专利名称：一种构建非人哺乳动物哮喘模型的方法
技术领域：
本发明涉及哮喘动物模型构建领域，特别涉及一种构建非人哺乳动物哮喘模型的方法。
背景技术：
支气管哮喘是一种气道慢性非特异性炎症，全球患病人数多，控制哮喘发作需花费大量人力物力。为尽最大可能解除患者痛苦，构建疾病动物模型，研究哮喘的发病机制十分必要。以往认为过敏原诱导Thl/Th2应答失衡致气道嗜酸性粒细胞浸润是哮喘的重要病理特点，此类患者对激素治疗效果敏感。现有技术构建的模型也多以致嗜酸性粒细胞升高为主。此类模型常用构建方法为分别在第I大和第14天腹腔注射鸡卵蛋白致敏，在第28、29,30连续3天，每天30分钟-I小时I %卵蛋白液雾化激发，第32天处死，收集相关标本。
然而，人们发现一类患者使用激素治疗效果不佳，症状得不到有效控制。研究发现，此类患者气道炎症以中性粒细胞为主，嗜酸性粒细胞轻度增高甚至不增高；外周血除了Th2细胞的增高，还有Thl7细胞的增高，且增加的幅度更大；相应细胞因子IL-4/IL-17的ELISA结果也有类似发现。据此提出静息型T细胞在接收树突状细胞处理、提呈的相关抗原刺激后向Thl7细胞方向偏振，诱导哮喘患者气道内中性粒细胞募集。现有技术虽能成功构建相关哮喘模型，但共有三次致敏，分别在第0、7、14天，在第21天激发，连续两周，建模时间较长，且鼻内滴入脂多糖量过大，不能排除气道损伤引起中性粒细胞增多的可能，不符合哮喘是以过敏原诱导体内免疫应答失衡的发病机制。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，从哮喘的疾病特点对模型进行全面的评价，缩短激发和致敏时间。为了达到上述目的，本发明提供了如下技术方案一种构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，其特征在于，包括步骤一、在第I天和第7天向非人哺乳动物腹腔注射有效量的含鸡卵蛋白和氢氧化铝凝胶的PBS溶液，同时从非人哺乳动物咽喉壁缓慢滴加有效量的含鸡卵蛋白和脂多糖的PBS溶液；步骤二、从第13天到第15大连续三天雾化含鸡卵蛋白的PBS溶液，对非人哺乳动物进行抗原的呼吸道致敏。优选的是，所述构建非人哺乳动物哮喘模型的方法中，同时构建的模型还包括只在腹腔注射等量的含鸡卵蛋白和氢氧化铝凝胶的PBS溶液的嗜酸性粒细胞哮喘模型组以及在腹腔注射等量的含氢氧化铝凝胶的PBS溶液的正常对照组，前者为含鸡卵蛋白的PBS溶液激发，后者为PBS溶液激发。优选的是，所述构建非人哺乳动物哮喘模型的方法中，所述的非人哺乳动物是小鼠。
优选的是，所述构建非人哺乳动物哮喘模型的方法中，从小鼠咽喉壁滴加含100 μ g鸡卵蛋白和O. I μ g含脂多糖的PBS溶液，共50 μ L，使小鼠慢慢将PBS溶液吸入肺部，滴加时用移液枪分次吸取滴加，每次10 μ L ;向腹腔注射含100 μ g鸡卵蛋白和100 μ L氢氧化铝凝胶的PBS溶液，共200 μ L。优选的是，所述构建非人哺乳动物哮喘模型的方法中，所述步骤2)中的雾化用的含鸡卵蛋白的PBS溶液浓度为I %。优选的是，所述构建非人哺乳动物哮喘模型的方法中，麻醉小鼠的麻醉剂为浓度4%水合氯醛，剂量为O. 08 O. lml/10g。本发明实施例所提供的技术方案，加入了以前从未使用过的气道致敏方法，即从小鼠咽喉壁将含鸡卵蛋白和脂多糖的PBS溶液缓慢滴入气道，且有效地控制了用量，排除了气道损伤引起中性粒细胞增多的可能，符合哮喘是以过敏原诱导体内免疫应答失衡的发病机制。本发明在最后一次抗原激发24小时后，处死小鼠，并从血清IgE水平、气道高反应 性、浸润到气道中炎症细胞的类型及数量和肺组织效应T细胞偏振情况等方面将此模型与嗜酸性粒细胞哮喘模型组和正常对照组模型进行了对比评价，因Thl7细胞应答增强致使气道中性粒细胞增高的非人哺乳动物哮喘模型构建成功。
