一种复合酶-热水浸提黄柏生物碱的方法

文档序号:912033阅读:489来源:国知局
专利名称:一种复合酶-热水浸提黄柏生物碱的方法
技术领域
本发明属于中药制药或原料加工领域,具体涉及一种复合酶法提取黄柏生物碱的方法。
背景技术
黄柏为芸香科植物黄皮树chinense Schneid.的干燥树皮及芸香科植物黄薜amurense Rupr.的树皮。是一种用途广,用量大的中药材。黄柏临床用于湿热泻痢、黄疸、带下、热淋、脚气、痿甓、骨蒸劳热、盗汗、遗精、疮疡肿毒、湿疹瘙痒。药理研究表明,黄柏具有调整心律、降血压、抗消化道溃疡、增强免疫系统和抗病原微生物等作用。黄柏含小檗碱(berberine)、木兰花碱(magnoflorine)、黄柏碱(phellodendrine)、掌叶防己碱(palmatine),药根碱(Jatrorrhizine)等多种生物碱及内酯、甾醇、粘液质等。黄柏生物碱作为黄柏的主要有效成分,对其应用研究越来越广泛。目前,黄柏生物碱的提取方法主要有酸水法、石灰乳法、乙醇法、超声波提取等,生物碱为黄柏主要有效成分,如小檗碱、黄柏碱、木兰花碱、掌叶防己碱、药根碱等,均为季铵生物碱,虽都为水溶性生物碱,采用热水提法,由于黄柏皮性质坚韧,溶剂无法穿透进入纤维素内部,制剂中提取含量不高;另一方面,黄柏粘液含量7% 8%,粘液通常为具有分支结构的杂多糖,与纤维素等同属多糖类,黄柏提取物中含粘液质制成的中药胶囊,崩解时限不合格,现有技术采用石灰乳祛除黏液质,但过滤的时间长,生物碱得率较低,而采用酸碱浸提、半仿生提取等可能会破坏其活性结构。考虑黄柏中生物碱的状态和性质,特别是几种生物碱分解点都特别低,随着温度增加,小檗碱转化为小檗红碱等特性,我们认为酶处理可提高药效成分提取率,有助于保持天然产物构象,保持成分原有性质,也是仿生化提取中药有效成分的一种方式,克服传统高温煎煮对活性成分的影响,提取温度接近人体温度,水解条件温和,操作简便易行,设备简单。用复合酶澄清提取黄柏,符合中医药理论,故我们采用复合酶-热水浸提黄柏生物碱。

发明内容
本发明主要目的是提供一种简单易行,提取分离速度快,成本低,效率高,适于大规模生产的黄柏生物碱有效部位提取工艺。为实现上述目的,本发明采用以下技术方案
一种复合酶-热水浸提黄柏生物碱的方法,所述方法是将黄柏药材用复合酶酶解,具体步骤如下
(1)将检验合格的黄柏原生药饮片粉碎成粗粉,备用;
(2)称取处方量黄柏粗粉,加15倍重量的水浸润,调温度30°C 40°C,pH为3.9
4. 5 ;
(3)另取复合酶加水10倍重量调匀,缓缓加入黄柏水浸液中,搅匀,保温160 200min,过滤,滤液备用;所述复合酶为每g黄柏取相当于酶活力0. 8 I万U的纤维素酶、I. 5 2.5万U的果胶酶,和0. 3 0. 5万U的半纤维素酶的混合物;
(4)将黄柏药渣继续加10倍重量的水,煎煮lh,过滤;
(5)将步骤(3)和(4)的滤液合并,灭酶,浓缩至规定量(相当于生药lg/ml),即得黄柏生物碱提取物。
如上所述的方法,其中,所述的复合酶为纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶混合物,所述复合酶较优的可以由以下组料组成每g黄柏取相当于酶活力0. 8 I万U的纤维素酶,I. 5 2. 5万U的果胶酶,0. 3 0. 5万U的半纤维素酶。如上所述的方法,其中,所述复合酶的酶活测定方法纤维素酶在35°C、/ H4条件下,I h分解羧甲基纤维素钠生成I mg还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为一个纤维素酶活力单位,即IU ;果胶酶在35°C、/7H4条件下,I h分解果胶生成I m g半乳糖醛酸的酶量为一个果胶酶活力单位,即IU ;半纤维素酶在35°C/7H4条件下,Ih分解木聚糖产生Img还原糖(以木糖计)的酶量定义为一个半纤维素酶活力单位,即IU。如上所述的方法,其中,冲值以0. 5%稀硫酸、5%Ca(OH)2水溶液调节。可见,本方法包括酶促浸提和灭酶浓缩两个阶段。第一阶段主要作用是酶解细胞表面纤维、半纤维木质结构及粘液物,热水浸提利于生物碱的分离、溶出;第二阶段通过加热,既具有灭酶活的作用,同时又浓缩药材至规定量。本发明对复合酶的选取及酶解条件的选择是一关键,申请人经大量的实验研究,选取了以纤维素酶-果胶酶-半纤维素酶的复合酶作为澄清剂,加入难滤皮类药材黄柏的水提工艺中。且筛选出最好的酶解条件为酶解温度35°C,酶解时间200min,酸碱度为
