诱导针对葡萄球菌属中细菌的免疫应答的组合物和方法

诱导针对葡萄球菌属中细菌的免疫应答的组合物和方法
【专利摘要】本发明涉及包括两种或更多种葡萄球菌类毒素的组合物，所述组合物可用于诱导针对葡萄球菌疾病的保护免疫应答。
【专利说明】诱导针对葡萄球菌属中细菌的免疫应答的组合物和方法
[0001]相关申请的交叉参考
[0002]本申请要求2011年3月16日提交的美国临时申请第61/453，216号的优先权。在先申请的公开内容被认为是本申请公开的部分(且通过引用纳入本文)。
[0003]关于联邦资助的研究或开发的声明
[0004]本申请中的一些研究由国立卫生研究院(National Institutes of Health)的基金A1074283和U54-AI57153资助。政府对本发明拥有某些权利。
【技术领域】
[0005]本文件关于含有葡萄球菌类毒素的组合物，更具体地关于含有两种或更多种葡萄球菌类毒素的组合物以及在对象中诱导针对葡萄球菌(Staphylococcus)菌株产生的两种或更多种葡萄球菌外毒素的免疫应答的方法。
【背景技术】
[0006]在美国，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)被认为是造成严重传染性疾病的最显著原因；在世界各地似乎也是如此。参见Klevens等，JAMA298:1763-1771 (2007)；和Lowy，NEngl J Med339:520-532 (1998)。该生物造成的严重疾病包括高致命性肺炎(每年有多达35000个患者死于该病)，感染性心内膜炎(其中金黄色葡萄球菌是多至20000个病例的原因(10000人致命，并且非常多的幸存者由于在脑部和其他器官中生成微生物凝块而出现中风和转移性脓肿))，败血症(其中该生物是血流感染的第二大病因(例如800000例外科手术后感染))，以 及骨髓炎(金黄色葡萄球菌是几乎所有该病症的病因)。另外，金黄色葡萄球菌已经变得对抗生素有高耐药性，出现了社区相关和医院相关的甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA)。
[0007]医学界和科学界已经做出巨大努力来开发针对金黄色葡萄球菌的疫苗。然而，至今所有的努力结果是失败的。因此，存在针对金黄色葡萄球菌的疫苗的需求。

【发明内容】

[0008]如本文所述，向人葡萄球菌肺炎和的感染性心内膜炎的动物模型给予含有两种或更多种葡萄球菌类毒素的组合物完全保护该动物免受金黄色葡萄球菌的攻击。本文所述的组合物能用于针对葡萄球菌属细菌的主动免疫。另外，本文所述的组合物能用于生成抗体，所述抗体能用作，例如，被动免疫治疗试剂。不受特定机理的限制，葡萄球菌生成外毒素以促进该生物造成感染的能力。因此，本文所述的组合物能够用于增强对象对于两种或更多种葡萄球菌外毒素的免疫应答，使得在对象中中和外毒素的活性。具体地，葡萄球菌外毒素，其属于称为超抗原分子家族，在CD40上含有人细胞受体作用位点。
[0009]如本文所述，非毒性的超抗原突变体能够扩大第二抗原(葡萄球菌β -毒素)的免疫应答10-100倍，以及其他抗原如HIV蛋白或绵羊红细胞的的免疫应答。另外，针对TSST-1类毒素的抗体能够中和超抗原性并且能够保护兔子免受天然TSST-1的致死攻击。带有葡萄球菌TSS的患者没有产生对于超抗原TSST-1的中和抗体，因此它们仍然容易受TSS复发的影响。这种效果是由于TSST-1的免疫功能障碍，而不是由于识别超抗原为外来的遗传缺陷。本文所述TSST-1类毒素促进针对天然TSST-1的保护性免疫并且作用为扩大第二抗原抗体应答的佐剂。这种效果在使用野生型TSST-1的情况中没有发现，其更可能造成抗体免疫抑制而不是佐剂特性。 [0010]在一个方面，本文涉及包含两种或更多种葡萄球菌类毒素的组合物，其中所述类毒素选自中毒性休克综合征毒素-1 (TSST-1)类毒素、葡萄球菌肠毒素B (SEB)类毒素、葡萄球菌肠毒素C(SEC)类毒素、葡萄球菌肠毒素样X(SEL-X)类毒素、α毒素类毒素、β毒素类毒素和Y毒素类毒素。所述TSST-1类毒素可包含在位点31的丝氨酸残基和在位点32的脯氨酸残基。TSST-1类毒素能是融合蛋白(例如，残基1-89为人TSST-1和残基90-195为绵羊TSST-1的融合蛋白)。TSST-1类毒素能包含在位点135的丙氨酸。TSST-1类毒素能包含在位点136的丙氨酸。SEB类毒素可以包含下列一种或多种:在位点90的丙氨酸残基，位点91的缬氨酸残基，和位点210的丙氨酸残基。SEC类毒素能是SEC3类毒素。SEC类毒素能包含位点90的丙氨酸残基和/或位点210的丙氨酸残基。α毒素类毒素能包含位点35的亮氨酸残基。β毒素类毒素能包含位点149的天冬酰胺和/或位点288的天冬酰胺。在一些实施方式中，所述组合物包含三种葡萄球菌类毒素。在一些实施方式中，所述组合物包含四种葡萄球菌类毒素。在一些实施方式中，所述组合物包含五种葡萄球菌类毒素。在一些实施方式中，所述组合物包含TSST-1类毒素、SEB类毒素、SEC类毒素、α类毒素和β类毒素。这种组合物还能包含SEL-X类毒素和/或Y毒素类毒素。在本文所述的任意组合物中，所述Y毒素类毒素能够是Y葡萄球菌毒素的单链(例如，Y葡萄球菌毒素的B链)。在一些实施方式中，所述组合物包含SEC类毒素、SEB类毒素和α类毒素。
[0011]本文所述的任意组合物还能包含佐剂(例如，不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂或铝盐)。
[0012]本文也涉及在对象中诱导针对葡萄球菌菌株产生的两种或更多种葡萄球菌外毒素的免疫应答的方法。所述方法包括向对象给予有效量的药物组合物以诱导免疫应答，所述药物组合物包含两种或更多种葡萄球菌类毒素，其中所述类毒素选自TSST-1类毒素、SEB类毒素、SEC类毒素、SEL-X类毒素、α毒素类毒素和β毒素类毒素。所述组合物能够皮下给药或肌肉内给药。所述方法还能包括确定对象血液中是否包含对一种或多种葡萄球菌类毒素有特异性结合亲和性的抗体。所述方法还包括确定对象血液中是否包含对一种或多种葡萄球菌外毒素有特异性结合亲和性的抗体。葡萄球菌菌株能够是甲氧西林耐药性或甲氧西林敏感性的。所述菌株能够是USA400、USA300或USA200的分离物。本文所述的任意组合物能用在所述方法中。
[0013]在另一方面，本文涉及包括TSST-1类毒素、SEB类毒素、SEC类毒素、葡萄球菌α毒素类毒素、葡萄球菌β毒素类毒素和Y葡萄球菌毒素单链的组合物。所述的组合物还能包含佐剂(例如，不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂或铝盐)。
[0014]在另一方面,本文涉及包含TSST-1类毒素、SEC类毒素、葡萄球菌α毒素类毒素、葡萄球菌β毒素类毒素和Υ葡萄球菌毒素的单链的组合物。所述的组合物还能包含佐剂(例如，不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂或铝盐)。这种组合物还能包含SEB类毒素。
[0015]在另一方面，本文涉及包含TSST-1类毒素、SEC类毒素和葡萄球菌α毒素类毒素的组合物。这种组合物还能包含SEB类毒素。所述组合物还能包含佐剂(例如，不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂或铝盐)。
[0016]除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但是下面描述了示例性的方法和材料。本文所述所有出版物、专利申请、专利、Genbank?登录号和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本申请(包括定义在内)为准。材料、方法和实施例都仅是说明性，并不意在构成限制。
[0017]从下面的详述和权利要求中容易了解本发明的其他特征和优点。
【专利附图】

【附图说明】
[0018]图1是显示在中毒性休克综合征毒素-1 (TSST-1)的类毒素突变体(G31S/S32P和Huvine, 1000 μ g/kg)(每种类毒素攻击10只兔子)或野生型TSST-1 (I μ g/kg) (5只兔子)攻击后兔子体温4小时变化的柱形图。在4小时时间点上，所有的兔子单独用50 μ g/kg的脂多糖(LPS) (1/10LD50)攻击。在造成致死TSS中，超抗原(TSST-1)和LPS之间存在IO6倍的协同作用。
[0019]图2是显示在用类毒素突变体SEC Y90A(10只兔子，1000μg/kg)或野生型SEC3(5只兔子，1μ g/kg)攻击后兔子体温4小时变化的柱形图。在4小时时间点上,所有的兔子单独用50 μ g/kg的LPS (I/IOLD5tl)攻击。在造成致死TSS中，超抗原(SEC3)和LPS之间存在IO6倍的协同作用。
[0020]图3显示在用中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1) (( ) ；G31S/S32P( ?)；H135A ( ▲);和Q136A (.))(每种类毒素攻击5只兔子)或野生型TSST-1 (I μ g/kg) (5只兔子)攻击后兔子的体温CC )。在4小时时间点上，就在测量4小时温度之后，所有的兔子单独用100 μ g/kg的LPS攻击。存活数/总数是在LPS注射后48小时测算的存活动物的数量。
[0021]图4显示通过3H-胸苷整合到增殖外周血单核细胞(PBMC)的DNA上测量的TSST-1类毒素突变体(G31S/S32P[实心正方形]，Huvine[实心三角形])的超抗原性。类毒素和野生型TSST-1的剂量从10 μ g/孔至0.000001 μ g/孔。
[0022]图5显示在4天试验中对于兔子脾细胞的TSST-1 ( )、G31S/S32P ( ?)、H135A( ▲)和Q136A(.)的超抗原性土标准偏差。兔子脾细胞(2xl05/孔)与TSST-1和突变体孵育3天，然后每孔加入I μ Ci3H-胸苷孵育24小时。收获DNA，并且测定计算的每分钟计数作为T细胞增殖的度量。
[0023]图6是显示在野生型TSST-1攻击(用类毒素预先免疫(prior immunization)或非免疫的兔子)之后，存活兔子数量的柱形图。用G31S/S32P或Huvine类毒素的预先免疫保护兔子免受TSST-1致死性。监测动物健康状况15天。
[0024]图7是显示在野生型SEC3攻击(用类毒素预先免疫或非免疫的兔子)之后，存活兔子数量的柱形图。用SEC3 Y90A预先免疫保护兔子免受SEC3致死性。监测动物健康状况15天。
