专利名称：一株鸭出血性卵巢炎病毒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一株鸭出血性卵巢炎病毒。该病毒分离自一种新的鸭病。属动物病毒学领域。
背景技术：
自2010年4月初以来，我国浙江、江苏、山东、福建、河北、北京等省份的种鸭、
蛋鸭发生一种以产蛋率急速下降、甚至停产及不同程度死亡为特征的疫病，俗称种(蛋)鸭产蛋骤降、卵巢出血症，引起此病的病毒最初命名为鸭黄病毒(Duck flavivirusvirus, DFV),现基本统一命名为鸭出血性卵巢炎病毒(Duck hemorrhagic hvaritis virus，DH0V)。各品种蛋鸭、种鸭等均有发生，但主要见于开产蛋鸭。产蛋鸭发病后出现长时间(4(T60d)的产蛋率低下，恢复后所产种蛋的受精率和孵化率出现下降。发病鸭采食量显著下降，拉绿色稀便，精神沉郁，扎堆，羽毛逆立，眼球深陷，目光呆滞，体重减轻。少量病鸭出现站立不稳、震颤，行走困难和姿势异常。主要病变为出血性卵巢炎、间质性肝炎和非化脓性脑炎。该病近期成为危害中国养鸭业的重要疫病之一。产蛋率高的鸭群患病后4 5(1从产蛋高峰或高产蛋率迅速下降至209Γ30%，严重的于发病后7d左右停产；刚开产种(蛋)鸭产蛋率上升缓慢或减蛋，长时间低产蛋率或无产蛋高峰出现。不同地区、不同品种鸭群发病率高低不一，群内发病率几乎100%，病死率为09Γ12%。国内外研究资料，黄病毒一般能在鼠脑、C6/36、BHK-21、Vero等组织或细胞上进行增殖，近年来，也有人接种9到10日龄鸡胚或鸭胚尿囊液进行病毒分离增殖。考虑到细胞来源稳定、质量可控、无外源病毒污染，我们选定SPF源鸡胚成纤维细胞(CEF)作为分离这种病毒的唯一细胞系。众所周知，CEF细胞来源于SPF鸡胚，其供体背景清楚(不含任何病源)、制备工艺成熟、方法简单、对禽源病毒较为敏感。同时，SPF级鸭胚来源有限，而用SPF鸡胚制备的CEF繁殖病毒，其每胚产量是SPF鸡胚的10倍左右，且效价较高，在鸡胚成纤维细胞繁殖的效价明显高于鸡胚和鸭胚上的效价。因此，我们选用CEF细胞用于这种病毒的分离培养，并取得成功，并对分离株进行了系统鉴定和E基因测序分析。由于是新发传染病，人们对鸭出血性卵巢炎病毒(Duck hemorrhagic hvaritisvirus, DHOV)的分离鉴定、生物学特性及主要抗原基因特征研究尚有较大的空白。
发明内容
本发明的目的是由病死蛋鸭体内分离病原、并对其分离物进行鉴定和利用。本发明采用的技术方案是采集病死鸭肝脏、卵巢等病变组织经研磨、离心、滤过后进行病原分离鉴定，对所获得的病毒分离株进行细胞培养特点、电镜观察、效价测定、疑似病原RT-PCR/PCR检测及测序、核酸型鉴定、理化特性鉴定、血凝性测定、血清中和试验、动物试验作进一步的鉴定。I.本研究通过对发病样品处理，接种原代细胞CEF和MDCK等哺乳动物传代细胞，相继获得具有同一种CPE表现的病毒分离物，经过效价测定、电镜观察、疑似病原RT-PCR/PCR检测及E基因测序、核酸型鉴定、理化特性鉴定、血凝性测定、中和试验及动物试验，结果表明该分离株为鸭出血性卵巢炎病毒(Duckhemorrhagic hvaritis virus, DH0V),命名为DHOV JN株,属黄病毒科、黄病毒属、恩塔亚病毒群成员。2.细胞培养特性DHOV-JN分离株具有较广的细胞适应谱，不仅能适应禽源细胞(CEF)、组织(SPF鸡胚)，也能适应1 0(、8皿-21、31\￥61'0等哺乳动物传代细胞系，也间接说明该病毒的宿主范围可能较广，对此应进行深入研究。