专利名称：一种制备热稳定疫苗的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备热稳定疫苗的方法，特别涉及一种基于磷酸钙矿化制备热稳定疫苗的方法。
背景技术：
传染性疾病对公共卫生安全造成严重的威胁，每年导致上百万人的死亡。疫苗接种作为对抗传染病最有效的医疗手段，挽救了无数人的生命。减毒活疫苗(即病毒的减毒毒株)是最为重要的一种疫苗形式，在天花和脊髄灰质炎的消灭过程中发挥了巨大作用。目前仍在临床使用的减毒活疫苗包括脊髓灰质炎疫苗、水痘疫苗、流感疫苗、黄热疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、流行性こ型脑炎疫苗、轮状病毒疫苗、甲型肝炎疫苗以及腺病毒疫苗等。减毒活疫苗的活性成为(I)或(2)或(3)的病原体(I)将病原体经过化学处理后，使病原体的毒性减弱但抗原性基本保持；(2)将病原体进行基因改造，使病原体毒性减·弱但抗原性基本保持不变；(3)直接分离或筛选得到毒性低但抗原性良好的病原体毒株。通过基因改造或分离筛选的方法，世界上已有很多疫苗株，其中部分已经商业化。由于减毒活疫苗为典型的生物制品，具有温度敏感性，因此运输和保藏过程必须采用低温环境(如冷冻)。据统计，由于储藏或运输不当，每年约有50%的疫苗被浪费。在缺乏广泛可靠冷链基础设施的发展中国家和不发达国家，疫苗的低温保存仍然非常困难。疫苗的冷链花费占据了大部分财政支出，毎年超出2亿美元。尤其在发展中国家，冷链花费占全国疫苗总财政支出的80%以上。因此，改善疫苗的热稳定性，制备热稳定的疫苗具有重大价值。现有的改善活疫苗稳定性的方法如下(I)在液体或干粉状态的疫苗中添加稳定齐U，如重水、MgCl2和非还原性糖；(2)在疫苗的冻干技术中，采用糖玻璃化干燥、喷雾干燥等，以增强疫苗的稳定性；(3)借助蛋白质工程技术，通过增加亚单位之间的静电作用力，衣売-核酸的相互作用或者引入ニ硫键的方式等来增加疫苗粒子的热稳定性。当上述步骤都存在操作过程复杂以及保护效果有限的局限性。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备热稳定疫苗的方法，特别涉及ー种基于磷酸钙矿化制备热稳定疫苗的方法。本发明提供了一种制备磷酸钙包被的病毒的方法，包括如下步骤(I)向病毒液加入具有Ca2+离子的化合物，即为初始体系；所述病毒液中具有PO,离子；(2)将所述初始体系进行孵育；(3)离心收集沉淀，即为磷酸钙包被的病毒。步骤(I)的目的是使Ca2+充分在病毒颗粒(负电性)周围富集，并自发矿化形成磷酸I丐矿物外壳。
所述病毒液的pH可为6. 0-9. 5。所述初始体系中，所述Ca2+离子浓度可为IOmM以上，优选为10_20mM，进ー步优选为 13-17mM，再进ー步优选为 13. 05839-16. 80839mM。所述初始体系中，所述P043_离子的浓度可为0. 5-1. 5mM，优选为0. 906mM。所述初始体系中，所述病毒的浓度可为109_10nPFU/L，优选为2X 101QPFU/L。所述初始体系中，病毒、Ca2+离子和有PO/—离子的配比可为IO9-IOiiPFU 10-20mmol,(优选为 13_17mmol，再进ー步优选为 13. 05839-16. 80839mmol) 0. 5-1. 5mmol(优选为 0. 906mmol)。所述孵育的时间可为2小时以上，优选为2-8小吋。所述孵育的温度可为25_37°C，具体可为37°C。·所述步骤(2)中，在所述孵育后还包括加入磷酸钙高亲和性大分子(如聚丙烯酸)的步骤。所述磷酸I丐高亲和性大分子在体系中的浓度可为lug/mL-100ug/mL,优选为IOug/mL。磷酸钙高亲和性大分子包被在磷酸钙外壳外，可増加磷酸钙外壳的稳定性，同时阻止包被磷酸钙外壳的病毒颗粒进ー步聚集。所述离心的參数具体可为10000g-16000g、5-15min (如lOmin)。所述病毒液的制备方法包括如下步骤将病毒感染哺乳动物细胞(如BHK-21细胞)，采用低糖DMEM培养液进行细胞培养，得到病毒液。