[0025]图8是比较在4天试验中用兔子脾细胞测试的，在来自非免疫动物收集的兔子血清与TSST-1突变体G31S/S32P、H135A和Q136A超免疫动物收集的兔子血清中TSST-1 (I μ g/孔)超抗原性的柱形图。脾细胞用指定稀释的血清+TSST-1孵育3天，然后加入I μ Ci3H-胸苷孵育24小时。收获DNA，并且测定计数/分钟作为淋巴细胞增殖的度量。脾细胞的计数/分钟+TSST-1 = 110，801 ±8647。单独脾细胞的计数/分钟=7248± 1164。
[0026]图9Α是显示对每个动物用2χ109量的野生型USA200MNPE(对于用G31S/S32P、G31S/S32P+Q或单独用α免疫的动物)或USA400MW2 (对于用Υ90Α和Υ90Α+α类毒素免疫的动物)菌在支气管内攻击之后，预免疫(pre-1mmunized)或非免疫的兔子存活数量的线形图。监测所述动物的健康状况7天。用G31S/S32P、Υ90Α± α类毒素的预先免疫保护兔子免受致死性肺炎。
[0027]图9Β是显示在用野生型USA200MNPE攻击之后预免疫或非免疫的兔子存活数量的线形图。兔子(11只/组)用抗原、TSST-l(G31S/S32P)+SEC+a-毒素(H35L或野生型)的混合物(□)或单独用a -毒素(H35L) ( ?)免疫3次，或保持非免疫(▲)。抗原在不完全佐剂中乳化并且免疫的动物加上非免疫对照动物用2xl09金黄色葡萄球菌MNPE肺内攻击。与非接种疫苗的动物或针对单独α-毒素(H35L或野生型)接种疫苗的动物相比，针对TSST-1 (G31S/S32P) +SEC+ a -毒素(H35L或野生型)免疫的兔子被显著保护免于死亡(P < 0.001)。与非接种疫苗的对照相比，针对a -毒素(H35L或野生型)接种疫苗的动物显著延缓死亡(P = 0.001)。
[0028]图1OA是显示在每只动物用2xl08量的野生型USA200MNPE IV菌攻击之后预免疫或非免疫兔子(每组4-5只)的存活数量的线形图。预免疫动物用G31S/S32P+Y90A+ a + β + y或单独用α类毒素免疫的。监测所述兔子的健康状况4天。
[0029]图1OB是显示在每只动物用2xl08量的野生型的USA200MNPE IV菌攻击之后预免疫或非免疫兔子(每组4-5只)存活数量的线形图。所述兔子用TSST-1 (G31S/S32P)、SEC、a -毒素(H35L)、β毒素和Y毒素(□)或单独用a -毒素(H35L) ( ?)免疫3次，或保持非接种疫苗(▲)。攻击生物是静脉内的USA200金黄色葡萄球菌MNPE (在PBS中2xl08/2ml 体积)。
[0030]图11是显示荷兰黑带(Dutch-belted)兔(3/组)对于用单独金黄色葡萄球菌β毒素(贝塔)和与两种TSST-1类毒素(TSST-1 (Q136A)和TSST-1 (G31S/S32P))结合的免疫应答的抗体效价的柱形图。与单独用β毒素的反应相比，在TSST-1突变体存在下的免疫应答在斯氏t检验下显著不同(P < 0.01)。
[0031]图12是显示来自用TSST-1和针对中和与T细胞⑶40配体互相作用的⑶40单克隆抗体处理的HVEC中IL-8生成(pg/mL)的柱形图。单独针对⑶40的单克隆抗体(x⑶40 ；20 μ I未稀释)、单独针对TSST-l(100yg/ml)的单克隆抗体、针对链球菌热原外毒素A(xSPEA)的同种型匹配单克隆抗体和针对⑶40+TSST-1的单克隆抗体、以及针对链球菌热原外毒素+TSST-1的单克隆抗体在96孔微孔板中与融合的HVEC重复三次孵育6小时。随后用ELISA测量IL-8的生成。误差线代表平均值的标准误差。
[0032]图13是表示针对攻击CA-MRSA菌株生成的α毒素和各自的超抗原(SEC或SEB)免疫或非免疫兔子的体温(V )和存活率的柱形图，其中CA-MRSA菌株通过肺内给药。在感染之前和感染后第I天用直肠温度计测量发热。在7天的时间期间记录死亡。
[0033]发明详述
[0034]通常，本文提供包含两种或更多种葡萄球菌类毒素的组合物(例如，2、3、4、5、6或7种葡萄球菌类毒素)。如本文所使用，类毒素是指与相应的野生型毒素相比生物活性至少有IO6倍降低并且保持免疫原性的毒素。一些葡萄球菌类毒素包含一个或多个突变，所述突变降低了生物活性。在一些实施方式中，葡萄球菌类毒素指毒素的单个蛋白组分，所述毒素需要两个不同的蛋白组分以生成生物活性毒素。在一些实施方式中，非毒性量的毒素被用于替代葡萄球菌类毒素或在葡萄球菌类毒素之外使用。
[0035]如本文所述，类毒素，特别是超抗原类毒素，通过位于它们中一些或所有之上的一个与B细胞上CD40相互作用的位点来扩大互相之间的免疫应答或对其他蛋白的免疫应答。参见实施例9。这个发现表明在一些其他类毒素疫苗(例如破伤风)的情况下，人不必每8-10年接受加强疫苗接种。另外，免疫剂量可以更小，在疫苗注射部位造成更少的不舒适。另外，这些超抗原类毒素可以加入到其他已确立的疫苗(例如破伤风、白喉、肺炎球菌(pneumonococcal)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、百日咳或奈瑟球菌属(Neisseria))以用相同的方式扩大免疫应答。在一些实施方式中，合适的葡萄球菌类毒素结合到CD40，但缺少与MHC II分子或T细胞受体β -链(νβ -TCR)的可检测的结合。
[0036]本文所述的组合物能包含中毒性休克综合征毒素-1 (TSST-1)类毒素、葡萄球菌肠毒素B(SEB)类毒素、葡萄球菌肠毒素C(SEC)类毒素、葡萄球菌肠毒素样X(SEL-X)类毒素、α毒素类毒素、β毒素类毒素或Y毒素类毒素中的两种或更多种(例如，三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种或者七种或更多种)。
[0037]TSST-1类毒素能包含一个或多个突变(例如，在位点31、32、135、136或140)。例如，TSST-1类毒素能包含在SEQ ID NO:1的位点31和32的突变，SEQ ID NO:1如下=STNDNIKDLLDWYSSGSDTFTNSEVLDNSLGSMRIKNTDGSISLIIFPSPYY SPAFTKGEKVDLNTKRTKKSQHTSEGTYIHFQISGVTNTEKLPTPIELPLK VKVHGKDSPLKYWPKFDKKQLAISTLDFEIRHQLTQIHGLYRSSDKTGG YffKITMNDUSTYQSDLSKKFEYNTEKPPINIDEIKTIEAEIN。
[0038]例如，TSST-1类毒素能包含丝氨酸取代在SEQ ID NO:1的位点31上的甘氨酸以及脯氨酸取代在SEQ ID NO:1的位 点32上的丝氨酸(G31S/S32P)。TSST-1类毒素也能包含丙氨酸取代在SEQ ID NO:1的位点135上的组氨酸(Η135Α)，丙氨酸取代在SEQ ID NO:I的位点136上的谷胺酰胺(Q136A)，或丙氨酸取代在SEQ ID NO:1的位点139上的谷氨酰胺(Q139A) ο TSST-1G31S/S32P 缺少结合 MHC II 分子的能力，并且 TSST-1H135A，Q136A 和Q139A缺少结合V β -TCR的能力。
[0039]TSST-1类毒素也能够是TSST-1毒素的人分离物和TSST-1毒素的绵羊分离物的融合蛋白，相对于成熟的人TSST-1分离物，其在SEQ ID NO:1的位点19、55、57、69、80、132和140含有不同的氨基酸。为了生成所述融合蛋白，tstH(人分离物)基因的部分和tstO(绵羊分离物)基因的部分连接以产生人-绵羊基因融合，称为huvine蛋白。所述huvine蛋白含有来自TSST-1 (人分离物)的前89个氨基酸和来自TSST-绵羊分离物的后105个氨基酸。Huvine不是促T细胞有丝分裂的，并且不会在兔子模型中引发中毒性休克综合征。参见例如，Murray 等，152 (I):87-95 (2001)。
[0040]如实施例2和4所述，TSST-1类毒素G31S/S32P、huvine、H135A和Q136A是无生物学活性的并且与野生型TSST-1相比至少IO6倍无活性。
[0041]SEB和SEC类毒素能够包含一个或多个突变(例如，在位点20、23、90、91或210)。参见例如，Leder 等，J Exp Med.187(6) =823-833(1998) ? 例如，SEC 类毒素能是 SEC3 类毒素，其在 SEQID NO:2 的位点 90 有突变，SEQ ID NO:2 如下:ESQPDPMPDDLHKSSEFTGTMGNMKYLYDDHYVSATKVKSVDKFLAHDLIYNISDKKLKNYDKVKTELLNEDLAKKYKDEVVDVYGSNYYVNCYFS SKDNVGKVTGGKTCMYGGITKHEGNHFDNGNLQNVLVRVYENKRNTIS FEVQTDKKSVTAQELDIKARNFLINKKNLYEFNSSPYETGYIKFIENNGNT FWYDMMPAP⑶KFDQSKYLMMYNDNKTVDSKSVKIEVHLTTKNG。例如，SEC3 类毒素能够包含丙氨酸取代在SEQ ID NO:2的位点23上的天冬酰胺。例如，SEC3类毒素能够包含丙氨酸取代在SEQ ID NO:2的位点90上的酪氨酸。SEC3类毒素能够包含丙氨酸取代在SEQ ID NO:2的位点210上的谷胺酰胺。
[0042]SEB类毒素能在SEQID NO:3的位点20、26、90、91或210上有突变，SEQID N0:3如下:ESQPDPKPDELHKSSKFTGLMENMKVLYDDNHVSAINVKSIDQFLYFDL1 YSIKDTKLGNYDNVRVEFKNKDLADKYKDKYVDVFGANYYYQCYFSK KTNDINSHQTDKRKTCMYGGVTEHNGNQLDKYRSITVRVFEDGKNLLSF DVQTNKKKVTAQELDYLTRHYLVKNKKLYEFNNSPYETGYIKFIENENS FWYDMMPAP⑶KFDQSKYLMMYNDNKMVDSKDVKIEVYLTTKKK。例如，SEB类毒素能够包括丙氨酸取代在SEQ ID NO:3的位点90上的酪氨酸。SEB类毒素能够包括丙氨酸取代在SEQ ID NO:3的位点210上的谷胺酰胺。SEB类毒素能够包括缬氨酸取代在SEQ ID NO:3的位点91上的酪氨酸。在另一个实施方式中，SEB类毒素能包括苏氨酸取代在位点20上的亮氨酸，酪氨酸取代缬氨酸，以及缬氨酸取代在SEQID NO:3的位点91上的酪氨酸。如实施例2和4所述，与野生型SEC3相比，SEC3Y90A至少IO6倍无活性。