考虑到细胞来源可控、无外源污染等因素，本研究选择SPF源CEF作为分离、传代、增殖该病毒的细胞，并取得成功，病毒能较好地适应CEF，效价也较高，达到105 5TCID5(i/0. lmL。这为进行病原鉴定、生物学特性、疫苗等研究奠定了极好的细胞平台和研究基础。3.病原学特点进行了电镜观察、理化特性、可疑病原检测、基因测序和进化分析、病毒核酸型鉴定、血清中和研究，结果发现病毒粒子大于60nm、呈六边形、有囊膜；该病毒对热敏感(56°C 15min可灭活)，对氯仿、乙醚和碱敏感，对酸、胰酶不敏感；用AIV等8种禽源病毒RT-PCR/PCR和黄病毒RT-PCR检测发现，仅能检出黄病毒核酸阳性，测定其E基因长 度为1503bp,构建了基于黄病毒E基因的遗传进化树,发现该分离株属黄病毒属恩塔亚病毒群的成员；IUDR代谢试验结果证实该分离株的核酸型为RNA ;该分离株不能被禽流感、新城疫、减蛋综合症、鸭肝炎、传染性法氏囊、传染性支气管炎、番鸭呼肠孤以及禽网状内皮增生症等8种常见禽源病毒的阳性血清所中和。4.病毒的致病性为验证DHOV-JN株对禽类的致病性，我们进行了该毒株对SPF鸡胚、SPF小鸡、SPF蛋鸡、雏鸭以及临床健康蛋鸭的致病性试验。结果发现DHOV-JN株可使9日龄SPF鸡胚的发育显著推迟，解剖发现胚体出血、成型鸡胚的肝脏肿大、呈现“花斑肝”。DHOV-JN株能致死2日龄SPF小鸡，一般3 5天死亡，死亡率为30% 50% ;初期鸡只食欲较对照差，耐过后无影响；死亡鸡解剖可见脑膜变软，肾脏和脾脏稍微肿大。但该病毒对50日龄的SPF鸡没有显著的临床影响。但该病毒对刚孵出的2日龄雏鸭具有致死性，用DHOV-JN株攻击2日龄雏鸭，实验组全部死亡，解剖发现肝脏病变严重，多器官出血；对开产蛋鸭具有较强的致病性，解剖发现，实验组的蛋鸭产蛋率严重下降，卵巢组织出现了卵泡液化、卵泡发育迟缓、出血以及输卵管萎缩等现象，肝脏发黄、肿大、质地变脆，脾脏肿大等。上述结果表明，分离自蛋鸭的DHOV-JN株对鸡、鸭都具有极强的致病性，是否对鹅具有致病性由于时间关系本研究为开展试验，但据黄欣梅(黄欣梅，李银，赵冬敏，等.新型鹅黄病毒JS804毒株的分离与鉴定.江苏农业学报，2011，27 (2) :354 360.)等的研究，这种病毒对鹅也具有相似的致病性。这些结果证实，这种新分离到的禽黄病毒对家禽业具有显著危害，需要加强流行病学、病原学、免疫学等研究。综上所述I.该株病毒为鸭出血性卵巢炎病毒(Duck hemorrhagic hvaritis virus, DHOV)JN株，该株病毒已于2012年3月22日将该分离株送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏号为 CGMCCNo. 5907。2.该分离毒株主要特点(I)分离的鸭出血性卵巢炎病毒CGMCCNo. 5907株病毒从一种临床症状称为鸭出血性卵巢炎的病鸭采集肝脏、卵巢组织，用SPF源CEF分离获得；
(2)鸭出血性卵巢炎病毒 CGMCC No. 5907 株病毒能在 CEF、MDCK、Vero、BHK_21、ST和Marc-145单层细胞上进行增殖，并能致这些细胞产生较为一致的CPE ；(3)用 SPF 源 CEF 测得 CGMCC No. 5907 株病毒效价为 105_5TCID5(l/0. ImL ；(4) CGMCC No. 5907株病毒接种鸡/和鸭能复制出典型的鸭出血性卵巢炎。3.鸭出血性卵巢炎病毒CGMCCNo. 5907株病毒用于制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗。4.鸭出血性卵巢炎病毒CGMCC No. 5907株病毒在鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力检验中用作攻毒毒株。
