一种b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的制备方法，制备方法为:A.B型流感嗜血杆菌的多糖提取物，室温下用超纯水或注射用水溶解PRP多糖至20mg/ml，按照PRP与CDAP的质量比为1的条件下加入CDAP，维持1.5min。0.3M?NaOH调节pH至9.5，维持3min。按照ADH与PRP多糖质量比为4：1的条件，加入固体ADH。0.3M?NaOH调节pH至9.5，维持1h。2-8℃，0.2M?NaCl透析；B.透析后的PRP-AH与20mg/ml?TT溶液以质量比1：2混合。0.1M?HCL调节pH至5.0，然后按照EDAC与PRP质量比为10：1的比例加入固体EDAC，室温下维持pH5.060min，0.3M?NaOH调节pH至7.5反应30min。
【专利说明】一种B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种疫苗的制备方法，特别涉及一种B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0002]B型流感嗜血杆菌(Hib)是流感嗜血杆菌中具极强侵袭力的一种，在流感嗜血杆菌引起的严重感染中，几乎90%是由B型引起的，主要引起脑膜炎、肺炎、心包炎、关节炎、菌血症、会厌炎等疾病，该病使15%至35%的存活者患有终身残疾，典型的病症有精神发育迟滞或耳聋。B型流感嗜血杆菌引起的脑膜炎、肺炎是导致婴幼儿死亡的主要原因。
[0003]多年流行病学研究表明，使用Hib疫苗是控制Hib侵袭性疾病的有效措施。因此研发效果好、成本低的Hib疫苗是必要的，也是重要的。
[0004]国内已经上市的B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗，系用纯化的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖与破伤风类毒素共价结合而成。随着大量的结合疫苗使用以及基础免疫中百白破的使用，目前以TT作为载体存在一些明显的劣势。目前国际市场上存在的Hib结合疫苗主要有三种载体蛋白，TT、DT、CRM197以及OMP。
[0005]现有Hib结合疫苗的生产技术，主要包括菌种的选育培养，荚膜多糖的提取分离纯化，载体蛋白的培养、分离纯化，荚膜多糖和载体蛋白的结合，以及疫苗的分离纯化等步骤，其中关键步骤存在工艺复杂，成本高，质量不稳定等缺陷。
[0006]本发明设计了不含动物源、有利于嗜血杆菌生长和PRP分泌的新培养基，此培养基完全不同于此前大家普遍采用的动物源BHI培养基。
[0007]本发明提出了新的PRP提取途径的荚膜多糖提取方法，此工艺的优点为处理量大，流程简单，回收率高，而且对内毒素也有部分去除能力。
[0008]本发明载体蛋白纯化工艺解决了蛋白纯化回收率低，蛋白纯化过程中活性丧失以及蛋白降解等困难，实现了高纯度(达90%以上)，短流程。
[0009]本发明公开使用CDAP活化PRP，并连接CRM197蛋白或TT蛋白的方法。
【发明内容】
[0010]本发明提供一种B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的制备方法，该方法包括:菌种的选育培养，荚膜多糖的提取分离纯化，载体蛋白的培养、分离纯化，荚膜多糖和载体蛋白的结合，以及疫苗的分离纯化的步骤。
[0011]本发明在于提供以下制备方法:
[0012]1)B型流感嗜血杆菌的培养(购买至ATCC)；
[0013]2) B型流感嗜血杆菌的多糖提取物即PRP的提取；
[0014]3)取PRP用水溶解，不断搅拌加入适量CDAP，维持l_3min ;加NaOH调节
[0015]pH 至 8-11，维持 l-5min ;加入 CRM197，加 NaOH 调节 pH 至 8-11，反应；