[0043]SEl-X类毒素能包含一个或多个突变(例如，在SEQ ID NO:1的位点31、32、135、136、139或140的对应残基)。例如，SEl-X类毒素能包含在SEQ ID NO:4 (MFKKYDSKNSIVLKSILSLGIIYGGTFGIYPKADASTQNSSSVQDKQLQ KVEEVPNNSEKALVKKLYDRYSKDTINGKSNKSRNWVYSERPLNENQV RIHLEGTYTVAGRVYTPKRNITLNKEVVTLKELDHIIRFAHISYGLYMGE HLPKGNIVINTKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTADIKNVTFKLVKSV NDIEQV)中与 SEQ ID NO:1 的位点 31 和 32 对应的突变。
[0044]α毒素类毒素能具有一个或多个突变(例如,在位点35)。例如，α毒素类毒素能包含在 SEQ ID NO:5 的位点 35 上的突变，SEQ ID NO:5 如下:ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKT⑶LVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHN KKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTCDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKY VQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSffNPVYGNQLF MKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNI DVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKffTDRS SERYKIDffEKEEMT N。
[0045]例如，亮氨酸能够取代SEQ ID NO:5的位点35上的组氨酸。参见例如，W02009/029831。如下文实施例6和7所述，单独针对G31S/S32P免疫或与α毒素结合免疫的兔子被完全保护以免受金黄色葡萄球菌菌株的攻击。然而，单独针对α毒素的免疫仅仅在部分程度上保护动物。
[0046]β毒素类毒素能具有一个或多`个突变(例如，在位点149或288)。例如，β毒素类毒素能包含在SEQ ID NO:6的位点149和288上的突变，SEQ ID NO:6如下:ESKKDDTDLKLVSHNVYMLSTVLYPNWGQYKRADLIGQSSYIKNNDVVI FNEAFDNGASDKLLSNVKKEYPYQTPVLGRSQSGWDKTEGSYSSTVAED GGVAIVSKYPIKEKIQHVFKSGCGFDNDSNKGFVYTKIEKNGKNVHVIGT HTQSEDSRCGAGHDRKIRAEQMKEISDFVKKKNIPKDETVYIGGDLNVN KGTPEFKDMLKNLNVNDVLYAGHNSTWDPQSNSIAKYNYPNGKPEHLD YIFTDKDHKQPKQLVNEVVTEKPKPWDVYAFPYYYVYNDFSDHYPIKA YSK。例如，天冬酰胺能取代SEQ ID NO:6的位点149上的组氨酸并且天冬酰胺能取代SEQ ID NO:6的位点288上的组氨酸。参见例如，Huseby 等，J.Bacteriol.，189 (23):8719-8726 (2007)。
[0047]y毒素取决于两个不同的蛋白组分，并且每个组分单独有免疫原性但是没有毒性。Y毒素的A蛋白与B蛋白或C蛋白配对以形成活性蛋白。因此，组合物能包含Y毒素的A蛋白、B蛋白或C蛋白。B蛋白在本文的组合物中特别有用，由于其单独不具有毒性。SEQ ID NO:7 是 A 链的氨基酸序列:GPLGSPEFENKIEDIGQGAEIIKRTQDITSKRLAICQNIQFDFVKDKKYNK DALVVKMQGFISSRTTYSDLKKYPYIKRMIWPFQYNISLKTKDSNVDLIN YLPKNKIDSADVSQKLGYNIGGNFQSAPSIGGSGSFNYSKTISYNQKNYV TEVESQNSKGVKWGVKANSFVTPNGQVSAYDQYLFAQDPTGPAARDYF VPDNQLPPLIQSGFNPSFITTLSHEKGKGDKSEFEITYGRNMDATYAYVT RHRLAVDRKHDAFKNRNVTVKYEVNWKTHEVKIKSITPKoSEQ ID NO:8 是B 链的氨基酸序列:GPLGSPEFEGKITPVSVKKVDDKVTLYKTTATADSDKFKISQILTFNFIKD KSYDKDTLVLKAAGNINSGYEKPNPNDYDFSKLYWGAKYNVSISSQSND SVNVVDYAPKNQNEEFQVQNTLGYTFGGDISISNGLSGGLNGNTAFSETI NYKQESYRTTLSRCTNYKNVGffGVEAHKIMNNGffGPYGRDSFHPTYG NELFLAGRQSSAYAGQNFIAQHQMPLLSRSNFNPEFLSVLSHRQDGAKK SKITVTYQREMDLYQIRffNGFYffAGANYKNFKTRTFKSTYEIDffENHK VKLLDTKETENNK。
[0048]在一些实验中，本文所述的组合物能包含TSST-1类毒素(例如，G31S/S32P、H135A、Q136A和/或Huvine)，SEC类毒素(例如，SECY90A和/或Q210A)，以及α毒素类毒素(例如,H35L)。这样的组合物还能包含下列中的一种或多种:SEB类毒素(例如，SECY90A和/或Q210A)、β毒素类毒素(例如，Η149Ν、Η288Ν)、Y毒素类毒素(例如，Y毒素的B链)以及SEl-X类毒素。
[0049]在一些实施方式中，本文所述的组合物能包含TSST-1类毒素(例如，G31S/S32P、H135A、Q136A 和 / 或 Huvine)，SEC 类毒素(例如，SECY90A 和 / 或 Q210A)，SEB 类毒素(例如，SECY90A和/或Q210A)、α毒素类毒素(例如，H35L)以及β毒素类毒素(例如,Η149Ν、Η288Ν)。这样的组合物还能包含Y毒素类毒素(例如，Y毒素的B链)和/或SEl-X类毒素。
[0050]本文所述的毒素和类毒素能通过标准体外重组DNA技术和使用合适的多肽的编码核苷酸序列的体内转基因制备。可采用本领域技术人员熟知的方法以引入突变和构建含有相关编码序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。参见例如，SambiOOk等，《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第二版)[纽约冷泉港实验室，1989],以及Ausubel等，《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols inMolecular Biology)[纽约格林出版联合公司和威利国际科学，1989]中描述的技术。
[0051]上述转录/翻译调控元件包括但不限于诱导型启动子和非诱导型启动子、增强子、操纵子和其他本领域技术人员已知并且驱动或调控基因表达的元件。这种调控元件包括但不限于巨细胞病毒hCMV快速早期基因、SV40腺病毒的早期启动子或晚期启动子、Iac (乳糖)系统、Trp (色氨酸)系统、TAC系统、TRC系统、噬菌体A的主要操纵子和启动子区域、fd外壳蛋白的控制区域、3磷酸甘油酸激酶启动子、酸性磷酸酶启动子以及酵母α交配因子启动子。
[0052]用于本发明目的的表达系统包括但不限于微生物，如含有编码增强剂或免疫原性刺激物的核酸分子的重组噬菌体DNA、质粒DNA或DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis));用含有编码增强剂或免疫原性刺激物的核酸分子的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces)和毕赤酵母(Pichia));用含有编码增强剂或免疫原性刺激物的核酸分子的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)或烟草花叶病毒(TMV))感染或用含有编码核酸分子的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或包容了含有衍生自哺乳动物基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子和牛痘病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK,293, VERO, HeLa, MDCK, WI38和NIH3T3细胞)。同样有用的宿主细胞是直接从哺乳动物得到并且用质粒载体转染或用病毒载体感染的原代或次生细胞。
[0053]用本文所述的表达载体转染或转导的细胞然后能用于，例如通过本领域已知的方法大规模或小规模体外制备类毒素。大体上，这种方法涉及在最大化多肽产量的条件下培养细胞和从培养物(例如，细胞和/或培养基)中分离多肽。纯化生物大分子(例如，蛋白质)的方法为本领域已知。例如，本文所述的类毒素能通过乙醇沉淀和等电聚焦的结合从含有突变基因克隆的培养液体中纯化。参见Blomster-Hautamaa和Schlievert, MethodsEnzymol 165:37-43(11) (1988)。大分子的纯度通过任何适当方法如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析来测定。
[0054]含有两种或更多种葡萄球菌类毒素的组合物能用作针对葡萄球菌属细菌所造成的疾病的预防性疫苗。本文所述的组合物也能用作生成针对两种或更多种葡萄球菌外毒素的抗体，以用作例如被动免疫治疗剂。例如，本文所述组合物能用作针对金黄色葡萄球菌(包含金黄色葡萄球菌的甲氧西林耐药性菌株如USA400、USA300或USA200)、中间葡萄球菌(S.1ntermedius)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、里昂葡萄球菌(S.1ugdunensis)、施氏葡萄球菌(S.schleiferi)、山羊葡萄球菌(S.caprae)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、李氏葡萄球菌(S.1eei)、其他凝固酶阴性或阳性葡萄球菌造成的疾病的疫苗。USA300和USA400是社区相关的甲氧西林耐药性的金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)菌株。USA400菌株，包含菌株MW2和c99_529,从USA400与坏死性肺炎(necrotizing pneumonia)的原始联系中分离，是坏死性肺炎的强效原因。参见JAMA 282 =1123-5(1999);和Fey等，AntimicrobAgents Chemother47:196-203 (2003)。
