专利名称：一种红豆杉枝叶提取物、其提取方法及应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种红豆杉枝叶提取物、其提取方法及应用，提取出活性成分用于皮肤癌的治疗。
背景技术：
从红豆杉的树皮和枝叶中提取的紫杉醇是世界公认的具有抗癌功效的天然化合物，红豆杉是集观赏、材用、药用为一体的经济价值极高的树种。到目前为止，化学家们已从该属植物中提取得到300多个紫杉烷二萜类化合物及许多生物碱类化合物，其中有些成 分如紫杉次碱也具有类似紫杉醇的抗癌活性，另一些成分如I-羟基巴卡亭I可通过化学修饰来合成紫杉醇。除此之外，一些学者还从该属植物中分离得到蜕皮留酮I种、三萜5种、木脂素7种、苷类3种、双黄酮8种、黄酮类化合物山柰素-4-甲醚、其他有机酸和醛等14种、糖苷类及多糖类化合物等。科学家发现红豆杉还能提高人体免疫力，使人体的自然功能恢复。它不但对高血压、高血糖、高血脂、肾脏病和经痛等有显著效果，还能减少尿蛋白流失。目前对红豆杉的研究主要是提取紫杉醇作为抗癌药，重点应用于结肠癌、头颈部肿瘤、胃癌、卵巢癌等的治疗，其他药用的用途几乎很少实际应用。目前尚未见到关于红豆杉枝叶提取物在制备治疗肛门鳞状上皮癌、食道鳞状癌、扁桃体鳞状细胞癌等的药物上应用的相关报道，有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于克服现有技术中的上述不足之处，利用红豆杉的资源优势，对南方红豆杉进行深入的开发利用研究；研究红豆杉中抗皮肤癌活性成分，找到可用于皮肤鳞状细胞癌，肛门鳞状上皮癌，食道鳞状癌，扁桃体鳞状细胞癌等多种鳞状细胞癌治疗的枝叶提取物，使红豆杉资源能充分的发挥其潜在优势。同时，为综合利用红豆杉资源积累经验，开辟新的应用领域奠定基础。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案
一种红豆杉枝叶提取物，以南方红豆杉的枝和/或叶为原料制备而成，所述的红豆杉枝叶提取物包括三尖杉宁碱及7-表紫杉醇。上述红豆杉枝叶提取物的提取方法包括如下步骤
(1)制备浸膏取红豆杉枝和/或叶，浸溃于质量浓度为70%-75%的醇溶液中，用醇溶液提取，剩余药渣继续用水提取，合并水和醇溶液，用石油醚回流，索氏提取回收溶剂，得到浸膏；
(2)梯度洗脱将浸膏用水溶解，上HP20大孔树脂，按顺序用水、15-25%的醇液、35-45%的醇液、55-65%的醇液，75-85%的醇液、90-98%的醇液和丙酮液梯度洗脱，收集并合并90-98%醇液和丙酮液段的洗脱液，即得红豆杉枝叶提取物。其中，步骤2中各洗脱液优选分别为水、20%的醇液、40%的醇液、60%的醇液，80%的醇液、95%的醇液和丙酮液。此时收集95%的醇液和丙酮液段的洗脱液，即得纯度和产率最理想的红豆杉枝叶提取物。其中，步骤2中各洗脱液的用量均为8-10倍柱体积，流速为1-1. 5mL/min。优选各洗脱液的用量均为9倍柱体积，流速为I. 2mL/min。其中，所述步骤I和步骤2中的醇优选为乙醇。其中，所述的提取方法还包括对红豆杉枝叶提取物进行浓缩除溶剂得到提取物浸膏的步骤。所述的浓缩除溶剂为本领域技术人员所掌握。本发明对此不作特别限定，本领域技术人员可采用现有技术公开的任一种浓缩方法除去洗脱液中的溶剂，得到红豆杉提取物浸膏或进一步得到粉末。 本发明的另一目的在于提供红豆杉提取物在制备治疗抗皮肤癌药物中的应用。所述的红豆杉提取物可以采用市售的三尖杉宁碱和/或7-表紫杉醇作为药物中的活性成分，优选采用本发明上述提取方法得到的红豆杉提取物，配以药学上可接受的载体，给药形式主要包括口服给药及经皮给药，包括但不限于液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、软胶丸、软胶囊、滴丸剂、软膏剂；每个单位制剂中含三尖杉宁碱和/或7-表紫杉醇IOmg 300mg，片剂或胶囊制剂常规用量每人每天服用I 12粒；外用制剂含三尖杉宁碱和/或7-表紫杉醇按重量分数计0. 005 % 0. 05 %。采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果