图I为本发明所述的构建非人哺乳动物哮喘模型的方法的流程示意图；图2为各组小鼠肺组织气道炎症情况(HE，X 200)，A图为正常对照组，B图为嗜酸性粒细胞哮喘模型组，C图为中性粒细胞哮喘模型组；
具体实施例方式为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要的附图作简单的介绍。本发明提供了一种构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，排除了气道损伤引起中性粒细胞增多的可能，缩短了激发和致敏时间。本发明实施例提供的一种构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，包括步骤一、在第I天和第7天向非人哺乳动物腹腔注射有效量的含鸡卵蛋白和氢氧化铝凝胶的PBS溶液，同时从非人哺乳动物咽喉壁缓慢滴加有效量的含鸡卵蛋白和脂多糖的PBS溶液；步骤二、从第13天到第15大连续三大雾化含鸡卵蛋白的PBS溶液，对非人哺乳动物进行抗原的呼吸道致敏。本方法的具体实施步骤为将实验所需BALB/c小鼠称重，并用麻醉剂麻醉小鼠；将小鼠四肢用活结固定于简易操作台上，并套牙固定小鼠颈部；将操作台竖立，用消毒后的无菌平镊夹出小鼠舌头，使其歪向一侧，充分暴露口腔；在第I天和第7天从小鼠咽喉壁缓慢滴加含100 μ g鸡卵蛋白和O. I μ脂多糖的PBS溶液，共50 μ L，使小鼠慢慢将PBS溶液吸入肺部；将小鼠腹外侧部消毒后，在第I天和第7天向腹腔注射含100 μ g鸡卵蛋白和100 μ L氢氧化铝凝胶的PBS溶液，共200 μ L ;将小鼠放回鼠笼中，侧卧，同时刨除小鼠口鼻周围垫料，防止堵塞呼吸道窒息；将小鼠放入密闭容器中，从第13天到第15天连续三天用雾化仪雾化含鸡卵蛋白的PBS溶液。所述的构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，同时构建的模型还包括只在腹腔注射等量的含鸡卵蛋白和氢氧化铝凝胶的PBS溶液的嗜酸性粒细胞哮喘模型组以及在腹腔注射等量的含氢氧化铝凝胶的PBS溶液的正常对照组，前者为含鸡卵蛋白的PBS溶液激发，后者为PBS溶液激发。所述的构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，所述的非人哺乳动物是小鼠。所述的构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，从小鼠咽喉壁滴加含100 μ g鸡卵蛋白和O. I μ g脂多糖的PBS溶液，共50 μ L，使小鼠慢慢将PBS溶液吸入肺部，滴加时用移液枪分次吸取滴加，每次10 μ L ;向腹腔注射含100 μ g鸡卵蛋白和100 μ L氢氧化铝凝胶的PBS 溶液，共 200 μ L。 所述的构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，所述步骤2)中的雾化用的含鸡卵蛋白的PBS溶液浓度为I %。所述的构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，麻醉小鼠的麻醉剂为浓度4%水合氯醛，剂量为O. 08 O. lml/10g。在最后一次抗原攻击24小时后，处死小鼠，检测其血清IgE水平、气道高反应性、浸润到气道中炎症细胞的类型及数量和肺组织效应T细胞偏振情况等方面情况。表I为各组模型的血清ELISA结果、灌洗液相关细胞因子浓度比较，其中，Thl细胞分泌的特异细胞因子为IFN-Y，Th2细胞分泌的特异细胞因子为IL-5，Thl7细胞分泌的特异细胞因子为IL-17。反应中性粒细胞炎症程度的炎症因子为TNF-a和IL_8。本方法构建的非人哺乳动物哮喘模型的炎症细胞中性粒细胞显著增高，且具有较高的鸡卵蛋白相关性血清IgE水平。表I血清ELISA结果、灌洗液相关细胞因子浓度比较
