专利名称：紫杉醇在制备治疗egfr-tki获得性耐药性药物中的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及紫杉醇在制备治疗非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药性药物中的应用。
背景技术：
目前在肿瘤药物治疗过程中获得性耐药性成为世界难题，同时也是治疗肿瘤无效的原因。EGFR-TKI药物(厄洛替尼或吉非替尼)是晚期非小细胞肺癌治疗中非常重要的靶向药物，但其获得性耐药的出现限制了临床的应用，因此需要积极探索获得性耐药的形成机制。EGFR-TKI药物获得性耐药的机制目前仍未完全明确。已有的研究显示，EGFR-TKI获得性耐药的产生可能主要与以下两种机制有关继发性外显子T790M突变和MET继发性扩增。目前I790M突变耐药研究已取得较好的结果，而对MET扩增所导致耐药的研究仍在探索中。MET癌基因信号扩增可致PI3K/AKT信号持续激活，活化的AKT可磷酸化它的下游分子，从而促进细胞增殖、细胞运动和侵袭、抑制细胞凋亡和导致EGFR-TKI耐药的产生。到目前为止，没有特别有效的办法解决EGFR-TKI获得性耐药性难题。本发明通过多年研究发现紫杉醇可以治疗EGFR-TKI获得性耐药性发挥作用。
发明内容
发明目的
本发明提供了紫杉醇治疗EGFR-TKI获得性耐药性方面提供新的治疗方案或选择，为将来治疗提供新的思路和方法。
技术方案
紫杉醇在制备治疗EGFR-TKI获得性耐药性药物中的应用 有益效果
I、肺癌居全球肿瘤发病和癌症死亡率的第一位。吉非替尼和厄洛替尼在NSCLC中的疗效经常受到获得性耐药的限制，而目前已知的获得性耐药的主要机制为第二代EGFRT790M突变和MET基因获得性扩增。本发明表明，当出现EGFR-TKI获得性耐药后，紫杉醇可能逆转其耐药。也就是说对于那些已从厄洛替尼/吉非替尼治疗中产生获得获得性耐药性的非小细胞肺癌病人，经紫杉醇化疗后，可以再次考虑使用厄洛替尼/吉非替尼治疗，使得厄洛替尼/吉非替尼继续发挥功能，同时紫杉醇也可以对肿瘤进行抑制，从而发挥回转耐药性和协同作用。具体来说通过CCK-8和流式结果发现，紫杉醇可以抑制肺癌EGFR-TKI耐药细胞株H1975、H820和A549增殖,并促进其凋亡。相关分析发现，肿瘤组织survivin表达与P-Akt表达成正相关。我们的Western blot结果提示紫杉醇作用后，H1975、PC-9和H820细胞MET、p-Akt, survivin蛋白的表达下调,而A549细胞未见三种蛋白表达,上述结果提示，H1975、PC-9和H820细胞凋亡与紫杉醇下调MET、p_Akt，survivin蛋白表达有关，A549细胞细胞耐药有其他机制参与。我们用Real-time PCR的方法检测了 4种肺癌细胞紫杉醇作用前后miR-1的表达，结果发现，紫杉醇作用后miR-1在H1975、PC-9和H820细胞中的表达均较前明显升高，A549细胞中表达无明显变化，提示EGFR-TKI获得性耐药细胞株出现凋亡与microRNA-1 (miR-1)表达上调有关。其中所述的microRNA-1 (miR-1)存在于大多数动物种系，特异性表达于心肌和骨骼肌细胞，通过作用于组蛋白去乙酰化酶4而促进成肌细胞分化，抑制细胞扩增。新近研究发现在支气管上皮细胞中表达miR-1，在肺癌肿瘤组织及细胞中其表达较低，转染miR-1后能够逆转肺癌细胞A549 and H1299的致瘤特性(包括生长、复制、迁移及肿瘤形成等)，伴随诱导阿霉素对A549细胞诱发的凋亡；相反miR-1缺失会导致肿瘤细胞生长,提示miR-1在肺癌的发生、发展过程中发挥重要的抑癌基因的作用。
综上所述，细胞实验表明，紫杉醇对两种对EGFR-TKI获得性耐药的肺癌细胞敏感，而对EGFR-TKI原发性耐药的肺癌细胞无明显作用，对临床治疗TKI耐药的病人有指导意义，扩大了 EGFR-TKI的应用范围。
图I 为 IC50 浓度紫杉醇对H1975、PC-9、H820 和 A549 细胞MET、p_Akt, survivin蛋白表达的影响；
图2. H1975、PC-9、H820和A549细胞中miR-1在IC50浓度紫杉醇作用前后的变化。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例I
I.细胞培养H1975细胞为EGFR L858R-I790M突变型，对EGFR-TKI耐药；H820细胞具有MET扩增，对EGFR-TKI耐药；A549细胞表达野生型EGFR基因，EGFR-TKI耐药；PC_9系EGFR-TKI高度敏感细胞，上述H1975、H820、PC-9细胞购自ATCC (美国)，A549细胞由本实验室保存。细胞培养应用RPMI-1640培养基(内含10% FBS、谷氨酰胺和青链霉索)传代培养细胞株H1975、H820、A549、PC-9。在37°C、含5% C02的孵箱中进行细胞培养，每I 2天更换培养液I次。该四种细胞为贴壁细胞，当细胞生长到融合度为90%左右时，使用胰酶消化，并用吸管反复吹打使其离开培养瓶底壁，然后离心收集。收集到的细胞一半用于提取RNA, —半用于提取蛋白。2、CCK-8法测细胞增殖抑制选择对数生长期H1975、H820、A549和PC-9细胞，调整细胞数为2 X IO4个/mL接种于96孔培养板，每孔100 ill。24h后加入药物(0，1，2，4，8，16，32nmol/L)。同时设阴性对照组(培养液中不加药物)，空白对照组(加细胞不加培养液)。每组设5个复孔，在37°C、5% C02培养箱中培养48h。检测时每孔加入CCK-8
