专利名称：源于白内障疾病模型小鼠的多潜能细胞、其制备方法及其用途的利记博彩app
技术领域：
本发明属于动物细胞领域，具体涉及一种来源于白内障疾病小鼠的多潜能细胞如胚胎干细胞(ES)其制备方法及其用途。
背景技术：
白内障是严重影响公众健康的重大疾病。据世界卫生组织统计，全世界约有4500 万人失明，其中有一半是由白内障导致的。白内障是由遗传和环境危险因素等多种原因引起的以晶状体混浊为主要症状的多因子失调眼科疾病(Mccarty C A, Taylor H R. The genetics of cataract [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2001,42 (8) :1677-8.)。白内障的遗传方式包括常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和X连锁隐性遗传。遗传性白内障无论从临床表现上还是遗传特性上都很复杂，许多与晶状体相关的基因突变都可导致白内障的形成。由于白内障疾病的复杂性，有效的方法就是研究遗传性单纯性白内障来进一步深入了解可导致和影响晶状体病变的所有基因及发病机制。人们最早对白内障遗传因素的认识是从动物模型开始的，主要是鼠模型(Graw J.Mouse models of cataract [J]. J Genet, 2009,88 (4) :469-86.)。这是由于晶状体混池能相对容易地在鼠模型中检测到，并且可同时观察白内障的遗传方式。疾病的动物模型是体外研究该疾病的发病机制、病理过程等的强有力的工具。鼠模型在白内障研究领域中发挥着重要的作用。迄今为止，国内外已发现的遗传性白内障小鼠模型约有140多个，这些小鼠模型主要是通过自发突变、诱发突变、敲除突变或转基因等方式获得。利用小鼠动物模型，可以克服白内障发生发展缓慢、潜伏期长、发病原因多样及经常伴有各种其它疾病等因素干扰的问题，可以通过单一的病因，在短时间内复制出典型的动物疾病模型，因此，白内障小鼠动物模型对于研究白内障的发生、发展规律和疾病诊断治疗等是极为重要的手段和工具。随着科学的发展，已经有20多个基因位点被证明与先天性白内障有关，其中17 个基因已经被完全克隆出来(He ff, Li S. Congenitalcataracts gene mapping [J]. Hum Genet, 2000,106 (I) : 1_13.)，人们对白内障的发生机制也逐渐有了一定的了解，但仍然还有许多家庭受到未知基因突变引起的白内障的影响。已发现的白内障小鼠突变系中，也还有部分突变基因在其分子水平尚未明确定义，即使是那些已知与白内障有关的基因，其确切的机制也还没有完全弄清楚。虽然随着医疗技术的不断进步，先天性白内障的诊断和治疗已非难事，但目前诊断仍以症状学诊断为主，治疗以手术为主，且手术治疗后会有一定的并发症。或许可以仿效其他遗传性疾病的做法，通过对胎儿期疾病基因筛选等方法，将疾病诊断提前到胎儿期，为有效的治疗提供时机及依据，再通过基因治疗的手段，将遗传性白内障控制在白内障尚未形成或尚未完全形成之前，以实现在基因水平对遗传性白内障的防治。基因治疗通常在细胞水平进行操作，而具有多能性的胚胎干细胞无疑是最佳选择。胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES)是从早期胚胎内细胞团中克隆出来的一类细胞，在理想的条件下培养，这类细胞能维持其无限自我更新增殖潜能，并可以分化为包括生殖细胞在内的多种类型子细胞，具有发育成完整生命个体的能力(Martin G R. Isolation of a pluripotentcell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned byteratocarcinoma stem cells [J].Proc Natl Acad Sci USA, 1981,78 (12) :7634-8 ；Mastui Y, Zsebo K, Hongan B L. Derivation ofpluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cellsin culture[J]· Cell,1992, 70(5) :841-7.)。