专利名称：从花椒叶中提取抗氧化活性植物多酚的方法
技术领域：
本发明涉及从花椒叶中提取抗氧化活性植物多酚的方法，属于化学化工技术领域。
背景技术：
目前有研究表明，人体组织内氧化性损伤的増加和衰老性疾病如组织老化、癌症、糖尿病、冠心病的发生密切相关。可以通过对体内自由基的清除而达到防御及治疗疾病的目的。目前，人工合成的抗氧化剂因其具有潜在毒性和致癌作用而受到人们的排斥，而天然抗氧化剂具有安全、低毒等优点，符合人们对绿色健康的需求，因此，从天然食材中筛选天然抗氧化物质一直是国际研究的热点。
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花椒叶又名椒叶，为芸香科植物花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim.)或青椒(Zanthoxylum schinifolium Zucc.)的叶。我国花椒种植面积约21万平方米,主要分布于陕西、甘肃、山东、四川等地，花椒叶产量巨大。《中国药典》记载其性味辛、热、无毒，归脾、胃经，温中散寒；燥湿健脾；杀虫解毒。《日华子本草》中记载花椒叶可治奔豚、霍乱、转筋等疾病。此外，花椒叶是我国的传统蔬菜和香料，可做调料食用或制作椒茶。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种从从花椒叶中提取抗氧化活性植物多酚的方法，其特点是从红花椒叶中分离植物多酚类物质，其中包含八种主要活性化合物，即槲皮素-3- β -D-葡萄糖苷、异槲皮苷、芦丁、茴香苷、山奈酚-7- β -D-葡萄糖苷、槲皮苷、山奈酚-3-β-D-半乳糖苷和阿福豆苷。这些混合物和分子可以用于预防和治疗体内自由基过多引起的衰老性疾病。本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外，均为重量份数。从从花椒叶中提取抗氧化活性植物多酚的方法包括以下步骤(I)将干红花椒叶粉碎，平均粒度为300 500μπι，按料液比Ig : 10 30ml，优选为Ig 15 25ml加入浓度50 100%，优选为60 80%的甲醇作为提取剂，在室温下震荡24 48h，分离上清液，并将上清液浓缩干燥后获得甲醇浸膏，得率为5 10% ；(2)将上述甲醇浸膏分散于蒸馏水中，料液比为Ig 20 40ml，优选为Ig 25 30ml，然后按体积比I : 2 5加入正己烷震荡萃取2 3次，收集水相萃取物；(3)将上述水相萃余物按体积比I : 2 5加入氯仿，震荡萃取2 3次，收集水相萃余物；(4)将上述步骤(3)中的水相萃余物按体积比I : 2 5加入こ酸こ酷，震荡萃取2 3次，收集こ酸こ酯相萃取物，浓缩干燥后得到红花椒叶中主要的植物多酚类组分，得率为4 10%ο从花椒叶中提取抗氧化活性植物多酚的方法制备得到的抗氧化活性植物多酚。
抗氧化活性植物多酚用于清除活性氧自由基，激活细胞内抗氧化防御系统，预防和治疗体内自由基过多引起的衰老性疾病。性能测试通过高效液相色谱及高效液相色谱质谱仪联用对上述步骤(4)中乙酸乙酯萃取物进行成分分析及标准品的比对，结果详见表I所示。结果表明上述步骤(4)中乙酸乙酯萃取物中主要活性植物多酚成分包含槲皮素-3-β -D-葡萄糖苷、异槲皮苷、芦丁、茴香苷、山奈酚-7-β -D-葡萄糖苷、槲皮苷、山奈酚-3-β -D-半乳糖苷和阿福豆苷，高效液相色谱以及质谱的条件如下
