专利名称：一种鸭疫里默氏杆菌二价复合佐剂灭活疫苗的制备方法
技术领域：
本发明属于兽用生物制品培育技术领域，具体涉及一种鸭疫里默氏杆菌二价复合佐剂灭活疫苗的制备方法。
背景技术：
鸭疫里默氏杆菌病俗称鸭传染性浆膜炎，鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipestifer,RA)感染病是鸭、鹅、火鸡等多种禽类的一种高致病性、接触传染性疾病，是严重危害2 7周龄雏鸭和幼龄鸭的一种细菌性传染病。本病以10 35日龄的雏鸭发病较多，发病率最高可达90%以上，死亡率为5% 75%，是影响鸭养殖业的重大传染病之一。该病广泛存在于世界各地的养鸭场，鸭场一旦发生该病则很难彻底清除感染。目前该病的控制主要依靠抗生素治疗，但随着该菌对多种抗生素耐药性的不断增加和食品安全的需要，研制疫苗以提前预防该病的需要越来越迫切。鸭疫里默氏杆菌血清型众多，目前世界范围内已确定的有21种，各血清型之间的交叉保护作用差，这就要求使用疫苗的抗原血清型必须与生产中的流行菌株的血清型一致。我公司对全国各地分离到数百株RA分离株的血清型进行了深入研究，研究结果表明流行菌株的优势血清型是血清2和10型。为此，我们对血清2和10型RA的灭活疫苗进行了研究。另外，疫苗中的免疫佐剂对疫苗的质量和效果起着重要的作用，免疫佐剂与抗原同时应用，可增强机体针对抗原的免疫应答能力，或者改变免疫反应的类型。目前疫苗中应用的免疫佐剂多为白油佐剂、氢氧化铝佐剂、类脂佐剂和蜂胶佐剂等。白油佐剂免疫原性好，但是毒副作用大；氢氧化铝胶佐剂免疫原性好，副作用小，但不能诱导细胞免疫；类脂佐剂和蜂胶佐剂免疫原性好，可诱导体液免疫和细胞免疫，免疫持续时间长，但原材料价格昂贵。单一应用以上任何一种免疫佐剂，均存在不同的缺陷，不同程度的制约了其推广应用
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术的不足，而提出了一种鸭疫里默氏杆菌二价复合佐剂灭活疫苗的制备方法，该方法较好的解决了鸭疫里默氏杆菌疫苗的制备问题，使得鸭疫里默氏杆菌疫苗的生产方法更加简单，产品质量更加稳定，并且制备了新型的复合免疫佐剂，辅以优质抗原，增强了产品的免疫效果。本发明的技术方案是通过如下步骤来实现的
(I)制备种子液将沃华研发中心保种的鸭疫里默氏杆菌2型GD-2株和沃华研发中心保种的鸭疫里默氏杆菌10型GN19株分别接种于改良酵母琼脂血平板进行培养，在37°C下培养24小时，挑取单菌落于改良酵母琼脂血平板纯化一代，选5 10个典型菌落接种于改良酵母液体培养基，在37°C下振荡培养24小时，得到种子液，用显微镜进行纯粹检验，将检验合格的作为种子，放入冰箱于2 8°C下保存备用。
(2)制备制苗用菌液在改良酵母液体培养基中接入步骤(I)得到的种子液，接入量为液体培养基量的2% 5%，37°C下培养8 12小时，对菌液进行检验提纯，选取活菌数不低于2X 101(lCFU/ml的菌液；(3)灭活将步骤(2)得到的制苗菌液中加入菌液量O.3%的甲醛溶液，在37°C下灭活 24 48小时，然后进行活菌检验，至活菌生长；(4)制备复合佐剂取占最终疫苗质量15%的氢氧化铝胶，用生理盐水溶解，将杨树皮类脂和免疫增强剂按比例加入，其中杨树皮类脂佐剂加入量为最终疫苗质量的4-6%，免疫增强剂用量为最终疫苗质量的1_3%，用均质机混合均匀，即得免疫复合佐剂。
(5)制备疫苗在步骤(3)得到的制苗的灭活菌液与免疫复合佐剂混合，以 3000rpm转速搅拌30分钟，运行完毕，疫苗降温至室温，分装，得到疫苗成品。