[0055]金黄色葡萄球菌引起的疾病包括，例如中毒性休克综合征、肺炎、感染性心内膜炎、败血症、皮肤感染、软组织脓肿、胃肠炎和骨髓炎。本文所用术语“预防”是指完全防止疾病的症状、延迟疾病症状的发生或减轻随后发展的疾病症状的严重程度。例如，对于金黄色葡萄球菌，预防性疫苗能防止肺炎、败血症、感染性心内膜炎或骨髓炎的发展，延迟肺炎、败血症、感染性心内膜炎或骨髓炎的症状或减轻肺炎、败血症、感染性心内膜炎或骨髓炎的随后发展症状的严重程度。本文所述的组合物能用于在人或其他动物(包括兔子、小鼠、雪貂、狗和鸡)中诱导针对葡萄球菌外毒素的免疫应答。
[0056]如本文所用，“免疫应答”是指在受体患者中出现针对葡萄球菌外毒素的体液应答(抗体介导)、细胞应答(抗原特异性T细胞或其分泌产物介导)或同时出现体液应答和细胞应答。这种应答可以是通过给予免疫原诱导的主动应答或者通过给予抗体、含有抗体的物质或激活(primed)的T细胞诱导的被动应答。如本文所用“主动免疫”是指通过给予抗原在对象中产生的任意免疫。如本文所用“被动免疫”是指不给予对象抗原的情况下产生的任意免疫。“被动免疫”因此包括但不限于，给予活化的免疫效应子，所述效应子包含免疫应答的细胞介导物或蛋白介导物(例如，单克隆抗体和/或多克隆抗体)。单克隆抗体或多克隆抗体组合物能用于被动免疫中，以用于防止或治疗葡萄球菌生物引起的感染。所述抗体组分能够是多克隆抗血清。在特定方面，一种或多种抗体从用本文所述组合物攻击的动物或第二对象中亲和纯化。
[0057]在一些实施方式中，向对象给予包含多种葡萄球菌类毒素的组合物。本文所述类毒素具有固有的佐剂活性，因为其能与其他抗原显著地协同以扩大抗体应答。同样，本文所述组合物不需要包括单独的佐剂。
[0058]在一些实施方式中，向对象给予含有多种葡萄球菌类毒素和佐剂的组合物。“佐剂”是能增强针对特定抗原(如多肽)的免疫应答的免疫学化合物。能够基于，例如给药途径或给药次数来选择合适的佐剂。佐剂的非限制性例子包含矿物油佐剂如弗氏完全佐剂和不完全佐剂、和蒙塔尼(Montanide)不完全森皮(seppic)佐剂(ISA,购法国巴黎的森皮(Seppic)公司)；水包油乳液佐剂如瑞比(Ribi)佐剂系统(RAS) ;TiterMax?，和含有胞壁酰二肽的语法佐剂(syntax adjuvant)制剂；角藍烯；或招盐佐剂(例如，磷酸招、氢氧化招或明矾)。
[0059]本文所述组合物能包含药学上可接受的赋形剂，如磷酸盐缓冲盐水或碳酸氢盐(例如，0.24M NaHCO3)。基于给药的模式和途径，以及标准药学实践，一名本领域普通技术人员能选择合适的赋形剂。药物赋形剂和稀释剂，以及使用它们的药学必要性，在例如《雷明顿药物科学》(Remington, s Pharmaceutical Sciences)中描述。药物赋形剂的非限制性例子包含溶剂(例如水或生理盐水) 、增溶剂(例如，乙醇、聚山梨酯或Cremophor EL7)、实现等渗的试剂、防腐剂 、抗氧化剂、乳糖、淀粉、结晶纤维素、甘露醇、麦芽糖、磷酸氢钙、轻质硅酸酐、碳酸钙、粘结剂(例如，淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮、羟丙基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素或阿拉伯胶)、润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或硬化油)或稳定剂(例如，乳糖、甘露醇、麦芽糖、聚山梨酯、聚乙二醇或聚氧乙烯硬化蓖麻油)。如果需要，能加入甘油、二甲基乙酰胺、70 %乳酸钠、 表面活 性剂、或碱性物质如氢氧化钠、乙二胺、乙醇胺、碳酸氢钠、精氨酸、葡甲胺或三氨基甲烷。如果需要缓慢释放所述组合物，可生物降解的聚合物如聚-D，L-交酯-共-乙交酯或聚乙交酯能被用作主体基质(bulk matrix)(参见例如,美国专利号5，417，986,4, 675，381和4，450，150)。药物制品如溶液、片剂、颗粒或胶囊能用这些组分制成。如果所述组合物通过口服给药，能够加入调味剂和/或色素。
[0060]通常，给药的组合物能在药学上可接受的赋形剂(例如，生理盐水)中悬浮并且通过口服、透皮、静脉内、皮下、肌肉内、眼内、腹膜内、直肠内、阴道内、鼻内、胃内、气管内、肺内或其任意组合给药。例如，所述组合物能通过鼻内和皮下给药。如果需要，加强免疫能在不同的间隔下(例如，间隔3个月或3年)下给予一次或多次(例如，2、3或4次)。例如，对于预防性疫苗，初免剂量后在不同的间隔下(例如间隔一周)一次或多次加强免疫(例如，三次加强剂量)。例如，使用相同的制剂，加强注射能在第一次免疫8-12周后给予，并且第二次加强注射在16-20周后给予。
[0061]合适剂量的组合物在对象中引起免疫应答但不造成对象出现葡萄球菌感染的严重临床信号。引起免疫应答所需要的剂量取决于给药的途径、组合物的本质、对象的尺寸、体重、表面积、年龄和性别、给予的其他药物以及主治医师的判断。从各种给药途径的不同效率来看，预期需要的剂量有很大的变化。例如，口服给药比静脉内注射给药预期需要的剂量更大。这些剂量水平的变化能用标准经验程序调节以优化，这是本领域所熟知的。把组合物包埋在合适的递送载剂(例如，聚合微粒或可植入装置)中可增加递送的效率，尤其是口服递送。
[0062]为了确定在对象中是否诱导免疫应答，能检测来自对象的生物样品以确定其是否包含可检测量的具有对一种或多种类毒素的特异结合亲和性的抗体，这些类毒素是对象接种疫苗所针对的。生物样品能够是血液(例如，血清)或粘膜样品(例如，唾液)。检测抗体(包括IgG、IgM和IgA)的方法是已知的，并且能够包括，例如酶联免疫吸附试验(ELISA)或Western印迹。
[0063]制品
[0064]本文所述组合物能与包装材料和固体结合作为制品或试剂盒。生产制品的组分和方法是熟知的。所述制品可与本文所述的一种或多种治疗组合物结合。另外，制品还可包含无菌水、药物运载体、缓冲液、抗体、指示分子和/或其他有用的检测微生物疾病的试剂。这种试剂盒中可包含说明书，所述说明书描述组合物或疫苗如何有效防止感染的出现、防止感染的临床信号的发生、缓解感染的临床信号、降低感染的临床信号的风险、降低感染的临床信号的发生和/或减少感染的扩散。本文所述组合物能以对单次给药有效量的预制并包装好的形式提供。
[0065]以下是本发明实践的实施例。它们不会以任何方式对本发明的范围构成限制。实施例
[0066]实施例1
[0067]材料和方法
[0068]含有编码TSST-1、TSST-1突变体或SEC的质粒的金黄色葡萄球菌菌株RN4220被用作 TSST-1、TSST-1 突变体或 SEC 的来源。参见 Leder 等，J Exp Med, 187 =823-33(1998)；Murray 等，Infect Immun, 64:371-4 (1996);以及Murray 等，J Immunol, 152:87-95 (1994)。菌株RN4220不产生可检测的内源性超抗原。RN4220也被用作β -毒素的来源。参见Gaskin等，Protein Expr Purif9:76_82S(1997)。
[0069]金黄色葡萄球菌菌株MNPE是天然α -毒素的来源。参见Lin等,Biochemistry50:7157-67(2011)。大肠杆菌克隆是突变体α-毒素(H35L)的来源，其由芝加哥大学的Juliane Bubeck-Wardenburg博士提供，并且Y -毒素表达自ρΕΤ载体。参见Bubeck-Wardenburg和 Schneewind, J Exp Med205:287_94S(2008)。
[0070]金黄色葡萄球菌菌株MNPE在微生物攻击研究中使用；该生物在明尼苏达州(Minnesota)造成流感后 TSS 的致命病情。参见 MacDonald 等，JAMA, 257 =1053-8(1987)。MNPE分离自USA200 ;这些生物造成了大多数的TSS病情。参见Schlievert等，J AllergyClin Immunol 125:39-49(2010)。MNPE 具有以下分泌毒力因子表型:TSST_1 高+、SEC高+、α -毒素S+、β -毒素S+和Y -毒素+。参见Lin等，2011，同上。对于在肺炎和感染性心内膜炎/败血症研究中使用，所述生物在37°C下在标准空气条件下在25ml的Todd-Hewitt (密歇根州底特律的迪菲克实验室(Difco Laboratories))肉汤中以200转/分钟的速度摇动。参见Schlievert等，Infect Disl47:236-42 (1983)。所述生物用磷酸缓冲盐水(PBS ;0.005M磷酸钠，pH7.2 ；0.15M NaCl)洗涤一次，在14，OOOx g下离心5分钟，然后以2x1070.2ml体积在Todd Hewitt培养基中重悬作为在肺炎研究中的高剂量注射(Strandberg 等，J Infect Dis 202:1690-7 (2010))，并且以 lxl08/ml 在 PBS 中重悬，对于感染性心内膜炎/败血症研究用2ml静脉内注射(Schlievert等，Infect Immun,66:218-23(1998))。
[0071]TSST-1的类毒素候选疫苗包含G31S/S32P(其中位点31从甘氨酸变为丝氨酸，并且位点32从丝氨酸变为脯氨酸)、H135A(其中位点135从组氨酸变为丙氨酸)、Q136A (其中位点136从谷胺酰胺变为丙氨酸)和huvine (人和绵羊TSST的融合基因；这些蛋白有7个氨基酸不同)。由于在结合到MHC II分子的外毒素的位点上的突变，并且这种结合对于毒性是必需的，G31S/S32P蛋白无生物学活性。参见See Kim等，Science,266:1870-1874(1994)。Huvine 蛋白也无生物学活性。参见 Murray 等，J Tmmunol 152:87-95(1994)。H135A蛋白无法结合到T细胞受体的β链的可变区(Vβ-TCR)，并且Q136A蛋白也不能结合到 νβ-TCR。参见 Jardetzky 等，Nature368:711_8 (1994) ;McCormick 等，J Tmmunol 1 71: 1385-92 (2003);以及 Murray 等，Infect Tmmun64:371-4(1996) ?