具体实施例方式I.病毒分离 (I)病料处理本发明人由某蛋鸭场产蛋下降病鸭中采集，每份病料主要有病死蛋鸭的部分卵巢组织、肝脏等病变组织。无菌操作剪取5. Og组织，加入少量的MEM (含青霉素、链霉素1000U/mL)，研磨至糊状，再加入4倍体积的MEM稀释成悬浊液，样品在_80°C和室温反复冻融3次,再经4°C、12000r/min离心IOmin,收集上清液用O. 22 μ m的一次性滤器滤过除菌，最后分装_80°C冻存备用。(2)鸡胚成纤维细胞(CEF)分离用9日龄SPF鸡胚(SPF鸡胚，SPF蛋鸡均购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司)，无菌条件下去头、爪、内脏以眼科翦剪碎，然后加
O.25%的胰酶进行消化，待液体自然浑浊后加MEM培养基终止，再用灭菌的6层纱布过滤后摇匀分装入普通细胞培养瓶，置37°C、5%C02培养箱内培养。待CEF铺满单层后按5%的量接入经预处理、并滤过除菌的组织上清液，继续培养观察至72h，无论有无病变均收获，然后继续盲传至F5代，直至细胞病变出现并趋于稳定，收获培养物_80°C保存备用。取一 80°C保存的病料处理上清液接种CEF，连续传7代，经观察传至F4代开始出现CPE，F5代的50h CEF开始出现CPE，65h时病变明显(75%细胞有病变)，CPE主要表现为细胞圆缩、融合，并逐渐拉网，然后脱落崩解。见下
图1、2。从F5代开始CPE趋于稳定。(3)病毒在其他细胞上的增殖用_80°C冻存的病毒CEF F5代培养物各ImL分别接种已长满单层的MDCK (狗肾传代细胞)、VeiO (非洲绿猴肾细胞)、BHK-21 (乳仓鼠肾细胞)、ST (猪睾丸细胞)以及Marc-145 (非洲绿猴肾细胞克隆细胞株)(以上传代细胞均为本申请人实验室保藏)，作用I 2h后，置37°C、5%C02的培养箱中进行连续培养观察，记录各种细胞的CPE情况。传代增殖方法与用鸡胚成纤维细胞(CEF)方法基本相同。用JN株CEF F5代分离物分别接种MDCK、Vero、BHK_21、ST以及Marc-145单层细胞，均能产生明显的CPE，病变表现与病毒致CEF的特点基本一致。2.分离物的鉴定(I)效价测定取新制备好的CEF细胞，接种96孔细胞培养板，每孔接种细胞悬液100 μ L，待细胞长成良好单层后。取置于一 80°C保存的JN株CEF F5代分离物进行10倍系列稀释至10_7，取每个稀释度的病毒液，分别接种于已生长良好CEF细胞96孔细胞培养板上，每个滴度接种8孔，每孔100 μ L，同时设立阳性对照和阴性对照各8孔。将细胞培养板置37°C、5%C02培养3 5d，每天观察细胞出现病变的情况，出现CPE者判为感染，按Reed —Muench法计算TCID5tl，结果测定JN株CEF F5代分离物的效价(TCID5tl)为105 5/0· ImL0
(2)电镜观察取JN株CEF F5代分离物做负染电镜观察，结果发现JN株CEF F5代病毒粒子大于60nm、呈六边形、有囊膜，见图3。(3)中和试验用固定抗体一稀释病毒法进行。取一 80°C保存的JN株CEF F5代分尚物，根据病毒含量测定结果将待检病毒液稀释为100TCID5(i/0. ImL,将病毒稀释液分别与等体积的AIV、NDV、EDSV、DHV、IBDV、IBV、MDRV以及REV标准阳性血清(均购自中国兽医药品监察所)震荡混合均匀，至37°C作用2h，期间震荡2 3次。作用结束后，将中和液接种96孔CEF细胞板，每孔100 μ L，同时设立阳性对照和正常细胞对照。将细胞培养板置37°C、5%C02培养5 7d,每天观察细胞出现病变的情况并详细记录。