其中以上本发明中所述的改良酵母液体培养基组成成分为牛肉膏、蛋白胨、水解乳蛋白、酵母浸粉、氯化钠，其中制作方无法为各成分按重量百分比牛肉膏蛋白胨水解乳蛋白酵母浸粉氯化钠为3 5% 3 5% : 3 5% : 2 3% 2. 3 3. 5%，用蒸馏水溶解，并定容，PH值调整为7. 2，在116°C下灭菌30分钟制成。
其中上述步骤(5)中灭活菌液与免疫复合佐剂的混合比例，根据每次培养的细菌中抗原的含量而定，使最终疫苗中抗原含量2型抗原为35亿/ml, 10型抗原为50亿/ml, 铝胶15%，类脂5%，免疫增强剂2%。
本发明所述技术方案的有益效果为本发明所述疫苗的疫苗株是经过深入研究、 严格筛选出来的，能有效预防鸭疫里默氏杆菌病。而且本发明所述疫苗用新型的复合免疫佐剂辅以优质抗原，单次免疫对鸭疫里默氏杆菌病预防效率高，效果明显，从而减少了反复使用次数，降低了使用成本低。另外本发明的疫苗制备工艺方法设计科学、系统，设备简单， 易于操作，得到的产品效果稳定，具有较好的社会效益和经济效益。
具体实施方式
为了使本发明的技术方案更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例一、菌株选择对已有的RAl和RA2型菌株进行免疫原性检测，成功筛选出了沃华研发中心保种的鸭疫里默氏杆菌2型GD-2株和沃华研发中心保种的鸭疫里默氏杆菌10型GN19株作为制苗菌株的备用株。
二、制备方法1、改良酵母培养基制备将牛肉膏5g、蛋白胨5g、水解乳蛋白5g、酵母浸粉2. 5g、氯化钠3g混合均匀，用加入蒸馏水补足至1000ml，充分混合，调节pH值为7. 2，在116°C下灭菌30分钟，备用。
2、制备种子液取出鸭疫里默氏杆菌2型和10型各I瓶，分别划线接种于改良酵母琼脂血平板进行培养，在37°C下培养24小时，挑取单菌落于改良酵母琼脂血平板纯化一代，选5 10个典型菌落接种于改良酵母液体培养基，在37°C下振荡培养24小时，得到种子液，用显微镜进行纯粹检验，将检验合格的作为种子，放入冰箱于2 8°C下保存备用。3、在改良酵母液体培养基中接入步骤(I)得到的种子液，接入量为液体培养基量的2% 5%，37°C下培养8 12小时，菌液培养完成后，取样用相同的培养基进行纯粹检验。按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15进行，应纯粹。同时作活菌计数，按附录17进行，各菌活菌数应不低于2 X 1010CFU/mlo4、灭活将步骤(2)得到的制苗菌液中加入菌液量O. 3%的甲醛溶液，在37°C下灭活24 48小时，然后用特 的改良酵母固体及液体培养基、马丁肉汤、马丁斜面、血斜面、沙氏培养基斜面进行活菌检验，并对液体培养物移植一代,应无菌生长。5、制备复合佐剂取占最终疫苗质量15%的氢氧化铝胶，用生理盐水溶解，将杨树皮类脂和免疫增强剂按比例加入，其中杨树皮类脂佐剂加入量为最终疫苗质量的5%，免疫增强剂用量为最终疫苗质量的2%，用均质机混合均匀，即得免疫复合佐剂。6、制备疫苗在步骤(3)得到的制苗的灭活菌液与免疫复合佐剂混合，混合比例按照使最终疫苗中抗原含量2型抗原为35亿/ml，10型抗原为50亿/ml，铝胶15%，类脂5%，免疫增强剂2%而换算加入，以3000rpm转速搅拌30分钟，运行完毕，疫苗降温至室温，分装，得到疫苗成品。三、疫苗检验
依照国家兽药标准对制备的鸭疫里默氏杆菌二价复合佐剂灭活疫苗进行检验，检验结果如下1、安全检验
选取7日龄樱桃谷肉鸭10只，每只皮下注射疫苗lml，连续观察14日，均应无异常反应。检验结果观察14日后樱桃谷肉鸭均未出现异常反应。2、效力检验