所述制备方法中，还包括如下步骤将所述细胞培养后的体系离心(具体离心參数可为16000g、10min)，收集上清液并过滤(具体可采用0. 22微米孔径的滤膜)，收集滤液(即为病毒液)的步骤。所述具有Ca2+离子的化合物具体可为CaCl2。所述PO,离子具体来源于NaH2PO4。本发明还保护磷酸钙包被的病毒。所述磷酸钙包被的病毒可为采用以上任一所述方法制备得到的磷酸钙包被的病毒。所述病毒可为こ型脑炎病毒。所述病毒为疫苗株的时候，所述磷酸钙包被的病毒即为热稳定的疫苗。所述病毒具体可为こ型脑炎病毒SA14-14-2韋株。本发明还保护ー种疫苗，它的活性成分为所述磷酸钙包被的病毒；所述病毒为疫苗株。所述疫苗可为こ型脑炎病毒疫苗，所以病毒为こ型脑炎病毒的疫苗株。所述病毒具体可为こ型脑炎病毒SA14-14-2毒株。我国目前广泛使用的流行性こ型脑炎减毒活病毒(SA14-14-2毒株)安全性和有效性俱佳，已出口印度、韩国、尼泊尔等国家。本发明以SA14-14-2毒株作为模型建立ー种能够通过生物矿化的方法提高病毒热稳定性的方法，该方法可以在病毒液中直接完成，简单方便。因此，本发明在热稳定性减毒活疫苗研发中具有良好的前景。本发明将SA14-14-2毒株表面进行了磷酸钙修饰，在病毒颗粒表面形成具有保护作用的无机外壳(磷酸钙薄层)。本发明提供的方法简单、快速。表面进行磷酸钙修饰的病毒作为疫苗的活性成分具有如下优点(结构原理示意图见图I):表面矿化提高了病毒沉降性，使得病毒能够在常速离心条件下快速高效的富集；生物可逆的矿化相能在细胞内溶解并且释放病毒颗粒，矿物相可辅助提高疫苗的热稳定性，使疫苗在常温的稳定性大大增强；该修饰没有显著改变病毒的生物学性质，不影响病毒本身的后续处理；其表面的磷酸钙外壳能够相应提高病毒的免疫原型，从而更好的实现其作为热稳性疫苗的功能。本发明通过病毒表面的矿化修饰，能够高效地解决疫苗运输和保存中的热失活现象，显著降低減毒活疫苗的财政支出。本发明在新型热稳定疫苗生产和制备中有广泛的应用。
图I为JEV-CaPi疫苗液与JEV疫苗液在热处理下的变化示意图。图2为实施例2中原位斑点杂交实验的结果；A :实施例I得到的JEV疫苗液；B JEV-CaPi疫苗液-甲-I离心得到的上清液；C JEV-CaPi疫苗液-甲-II ；D =JEV-CaPi疫苗液-こ-I离心得到的上清液；E JEV-CaPi疫苗液-こ-II ；F : JEV-CaPi疫苗液-丙-I离心得到的上清液；G JEV-CaPi疫苗液-丙-II ;H : JEV-CaPi疫苗液-丁 - I离心得到的上清液;I JEV-CaPi疫苗液-丁 - II。图3为实施例2中离心实验的结果和矿化效率的结果；A :离心实验的结果；B :通过病毒RNA评价矿化效率的结果；C :通过空斑试验检测到的病毒滴度评价矿化效率的结
果。·图4为实施例2中JEV-CaPi疫苗液-丙-II在透射电子显微镜下的照片；主照片为不经过负染的JEV-CaPi疫苗液-丙-II在透射电子显微镜下的照片，右上角为经过磷钨酸负染后的JEV-CaPi疫苗液-丙-II照片。图5为实施例2中JEV-CaPi疫苗液-丙-II的X射线能谱分析图。 图6为实施例2中JEV-CaPi疫苗液-丙-II的X射线粉末衍射仪检测图。图7为实施例3中JEV-CaPi疫苗液的生物学特征实验结果；A为空斑形态结果；B为ー步生长曲线结果；C为荧光显微镜下的观察結果。图8为实施例4中JEV-CaPi疫苗液在小鼠体内诱导体液免疫和细胞免疫的能力结果；A为IgG结果；B为中和抗体结果；C为刺激细胞广生Y干扰素能力结果。图9为实施例5中JEV-CaPi疫苗液在不同温度下的稳定性实验结果；A为26°C ；B为37°C ；C为42°C ;正方形标注的是JEV疫苗液，圆形标注的是JEV-CaPi疫苗液-丙-II。图10为实施例6中热处理后JEV-CaPi疫苗液在小鼠体内诱导体液免疫和细胞免疫的能力；A为IgG结果；B为中和抗体结果；C为刺激细胞产生、干扰素能力結果。图11为实施例7中矿化反应时间对表面磷酸钙修饰程度的影响。