3.9,纤维素用量为I万U/g,果胶酶用量为2万U/g,半纤维素酶用量为0.4万U/g。如上所述的方法,其中,所述黄柏药材为芸香科植物黄皮树Yhellodendronchinense Schneid.的干燥树皮及芸香科植物黄檗/%< 77o£/e/ £/ro/7 amurense Rupr.的干燥树皮。发明人是通过大量实验研究,提出复合酶-热水浸提黄柏生物碱的方法。其用复合酶澄清提取黄柏,符合中医药理论,其考虑到了黄柏中生物碱的状态和性质,特别是几种生物碱分解点都特别低,随着温度增加,小檗碱转化为小檗红碱等特性,采用酶处理可提高药效成分提取率,有助于保持天然产物构象,保持成分原有性质,也是仿生化提取中药有效成分的一种方式。另外,克服传统高温煎煮对活性成分的影响,提取温度接近人体温度,水解条件温和,操作简便易行,设备简单,适宜工业化生产。本发明的有益效果
本发明提供了一种提取制备黄柏生物碱有效部位的新方法,对难滤皮类中药黄柏增加一项酶解澄清工艺流程,破坏植物细胞壁,分解除去黏液等杂质,提高了有效成分的溶出率,同时极大加快药液滤过速度,提高药液澄清度,提高制剂的稳定性。本发明的提取方法采用复合酶对原料进行酶解处理,对多种酶进行了筛选,并优化了酶比例,酶反应条件,提取分离速度快,提高了有效成分收率和利用率,本发明制得的黄柏生物碱提取率较通常不加酶热水浸提法提高60%以上,技术含量高,工艺简单,成本低,对环境友好,产量高,效率高,适宜工业化生产。另外,本发明未使用石灰水等碱化措施,提取液澄清,粘度低,产品杂质少,后续处理方便。


图I黄柏生物碱对照品的HPLC图谱 图2黄柏生物碱未加酶提取的HPLC图谱 图3黄柏生物碱加酶提取的HPLC图谱
其中5个色谱峰为代表化合物,2、3、4、6、7号峰分别为木兰花碱、黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱。
具体实施例方式实施例I :
(I)检验合格的川黄柏(黄皮树)原生药饮片,粉碎成粗粉。(2)称取处方量黄柏粗粉,加15倍重量的水浸润,调温度40°C,以0. 5%稀硫酸、5%Ca (OH) 2 水溶液调为 4. 5。(3)每g黄柏取相当于酶活力0.8万U的纤维素酶、I. 5万U的果胶酶,和0. 3万U的半纤维素酶,加水10倍重量调匀,缓缓加入步骤(2)得到的黄柏水浸液中,搅匀,保温 160min。(4)九号筛过滤,滤液备用。(5)黄柏药渣继续加10倍重量的水,常规煎煮lh,九号筛过滤。(6)滤液合并,灭酶,浓缩至规定量(相当于生药lg/ml),即得提取物。经复合酶处理后,用复合酶提取的黄柏生物碱比单纯水浸提提高了 60%。实施例2
(I)检验合格的川黄柏(黄皮树)原生药饮片,粉碎成粗粉。(2)称取处方量黄柏粗粉,加15倍重量的水浸润,调温度30°C,以0. 5%稀硫酸、5%Ca (OH) 2 水溶液调为 4. 2。(3)每g黄柏取相当于酶活力0. 9万U的纤维素酶、2. 5万U的果胶酶和0. 5万U的半纤维素酶,加水10倍重量调匀,缓缓加入黄柏水浸液中,搅匀,保温180min。(4)九号筛200目过滤,滤液备用。(5)黄柏药渣继续加10倍重量的水,常规煎煮lh,九号筛200目过滤。(6)滤液合并,灭酶,浓缩至规定量(相当于生药lg/ml),即得提取物。经复合酶处理后,用复合酶提取的黄柏生物碱比单纯水浸提提高了 70%。实施例3
(I)检验合格的川黄柏(黄皮树)原生药饮片,粉碎成粗粉。(2)称取处方量黄柏粗粉,加15倍重量的水浸润,调温度35°C,以0. 5%稀硫酸、5%Ca (OH) 2 水溶液调为 3. 9。(3)每g黄柏取相当于酶活力I万U的纤维素酶、2万U的果胶酶和0. 4万U的半纤维素酶,加水10倍重量调匀,缓缓加入黄柏水浸液中,搅匀,保温200min。(4)九号筛200目过滤,滤液备用。(5)黄柏药渣继续加10倍重量的水,常规煎煮lh,九号筛200目过滤。(6)滤液合并,灭酶,浓缩至规定量(相当于生药lg/ml),即得提取物。
经复合酶处理后,用复合酶提取的黄柏生物碱比单纯水浸提提高了 90%。上述实施例中,复合酶的酶活测定方法如下纤维素酶在35°C、/7H4条件下,I h分解羧甲基纤维素钠生成I m g还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为一个纤维素酶活力单位,即IU ;果胶酶在35°C、/7H4条件下,I h分解果胶生成I m g半乳糖醛酸的酶量为一个果胶酶活力单位;半纤维素酶在35°C/7H4条件下,Ih分解木聚糖产生Img还原糖(以木糖计)的酶量定义为一个半纤维素酶活力单位。黄柏生物碱的含量检测