[0016]4)分离纯化得B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗原液。[0017]其中，优选的步骤3)为:取PRP用水溶解，不断搅拌加入适量CDAP，维持l_2min ；NaOH调节pH至9-10，维持2_4min ;加入CRM197,加NaOH调节pH至9-10，反应；特别优选的步骤3)为:PRP用超纯水溶解至25mg/ml，不断搅拌加入CDAP，其中PRP与CDAP的重量比% 1:1.25,维持 1.5min ；0.3M NaOH 调节 pH 至 9.5，维持 3min ;加入 CRM197，加 0.3M NaOH调节pH至9.5，反应；利用4FF凝胶色谱柱进行纯化，收集Vo附近液体，得B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗。
[0018]本发明也包括，其中步骤3中的CRM197蛋白可用TT蛋白代替，具体工艺如下:
[0019]A.取B型流感嗜血杆菌的多糖提取物即PRP，室温下用超纯水或注射用水溶解PRP多糖至20mg/ml，不断搅拌的情况下按照PRP与CDAP的质量比为I的条件下加入CDAP，维持1.5min ；0.3M NaOH调节pH至9.5，维持3min ;按照ADH与PRP多糖质量比为4:1的条件，加入固体 ADH0 0.3M NaOH 调节 pH 至 9.5，维持 1h ；2-8°C，0.2M NaCl 透析；
[0020]B.透析后的PRP-AH与20mg/ml TT溶液以质量比1:2混合；(λ IM HCL调节pH至.5.0，然后按照EDAC与PRP质量比为10:1的比例加入固体EDAC，室温下维持pH5.060min,.0.3M NaOH调节pH至7.5反应30min ;利用4FF凝胶色谱柱进行纯化。
[0021]其中，步骤b)中PRP多糖的制备方法如下:
[0022]A,提取PRP粗糖:1)B型流感嗜血杆菌培养液离心去除菌体沉淀，收集上清；2)上清过中空纤维，收获滤过液；3)中空纤维滤过液用50KDa的膜包超滤浓缩；4)膜包浓缩液进行分级醇沉:a.低浓度醇沉:顺序加入以下物质,每100ml加入0.5-0.7g NaCl，加入无水乙醇使得终浓度为20-30%，同时按每100ml加入2M 0.5-1.5ml CaCl2比例加入CaCl2.醇沉过夜后离心，收集上清；高浓度乙醇醇沉:低浓度醇沉的上清中加入乙醇，终浓度为70-90%，醇沉过夜后离心，收集沉淀；c.0.2M NaCl复溶70-90%乙醇醇沉的沉淀；5)复溶液过0.45um的滤膜后上样，用4FF柱子进行进一步的分离；6)按照KD=0.55的原则收集洗脱液，脱盐，冻干即得；
[0023]B,提取PRP精糖:1)用乙酸钠溶解步骤A中得到的PRP多糖，浓度为5mg/ml或10mg/ml ;2)加入等体积的苯酚，混匀数次，低温过夜；3)离心收集上层水相；4)再次加入等体积的苯酚，之后重复进行步骤2-3，连续抽提三次，透析，冻干即得PRP多糖。
[0024]优选的，PRP多糖的制备方法如下:
[0025]A,提取PRP粗糖:I) B型流感嗜血杆菌培养液8000rpm IOmin去除菌体沉淀，收集上清；2)上清过0.22um的中空纤维，收获滤过液；3)中空纤维滤过液用50KDa的膜包超滤浓缩；4)膜包浓缩液进行分级醇沉:a.25%低浓度醇沉:顺序加入以下物质，每100ml加Λ 0.616g NaCl，加入无水乙醇使得终浓度为25%，同时按每100ml加入lml2M CaCl2比例加入CaCl 2.醇沉过夜后8000rpm离心20min，收集上清；b.80%高浓度乙醇醇沉:低浓度醇沉的上清中加入乙醇，终浓度为80%，醇沉过夜后8000rpm离心20min，收集沉淀；c.0.2M NaCl复溶80%乙醇醇沉的沉淀；5)复溶液过0.45um的滤膜后上样，用4FF柱子进行进一步的分离；6)按照KD=0.55的原则收集洗脱液，脱盐，冻干即得；
[0026]B,提取PRP精糖:1)用10%乙酸钠溶解步骤A中得到的PRP多糖，浓度为5mg/ml或10mg/ml ;2)加入等体积的苯酹,混匀数次,4摄氏度过夜；3) 12000rpm离心20min,收集上层水相；4)再次加 入等体积的苯酚，之后重复进行步骤2-3，连续抽提三次，透析，冻干即得PRP多糖。[0027]其中步骤a)中用于提取PRP的B型流感嗜血杆菌用如下方式获得的:
[0028]培养基配方为，每升培养液中含有如下成分:
[0029]
【权利要求】
1.一种B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)多糖结合疫苗的制备方法,其特征在于制备方法如下: DB型流感嗜血杆菌的培养； 2)B型流感嗜血杆菌的多糖提取物即PRP的提取； 3)取PRP用水溶解，不断搅拌加入适量CDAP，维持l-3min;加NaOH调节pH至8_11，维持l-5min ;加入CRM197，加NaOH调节pH至8-11，反应； 4)分离纯化得B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗原液。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤3为取PRP用水溶解，不断搅拌加入适量CDAP，维持l-2min ;NaOH调节pH至9_10，维持2_4min ;加入CRM197，加NaOH调节pH至9-10，反应。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于制备方法如下: DB型流感嗜血杆菌的培养； 2)B型流感嗜血杆菌的多糖提取物即PRP的提取； 3)PRP用超纯水溶解至25mg/ml，不断搅拌加入CDAP，其中PRP与CDAP的重量比为1:1.25,维持 1.5min ；0.3M NaOH 调节 pH 至 9.5，维持 3min ;加入 CRM197，加 0.3M NaOH 调节pH至9.5，反应； 4)利用4FF凝胶色谱柱进行纯化，收集Vo附近液体，得B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗原液。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3中的CRM197蛋白用TT蛋白代替，具体工艺如下: A.取B型流感嗜血杆菌的多糖提取物即PRP，室温下用超纯水或注射用水溶解PRP多糖至20mg/ml，不断搅拌的情况下按照PRP与CDAP的质量比为I的条件下加入CDAP，维持1.5min ；0.3M NaOH调节pH至9.5，维持3min ;按照ADH与PRP多糖质量比为4:1的条件，加入固体 ADH0 0.3M NaOH 调节 pH 至 9.5，维持 Ih ； 2-8 °C，0.2M NaCl 透析； B.透析后的PRP-AH与20mg/mlTT溶液以质量比1:2混合；0.IM HCL调节pH至5.0，然后按照EDAC与PRP质量比为10:1的比例加入固体EDAC，室温下维持pH5.060min,0.3MNaOH调节pH至7.5反应30min ;利用4FF凝胶色谱柱进行纯化。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于PRP多糖的制备方法如下: A.提取PRP粗糖:1)B型流感嗜血杆菌培养液离心去除菌体沉淀，收集上清；2)上清过中空纤维，收获滤过液；3)中空纤维滤过液用50KDa的膜包超滤浓缩；4)膜包浓缩液进行分级醇沉:a.低浓度醇沉:顺序加入以下物质,每100ml加入0.5-0.7g NaCl，加入无水乙醇使得终浓度为20-30%，同时按每100ml加入2M 0.5-1.5ml CaCl2比例加入CaCl2.醇沉过夜后离心，收集上清；b.高浓度乙醇醇沉:低浓度醇沉的上清中加入乙醇，终浓度为70-90%，醇沉过夜后离心，收集沉淀；c.0.2M NaCl复溶70-90%乙醇醇沉的沉淀；5)复溶液过0.45um的滤膜后上样，用4FF柱子进行进一步的分离；6)按照KD=0.55的原则收集洗脱液，脱盐，冻干即得； B.提取PRP精糖:I)用乙酸钠溶解步骤A中得到的PRP多糖，浓度为5mg/ml或IOmg/ml ；2)加入等体积的苯酚，混匀数次，低温过夜；3)离心收集上层水相；4)再次加入等体积的苯酚，之后重复进行步骤2-3，连续抽提三次，透析，冻干即得PRP多糖。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于PRP多糖的制备方法如下: A.