本发明利用红豆杉的资源优势，对南方红豆杉进行深入的开发利用研究；提供一种操作简单方便的红豆杉抗皮肤癌成分的提取方法，并且测定了其在抗皮肤癌应用上的效果。
图I为流式细胞仪检测A431药物作用后的凋亡指数(空白组)；
图2为流式细胞仪检测A431药物作用后的凋亡指数(Y-2)；
图3为流式细胞仪检测A431药物作用后的凋亡指数(Y-7)；
图4为流式细胞仪检测A431药物作用后的凋亡指数(Y-8)；
图5为流式细胞仪检测A431药物作用后的凋亡指数(Z-I)；
图6为流式细胞仪检测A431药物作用后的凋亡指数(Z-2)；
图7为流式细胞仪检测A431药物作用后的凋亡指数(Z-7)；
图8为流式细胞仪检测A431药物作用后的凋亡指数(Z-8)。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例I
(1)浸膏I的制备取红豆杉枝，浸溃于质量浓度为70%-75%的乙醇溶液中，用乙醇溶液提取，剩余药渣继续用水提取，合并水和乙醇溶液，用石油醚回流，索氏提取回收溶剂，得到浸膏Z-I ；
或红豆杉叶，操作步骤同红豆杉枝，对应的浸膏为Y-I ；
(2)梯度洗脱按质量浓度计将制备的浸膏用水溶解，上HP20大孔树脂，按顺序用水液、20%的醇液、40%的醇液、60%的醇液，80%的醇液、95%的醇液和、丙酮液梯度洗脱，依次得到的洗脱液为Z-2、Z-3、Z-4、Z-5、Z-6，收集95%乙醇和丙酮洗脱液，得到洗脱液Z_7、Z-8，即为红豆杉枝取物；洗脱液均为9个柱体积，流速为I. 2L/min ；
或红豆杉叶，操作步骤同红豆杉枝，对应的洗脱液依次为Y-7和Y-8，即为红豆杉叶提取物。(用水液、20%的醇液、40%的醇液、60%的醇液，80%的醇液、95%的醇液和、丙酮液梯度洗脱，依次得到的洗脱液为Y-2、Y-3、Y-4、Y-5、Y-6)
收集Z-7、Z-8或Y-7、Y-8，浓缩洗脱液，蒸发溶剂后得到浸膏。
实施例2
与实施例I相比，区别点仅在于，本实施例中将红豆杉枝和叶混合后同时进行提取，洗脱液均为8倍柱体积,流速为lmL/min。实施例3
与实施例I相比，区别点仅在于，本实施例中仅对红豆杉叶进行提取，洗脱液均为10倍柱体积，流速为I. 5mL/min。试验例I红豆杉枝叶提取物中各成分的分离 分离结果测定
(I)实验材料、仪器及试剂氢谱用Bruker Avance500型核磁共振仪测定(Q)C13、TMS为内标)；质谱用Vacuum Generators ZAB-HS型质谱仪测定。柱层色谱用娃胶(300 400目)和薄层色谱用硅胶均为青岛海洋化工厂出品，其它试剂均为分析纯。(2)提取分离红豆杉干燥根和叶各2. 5kg，采用实施例I方法浓缩得到浸膏，或合并用95%乙醇热回流提取三次，每次三个小时，过滤，滤液浓缩得浸膏，浸膏用水溶解后上HP-20大孔树脂柱，梯度洗脱，收集95%乙醇及丙酮部位(即Y-7、Y-8、Z-7、Z_8)，回收溶剂浸膏用甲醇溶解后上硅胶(300 400目)柱，先后用石油醚、石油醚一乙酸乙酯(5 :1、3 1、1 :1、1 :2、1 :4)、氯仿一甲醇(50 1,20 1,10 :1、5 :1)、甲醇梯度洗脱，每份 IOOmL，喷显色剂TLC检查相同的合并，进一步上凝胶LH-20柱，最后从中得到分离鉴定出7种化合物，分别为紫杉素 J (taxinine J)、baccatin VI、taxicin、中国紫杉三烯甲素(taxachitrieneA)、紫杉醇 taxol、三尖杉宁碱(cephalomannine)、7_ 表-紫杉醇(7-epitaxol)。(3)结构与鉴定