胚胎干细胞的用途很多，在生命科学及医学的各个领域都有很重要而深远的影响。胚胎干细胞的全能性、可遗传操作性和无限扩增能力，使其成为细胞和分子水平上研究个体发育过程中极早期事件的良好材料和方法。随着人类基因组学研究基因芯片、基因诱捕等生物技术的应用，比较ES细胞及不同发育阶段的细胞和分化细胞的基因转录和表达，可确定胚胎发育及细胞分化的分子机制、发现新基因。结合基因打靶技术，可发现不同基因在生命活动中的功能等。胚胎干细胞还提供了新药物的药理药效、毒理及药物代谢等研究的细胞水平的研究手段，可大大减少药物实验所需实验动物的数量，ES细胞还可用来研究动物和人类疾病的发生机制和发展，过程以便找到有效和持久的治疗方法。此外通过ES细胞和基因治疗技术，还有可能矫正缺陷基因。1981年，Evans等采用STO细胞作为饲养层，在添加了血清的培养液中成功从囊胚 ICM 中培养了小鼠 ES 细胞(Evans M J, Kaufman M H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos[J]. Nature,1981,292(5819) :154-156.)。 Martin GR以免疫外科法剥得囊胚内细胞团(ICM)并将其置于STO细胞饲养层上，并用小鼠PSA21-ES细胞条件培养基培养，得到小鼠ES细胞(Marin G R. Isolation of apluripotent cell line from early mouse embryos cultured in mediumconditioned by teratocarcinoma stem cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1981,78(12) :7634-8.)。 Dhhaise等将8-细胞小鼠胚胎消化成单个分裂球并培养于小鼠原代成纤维细胞饲养层上， 以添加了胎牛血清的DMEM/F12培养基培养，建立了一个ES细胞系MSBl，该细胞系细胞具有形成嵌合鼠的能力。上述研究者都是应用经典的饲养层加血清培养体系培养获得小鼠 ES细胞。虽然科学家用这个体系成功建立了多种小鼠品系的ES细胞系，但是这种培养体系仍存在很多不足。如饲养层细胞不具耐药性，因此无法用于转染外源性基因的胚胎干细胞筛选，且死亡的饲养层细胞可能会导致ES细胞的突变及影响正常核型的保持(Suemori H, Nakatsuji N. Establishment of the Embryo-derived Stem(ES)Cell Linesfrom mouse blastocysts effects of the feeder cell layers[J]. DevelopmentGrowth & Differentiation, 1987，29 (2) :133-9.)。最重要的是饲养层和血清都具有动物源性，且成分复杂，作用机制不清，具有不确定性和不可控性，因而限制了更多胚胎干细胞系的成功建立。2003年，Ying等人发现，血清中起作用的成分为BMP4，并利用LIF+BMP4的无血清无饲养层培养体系成功建立了小鼠ES细胞系(YingQ L,Nichols J, Chambers I, et al.BMP induction of Id proteinssuppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3[J]. Cell,2003,115(3) :281-92.) 2007 年，Ying等更在含有MEK抑制剂、GSK3抑制剂和FGF受体拮抗剂的无血清培养基中获得多能细胞(包括小鼠ES细胞)，并在其中保持自我更新状态(专利申请号200780011232. 5)。