选用樱桃谷肉鸭为试验动物，10只/组，每只皮下注射疫苗O. 3ml。I个月后连同条件相同的对照樱桃谷肉鸭10只，各肌肉攻毒RA2和RAlO型，观察14日，对照鸭应全部发病，免疫鸡至少保护8只以上为合格。检验结果对照组全发病，免疫组全健活。
权利要求
1.一种鸭疫里默氏杆菌二价复合佐剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于其制备方法及步骤如下 (1)制备种子液将沃华研发中心保种的鸭疫里默氏杆菌2型GD-2株和沃华研发中心保种的鸭疫里默氏杆菌10型GN19株分别接种于改良酵母琼脂血平板进行培养，在37°C下培养24小时，挑取单菌落于改良酵母琼脂血平板纯化一代，选5 10个典型菌落接种于改良酵母液体培养基，在37°C下振荡培养24小时，得到种子液，用显微镜进行纯粹检验，将检验合格的作为种子，放入冰箱于2 8°C下保存备用； (2)制备制苗用菌液在改良酵母液体培养基中接入步骤(I)得到的保存不超过7天的种子液，接入量为液体培养基量的2% 5%，37°C下培养8 12小时，对菌液进行检验提纯，选取活菌数不低于2X 101(lCFU/ml的菌液； (3)灭活将步骤(2)得到的制苗菌液中加入菌液量O.3%的甲醛溶液，在37°C下灭活24 48小时，然后进行活菌检验，至无活菌生长； (4)制备复合佐剂取占最终疫苗质量15%的氢氧化铝胶，用生理盐水溶解，将杨树皮类脂和免疫增强剂按比例加入，其中杨树皮类脂佐剂加入量为最终疫苗质量的4-6%，免疫增强剂用量为最终疫苗质量的1_3%，用均质机混合均匀，即得免疫复合佐剂； (5)制备疫苗将步骤(3)得到的制苗的灭活菌液与免疫复合佐剂混合，以3000rpm转速搅拌30分钟，运行完毕，疫苗降温至室温，分装，得到疫苗成品。
2.根据权利要求1所述的一种鸭疫里默氏杆菌二价复合佐剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的改良酵母液体培养基组成成分为牛肉膏、蛋白胨、水解乳蛋白、酵母浸粉、氯化钠，其中制作方无法为各成分按重量百分比牛肉膏蛋白胨水解乳蛋白酵母浸粉氯化钠为3 5% 3 5% 3 5% : 2 3% 2. 3 3. 5%，用蒸馏水溶解，并定容，pH值调整为7. 2，在116°C下灭菌30分钟制成。
3.根据权利要求1所述的一种鸭疫里默氏杆菌二价复合佐剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤(5)中灭活菌液与免疫复合佐剂的混合比例，根据每次培养的细菌中抗原的含量而定，使最终疫苗中抗原含量2型抗原为35亿/ml，10型抗原为50亿/ml，铝胶15%，类脂5%，免疫增强剂2%。
全文摘要
本发明涉及一种鸭疫里默氏杆菌二价复合佐剂灭活疫苗的制备方法，该方法对鸭疫里默氏杆菌的菌株进行了严格筛选，通过对制备制苗用菌液、灭火过程的严格控制，制备新型的复合佐剂与制苗的灭活菌液合理混配、乳化制得疫苗。用该方法制备的疫苗，单次免疫对鸭疫里默氏杆菌病预防效率高，效果明显，从而减少了反复使用次数，降低了使用成本低。另外该工艺方法设计科学、系统，设备简单，易于操作，得到的产品效果稳定，具有较好的社会效益和经济效益。
文档编号A61K39/39GK102988967SQ20121054200
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者郎景民, 程小果, 蔡培军 申请人:山东滨州沃华生物工程有限公司