(I)高效液相色谱分析条件0DS-2色谱柱(04. 6 X 150mm, 5 μ m);流速，O. 5ml/min ;柱温，25°C ;检测波长，280nm ;梯度洗脱液0min时，5%甲醇(含O. 1%甲酸)；IOmin时，25%甲醇(含O. 1%甲酸);20min时,30%甲醇(含O. 1%甲酸);30_50min，35%甲醇(含O. 1%甲酸)；60min 时,50% 甲醇(含 O. 1% 甲酸)；70min 时,60% 甲醇(含 O. 1% 甲酸)；80-90min, 100%甲醇(含O. 1%甲酸)。(2)质谱分析条件电喷雾离子源(ESI)，正(负)离子电离；喷雾电压5500V;结束电压350 V ;干燥气流速10 L/min，干燥温度400°C ;氮气压力60psi ;扫描范围100 800 m/ Z0本发明具有如下优点(I)上述的花椒叶乙酸乙酯提取物在制备植物多酚中的应用，具有工艺简单、操作方便等优点；(2)抗氧化活性强。实验证明，利用本发明提供的制备方法所获得的有效组分显示了很强的抗氧化活性，在浓度为4 μ g/ml时，对2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基清除能力就达到59. 9%，IC50=2. 47Pg/ml。
图I:花椒叶乙酸乙酯提取物的高效液相色谱分析。分析条件如下0DS_2色谱柱(04. 6 X 150mm, 5 μ m);流速，O. 5ml/min ;柱温,25。。;检测波长，280nm ;梯度洗脱液0min时，5%甲醇(含O. 1%甲酸)；IOmin时，25%甲醇(含O. 1%甲酸)；20min时，30%甲醇(含O. 1%甲酸)；30-50min，35% 甲醇(含 O. 1% 甲酸);60min 时,50% 甲醇(含 O. 1% 甲酸)；70min 时,60%甲醇(含O. 1%甲酸)；80-90min, 100%甲醇(含O. 1%甲酸)。槲皮素_3_β -D-葡萄糖苷(保留时间为50. lmin)、异槲皮苷(保留时间为52. lmin)、芦丁(保留时间为52. lmin)、茴香苷(保留时间为57. 9min)、山奈酚_7_β -D-葡萄糖苷(保留时间为61. 5min)、槲皮苷(保留时间为62. 7min)、山奈酚_3_β -D-半乳糖苷(保留时间为63. 4min)和阿福豆苷(保留时间为68.5min)。图2:花椒叶乙酸乙酯提取物的高效液相色谱质谱仪联用分析图谱。高效液相色谱分析条件如下0DS-2色谱柱(04. 6 X 150mm, 5 μ m);流速,0. 5ml/min ;柱温，25°C ;检测波长，280nm ;梯度洗脱液=Omin时，5%甲醇(含O. 1%甲酸);IOmin时,25%甲醇(含O. 1%甲酸)；20min 时,30% 甲醇(含 O. 1% 甲酸)；30-50min, 35% 甲醇(含 O. 1% 甲酸)；60min 时,50% 甲醇(含O. 1%甲酸);70min时,60%甲醇(含O. 1%甲酸);80_90min，100%甲醇(含O. 1%甲酸)。质谱分析条件如下电喷雾离子源(ESI)，正离子电离；喷雾电压5500V;结束电压350 V ;干燥气流速10 L/min，干燥温度400°C ;氮气压力60psi ;扫描范围100 800 m/z。槲皮素-3-β -D-葡萄糖苷(离子峰时间为53. 8min)、异槲皮苷(离子峰时间为55. 6min)、芦丁(离子峰时间为55. 6min)、茴香苷(离子峰时间为59. 2min)、山奈酚_7_β -D-葡萄糖苷(离子峰时间为61. 9min)、槲皮苷(离子峰时间为62. 9min)、山奈酚-3-β-D-半乳糖苷(离子峰时间为67. 2min)和阿福豆苷(离子峰时间为68. 3min)。图3:花椒叶こ酸こ酯提取物的高效液相色谱质谱仪联用分析图谱。高效液相色谱分析条件如下0DS-2色谱柱(04. 