专利名称：枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣中提取α-葡萄糖苷酶活性抑制剂的方法及其用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种药物的提取分离方法及应用，特别是一种从枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣中提取α-葡萄糖苷酶活性抑制剂的方法及其应用。
背景技术：
α -葡萄糖苷酶(a -glucosidase)是一类能够从含有α -葡萄糖苷键底物的非还原端催化水解α-葡萄糖基的酶的总称，其广泛分布于生物体中，参与食物消化、糖蛋白的生物合成，多糖及糖复合物的合成与分解代谢等许多生物代谢过程。抑制α-葡萄糖苷酶的活性可调节细胞表面的复合糖质，而糖尿病、肥胖症、高血脂、炎症、癌变、免疫反应和病毒感染等都和细胞表面的复合糖质有密切关系，因此，开发出适当的α -葡萄糖苷酶抑制 剂类药物，可以治疗很多疾病。枸杞(Lycium)是我国传统的中草药，首载于《神农本草经》，之后历代本草对其都有详尽的记载。果实入药称枸杞子，味甘，性平。有滋补肝肾，益精明目功效。主治肝肾阴虚、头晕目眩、腰膝酸痛等证。现代免疫学和临床医学多项试验表明枸杞果实及枸杞多糖可有效提高机体免疫调节功能，治疗糖尿病及其并发症，具有抗突变、抗肿瘤、抗疲劳、延缓衰老、明目养颜保肝降血糖等功效。而对枸杞籽的研究不多，一般主要用于提取具有医疗保健作用的枸杞油，提取后的残渣则视为废物，但枸杞籽和果是包含在一起的，且籽约占干果的四分之一重量，为了开发利用枸杞籽及其提取枸杞油后废弃的残渣，我们对其进行了化学成分及生物活性的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种从枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣中提取α-葡萄糖苷酶活性抑制剂的制备方法及其应用。本发明的目的按照下述方案实现从枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣中提取α -葡萄糖苷酶活性抑制剂的方法，其步骤为枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣经甲醇超声提取3次，合并提取液，减压干燥得甲醇总提取物，将甲醇总提取物加水溶解后，分别用等体积的正己烷、乙酸乙酯萃取3次，减压回收溶剂，得正己烷提取物、乙酸乙酯提取物；剩下的水层经大孔树脂柱处理，甲醇洗脱，得甲醇洗脱物、水洗脱物，采取α-葡萄糖苷酶活性体系追踪，发现正己烷提取物、乙酸乙酯提取物、甲醇洗脱物均表现出一定的α -葡萄糖苷酶抑制活性，将上述三种提取物经硅胶柱色谱，ODS柱色谱以及高效液相制备色谱分离得到14个化合物，结构和名称见附图
Io所述抑制剂的用途，是将其用作临床治疗II型糖尿病治疗的首选药和I型糖尿病的胰岛素治疗的辅助药物；所述抑制剂的用途，是将其用作预防艾滋病的辅助药物；
所述抑制剂的用途，是将其用作阻止肿瘤血管生长的抗肿瘤药物。α -葡萄糖苷酶抑制活性的测定本发明以4-硝基酚-2-D-吡喃葡萄糖苷(缩写PNPG)为反应底物，具体的反应体系为25 μ L PNPG，加入25 μ L各种浓度的样品溶液后，加入25 μ L α-葡萄糖苷酶，再加Λ 175 μ L磷酸盐缓冲液，在混合器上混合10分钟后。在37°C反应15分钟，加入IM Na2CO350 μ L终止反应，在405nm波长处测定吸收值。通过不加样品测定样品空白，不加α -葡萄糖苷酶测定阴性对照。样品的抑制率通 过以下公式计算抑制率) = (0DNegative control-0DB1
ank) (0Dsampie ODganlP^e blank) I ^^Negative controlIank^