10yl，温育Ih后，于波长450nm酶标仪检测吸光度(A)值。实验重复3次并按下列公式计算肿瘤细胞抑制率，抑制率=(I-实验孔平均OD值/对照孔平均OD值)X 100%。实验结果紫杉醇对H1975、H820、A549和PC-9细胞的生长抑制作用
不同浓度紫杉醇作用于肺癌H1975、H820、A549和PC-9细胞48h后，细胞生长明显
抑制，呈现浓度依赖性，延长作用时间未见细胞生长抑制率有明显提高。如表I所示。
浓度(nM)__1_2_4_8_16_32_IC50_
H1975_ 69. 44±3. 75 57. 11±3. 88 36. 12±2. 25 15. 69±1.37 10. 06±0. 902 4. 68±0. 40 3. 63±0. 559
H820_ 89. 58±4. 29 84. 2±4. 88 62. 85±4. 49 18. 29±1.52 8. 81±0. 86 1.98±0. 18 5. 05±0. 217
A549_ 72.89±3. 13 67. 6±4. 19 350. 74±3. 28 36. 37±2. 96 29. 75±2.89 14. 52±1.37 6. 124±0. 291
PC-9_81.84±4. 74 78. 71±5. 06 61. 04±2. 94 30. 68±2. 45 14. 85±1.33 7. 01±0. 65 5. 786±0. 258
表I紫杉醇作用后的细胞生存率及IC50
Fig I The effect of paclitaxel on proliferation of H1975， H820 ，A549 andPC-9 cells. H1975， H820 ，A549 and PC-9 cells were treated for 48 h wit h varyingconcentrations (0，1，2，4，8，16，32 nmol/L) of paclitaxel ；
CCK-8 法文献依据 Shimamura T，Lowell AM，Engelman JAj et al. . Epidermalgrowth factor receptors harboring kinase domain mutations associatewith theheat shock protein 90 chaperone and are destabilized following exposure togeldanamycins[J] Cancer Res, 2005，65 (14):6401-8.
3、流式细胞术检测细胞凋亡率将四种细胞分别分组为正常对照组，和紫杉醇处理组。用IC50浓度紫杉醇分别处理四种细胞，各细胞作用于紫杉醇48小时；每组重复3次。用不含EDTA的胰酶消化收集细胞(包括凋亡和坏死的细胞)，收集细胞总数约106个，并迅速加入I 2ml含小牛的血清培养液中和胰酶(购自GIBCO公司，美国)。IOOOrpm离心3min，弃上清，PBS重悬，离心2次。加入500ul的Binding Buffer (购自BIPEC公司，美国)悬浮细胞；加入 5ul Annexin V-FITC(购自 BIPEC 公司，美国)混勻后，加入 5ul Propidium Iodine(购自BIPEC公司，美国)，混匀。室温避光反应15min。I小时内上流式细胞仪检测凋亡率。用未经凋亡诱导处理的正常细胞作为荧光补偿调节。实验结果流式细胞术检测细胞凋亡率
IC50浓度紫杉醇作用于H1975、H820、A549和PC-9细胞48h后的凋亡率结果，如表2所示，紫杉醇可促进H1975、H820、A549和PC-9细胞凋亡。
组别|H1975IH820IA549I PC-9
紫杉醇处理组 34. 99±0. 135 18. 22±2. 517_ 32. 38±3. 165 64. 35±2. 438 '
对照组丨5.29±0.147 丨4.32±0.074 丨4. 74±0.069 丨3. 35±0.083。表2. IC50浓度紫杉醇处理后的细胞凋亡率。Fig 2 Effect of paclitaxel on induction of apoptosis in H1975, PC-9 ,H820 and A549 cells. Cells were treated with paclitaxel at the concentration ofIC50 for up to 48 h.