6 X 150mm, 5 μ m);流速,O. 5ml/min ;柱温,25°C ;检测波长，280nm ;梯度洗脱液=Omin吋，5%甲醇(含O. 1%甲酸);IOmin吋,25%甲醇(含O. 1%甲酸)；20min 吋,30% 甲醇(含 O. 1% 甲酸)；30-50min, 35% 甲醇(含 O. 1% 甲酸)；60min 吋,50% 甲醇(含O. 1%甲酸);70min吋,60%甲醇(含O. 1%甲酸);80_90min，100%甲醇(含O. 1%甲酸)。质谱分析条件如下电喷雾离子源(ESI)，负离子电离；喷雾电压5500V ;结束电压350 V ;干燥气流速10 L/min，干燥温度400°C ;氮气压力60psi ;扫描范围100 800 m/z。槲皮素-3-β -D-葡萄糖苷(离子峰时间为53. 8min)、异槲皮苷(离子峰时间为55. 6min)、芦丁(离子峰时间为55. 6min)、茴香苷(离子峰时间为59. 2min)、山奈酚_7_β -D-葡萄糖苷(离子峰时间为61. 9min)、槲皮苷(离子峰时间为62. 9min)、山奈酚-3-β-D-半乳糖苷(离子峰时间为67. 2min)和阿福豆苷(离子峰时间为68. 3min)。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进ー步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据发明的内容作出ー些非本质的改进和调整。实施例I :
(I)将干花椒叶IOg粉碎后，然后用50%甲醇IOOml作为提取剂，在室温下震荡24h，分离上清液，并将上清液浓缩干燥后获得甲醇浸膏O. 63g ；(2)将上述甲醇浸膏分散于30ml蒸馏水中，然后用60ml正己烷振荡萃取2次，将萃取液和水相萃取物分离；(3)将上述水相萃余物部分用60ml氯仿振荡萃取2次，将萃取液和水相萃取物分离；(4)将上述水相萃余物部分用60mlこ酸こ酯振荡萃取2次，将萃取液和水相萃取物分离得到こ酸こ酯萃取物，将其浓缩并干燥，即可获得14. 4mg具有很强抗氧化活性的黄色粉状红花椒叶提取物。实施例2 (I)将花椒叶IOg粉碎后，然后用80%甲醇300ml作为提取剂，在室温下震荡36h，分离上清液，并将上清液浓缩干燥后获得甲醇浸膏O. 54 g ;(2)将上述甲醇浸膏分散于30ml蒸馏水中，然后用60ml正己烷震荡萃取3次，将萃取液和水相萃取物分离；(3)将上述水相萃余物部分用60ml氯仿振荡萃取3次，将萃取液和水相萃取物分离；(4)将上述水相萃余物部分用60mlこ酸こ酯振荡萃取3次，将萃取液和水相萃取物分离得到乙酸乙酯萃取物，将其浓缩并干燥，即可获得27. Img具有很强抗氧化活性的黄色粉状红花椒叶提取物。实施例3 (I)将花椒叶IOg粉碎后，然后用100%甲醇200ml作为提取剂，在室温下震荡48h，分离上清液，并将上清液浓缩干燥后获得甲醇浸膏O. 59 g ;(2)将上述甲醇浸膏分散于30ml蒸馏水中，然后用60ml正己烷震荡萃取2次，将萃取液和水相萃取物分离；(3)将上述水相萃余物部分用60ml氯仿振荡萃取2次，将萃取液和水相萃取物分离。
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(4)将上述水相萃余物部分用60ml乙酸乙酯振荡萃取2次，将萃取液和水相萃取物分离得到乙酸乙酯萃取物，将其浓缩并干燥，即可获得23. 7mg具有很强抗氧化活性的黄色粉状红花椒叶提取物。由上述实施例中获得的花椒叶乙酸乙酯提取物的高效液相色谱分析结果如图I所示。为了考察由上述实施例中获得的花椒叶乙酸乙酯提取物的抗氧化能力，本发明将实施例中获得乙酸乙酯提取物进行了抗氧化试验，具体的方法及结果如下应用实例II. ABTS自由基清除实验取19 ml的ABTS自由基溶液中加入3. 3 mg的过硫酸钾，混合均匀，在室温、避光条件下静置过夜。使用前将储备液加水稀释使其在734 nm波长下吸光度为O. 