附图I是本发明从枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣中提取得到的14个化合物的名称及结构示意图。附图2是本发明枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣提取工艺流程图，图中，LB代表枸杞；M为甲醇；N为乙腈汀为O. 06%三氟乙酸；HAc为3%的醋酸；例如12% NT是12%的乙腈溶液(包含O. 06%三氟乙酸);IC50为半数致死率；HPLC为制备高效液相色谱法。单体化合物的IC50 (半数致死率)单位Mm
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明进行描述。但本发明的范围并不仅限于此。I、提取与分离枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣各I. OOkg经甲醇超声提取3次，合并提取液，减压干燥得甲醇总提取物8. 97g，该提取物具有抗α-葡萄糖苷酶活性，IC50为2. 33mg/mL。将甲醇总提取物加水溶解后，分别用等体积的正己烷、乙酸乙酯萃取3次，减压回收溶剂，得正己烷提取物I. 90g、乙酸乙酯提取物I. 30g。剩下的水层经大孔树脂柱处理，甲醇洗脱，得甲醇洗脱物0.52g、水洗脱物4.61g。采取α-葡萄糖苷酶活性体系追踪，发现正己烷提取物、乙酸乙酯提取物、甲醇洗脱物均表现出一定的α -葡萄糖苷酶抑制活性，IC50分别为2. llmg/mL, I. 57mg/mL, I. 89mg/mL。因此将上述三部分经硅胶柱色谱，ODS柱色谱以及高效液相制备色谱等方法，分离得到14个化合物，其分离流程图如附图2所示。2、14种化合物化学成分的结构鉴定化合物I :白色固体(甲醇)，在254nm下有暗斑，分子式为C17H17NO3。氢谱的低场区给出两组AA' BB'偶合系统的芳香质子信号δ7. 39(1H，d，J=8.6Hz，H-2，6)，6.72(lH，d，J=8.6Hz，H-3，5)和 5 7. 05(1H, d,J=8. 6Hz,H-2/，6' ),6. 75(1H, d,J=8. 6Hz,H-3'，5')，推测该化合物中应有两个1，4 二取代的苯基片段；一组反式双键质子信号δ 7. 44 (1Η, d，J=15. 7Ηζ, Η_7)，6·38(1Η，d，J=15. 7，Hz, H_8);高场区给出一组 A2M2 偶合系统的质子信号 δ3. 46(2H，t，J=7. 2Hz，H-8' ),2. 75 (2H, t, J=7. 2Hz, W~T )。碳谱给出17个碳信号，其中包括I个羰基碳信号δ 169. 3 (C=O)，两个孤立的连氧芳香碳信号δ 160.5 (C-4)，157.0 (C-f );两个反式烯碳信号 δ 141. 8 (C-7)，118. 6 (C-8);—个连氮碳信号S42.6(C-8');进一步说明该化合物为对羟基桂皮酸与对羟基苯乙胺酰化脱水而成的酰胺。根据以上数据将该化合物鉴定为N-反式-香豆酰酪胺(N-(p-trans-coumaroyl)tyramine)化合物2 :白色固体(甲醇)，在254nm下有暗斑，分子式为C17H17NO3，氢谱的低场区给出两组AA, BB'偶合系统的芳香质子信号δ 7. 36 (1Η, d, J=8. 6Hz, H-2,6), 6. 69 (1H, d,J=8. 6Hz，H-3，5)和 δ 7. 01(lH，d，J=8. 6Hz，H-2'，6' ) ,6. 72(lH,d, J=8. 6Hz,H-3/ ,5')，推测该化合物中应有两个1，4 二取代的苯基片段；一组顺式双键质子信号δ6.61(1Η，d，J=12. 5Hz, H-7)，5· 79 (1H，d，J=12. 5，Hz, H_8);高场区给出一组A2M2偶合系统的质子信号δ 3. 39 (2H，t，J=8. IHz，H-8' ),2. 69(2H, t, J=8. 1Ηζ,Η-7/ )。化合物 2 与化合物 I 的氢谱和碳谱数据很相似，差别在于化合物2的双键为顺式双键。通过与化合物I比较，将该化合物鉴定为N-顺式-香豆酰酪胺(N-(p-cis-coumaroyl) tyramine)。化合物3:白色固体(甲醇)，在254nm下有暗斑，分子式为C18H19N04。