[0072]TSST-1 的 G31S/S32P、H135A 和 Q136A 位点特异突变通过使用快变(Quikchange)方法(加利福尼亚州拉由拉市司查塔基公司(Stratagene))制备。初始质粒是在穿梭质粒pCE104上的天然tstH,克隆进入大肠杆菌。参见Murray等，1996,同上。在进行诱变之后，所得的质粒克隆进入大肠杆菌并且验证完整的结构基因序列以确认TSST-1突变。然后该质粒克隆进入金黄色葡萄球菌RN4220用于制备和纯化。Huvine蛋白通过剪接TSST-1和TSST-绵羊的基因制作并且然后克隆进入RN4220。
[0073]G31S/S32P、H135A、Q136A、huvine 类毒素和 TSST-1, SEC 以及天然 α -毒素和β_毒素通过乙醇沉淀和等电聚焦的结合从含有突变基因克隆的培养液体中纯化。参见 Blomster-Hautamaa 和 Schlievert, Methods Enzymol 165:37-43(11) (1988)；以及Blomster-Hautamaa 等，Biochemistry25:54-9(1986)。基本上，对于 TSST-1、TSST-1 类毒素、SEC、天然α-毒素和天然毒 素的生产，生物体在透析的牛心培养基中生长过夜。TSST-U TSST-1类毒素、SEC和β-毒素从培养液体中用四倍体积的无水乙醇沉淀两天(80 %终浓度)，在蒸馏水中重新溶解，然后通过薄层等电聚焦纯化。对于初始分离，等电聚焦的PH梯度是ρΗ3.5-10，然后对于TSST-1、TSST-1类毒素和α -毒素是ρΗ6_8，对于SEC和毒素是ΡΗ7-9。天然α-毒素相似地从金黄色葡萄球菌菌株MNPE生成，除了所述毒素用80%终浓度饱和硫酸铵从培养液体中沉淀，然后在蒸馏水中溶解并且透析3天，然后等电聚焦。
[0074]α -毒素(H35L)的无生物学活性的突变体和Y _毒素的富集制备从ρΕΤ载体中的大肠杆菌克隆中生成并且在镍柱上纯化。参见Bubeck Wardenburg和Schneewind, J ExpMed205:287-94(2008)。
[0075]当用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和反相高效液相色谱检测时，TSST-K TSST-1 突变体和 SEC 是均匀的。参见 Blomster-Hautamaa 和 Schlievert,1988，同上。另外，这些蛋白对于污染脂多糖(LPS)、肽聚糖、溶细胞素、脂肪酶和蛋白酶是阴性的。天然α-毒素还通过反相高效液相色谱纯化并且是均匀的。参见Lin等，2011，同上。由大肠杆菌生成的α-毒素突变体H35L和Y-毒素含有少量大肠杆菌污染物，其并不影响实验。纯化的蛋白用伯乐(BioRad)蛋白试验定量。
[0076]实施例2
[0077]在兔子中类毒素疫苗的安全性
[0078]通过给予类毒素尝试在兔子中生成TSS，从而在兔子中测试(荷兰黑带兔(Dutch-belted),购自明尼苏达州雷德温市(Red Wing)Bakkom养兔场)类毒素的安全性。超抗原外毒素是已知最有效的热原之一，并且扩大革兰氏阴性脂多糖LPS的致死效果
1,000，000 倍。参见 Schlievert，Infect Immun 36:123-128(1982)。使用三个试验以测试类毒素的残余毒性:1)在静脉内给予类毒素然后给予LPS ；2)通过微渗透泵皮下给予类毒素；以及3)超抗原性的体外测试。
[0079]在一个实验中，兔子(每组10只)用TSST-1类毒素突变体(G31S/S32P或Huvine，1000 μ g/kg)或I μ g/kg的野生型TSST-1 (5只兔子)攻击IV。在4小时时间点上，所有的兔子都用501^/1^的1^5(1/100)5(|)单独攻击。所述LPS来自肠炎沙门菌(Salmonellaenteritidis)伤寒血清型(serovar),并且通过热-苯酹方法制备。图1显示用类毒素突变体或野生型TSST-1攻击后兔子的发热反应。在4小时时间期间没有类毒素诱导的显著发热，而野生型TSST-1是高热原的(P << 0.001，对于类毒素和野生型TSST-1，用斯氏t检验)。给予1000 μ g/kg的各类毒素然后给予LPS的兔子都没有死亡，相比之下，所有5只给予I μ g/kg野生型TSST-1然后给予50 μ g/kg LPS的动物死亡(P = 0.003，用菲希尔精确检验)。这些研究表明G31S/S32P和Huvine类毒素与野生型TSST-1相比至少1，000, 000倍无活性，并且两种类毒素都被兔子良好耐受，因为兔子没有显示源于攻击的不良作用。
[0080]在另一个实验中，兔子(每组5只)用500ug/kg天然TSST-1或TSST-1G31S/S32P、H135A或Q136A突变体中的一种来攻击IV，然后在4小时时间点上用100ug/kg通过热-苯酚方法制备的，来自肠炎沙门菌伤寒血清型的LPS攻击IV。就在给予LPS之前，相比TSST-1或突变体预先注射，在4小时时间点上记录发热情况，并且在48小时时间期间内记录死亡情况。天然TSST-1造成高烧，而所有`的3个突变体都是非热原的(P < 0.001，对于TSST-1与任意突变体的比较)(图2)。另外，所有接受天然TSST-1然后接受LPS的5只兔子都在I小时内死亡，但是所有接受突变体TSST-1蛋白然后接受LPS的5只兔子在48小时都没有死亡(P < 0.008，对于TSST与任意突变体相比)(图2)。这些数据表明所有3种突变体蛋白是> 500, 000倍无活性的，因此能被认为是类毒素。
[0081]相似的实验用SEC3 Y90A重复(葡萄球菌肠毒素C，其中位点90从酪氨酸残基变为丙氨酸残基)。结果见图2。与G31S/S32P和huvine类毒素相同，相比野生型SEC3，所述SEC3 Y90A类毒素至少1，000, 000无活性并且被兔子良好耐受，因为没有观察到源于攻击的不良作用。
[0082]当植入的微渗透泵在皮下给药时，单独用TSST-1对于兔子是致死的；该模型中的致死剂量是75ι^/动物(llyg/天)。天然TSST-1和每个TSST-1突变体(G31S/S32P、H135A或Q136A) (1000 μ g/动物;143yg/天或IOxLD50)在微渗透泵(加利福尼亚州瓦卡维尔的阿尔扎公司(Alza Corporation))中向5兔子/组给药。当动物用氯胺酮(25mg/kg)和赛拉嗪(25mg/kg)(加利福尼亚州伯林格姆的菲尼克斯制药公司(PhoenixPharmaceuticals))麻醉时,植入泵。监测7天内兔子TSS症状(发热、腹湾、结膜发红和低血压迹象)和致死疾病的发展，所述致死疾病定义为即将死亡的100%预测值，包括动物同时不能保持挺直和不能展示逃跑反应。动物用静脉内注射lml/kg的Beuthanasia-D (德克萨斯州西湖的先林葆雅公司(Shering-Plough))处死。存活的兔子在7天结束时处死。给予三种TSST-1突变体的没有引起发热，如植入后第二天所测量(P < 0.001，对于TSST-1相比任意突变体)，没有造成任何TSS病症并且没有造成任何动物的死亡。相反，天然TSST-1是热原的，诱导TSS病症，并且造成所有5只动物在48小时内死亡(P < 0.008，对于TSST-1相比任意突变体)。
[0083]这些数据通过体外测试确定，所述体外测试通过评估造成人PBMC增殖的能力来评估类毒素造成人T细胞超抗原性刺激的能力(图4)。在一个实验中，试验在96孔微孔板中孵育4天后重复四次进行。参见Barsumian等，Infect Immun22:681-688 (1978)。相似比较野生型TSST-1 [空心正方形]的超抗原性。在完整的剂量反应(10 μ g/孔-0.000001 μ g/孔)中，类毒素(G31S/S32P或huvine)都没有在体外展示出超抗原性，而野生型TSST-1在10 μ g/孔和0.00001 μ g/孔的剂量之间有超抗原性(所有试验重复四次进行)。参见图4。两种类毒素的3H胸苷整合入DNA的每分钟计数(CPM)(增殖的度量)相比野生型TSST-1在从10 μ g/孔下至0.00001 μ g/孔之间的所有剂量下，通过斯氏t检验有显著差异(P << 0.001)。这些数据证实两种类毒素与野生型TSST-1相比至少IO6倍无活性。
[0084]在另一个实验中，兔子脾细胞(2xl05/孔)与TSST-1和突变体(G31S/S32P、H135A或Q136A)孵育3天，然后每孔加入I μ Ci3H-胸苷24小时。收获DNA，并且测定每分钟计数作为T细胞增殖的度量。参见Schlievert等，J Infect Disl43:509-16 (1981)。天然TSST-1在IOyg/孔下至KT6Ug/孔的毒素范围内是超抗原性的(图5)。3种TSST-1突变体都没有展示出超抗原性活性，甚至在10 μ g/孔的剂量也没有。这些研究表明突变体的超抗原性降低> IO7倍。
[0085]实施例3
[0086]兔子抗体反应
[0087]大约20%的人显示不能产生针对超抗原TSST-1的抗体应答。参见Parsonnet等,JClin Microbiol43:4628-34(2005);以及 Vergeront 等，J Infect Dis, 148:692-8 (1983)。另外，缺少抗体TSST-1的月经期的TSS病人，没有产生感染之后的保护性抗体因而易于多次复发TSS。参见Osterholm等，J Infect Disl45:431-40 (1982)。这种现象在感染疾病中是不正常的，通常感染导致特异的免疫。已经假设了两种可能的机理以解释在易感个体中缺少产生针对TSST-1的抗体:1)这些人可能遗传上不能识别TSST-1为外来物，因而不能产生针对这个22，000分子量蛋白的抗体应答；以及2)这些人可能对于超抗原是超敏感(hyper-responsive)的,具有免疫调节异常防止抗体应答。如果20%的人由于遗传缺陷不能产生针对任意提供的超抗原的抗体应答，这会减少使用超抗原类毒素试图向人接种以免受严重葡萄球菌疾病的争议。
[0088]兔子产生针对天然TSST-1的保护性抗体应答的能力被确定作为体内模型，以理解在人中缺少保护性抗体应答的机理。与小鼠相反，兔子对于超抗原是高度易受感染的，并且成为研究产生TSS的重要因子的极好的模型。
[0089]20只荷兰黑带兔用25 μ g/剂量的在不完全佐剂中乳化的天然TSST-1隔周注射3次。在颈背上多个皮下位点免疫。在对动物的最后一次免疫一周之后，从耳缘静脉处抽血，收集血清，并且通过酶联免疫吸附试验(ELISA)确定抗体效价，如Strandberg等，J Infect Dis202:1690-7(2010)所述。简要地，平底96孔板(新罕布什尔州朴次茅斯的NUNC Maxisorp公司)用1.Ομ g/孔纯化的天然同源超抗原或溶细胞素包被,然后洗漆。兔血清样品从1:10稀释开始系列稀释2倍；平板在室温下最少孵育1.5小时，然后洗涤。加入辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG抗体(密苏里州圣路易斯市的西格玛-阿尔德里奇公司(Sigma-Aldrich))到孔中。这些平板再孵育最少1.5个小时，并洗涤孔。IgG的相对水平通过加入100 μ I/孔的邻苯二胺和H2 O 2底物确定。比色反应通过加入50 μ 112.5%的硫酸溶液停止。平板用分光光度计在490nm的波长下扫描吸光度。
