肿瘤药,其包含通过RNAi作用可以抑制胸苷酸合成酶的表达的短发夹RNA即shRNA和PEG修饰阳离子性脂质体，其中，该shRNA结合在该PEG修饰阳离子性脂质体的表面，并且在3’末端至少具有由2个核苷酸组成的突出端。
2.权利要求1所述的抗肿瘤药，其中，shRNA包含由SEQID NO:1所表示的核苷酸序列组成的有义链和与该有义链在严格条件下杂交的反义链。
3.权利要求1或2所述的抗肿瘤药，其中，shRNA包含由SEQID NO:1所表示的核苷酸序列组成的有义链和由SEQ ID NO: 2所表示的核苷酸序列组成的反义链。
4.权利要求1~3中任一项所述的抗肿瘤药，其中，shRNA由SEQID NO: 8所表示的核苷酸序列组成。
5.权利要求1~4中任一项所述的抗肿瘤药，其中，PEG修饰阳离子性脂质体包括由二油酰磷脂酰乙醇胺即DOPE、棕榈酰油酰甘油磷酰胆碱即P0PC、胆固醇即CHOL和0，O’-双十四酰基-Ν-(σ-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺氯化物即DC-6-14构成的阳离子性脂质体。
6.权利要求5所述的抗肿瘤药，其中，VX3:2:3:2的摩尔比包含DOPE、POPC, CHOL和DC-6-14。
7.权利要求1~6中任一项所述的抗肿瘤药，其中，抗肿瘤药的粒径为200~300nm。
8.权利要求1~7中任一项所述的抗肿瘤药，进一步地，可以抑制选自参与肿瘤细胞增殖的基因的基因表达的siRNA或shRNA结合在PEG修饰阳离子性脂质体的表面。
9.权利要求8所述的抗肿瘤药，其中，参与肿瘤细胞增殖的基因是选自编码VEGF、EGFR、PDGF, HGF、Wint、Bcl_2、存活素、核苷酸还原酶、DNA聚合酶的基因中的一种或多种基因。
10.权利要求1~9中任一项所述的抗肿瘤药，该抗肿瘤药与用于治疗肿瘤的化疗药联合使用。
11.组合物,该组合物包含权利要求1~10中任一项所述的抗肿瘤药和用于治疗肿瘤的化疗药。
12.权利要求10所述的抗肿瘤药和权利要求11所述的组合物，其中，用于治疗肿瘤的化疗药为具有TS抑制作用的抗肿瘤药。
13.权利要求12所述的抗肿瘤药或组合物，其中，具有TS抑制作用的抗肿瘤药为5-FU类抗肿瘤药或培美曲塞钠水合物。
14.权利要求13所述的抗肿瘤药或组合物，其中，5-FU类抗肿瘤药为替加氟.吉美嘧啶.奥替拉西 钾复方药。
【文档编号】A61K47/18GK103561775SQ201280025004
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2012年5月22日 优先权日:2011年5月23日
【发明者】石田龙弘, 黃政龙, 和田洋巳 申请人:德尔塔菲制药股份有限公司