氢谱的低场区给出一组AA' BB'偶合系统的芳香质子信号δ7.05(1Η，d，J=8. 5Hz，H-2' ,6')，6. 72(1H, d, J=8. 5Hz,H-3/，5')，推测该化合物中应有一个1，4 二取代的苯基片段；一组ABX 偶合系统的芳香质子信号 δ 7. 12 (1Η，s’ H-2)，7. 02 (1H，d，J=8. OHz, H_6)，6 . 79 (1H，d，J=8. OHz, H-5)，推测该化合物中应有一个1，3，4三取代的苯基片段；一组反式双键质子信号 δ 7. 43 (1Η, d, J=15. 6Hz, H-7), 6. 40 (1H, d, J=15. 6，Hz, H_8)。高场区给出一个甲氧基质子信号 δ3. 88 (3Η, s，3-0CH3);一组 A2M2 偶合系统的质子信号 δ 3. 47 (2H，t，J=7. IHz,H-8' )，2. 75 (2H，t，J=7. IHz, H_7')。化合物3与化合物I的碳谱数据很相似，差别在于化合物3比化合物I多了一个甲氧基碳信号δ 56. 5 (3-0CHs)。通过与化合物I比较，将该化合物鉴定为N-反式-对轻基苯乙基阿魏酰胺(N-p-trans-hydroxyphenethyl ferolamine)
O化合物4 :白色固体(甲醇)，在254nm下有暗斑，分子式为C36H36N2O815氢谱的低场区给出两组AA' BBi偶合系统的芳香质子信号δ7.05(1Η，d，J=8. 5Hz，H-2'，6' ),6. 71 (1H, d, J=8. 5Hz, H-3 ;，5')和 δ 6. 84 (1H，d，J=8. 4Hz，H_2 " '，6"')，6. 59(lH，d，J=8. 4Hz，H-3" '，5"')，推测该化合物中应有两个1，4 二取代的苯基片段;两组 ABX 偶合系统的芳香质子信号 δ 7. 29 (1Η, d，J=2. IHz, H_2" ),7. 04 (1H, dd，J=8. 3，2.1Hz，H-6" )，6. 72(1H，d，J=8. 3Hz，H-5")和 δ 7. 23 (1H，d，J=L 8Hz，H_2)，7. 01 (1H，dd, J=8. 4,1.8Hz, H-6),6. 71 (1H, d，J=8. 4Hz, H_5)，推测该化合物中应有两个 1，3，4 三取代的苯基片段；一组反式双键质子信号5 7. 45 (1H, d，J=15. 9Hz, H_7 " ),6. 49 (1H, d，J=15.9Hz，H-8"); 一个孤立的烯氢信号δ7.23(1Η，s，Η_7)。高场区给出两个甲氧基质子信号δ3. 92 (3Η, s，3" -OCH3)，3. 66 (3Η，s，3_0CH3);两组A2M2偶合系统的质子信号δ 3. 47 (2H，t，J=7. 6Hz，H-8 " ' )，2· 75 (2H，t，J=7. 6Hz，Η_7 "')和 3· 46 (2Η，t，J=6. 9Hz，H-8' )，2. 64(2Η，t，J=6. 9Hz，H-7' ) (Τ。碳谱给出36个碳信号。低场区给出2个羰基碳信号δ 168. 9 (C=O)，δ 165. 6 (C=O);两个孤立的连氧芳香碳信号δ 157.0 (C-4')，156.9(C-4"');两对邻二连氧取代的芳香碳信号δ 150.6(C-3" )，147. 6 (C_4 ")和149. 6 (C-4)，149. O (C_3) ;4 个烯键碳信号 δ 141. 7 (C-8)，141. I (C-7 " )，125. 4 (C-7)，121. I (C-8");高场区给出4个亚甲基碳信号5 42. 6,42. 2,35. 8,35. 6ο从氢谱、碳谱和分子量进一步说明化合物4应为化合物3的二倍体。并且化合物4中只有3个烯氢信号，推测两分子化合物3应该在其中一组反式双键处连接而成二倍体，这在HMBC相关谱中得到了证明。HMBC 谱中，δΗ δ7·23(Η-7)与 δ c 141. 7 (C_8)，168. 9 (C_9)，122. 3 (C-6)有远程相关，证明一分子化合物3的C-4" -OH与另一分子化合物3得8-H脱水而成醚。根据以上数据将该化合物鉴定为大麻酰胺己(cannabisin F),其推测结构如下所示