[0090]用25 μ g/剂量的天然TSST-1免疫导致仅仅10/20的兔子产生针对TSST-1的抗体效价，并且ELISA测试其> 10，000，其中效价是提供超过背景的颜色变化的最后一个孔稀释度的倒数。为了比较，易受TSS感染的人的针对TSST-1抗体效价< 40，而不发生TSS的人的效价> 80。因而，认为10只产生抗体的兔子对TSST-1是超免疫的。
[0091]相反，10只剩下的动物的抗体效价< 10，这是该试验中的检测的下限。然后只要它们存活，这些10只无应答的动物每个月持续免疫直到6个月。这些兔子每个月也通过ELISA监测针对TSST-1的抗体的产生。所有10只动物死于疫苗接种尝试，其中7只在6个月之后死亡。在所有测试的时间点上，所有这10只兔子的抗体效价< 10。因此，兔子模型显示重复人的情况，因为相当大百分比的人和兔子都不能产生针对TSST-1的抗体应答。在兔子针对超抗原SEB和SEC的抗体应答中观察到相同的现象。
[0092]实施例4
[0093]在兔子中类毒素 疫苗的免疫原性和安全性
[0094]针对无生物学活性的蛋白(TSST-1和α -毒素突变体)超免疫的荷兰黑带兔和新西兰白兔，所述蛋白通过25 μ g的各蛋白单独或与PBS结合用等体积的弗氏不完全佐剂乳化。在颈背上多个皮下位点免疫。天然毒素(TSST-l、SEC、a-毒素、β-毒素和Y -毒素)以约10 μ g/ml的剂量按照相同的方案免疫。所有试验的免疫是隔周的(第O、14和28天)，注射3次。在最后一次动物免疫一周后，从耳缘静脉处抽血，收集血清，并且通过ELISA测定抗体效价(参见实施例3)。
[0095]在一个实验中，用25 μ g的在弗氏不完全佐剂中乳化的G31S/S32P或Huvine在颈背皮下注射3次，以隔周免疫兔子(20只/组)。用ELISA所测定，在最后一次免疫I周后所有兔子的抗体效价大于100，000，相比非免疫(20只动物)和免疫前动物的抗体效价是< 10。
[0096]用野生型TSST-1攻击免疫的和非免疫对照动物(通过阿尔扎微渗透泵皮下给药500 μ g)，并且在15天的时间期间监测致死TSS的发展(图6)。当通过阿尔扎微渗透泵皮下给药时,野生型TSST-1对于兔子是致死的。参见Lee等，Infect Immun59:879-884 (1991)。微渗透泵被设计在7天期间释放恒定量的毒素，在这段期间内在100 μ g/泵(14 μ g/天)的野生型TSST-1剂量下，兔子出现统一的致死TSS。在这个模型中致死性不需要LPS。
[0097]没有免疫的动物在测试期间死亡，并且在第I天测量时也没有出现发热(平均0.3±0.10C )，没有出现腹泻并且没有减少体重。相反，所有非免疫动物都死亡(P = 7xl0_12相比于免疫组)，所有动物在第I天发热显著(平均1.9±0.2V )，所有动物有大量腹泻，并且都在死亡前减少体重。
[0098]用SEC3 Y90A类毒素重复类似的实验。如图7所示，用SEC3 Y90A的预先免疫保护兔子免受野生型SEC3的攻击。
[0099]在另一个实验中，兔子(10只/组)用TSST-1突变体G31S/S32P、H135A或Q136A隔周免疫，共3次。在第三次注射一周后采血时，ELISA测试各组中的所有10只动物(总共30只)具有> 10，000的针对天然TSST-1的抗体效价。这些数据说明之前50%的兔子无法产生抗体应答是由于TSST-1诱导的免疫应答的调节异常，而不是遗传上不能识别TSST-1为外来蛋白。
[0100]针对TSST-1突变体G31S/S32P、H135A或Q136A免疫的兔子以及对照、非免疫动物(5只/组)然后在最后一次免疫一周后，用致死剂量的天然TSST-1攻击，或以10 μ g/kg加LPS(10 μ g/kg)静脉内(5000x LD50)攻击或单独以500 μ g/kg在微渗透泵中(71 μ g/天; 5.5x LD50)攻击。在LPS增强模型中用TSST-1攻击时，每组的5只兔子中都没有出现发热，并且在给予LPS后4小时时间点上，每组5只动物都没有死亡。相反，所有5只对照，非免疫动物出现TSST-1引起的发热，并且所有都在LPS给药后< 6小时内死亡。在微渗透泵模型中，在植入后第2天测量，每组中的5只动物都没有出现发热，都没有显示TSS症状并且没有死亡。相反，所有5只对照、非免疫动物显示出发热，并且所有动物都在植入后第2天之前死亡。
[0101]总体来说，实施例2和4表明类毒素是安全的，因为蛋白> IO6失活；所述类毒素是免疫原性的(3次免疫的效价> 100，000，相比免疫前和对照动物< 10的效价)；并且在TSS的标准高敏感兔子模型中，当用五倍剂量的造成100%致死的TSST-1攻击时所述动物被保护。
[0102]实施例5
[0103]用抗体中和TSST-1
[0104]在用天然TSST-1攻击之前，合并从上述10只兔子收集的血清，所述兔子用突变体蛋白(G31S/S32P、H135A或Q136A)隔周免疫3次。这些合并的血清和来自接种前动物的合并的血清在体外测试其中和TSST-1超抗原性的能力，所述测试用兔子脾细胞和I μ g/孔的天然TSST-1测试(图8)。在这些试验中，来自免疫动物的未稀释和1/10和1/100稀释的血清完全中和TSST-1超抗原性；甚至1/1000稀释的来自免疫动物的合并的血清部分中和天然TSST-1的超抗原性。相反，20ul的未稀释的、合并的免疫前血清不能中和超抗原性。在所有稀释免疫血清下TSST-1超抗原性的抑制与用非免疫血清超抗原性的抑制存在至少P < 0.003的显著差异。所述数据表明针对TSST-1致死性的免疫机理是中和超抗原性。
[0105]实施例6
[0106]针对致命肺炎的免疫
[0107]兔子(每组11只)针对G31S/S32P TSST-1和α毒素免疫，并且分别用Υ90Α SEC3和单独α毒素免疫。另外,用单独G31S/S32P、单独Y90ASEC3和单独α毒素进行相似研究。所有动物隔天用在弗氏不完全佐剂中的25 μ g的各抗原/类毒素免疫，共注射3次。在最后一次免疫一周后，进行ELISA。与免疫前和非免疫动物< 10的效价相比，免疫兔子的抗体效价超过100，000。所述兔子然后用2xl09菌落形成单位(CFU)的USA200菌株MNPE支气管内攻击(这些动物对TSST-1和α类毒素免疫)或2χ109菌落形成单位USA400菌株MW2支气管内攻击(这些动物对SEC3和α毒素免疫)。与对照，非免疫动物相比，就兔子免受攻击的保护而言，监测7天(图9Α)。[0108]针对单独G31S/S32P免疫或与α毒素结合免疫的动物完全被保护而免受USA200MNPE金黄色葡萄球菌的攻击；单独α毒素免疫的这些动物仅仅部分被保护。对于免疫的动物，除了这些针对单独α毒素免疫的兔子，在7天的时间内没有动物显示发热、腹泻或减少体重；所有动物保持健康。这些用α毒素的数据与小鼠中进行的研究不同，而在小鼠中当单独用α毒素接种时观察到完全保护。在金黄色葡萄球菌感染方面，小鼠与人不同，而兔子与人高度相似，因此兔子是更敏感的动物模型。针对单独Υ90Α SEC免疫或Υ90Α+ α毒素免疫的兔子完全被保护而免受USA400丽2的攻击。当用USA200MNPE或USA400MW2攻击时，非免疫动物(在本研究中仅显示为一行)都在I天内死亡。
[0109]在另一个实验中，使用兔子肺病模型，其中荷兰黑带兔通过气管内接种给予MNPE (0.2ml 体积中 2xl09CFU)，该方法如 Strandberg 等，J Infect Dis 202:1690-7(2010)所述。简单地说，用皮下注射氯胺酮(25mg/kg)和赛拉嗪(25mg/kg)(加利福尼亚州伯林格姆的菲尼克斯制药公司(Phoenix Pharmaceuticals))麻醉兔子。刮去它们颈部的毛，造成小的切口以暴露气管。在插入Imm直径的聚乙烯导管(马里兰州斯帕克斯的BD公司(Becton, Dickinson and Co))并将其穿透左侧的支气管之前,在气管中造成小切口(3mm)。MNPE通过导管给予，然后移去导管并封闭切口。监测7天内兔子TSS症状(发热、腹泻、结膜发红和低血压迹象)和致死疾病的发展，所述致死疾病定义为即将死亡的100%预测值，包括动物同时不能保持挺直和不能展示逃跑反应。动物用静脉内注射lml/kg的Beuthanasia-D(德克萨斯州西湖的先林德雅公司(Shering-Plough))处死。存活的兔子在7天结束时处死。
[0110]评估由TSST-1 (G31S/S32P)、低剂量天然SEC和非毒性剂量α -毒素(H35L) (5只兔子)或野生型α-毒素出只兔子)组成的三价疫苗保护免受高剂量USA200金黄色葡萄球菌MNPE (2x109CFU)攻击的致死肺炎的能力。也评估针对α -毒素非毒性突变体(H35L) (5只动物)或单独用天然α-毒素(5只动物)的免疫以保护兔子免受金黄色葡萄球菌MNPE的相似攻击。所有的动物用不完全佐剂隔周注射3次来免疫，ELISA显示出有针对所有三种天然毒素的高抗体效价(> 10，000)，并且这些动物在最后一次免疫一周后与非免疫对照一起，用2χ109ΜΝΡΕ肺内攻击。在这些组中存活率有显著的差异(β <0.001)。对于针对包含TSST-lG31S/S32P+SEC+a-毒`素(H35L或天然)的三价疫苗免疫的兔子，所有兔子都被保护免受致死性肺炎(图9B)。相反，所有11只非免疫动物在致死性攻击下死亡(β<0.001)。用单独a -毒素H35L或单独天然a -毒素免疫的兔子显示由于MNPE攻击而减缓死亡，但是最终9/11的兔子死亡(β = 0.001，相比于非免疫组)。针对三价疫苗免疫的兔子相比针对单独α-毒素(H35L或天然)免疫的兔子有更高的存活率(β <0.001)。
[0111]实施例7
[0112]五价疫苗防止感染性心内膜炎和败血症
[0113]通过用(i)G31S/S32PTSST-1、Y90A SEC、α 类毒素、β 毒素和 Y 毒素或(ii)G31S/S32P TSST-U SEC、α类毒素(H35L)、β毒素和、毒素免疫来评价保护兔子免受USA200MNPE败血症和感染性心内膜炎。USA200MNPE分泌所有这些外毒素。在这个模型中，通过插入2小时导管破坏新西兰白兔的左颈动脉瓣。参见Schlievert等，Infection andImmunity 66(1):218-23 (1998)。简单地说,这些兔子用氯胺酮(25mg/kg)和赛拉嗪(25mg/kg)麻醉。在颈部的左侧造成缺口以暴露左颈总动脉。导管插入左颈动脉并且推送到主动脉瓣，在那里导管放置2小时以诱导对内皮的破坏。在2小时后，移去导管并缝合手术位点。2x108CFU剂量的金黄色葡萄球菌USA200MNPE被注射进入耳缘静脉。因为这些动物是静脉内注射，能够监测致死败血症和感染性心内膜炎的发展。如上述，监测兔子4天内的疾病信号和致死率。在即将死亡时或4天之后，兔子被处死。取出心脏并检测增殖体。如果观察到增殖体，对其切下、称重、匀浆并系列稀释以测定CFU。如果不存在增殖体，取用主动脉瓣的刮片、系列稀释并涂板。