70±0. 02，形成ABTS工作液。将样品用纯水配制成一系列浓度，取30 μ I的受试物加入2. 97 ml ABTS自由基工作液，混合均匀，避光放置30 min后，在734 nm处测定吸光度。每份样品重复操作3次。以Trolox (6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃_2_羧酸)为参照物做阳性对照，ABTS自由基清除率(S%)计算公式如下:S%=(A0 - A)/A。，其中Atl为ABTS自由基溶液与纯水混合的吸光度，A为加受试物后的吸光度。测试结果详见表2所示。应用实例22. I, I- 二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除实验配制一定浓度的样品溶液，根据浓度需要取不同体积的待测溶液，加相应溶剂至
2.O ml，再加入DPPH试剂I. O ml，强裂振荡后避光静置30 min，利用DPPH甲醇溶液在517nm波长处有特征吸收峰测定各浓度待测试样吸光度值。空白对照为2 ml不同浓度受试物的甲醇溶液加上I. O ml的甲醇，阴性对照为2 ml的甲醇加上I ml (O. 3 mM)的DPPH甲醇溶液。维生素C作为阳性对照。每个处理试样均做三个平行试验，清除效果以半数清除率浓度(IC50)来表示。按下式计算对DPPH自由基的清除率(%)。DPPH自由基清除率(%) = [ (A1-Atl) /A1] X 100，其中A1表示DPPH与甲醇混合后所测的吸光度，A0表示加入受试物后所测的吸光度。测试结果详表3所示。表I乙酸乙酯提取物主要多酚成分HPLC-DAD-MS分析
权利要求
1.从花椒叶中提取抗氧化活性植物多酚的方法，其特征在于该方法包括以下步骤 (1)将干红花椒叶粉碎，平均粒度为300 500μ m,按料液比Ig : 10 30ml加入浓度50 100%的甲醇作为提取剂，在室温下震荡24 48h，分离上清液，并将上清液浓缩干燥后获得甲醇浸膏，得率为5 10 % ； (2)将上述甲醇浸膏分散于蒸馏水中，料液比为Ig 20 40ml，然后按体积比I : 2 5加入正己烷震荡萃取2 3次，收集水相萃取物； (3)将上述水相萃余物按体积比I: 2 5加入氯仿，震荡萃取2 3次，收集水相萃余物； (4)将上述步骤(3)中的水相萃余物按体积比I: 2 5加入乙酸乙酯，震荡萃取2 3次，收集乙酸乙酯相萃取物，浓缩干燥后得到红花椒叶中主要的植物多酚类组分，得率为4 10%。
2.如权利要求I所述从花椒叶中提取抗氧化活性植物多酚的方法制备得到的抗氧化活性植物多酚。
3.如权利要求2所述从花椒叶中提取抗氧化活性植物多酚用于清除活性氧自由基，激活细胞内抗氧化防御系统，预防和治疗体内自由基过多引起的衰老性疾病。
全文摘要
本发明公开了从花椒叶中提取抗氧化活性植物多酚的方法，其特点是将红花椒叶粉碎，平均粒度为300～500μm，按料液比1g∶10～30ml加入浓度50～100%的甲醇作为提取剂，在室温下震荡24～48h，分离上清液，并将上清液浓缩干燥后获得甲醇浸膏，得率为5～10%；将甲醇浸膏分散于蒸馏水中，料液比为1g∶20～40ml，然后按体积比1∶2～5加入正己烷震荡萃取2～3次，收集水相萃取物； 再将水相萃余物按体积比1∶2～5加入氯仿，震荡萃取2～3次，收集水相萃余物；然后将水相萃余物按体积比1∶2～5加入乙酸乙酯，震荡萃取2～3次，收集乙酸乙酯相萃取物，浓缩干燥后得到抗氧化活性植物多酚，得率为4～10%。
文档编号A61P39/06GK102836260SQ20121033003
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年9月7日
发明者钟凯, 黄毅娜, 高鸿 申请人:四川大学