图12为实施例8中JEV-CaPi疫苗液的制备和耐热性能分析的结果；正方形标注的是JEV疫苗液，圆形标注的是JEV-CaPi疫苗液。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中，均采用低糖DMEM培养液调节JEV疫苗液或JEV-CaPi疫苗液的病毒浓度(在实际应用中，也可采用PBS缓冲液调节疫苗液的浓度)。BHK-21细胞购自ATCC，产品目录号为CCL-10 。こ型脑炎病毒SA14-14-2毒株(ー种こ型脑炎病毒减毒活疫苗株)购自中生集団成都生物制品研究所有限公司。聚丙烯酸(平均相对分子量为1800):购自sigma公司，货号323667。低糖DMEM培养基干粉购自Iifetechnologies公司，货号31600-034。碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG :购自Jackson,货号，515-055-003,名称Alkal ine Phosphatase-conjugated AffiniPure SheepAnti-Mouse IgG(H+L)。BCIP/NBT (染液)购自 Sigma，货号 B1911-100ML。BALB/c 雌性小鼠购自军事医学科学院实验动物中心。低糖DMEM培养基干粉按说明书配制，得到低糖DMEM培养液；低糖DMEM培养液的溶剂为水，溶质及其浓度见表I。低糖DMEM培养液中的Ca2+离子(由D-泛酸钙和CaCl2提供)浓度为I. 80839mM, PO广离子(由NaH2PO4 H2O提供)浓度为0. 906mM。 表I低糖DMEM培养液的溶质及其浓度
权利要求
1.一种制备磷酸钙包被的病毒的方法，包括如下步骤 (1)向病毒液加入具有Ca2+离子的化合物，即为初始体系；所述病毒液中具有PO广离子; (2)将所述初始体系进行孵育； (3)离心收集沉淀，即为磷酸钙包被的病毒。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述病毒液的pH为6.0-9. 5。
3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述初始体系中，所述Ca2+离子浓度为IOmM以上。
4.如权利要求I至3中任一所述的方法，其特征在于所述初始体系中，所述PO/—离子的浓度为0. 5-1. 5mM。
5.如权利要求I至4中任一所述的方法，其特征在于所述初始体系中，所述病毒的浓度为 109-10nPFU/L。
6.如权利要求I至5中任一所述的方法，其特征在于所述孵育的时间为2小时以上。
7.如权利要求I至6中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，在所述孵育后还包括加入磷酸钙高亲和性大分子的步骤。
8.磷酸钙包被的病毒。
9.如权利要求8所述的磷酸钙包被的病毒，其特征在于所述磷酸钙包被的病毒是采用权利要求I至7中任一所述方法制备得到的。
10.一种疫苗，它的活性成分为权利要求8或9所述的磷酸钙包被的病毒；所述病毒为疫苗株。
全文摘要
本发明公开了一种制备热稳定疫苗的方法，特别涉及一种基于磷酸钙矿化制备热稳定疫苗的方法。本发明提供了一种制备磷酸钙包被的病毒的方法，包括如下步骤(1)向病毒液加入具有Ca2+离子的化合物，即为初始体系；所述病毒液中具有PO43-离子；(2)将所述初始体系进行孵育；(3)离心收集沉淀，即为磷酸钙包被的病毒。本发明通过病毒表面的矿化修饰，能够高效地解决疫苗运输和保存中的热失活现象，显著降低减毒活疫苗的财政支出。本发明在新型热稳定疫苗生产和制备中有广泛的应用。
文档编号A61P31/14GK102784390SQ201210282409
公开日2012年11月21日 申请日期2012年8月9日 优先权日2012年8月9日
发明者唐睿康, 王广川, 秦成峰 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所