4、蛋白提取和Westernblot H1975、H820、A549和PC_9细胞于IC50浓度紫杉醇处理48后小时，弃去培养液，用冰PBS [IOnmoI/L, PH7. 45 ]清洗两次。加入冰细胞裂解液[50 mmol /T, Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl, I mmol/L EGTA, I mmol/L EDTA, 20 mmol /L NaF,0. 5% NP 40，1% Triton X-100，I mmol/L PMSF，临用前新鲜加入 sigma 公司的蛋白酶抑制剂I]，置于冰上裂解5分钟。收集细胞，置于离心管中，4°C下12000 r / min离心20分钟。收集上清，BCA试剂盒(购自碧云天公司，中国)测定蛋白含量，加入5X上样缓冲液(Loading Buffer)使成IX。样品于_80°C冻存。用于Western blot实验,取30iig蛋白于7. 5%、10%和12. 3%分离胶上电泳，转膜至0. 22或0. 45 ii m的PVDF膜。膜上非特异性的位点用封闭液(5%脱脂奶粉或BSA，l%Tween-20的20 mmol/L的TBS溶液)室温下封闭2h，单克隆一抗(购自Cell Signaling Technology公司，美国)4°C孵育过夜。TBST溶液清洗4次，每次10分钟，加入辣根过氧化物酶标记的抗小鼠二抗(购自北京中杉公司，中国)室温下孵育2h。暗室内用ECL试剂盒显影，待蛋白条带显色清晰时，终止反应，曝光洗片。实验结果紫杉醇对H1975、PC-9、H820 和 A549 细胞 MET、p_Akt、survivin 蛋白表达的调节
用Western blot检测H1975、PC_9、H820和A549细胞用IC50浓度紫杉醇前后MET、p-Akt、survivin 蛋白的表达，结果显示(如图 I) H1975、PC-9 和 H820 细胞 MET、p-Akt、survivin蛋白，经紫杉醇处理后,表达量下降明显,而A549细胞未见三种蛋白表达。H1975、PC-9、H820三株肺癌细胞中MET、survivin蛋白表达和Akt磷酸化水平呈明显正相关Cr彡0.997, P < 0. 05) , Akt磷酸化水平愈高，MET、survivin蛋白表达愈高，反之亦然。5、Real-time PCR 应用Trizol提取总RNA0紫外分光光度计测0. D值，计算RNA的浓度。下面所有试剂或试剂盒均为ABI (AppliedBiosystems, USA)公司产品，将RNA用RT试剂盒(P/N 4366596)在ABI Prism 7900HT系统中反转成cDNA。cDNA在特异的TaqMan 探针 hsa-miR-1 (P/N: 4373090)和内参 U6 (P/N: 4373381)的参与下被进行定量检测。数据运用公式RQ=2_ AA Ct进行分析，每种样本均经过3次独立实验验证。统计学方法每次实验重复三次以上，数据资料用均数土标准差(土s)表示，用SPSS16. 0进行统计学处理，P<0. 05表示差异有统计学意义。
权利要求
1.紫杉醇在制备治疗EGFR-TKI获得性耐药性药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及本发明涉及紫杉醇在制备治疗非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药性药物中的应用。肺癌居全球肿瘤发病和癌症死亡率的第一位。吉非替尼和厄洛替尼在NSCLC中的疗效经常受到获得性耐药的限制，而目前已知的获得性耐药的主要机制为第二代EGFRT790M突变和MET基因获得性扩增。本发明表明，当出现EGFR-TKI获得性耐药后，紫杉醇可能逆转其耐药。也就是说对于那些已从厄洛替尼/吉非替尼治疗中产生获得获得性耐药性的非小细胞肺癌病人，经紫杉醇化疗后，可以再次考虑使用厄洛替尼/吉非替尼治疗，使得厄洛替尼/吉非替尼继续发挥功能，同时紫杉醇也可以对肿瘤进行抑制，从而发挥回转耐药性和协同作用。
文档编号A61P35/00GK102626405SQ20121008151
公开日2012年8月8日 申请日期2012年3月26日 优先权日2012年3月26日
发明者束永前, 王萱怡, 郭人花, 金时代 申请人:江苏省人民医院