[0114]在一个实验中，用超抗原类毒素和溶细胞素(G31S/S32P、Y90A SEC、H35La类毒素、野生型β毒素和Y毒素)的结合物免疫的兔子被完全保护免受致死性败血症和没有形成感染性心内膜炎增殖体(图10)。一只免疫的兔子在接受丁丙诺啡的缓解疼痛药物后30秒死于致死性过敏。剩余的动物在4天的测试期间(相对于形成心脏增殖体的峰值时间，心内膜炎的标记信号)中保持健康。一些兔子仅仅针对α毒素免疫，并且这些动物显示减缓的死亡。非免疫动物在I天内死亡。
[0115]在另一个实验中，兔子(4-5只/组)针对G31S/S32P TSST-1、SEC、α类毒素(H35L)、β毒素和Y毒素或单独a -类毒素H35L隔周免疫,共3次。对照动物保持非免疫性。在免疫后，通过ELISA，所有的动物对各毒素高度免疫，并且在上述的感染性心内膜炎和败血症模型中，所有的免疫动物和非免疫动物在最后一次免疫后一周用MNPE攻击。用五价疫苗预先免疫的兔子被显著保护免受致死性败血症(图10B)。通常MNPE的增殖体尺寸大至IOOmg (数据未显示)。一只来自五价免疫组的兔子在第2天晚些时间死亡并且有6mg的IxlO8CFU的增殖体。在免疫的兔子中观察到最大的增殖体是14mg而最小的是lmg，比MNPE相关的通常尺寸小得多。这个数据表明针对这5个分泌毒素的预先免疫提供了针对其他致死攻击的免疫保护并且显著减小了增殖体的尺寸。
[0116]对于针对单独α-毒素H35L预先免疫的兔子，四只中有三只出现小的增殖体(2-3mg)，并且所有的兔子都死于致死性败血症(图10B)，尽管致死性相比非免疫对照组延缓了(H35L免疫的兔子在第2天或第3天死亡而对照兔子在第I天死亡)。在这些组中总存活率存在显著的差异(P = 0 .01)。针对单独a -毒素和五价疫苗免疫的动物的存活率都显著高于非免疫动物(P分别=0.002和0.001)。另外，针对五价疫苗免疫的兔子相比单独针对a -毒素免疫的兔子也被显著地保护而免受致死性败血症(P = 0.004)。
[0117]在本研究中的所有的对照、非免疫动物在注射MNPE后24小时内死于致死性败血症(图10B)。这些动物都没有显著的增殖体，可能是由于这些动物死亡太快，尽管在他们的主动脉瓣上有可见的小增殖体形成。
[0118]实施例8
[0119]TSST-1 (Q136A)和TSST-1 (G31S/S32P)作用为佐剂以刺激针对其他抗原的抗体应答。
[0120]用TSST-1突变体(G31S/S32P或Q136A)与葡萄球菌溶细胞素β -毒素结合免疫的兔子相比用单独β_毒素免疫的兔子生成高得多的针对β_毒素的抗体应答(图8)。兔子用全蛋白25 μ g/兔子的免疫剂量免疫3次，然后在免疫后一周测试抗体效价。在用不完全佐剂免疫当天后的第14天，通过ELISA评价第一免疫应答；在第14天用不完全佐剂免疫后的第28天，通过ELISA评价第二免疫应答；并且在第28天免疫后的第42天，通过ELISA评价第三免疫应答。单独用β -毒素免疫的兔子产生免疫应答抗体效价，所述效价从第一次免疫后的100增加至第三次免疫后的600(图11)。相反，用β-毒素和任意TSST-1 (G31S/S32P)或TSST-1 (Q136A)的共免疫造成β _毒素抗体效价从第一次免疫之后的200-300增加到第三次免疫之后的接近IO6 (P < 0.001比较单独用β -毒素第三次免疫后的抗体效价与用β -毒素+任意TSST-1突变体的共免疫后的抗体效价)。这些数据表明MHC II突变体TSST-1 (G31S/S32P)以及TCR突变体TSST-1 (Q136A)作用为有效的佐剂。因此，超抗原(SAg)具有固有的佐剂活性，因为它们能够与其他抗原高度显著地协同以扩大抗体应答。这个实验用绵羊红细胞和卵清蛋白加/减突变体TSST-1蛋白重复得到相似结果。实施例9[0121]TSST-1 结合至 CD40
[0122]超抗原(SAg)是强效的T淋巴细胞促分裂原，这种性质称为超抗原性，并且刺激来自多个物种的T淋巴细胞。然而，在小鼠和大多数非人灵长类中SAg不生成TSS，但是它们在人，以及作为动物模型的兔子和雪貂中引起TSS。因此，本文所述的疫苗研究在兔子中进行，因为这些动物，像人那样，对于超抗原的毒性效果是高度易感染的。然而，兔子中的研究限制了测定佐剂特性机理的能力。由于这个问题，用人阴道上皮细胞(HVEC)进行体外研究以确定固有佐剂特性的可能的机理。T细胞刺激取决于SAg与T细胞受体β -链可变区(νβ-TCR)的结合，而不取决于T细胞的抗原特异性。另外，最优的T细胞刺激需要通过II型MHC分子向T细胞呈递SAg。在没有抗原加工的情况下，通过SAg与在巨噬细胞表面上MHC II分子可变区的结合而发生呈递。SAg并不在TCR的典型凹槽区域气结合，其涉及抗原肽-1I型MHC的识别。相反，所述毒素与Vi3-TCR上的外部、相对不变的位点相互作用。由SAg的T细胞刺激(主要是CD4+)和巨噬细胞激活通过细胞因子对TSS疾病的发展起显著作用，所述细胞因子包含IL-1 β、IL-2、TNF-α、TNF-β和干扰素Y。
[0123]预先研究通过微阵列分析检测了在暴露于TSST-1之后HVEC基因表达的变化。Peterson等，Infect Immun73:2164-74 (2005)。除了增加细胞因子和趋化因子的表达，当ATCC HVEC与TSST-1孵育时，⑶40RNA转录上调(未公开数据)。⑶40位于上皮细胞和抗原递呈细胞包括B淋巴细胞上。CD40是最优的B细胞抗体生成所必需的重要的免疫共刺激分子。参见Elgueta等，ImmunolRev229:152-72(2009)。CD40也促进免疫球蛋白同种型的类别转换。另外，HVEC在其表面缺少MHC II分子(数据未显示)。因此，这些细胞用于确定TSST-1是否与作为佐剂特性所需要的潜在受体的CD40相互作用。
[0124]TSST-1结合到⑶40的能力用Western免疫印迹评价。⑶40(2 μ g，购自R&D系统公司(R&D systems))和对照蛋白(卵清蛋白，2yg)经非变性PAGE并转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。膜通过加入1%牛血清白蛋白和1%人血清封闭30分钟。然后，0.033μ8/ml-33 μ g/ml 的 TSST_1、TSST_1 (Q136A)或 TSST-1 (G31S/S32P)与膜在室温下孵育 24 小时。然后洗涤膜并且用针对TSST-1的兔抗体、碱性磷酸酶-偶联的抗兔IgG的抗体和最终底物依次孵育，每个步骤之间洗涤。
[0125]观察到TSST-1结合⑶40。出现两种类毒素突变体TSST-1与⑶40的结合相似:，G31S/S32P缺少结合MHC II分子的能力，Q136A缺少结合V β-TCR的能力。这两种类毒素突变体不与电泳的卵清蛋白结合。所有三种TSST-1蛋白的结合是相似的。所有三种蛋白的相似结合说明TSST-1与νβ-TCR(Q136)和α -链MHC II(G31/S32)的相互作用区域不与⑶40相互作用。
[0126]为了测定TSST-1与CD40的结合的Kd，各种浓度的TSST-1，范围从0.033 μ g/ml至33μ8/πι1，单独与PVDF膜上的2yg⑶40孵育过夜以保证结合的平衡。然后，洗涤膜并且用针对TSST-1的兔抗体、碱性磷酸酶-偶联的抗兔IgG抗体和最终底物依次孵育。蛋白条带的浓度与相似处理的标准量的纯化TSST-1作比较,通过NIH程序ImageJ(万维网www.rsbweb.nih.gov/ij/)比较浓度。通过斯卡查德(Scatchard)分析确定的⑶40与TSST-1相互作用的Kd为约2.7X10_6M。
[0127]为了具有评价⑶40与TSST-1相互作用的独立方法，使用牵出试验来验证结合。用蛋白A包被的磁珠(Dynabeads,纽约州格兰德岛的英杰生物科学公司(Invitrogen LifeSciences))用针对TSST-1的山羊IgG抗体处理，然后用TSST-1，最后用CD40 (2ug)处理，每个步骤之间和用CD40孵育之后洗涤。所得的制备物用十二烷基硫酸钠(SDS)PAGE点样缓冲液处理，SDS-PAGE电泳，然后用Western免疫印迹测试⑶40。对照是由不用TSST-1但用⑶40处理的磁珠组成。在磁珠上存在TSST-1的情况下，相比没有TSST-1时，更多的⑶40被拉下，证实TSST-1结合到⑶40。
[0128]假设用将TSST-1和单克隆抗体(所述抗体中和T细胞上与⑶40配体相互作用的CD40)与HVEC共同孵育会导致干扰IL-8趋化因子的生成。来自绝经前女性的HVEC描述于Petersen等，2005，同上。第二 HVEC系购自ATCC (登录号CRL-2614)。在使用前，HVEC在角质形成细胞无血清培养基(KSFM)中用抗生素培养至24小时。在那个时候，所述细胞转变到不含抗生素的KSFM中。实验在不含抗生素的KSFM培养基中进行。出乎意料的是，与单独用TSST-1孵育相比，当TSST-1和针对⑶40的单克隆抗体与HVEC孵育时，在IL-8趋化因子生成中观察到接近3倍的协同作用(图12) ；CD40的单克隆抗体没有诱导生成细胞因子。另外，非相关单克隆抗体(针对链球菌热原外毒素A(SPEA)的单克隆抗体)不与TSST-1协同作用以造成扩大的IL-8生成。最后，相同的针对⑶40的单克隆抗体阻隔⑶40配体刺激的来自HVEC的趋化因子生成(数据未显示)。
[0129]总体来说，这些数据表明TSST-1结合到免疫共刺激分子⑶40，⑶40对产生中和抗体的B细胞的最优刺激是必需的，因此对TSST-1突变体类毒素的佐剂特性起作用。天然TSST-1可能与MHC II和νβ -TCR更显著地相互作用以掩盖佐剂效果。
[0130]实施例10
[0131]针对坏死性肺炎的免疫
[0132]通过用α毒素、SEC和SEB免疫来评价保护兔子免受USA400菌株MW2和c99_529感染造成的坏死性肺炎。MW2对于溶细胞素α毒素和SEC的产生是阳性的，而菌株C99-529对于α毒素和SEB的产生是阳性的。
[0133]兔子(每组10只)通过在颈背上3次皮下注射针对α毒素和SEC来免疫，注射的组合物如下:第O天，在弗氏不完全佐剂(密歇根州底特律的迪菲克公司(Difco))中乳化的(10 μ g α毒素、IOyg SEC和IOyg SEB);第14天,在弗氏不完全佐剂(密歇根州底特律的迪菲克公司)中乳化的(IOyg α毒素、IOyg SEC和IOyg SEB);以及第28天，在弗氏不完全佐剂(密歇根州底特律的迪菲克公司)中乳化的(10 μ g α毒素，IOyg SEC和10 μ g SEB)。ELISA证明了针对相应毒素的兔子血清抗体效价> 10，000。
[0134]四组兔子用2x109/0.2ml体积的丽2或c99_529肺内攻击。这四组兔子是:
[0135]第I组:10只α毒素+SEC免疫并且用MW2攻击的兔子；第2组:10只非免疫并且用丽2攻击的兔子；第3组:10只α毒素+SEB免疫并且用c99_529攻击的兔子；第4组:10只非免疫并且用C99-529攻击的兔子。
[0136]这些实验的结果视于图13。当第O天(注射前)与注射后第I天比较时，动物(两种性别的新西兰白兔，2-3Kg)显示体温升高。在第I天，非免疫动物的体温升高比免疫动物的体温升高显著得多，如斯氏t检验分析所测试(P<<0.001)。这个数据显示对于α毒素以及相应超抗原的免疫能显著防止发热的发展。用CAMRSA菌株攻击的在两组中非免疫动物在注射后第三天前一律死亡。所有这些动物都有出血性坏死性肺炎。相反，免疫动物都没有死亡，事实上，所有动物在注射后第7天都似乎是健康的。在免疫和非免疫动物之间的存活率有显著差异，对于两种攻击生物的菲希尔精确检验P < 0.0001。这些数据指示了由USA400CA-MRSA产生的对于α毒素和主要超抗原(SEB或SEC)的免疫保护免受坏死性肺炎。
[0137]其他实施方式
[0138]虽然结合 具体说明描述了本发明，但上述说明旨在阐释而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书所限定。其他方面、优势和修改在以下权利要求的范围内。
【权利要求】
1.一种包含两种或更多种葡萄球菌类毒素的组合物，其特征在于，所述类毒素选自中毒性休克综合征毒素-1 (TSST-1)类毒素、葡萄球菌肠毒素B (SEB)类毒素、葡萄球菌肠毒素C(SEC)类毒素、葡萄球菌肠毒素样X(SEL-X)类毒素、α毒素类毒素、β毒素类毒素和Y毒素类毒素。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述TSST-1类毒素包含位点31的丝氨酸残基和位点32的脯氨酸残基。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述TSST-1类毒素是融合蛋白。
4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述融合蛋白是人TSST-1的残基1-89和绵羊TSST-1的残基90-195的融合。
5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述TSST-1类毒素包含位点135的丙氨酸残基。
6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述TSST-1类毒素包含位点136的丙氨酸。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其特征在于，所述SEB类毒素包含下面的一种或多种:位点90的丙氨酸残基，位点91的缬氨酸残基，和位点210的丙氨酸残基。
8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其特征在于，所述SEC类毒素是SEC3类毒素。
9.如权利要求1或8所述的组合物，其特征在于，所述SEC类毒素包含位点90的丙氨酸残基和/或位点210的丙氨酸残基。
10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其特征在于，所述α毒素类毒素包含位点35的売氣酸残基。
11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其特征在于，所述β毒素类毒素包含位点149的天冬酰胺和/或位点288的天冬酰胺。
12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含3种葡萄球菌类毒素。
13.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含4种葡萄球菌类毒素。
14.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含5种葡萄球菌类毒素。
15.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含TSST-1类毒素、SEB类毒素、SEC类毒素、α毒素类毒素和β毒素类毒素。
16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含SEL-X类毒素。
17.如权利要求15或16所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含Y毒素类毒素。
18.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述Y毒素类毒素是Y葡萄球菌毒素的单链。
19.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述单链是Y葡萄球菌毒素的B链。
20.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含SEC类毒素、SEB类毒素和α毒素类毒素。
21.如权利要求1-20中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含佐剂。
22.如权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述佐剂选自不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂和铝盐。
23.一种在对象中诱导针对葡萄球菌菌株生成的两种或更多种葡萄球菌外毒素的免疫应答的方法，所述方法包括向所述对象给予一定量的有效诱导所述免疫应答的药物组合物，所述药物组合物包含两种或更多种葡萄球菌类毒素，其中所述类毒素选自中毒性休克综合征毒素-1 (TSST-1)类毒素、葡萄球菌肠毒素B(SEB)类毒素、葡萄球菌肠毒素C(SEC)类毒素、葡萄球菌肠毒素样X(SEL-X)类毒素、α毒素类毒素和β毒素类毒素。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述组合物通过皮下给药。
25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述组合物通过肌肉内给药。
26.如权利要求23-25中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包含确定所述对象的血液是否包含具有对于一种或多种所述葡萄球菌类毒素的特异性结合亲和力的抗体。
27.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其特征在于，所述菌株是甲氧西林耐药性的。
28.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其特征在于，所述菌株是甲氧西林敏感的。
29.如权利要求23-26中任 一项所述的方法，其特征在于，所述菌株是USA400、USA300或USA200的分离物。
30.如权利要求23-29中任一项所述的方法，其特征在于，所述TSST-1类毒素包含位点31的丝氨酸残基和位点32的脯氨酸残基。
31.如权利要求23-29中任一项所述的方法，其特征在于，所述TSST-1类毒素是融合蛋白。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白是人TSST-1的残基1-89和绵羊TSST-1的残基90-195的融合。
33.如权利要求23-29中任一项所述的方法，其特征在于，所述TSST-1类毒素包含135位点的丙氨酸残基。
34.如权利要求23-29中任一项所述的方法，其特征在于，所述TSST-1类毒素包含136位点的丙氨酸残基。
35.如权利要求23-34中任一项所述的方法，其特征在于，所述SEB类毒素包含下面的一种或多种:位点90的丙氨酸残基，位点91的缬氨酸残基，和位点210的丙氨酸残基。
36.如权利要求23-35中任一项所述的方法，其特征在于，所述SEC类毒素是SEC3类毒素。
37.如权利要求23-36中任一项所述的方法，其特征在于，所述SEC类毒素包含位点90的丙氨酸残基和/或位点210的丙氨酸残基。
38.如权利要求23-37中任一项所述的方法，其特征在于，所述α毒素类毒素包含位点35的売氣酸残基。
39.如权利要求23-38中任一项所述的方法，其特征在于，所述β毒素类毒素包含位点149的天冬酰胺和/或位点288的天冬酰胺。
40.如权利要求23-39中任一项所述的方法，其特征在于，所述组合物包含3种葡萄球菌类毒素。
41.如权利要求23-39中任一项所述的方法，其特征在于，所述组合物包含4种葡萄球菌类毒素。
42.如权利要求23-39中任一项所述的方法，其特征在于，所述组合物包含TSST-1类毒素、SEB类毒素、SEC类毒素、α毒素类毒素和β毒素类毒素。
43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述组合物还包含SEL-X类毒素。
44.如权利要求42或43所述的方法，其特征在于，所述组合物还包含Y毒素类毒素。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述Y毒素类毒素是Y葡萄球菌毒素的单链。
46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述单链是Y葡萄球菌毒素的B链。
47.如权利要求23-46中任一项所述的方法，其特征在于，所述组合物还包括佐剂。
48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述佐剂选自不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂和铝盐。
49.一种包含TSST-1类毒素、SEC类毒素、葡萄球菌α毒素类毒素、葡萄球菌β毒素类毒素和Y葡萄球菌毒素的单链的组合物。
50.一种包含TSST-1类毒素、SEC类毒素和葡萄球菌α毒素类毒素的组合物。`
51.如权利要求49或50所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含SEB类毒素。
52.如权利要求49-51中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含佐剂。
53.如权利要求52所述的组合物，其特征在于，所述佐剂选自不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂和铝盐。
【文档编号】A61K39/085GK103561762SQ201280023672
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2012年3月16日 优先权日:2011年3月16日
【发明者】P·M·施利弗特, M·L·彼德森 申请人:明尼苏达大学董事会