组别IFN r IL-5 IL-17 鸡卵蛋白-IgE TNF-a IL-8
ιΚ常对照组低于不限 1.75 5.94 低于下限 49.47 低于下限 嗜酸性粒模型组 444.17 3.53 42 U52.0562 49 队T下限
屮性粒模型组 1042.4 7.752 56.1610.51 296.39 36.08表2为各组肺功能Penh值增长倍数比较，分5个乙酰胆碱浓度测定Penh值，并与正常对照组比较计算增长倍数[R(测)-R(基)]/R(基)。与嗜酸性粒细胞哮喘模型组比较，中性粒细胞哮喘模型组在浓度12mg/mL已有显著的气道高反应性，在浓度25mg/mL时气道高反应性更显著，差异有统计学意义。表2各组肺功能Penh值增长倍数比较(η = 12, χ ±s )
权利要求
1.一种构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，其特征在于，包括 步骤一、在第I天和第7天向非人哺乳动物腹腔注射有效量的含鸡卵蛋白和氢氧化铝凝胶的PBS溶液，同时从非人哺乳动物咽喉壁缓慢滴加有效量的含鸡卵蛋白和脂多糖的PBS溶液； 步骤二、从第13天到第15天连续三天雾化含鸡卵蛋白的PBS溶液，对非人哺乳动物进行抗原的呼吸道致敏。
2.如权利要求I所述的构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，其特征在于，同时构建的模型还包括只在腹腔注射等量的含鸡卵蛋白和氢氧化铝凝胶的PBS溶液的嗜酸性粒细胞哮喘模型组以及在腹腔注射等量的含氢氧化铝凝胶的PBS溶液的正常对照组，前者为含鸡卵蛋白的PBS溶液激发，后者为PBS溶液激发。
3.如权利要求I所述的构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，其特征在于，所述的非人哺乳动物是小鼠。
4.如权利要求I所述的构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，其特征在于，从小鼠咽喉壁滴加含100 μ g鸡卵蛋白和O. I μ g脂多糖的PBS溶液，共50 μ L，使小鼠慢慢将PBS溶液吸入肺部，滴加时用移液枪分次吸取滴加，每次10 μ L ;向腹腔注射含100 μ g鸡卵蛋白和100 μ L氢氧化铝凝胶的PBS溶液，共200 μ L。
5.如权利要求I所述的构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，其特征在于，所述步骤2)中的雾化用的含鸡卵蛋白的PBS溶液浓度为I %。
6.如权利要求I所述的构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，其特征在于，麻醉小鼠的麻醉剂为浓度4%水合氯醛，剂量为O. 08 O. lml/10go
全文摘要
本发明提供了一种构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，包括步骤一、在第1天和第7天向非人哺乳动物腹腔注射有效量的含鸡卵蛋白和氢氧化铝凝胶的PBS溶液，同时从非人哺乳动物咽喉壁缓慢滴加有效量的含鸡卵蛋白和脂多糖的PBS溶液；步骤二、从第13天到第15天连续三天雾化含鸡卵蛋白的PBS溶液，对非人哺乳动物进行抗原的呼吸道致敏。上述方法成功构建了气道以中性粒细胞增高的非人哺乳动物的哮喘模型，排除了气道损伤引起中性粒细胞增多的可能，缩短了建模时间。
文档编号A61K38/38GK102895657SQ20121039032
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月15日 优先权日2012年10月15日
发明者程晓明 申请人:中国人民解放军第三军医大学第二附属医院