按Reed — Muench法计算TCID50,结果未见任何一份血清被中和，说明JN株不属于这些常见的禽源病毒，需要进一步鉴定。(4)核酸型鉴定用终浓度为50 μ g/mL的5’-碘脱氧尿核苷处理DHOV-JN株CEF F5代培养物后，测得其TCID50S IO5.3/0· lrnL，未处理对照组TCID5tl为105 5/0· lmL，说明5’-碘 脱氧尿核苷不能抑制JN分离株在CEF中的增殖，该病毒为RNA病毒。(5)疑似病原RT-PCR/PCR检测登录GenBank，下载51个具有代表性的黄病毒全基因序列，经DNAstar软件分析其E基因后，利用Primer5. O软件设计了 I对检测引物，FLVTF 5’ -TTACCATGGACAGGGTCATCA-3’，FVTRl :5’ -TCCAATTGTGCTCCCACTTCT-3’，预期目的片段为549bp ;按照本发明中初步建立的本病以及其他8种病毒的RT-PCR检测方法(见表I)进行扩增和电泳检测(图4)。表I分离毒及8种疑似禽源病毒PCR检测条件
权利要求
1.一株鸭出血性卵巢炎病毒，其特征在于该株病毒为鸭出血性卵巢炎病毒DHOV-JN株，该株病毒已于2012年3月22日将该分离株送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏号为CGMCCNo. 5907。
2.如权利要求I所述的一株鸭出血性卵巢炎病毒，其特征在于 (1)鸭出血性卵巢炎病毒CGMCCNo. 5907株病毒从一种临床症状称为鸭出血性卵巢炎的病鸭采集肝脏、卵巢组织，用SPF源CEF分离获得； (2)鸭出血性卵巢炎病毒CGMCCNo. 5907株病毒能在CEF、MDCK, Vero, BHK-21、ST和Marc-145单层细胞上进行增殖，并能致这些细胞产生较为一致的CPE ；(3)用SPF 源 CEF 测得 CGMCC No. 5907 株病毒效价为 105·5TCID50/0. ImL ； (4)CGMCC No. 5907株病毒接种鸡/和鸭能复制出典型的鸭出血性卵巢炎。
3.如权利要求I所述的一株鸭出血性卵巢炎病毒的应用，其特征在于鸭出血性卵巢炎病毒CGMCC No. 5907株病毒用于制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗。
4.如权利要求3所述的一株鸭出血性卵巢炎病毒的应用，其特征在于鸭出血性卵巢炎病毒CGMCC No. 5907株病毒在鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力检验中用作攻毒毒株。
全文摘要
本发明涉及一株鸭出血性卵巢炎病毒(Duck hemorrhagic ovaritis,DHOV)。从临床发病蛋鸭的组织病料中用SPF源鸡胚成纤维细分离到一株DHOV-JN，该分离株能在CEF上增殖并能致其产生典型的细胞病变，亦能在MDCK、Vero、BHK-21、ST和Marc-145单层细胞上进行增殖并出现较为一致的CPE，用CEF测得分离株效价为105.5TCID50/0.1mL；该分离株属黄病毒科、黄病属、恩塔亚病毒群的成员；该毒株可以此研究为基础开发相应的RT-PCR检测/诊断方法(试剂)，也可研制用于本病临床预防用疫苗等生物制品。
文档编号A61K39/12GK102899295SQ20121042534
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者邹敏, 吴发兴, 刘 东, 刘新文, 申洪银, 孙健, 刘蕾, 范根成, 杜元钊 申请人:青岛易邦生物工程有限公司