提取PRP粗糖:I)B型流感嗜血杆菌培养液8000rpm IOmin去除菌体沉淀，收集上清；2)上清过0.22um的中空纤维，收获滤过液；3)中空纤维滤过液用50KDa的膜包超滤浓缩；4)膜包浓缩液进行分级醇沉:a.25%低浓度醇沉:顺序加入以下物质，每100ml加入0.616g NaCl，加入无水乙醇使得终浓度为25%，同时按每100ml加入lml2M CaCl2比例加入CaCl 2.醇沉过夜后8000rpm离心20min，收集上清；b.80%高浓度乙醇醇沉:低浓度醇沉的上清中加入乙醇，终浓度为80%，醇沉过夜后8000rpm离心20min，收集沉淀；c.0.2M NaCl复溶80%乙醇醇沉的沉淀；5)复溶液过0.45um的滤膜后上样，用4FF柱子进行进一步的分离；6)按照KD=0.55的原则收集洗脱液，脱盐，冻干即得； B.提取PRP精糖:1)用10%乙酸钠溶解步骤A中得到的PRP多糖，浓度为5mg/ml或10mg/ml ;2)加入等体积的苯酹,混匀数次,4摄氏度过夜；3) 12000rpm离心20min,收集上层水相；4)再次加入等体积的苯酚，之后重复进行步骤2-3，连续抽提三次，透析，冻干即得PRP多糖。
7.如权利要求1所述的制备方法， 其特征在于用于提取PRP的B型流感嗜血杆菌用如下方式获得的: 培养基配方为，每升培养液中含有如下成分:
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于用于提取PRP的B型流感嗜血杆菌用如下方式获得的: 培养基配方为，每升培养液中含有如下成分:
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于CRM197的生产过程如下:.O采用天然棒状白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)进行发酵培养；2)发酵液通过连续流或者杯式离心机离心后，过中空纤维进行进澄清处理； 3)经过澄清之后的发酵液用IOkDa超滤膜进行超滤浓缩； 4)超滤浓缩液采用20-50%饱和硫酸铵进行第一次盐析，离心去除沉淀后用60-85%饱和硫酸铵对上清液进行第二次盐析，然后复溶； 5)复溶液经离子交换捕获CRM197蛋白，过程为，复溶液经10-50MPB缓冲液超滤换液至 Cond 10.0-2.0, pH 调节至 7.0-8.0 上样，色谱填料选自:ToyopearI DEAE-650S、DEAE.Fratogel EMD、Q.Sepharose.FF、CaptoQ Seharose.FF ;洗脱液为:IOmM-1OOM PB+0.5M KC ；25%B 一步洗脱； 6)捕获后的蛋白经疏水分离进行进一步纯化，分离纯化过程为:疏水填料为Butyl-650S Toyopearl、Phenyl Sepharose highsub,平衡缓冲液为 10 ~50mM PB,pH 7.0,.1.5M硫酸铵；洗脱缓冲液为10~IOOmM PB, pH7.0~7.6 ;洗脱缓冲液为10~50mM PB，pH 7.0,洗脱方式为一步洗脱，先用预洗缓冲液洗脱杂蛋白以后，再用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，其中预洗缓冲液为50mM PB, PH 7.0, 1.05M硫酸铵； 7)浓缩至所需浓度保存。
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤4中所得的疫苗原液经含NaCl的水溶液稀释，同时加入PB缓冲液、tween-80以及磷酸铝佐剂，至PRP终浓度为20ug/ml，NaCl终浓度为0.9%，磷酸铝终浓度为2.5mg/ml, PB终浓度为10mM，tween-80终浓度为.0.01%时，分装得到B型流感嗜血杆菌多糖蛋白结合疫苗。
【文档编号】A61P31/04GK103623404SQ201210311027
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年8月28日 优先权日:2012年8月28日
【发明者】李军强, 孙倩, 赵秋敏, 李亚冰, 刘贺军, 金永杰 申请人:天士力制药集团股份有限公司