权利要求
1.一种从枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣中提取α-葡萄糖苷酶活性抑制剂的方法，其提取步骤为枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣经甲醇超声提取3次，合并提取液，减压干燥得甲醇总提取物，将甲醇总提取物加水溶解后，分别用等体积的正己烷、乙酸乙酯萃取3次，减压回收溶剂，得正己烷提取物、乙酸乙酯提取物；剩下的水层经大孔树脂柱处理，甲醇洗脱，得甲醇洗脱物、水洗脱物，采取α -葡萄糖苷酶活性体系追踪，发现正己烷提取物、乙酸乙酯提取物、甲醇洗脱物均表现出一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，将上述三种提取物经硅胶柱色谱，ODS柱色谱以及高效液相制备色谱分离得到14个化合物，分别为N-反式-香豆酰酪胺(N- (p-trans-coumaroyl) tyramine) (I)、N-顺式_香豆酰酪胺(N-(p-cis-coumaroyl) tyramine) (2)、N-反式-对轻基苯乙基阿魏酰胺(N-p-trans-hydroxyphenethyl ferolamine) (3)、大麻酉先胺己(cannabisin F)(4)、大海米酸胺(grossamide) (5)、芥子醒(sinapaldehyde) (6)、阿魏醒(ferulaldehyde) (7)、对轻基苯甲醒(p-hydroxy benzaldehyde) (8)、香草酸(vanillic acid) (9)、对香豆酸(trans-p-hydroxycinnamic acid) (10)、3_ 轻基-1-(4-轻基-3-甲氧基苯基)丙-I-酮(3-hydroxy-l-(4-hydroxy-3_methoxyphenyl)propan-l-one) (11)、2, 3_ 二轻基-1_(4_ 轻基-3-甲氧基苯基)丙-I-酮(2,3-dihydroxy-l-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)propan-l-one) (12)、东直菪素(scopoletine) (13),东直菪昔(scopoloside) (14)。
2.如权利要求I所述抑制剂在制备治疗糖尿病的药物中的应用，是将其用作临床治疗II型糖尿病治疗的首选药和I型糖尿病的胰岛素治疗的辅助药物。
3.如权利要求I所述抑制剂在制备预防艾滋病的药物中的应用，是将其用作预防艾滋病的辅助药物。
4.如权利要求I所述抑制剂在制备抗肿瘤的药物中的应用，是将其用作阻止肿瘤血管生长的抗肿瘤药物。
全文摘要
本发明是从枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣中提取α-葡萄糖苷酶活性抑制剂，其提取方法为枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣经甲醇超声提取3次，合并提取液，减压干燥得甲醇总提取物，将甲醇总提取物加水溶解后，分别用等体积的正己烷、乙酸乙酯萃取3次，减压回收溶剂，得正己烷提取物、乙酸乙酯提取物；剩下的水层经大孔树脂柱处理，甲醇洗脱，得甲醇洗脱物、水洗脱物，采取α-葡萄糖苷酶活性体系追踪，发现正己烷提取物、乙酸乙酯提取物、甲醇洗脱物均表现出一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，将上述三种提取物经硅胶柱色谱，ODS柱色谱以及高效液相制备色谱分离得到14个化合物。
文档编号A61K31/343GK102872064SQ201210347818
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者李巍, 王英华, 小池一男, 付红伟, 谢鹏 申请人:宁夏回族自治区药品检验所, 李巍