分别精密称取木兰花碱、盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品,采用高效液相色谱法检测。色谱条件
色谱柱菲罗门 Gimini C18 (250X4. 6mm, IlOA)
流动相乙腈(A)-0.025mol/L NaH2PO4(含 0.0125 mo I /L的十二烷基硫酸钠(B),梯度洗脱,梯度洗脱程序为35 (A) /65 (B) 0— 15min, 50 (A) /50 (B) 15 — 35 min ;流速1. Oml/min ;柱温35°C ;检测波长ZDonm ;进样量20 U I。 黄柏生物碱对照品的HPLC图谱,见图I。黄柏生物碱未加酶提取的HPLC图谱,见图2。黄柏生物碱加酶提取的HPLC图谱,见图3。黄柏未加酶提取和加酶提取生物碱结果,见表I。表I
权利要求
1.一种复合酶-热水浸提黄柏生物碱的方法,其特征在于,所述方法是将黄柏药材用复合酶酶解提取黄柏生物碱,具有包括如下步骤 (1)将检验合格的黄柏原生药饮片粉碎成粗粉; (2)称取黄柏粗粉,加15倍重量的水浸润,调温度30°C 40°C,pH为3.9 4. 5 ; (3)另取复合酶加水10倍重量调匀,缓缓加入黄柏水浸液中,搅匀,保温160 200min,过滤,滤液备用;所述复合酶为每g黄柏取相当于酶活力O. 8 I万U的纤维素酶、I. 5 2.5万U的果胶酶和O. 3 O. 5万U的半纤维素酶的混合物;复合酶的酶活力测定方法为纤维素酶在35°C、/7H4条件下,I h分解羧甲基纤维素钠生成I mg还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为一个纤维素酶活力单位,即IU ;果胶酶在35°C、/7H4条件下,I h分解果胶生成I m g半乳糖醛酸的酶量为一个果胶酶活力单位,即IU ;半纤维素酶在35°C、/7H4条件下,Ih分解木聚糖产生Img还原糖(以木糖计)的酶量定义为一个半纤维素酶活力单位,即IU ; (4)将黄柏药渣继续加10倍重量的水,煎煮lh,过滤; (5)将步骤(3)和(4)的滤液合并,灭酶,浓缩至生药lg/ml,即得黄柏生物碱提取物。
2.权利要求I所述的复合酶-热水浸提黄柏生物碱的方法,其特征在于, 所述步骤(2)中,调温度35°C,pH为3. 9; 所述步骤(3)每g黄柏取相当于酶活力I万U的纤维素酶,2万U的果胶酶,0.4万U的半纤维素酶的混合物为复合酶,加水10倍调匀,缓缓加入黄柏水浸液中,搅匀,保温200mino
3.权利要求I所述的复合酶-热水浸提黄柏生物碱的方法,其特征在于, 所述步骤(4)中,用200目筛过滤; 所述步骤(5)中,用200目筛过滤。
4.根据权利要求I或2所述的方法,其特征在于,所述黄柏药材为芸香科植物黄皮树Yhellodendron chinense Schneid.的干燥树皮或芸香科植物黄檗Phellodendronamurense Rupr.的干燥树皮。
全文摘要
本发明涉及一种复合酶-热水浸提黄柏生物碱的方法,将检验合格的黄柏原生药饮片,粉碎成粗粉,备用;称取处方量黄柏,加15倍水浸润,调温度30℃~40℃,pH为3.9~4.5;另每g黄柏取相当于酶活力0.8~1万U的纤维素酶、1.5~2.5万U的果胶酶和0.3~0.5万U的半纤维素酶,加水10倍调匀,缓缓加入黄柏水浸液中,搅匀,保温160~200min,过滤,滤液备用;黄柏药渣继续加10倍水,常规煎煮1h,过滤,滤液合并,灭酶,浓缩至规定量(相当于生药1g/ml),即得黄柏生物碱提取物。本发明与传统提取法相比,提取速度快,提高有效成分收率和利用率,大幅降低生产成本,宜于大规模生产。
文档编号A61P31/00GK102626459SQ20121006843
公开日2012年8月8日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者张太君, 张雪梅, 成建国, 文洪宇, 李洪, 杨娟, 陈曦, 黄彦 申请人:重庆市中医院
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