化合物(I):白色块状固体，mp. 249-251°C。ESI-MS m/ z : 731 [M + Na ] +。IH-NMR ( 8，ppm, CDC13) : I. 08 (3H, s)，I. 13 (3H, s)，I. 76 (3H, s)，2. 32 (3H, brs) ,3. 34 (1H, d，6. 2) ,5. 94 (1H, d，11)，6. 22 (1H，d，11)，6. 64 (1H，d, 16) ,7. 78 (1H, d，16)，
5.45 (1H, s)，5. 00 (1H, s)，7. 43 (SH, m)，5. 40-5. 82 (4H, m)。13C-NMR ( 8 , ppm, CDC13) 118. 94,35. 30,28. 32,13. 68,15. 89,27. 19,31. 66,20. 79,21. 36,21. 44,21. 02,20. 79，146.04，118.40，128. 19，129. 02，130. 65，169.24，169. 43，169. 82，170. 71，133. 68，134. 20，137. 12，140. 44,37. 67,47. 10。根据文献确定化合物为紫杉素J (taxinine J)，其结构式如下
权利要求
1.一种红豆杉枝叶提取物，其特征是以南方红豆杉的枝和/或叶为原料制备而成，所述的红豆杉枝叶提取物包括三尖杉宁碱及7-表紫杉醇。
2.—种红豆杉枝叶提取物的提取方法，其特征是所述的提取方法包括如下步骤 (O制备浸膏取红豆杉枝和/或叶，浸溃于质量浓度为70%-75%的醇溶液中，用醇溶液提取，剩余药渣继续用水提取，合并水和醇溶液，用石油醚回流，索氏提取回收溶剂，得到浸膏； (2)梯度洗脱将浸膏用水溶解，上HP20大孔树脂，按顺序用水、15-25%的醇液、35-45%的醇液、55-65%的醇液，75-85%的醇液、90-98%的醇液和丙酮液梯度洗脱，收集并合并90-98%乙醇和丙酮液段的洗脱液，即得红豆杉枝叶提取物。
3.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于步骤2中各洗脱液分别为水、20%的醇液、40%的醇液、60%的醇液，80%的醇液、95%的醇液和丙酮液。
4.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于步骤2中各洗脱液的用量均为8-10倍柱体积，流速为1_1. 5mL/min。
5.如权利要求I所述红豆杉枝叶提取物的提取方法，其特征是所述步骤I和步骤2中的醇为乙醇。
6.如权利要求2所述红豆杉枝叶提取物的提取方法，其特征是所述的提取方法还包括对红豆杉枝叶提取物进行浓缩除溶剂得到提取物浸膏的步骤。
7.含有三尖杉宁碱和/或7-表紫杉醇的红豆杉枝叶提取物在制备治疗抗皮肤癌药物中的应用。
8.含有三尖杉宁碱和/或7-表紫杉醇的红豆杉枝叶提取物在制备抑制皮肤癌中鳞状细胞药物中的应用。
9.含有三尖杉宁碱和/或7-表紫杉醇的红豆杉枝叶提取物在制备治疗肛门鳞状上皮癌、食道鳞状癌、扁桃体鳞状细胞癌药物中的应用。
10.根据权利要求6-8任一项所述的应用，其特征是所述的药物为液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、软胶丸、软胶囊、滴丸剂、软膏剂。
全文摘要
本发明涉及一种红豆杉枝叶提取物、其制备方法及其应用，所述的红豆杉枝叶提取物以南方红豆杉的枝叶为原料提取得到，包括三尖杉宁碱、7-表紫杉醇。上述活性成分对皮肤癌中的鳞状细胞具有抑制作用，尤其对肛门鳞状上皮癌、食道鳞状癌、扁桃体鳞状细胞癌有显著疗效。本发明利用红豆杉的资源优势，对南方红豆杉进行深入的开发利用研究；提供一种操作简单方便的红豆杉抗皮肤癌成分的提取方法，并且测定了其在抗皮肤癌应用上的效果。
文档编号A61P17/06GK102949385SQ20121043548
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月5日 优先权日2012年11月5日
发明者王琼, 喻琼林, 蔡强 申请人:江苏红豆杉生物科技股份有限公司