该培养体系的优点在于不添加来自饲养层和血清中任一刺激更新维持ES细胞不分化状态的成份，越来越多小鼠品系的胚胎干细胞系利用该培养体系得以建成，如NOD小鼠ES 系、C57BL/6N小鼠ES系和非肥胖型糖尿病小鼠ES细胞系等(Ohta H，Ohinata Y，Ikawa M, et al. Male germline and embryonic stem cell linesfrom NOD mice !efficient derivation of Gscells from a nonpermissivestrain for ES cell derivation[J]. Biology of reproduction,2009,81(6) :1147 ；Kiyonari H,Kaneko M,Abe S,et al. Three inhibitors ofFGF receptor, ERK, and GSK3establishes germline-competentembryonic stem cells of C57BL/6N mouse strain with high efficiencyand stability. Genesis, 48(5) :317-27 ；Nichols J, Jone K, Phillips J, et al. Validated germline-competent embryonic stem cell lines from nonobesediabetic mice. Nature medicine,2009, 15(7) :814-8.)。但目前为止，国内外尚没有关于成功获得来源于白内障动物模型的胚胎干细胞的报道。同时本领域急需获得白内障小鼠的胚胎干细胞，在细胞水平上为研究白内障疾病，如发病机制研究、药物筛选及基因治疗等提供新的材料和方法。与动物模型相比，胚胎干细胞的优势在于可以更为方便的进行大规模的遗传操作、筛选。
发明内容
为此，本发明人进行多方面的研究，终于以白内障小鼠为原材料，成功地从白内障小鼠的早期胚胎中培养获得了白内障小鼠的胚胎干细胞、并验证了以白内障小鼠为来源可以成功获得具有白内障遗传信息的胚胎干细胞的方法是可行的。具体地，本发明包括以下几项本发明的第一方面涉及一种多潜能细胞，其分离自白内障疾病模型小鼠，优选地，所述的模型小鼠为遗传性白内障疾病模型小鼠，优选地，所述的遗传性白内障疾病模型小鼠选自a :遗传性BALB/cCat/Cat白内障小鼠；b:Philly 小鼠;c =Crybal基因突变小鼠；d :显性白内障小鼠Hif ;进一步优选为遗传性BALB/cGat/Gat白内障小鼠；优选地，所述的多潜能细胞为胚胎干细胞。本发明第一方面所述的多潜能细胞，其分离自白内障疾病模型小鼠的早期胚胎。本发明第一方面所述的多潜能细胞，其表达碱性磷酸酶、SSEAl基因和/或选自 0ct4、Nanog、Sox2、Eras、Esgl、Fgf4、Utfl、Cripto、Rexl、Gdf3 中的一种或多种基因；优选地,该多潜能细胞表达0ct4、Nanog和Sox2 ；更优选地,该多潜能细胞表达0ct4、Nanog、Sox2和Eras ；进一步优选地,该多潜能细胞同时表达碱性磷酸酶、SSEAl以及选自0ct4、Nanog、 Sox2、Eras、Esgl、Fgf4、Utf I、Cripto、Rexl、Gdf3 中的一种或多种基因；更进一步优选地，该多潜能细胞同时表达碱性磷酸酶、SSEAU 0ct4、Nanog和 Sox2。
本发明第一方面所述的多潜能细胞，其可形成畸胎瘤或畸胎癌，优选地，所形成的畸胎瘤或畸胎癌中含有源于外胚层、中胚层和内胚层三个胚层的分化细胞。本发明第一方面所述的多潜能细胞，其在培养基中可作为单个细胞生长和/或增殖。本发明第一方面所述的多潜能细胞，其可形成嵌合体；优选地，所述嵌合体中的所有细胞与所述多潜能细胞源于同一亲本；进一步优选地，所述的嵌合体为嵌合鼠； 更进一步优选地，所述的嵌合鼠患有白内障疾病。本发明的第二方面涉及一种多潜能细胞，其是保藏号为CCTCCC201217、于2012年 2月15日保藏在地址是中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心的遗传性BALB/ceat/eat白内障小鼠的胚胎干细胞系。本发明的第三方面涉及一种嵌合鼠，由前述任一项的多潜能细胞与受体胚胎聚合后，培育获得。本发明的第四方面涉及一种多潜能细胞群，其包含前述任一项所述的多潜能细胞；优选地，其包含至少95%的所述的多潜能细胞。本发明的第五方面涉及一种分离多潜能细胞的方法，该方法从白内障疾病模型小鼠中分离获得多潜能细胞，优选地，从白内障疾病模型小鼠的早期胚胎中分离获得多潜能细胞。优选地，该方法包括以下步骤(I)使白内障小鼠母鼠与白内障小鼠公鼠交配，使母鼠受孕；(2)从受孕母鼠的子宫中获得囊胚；(3)从步骤⑵的囊胚获得内细胞团(ICM, inner cell mass :哺乳类囊胚中位于囊胚腔一侧的具有全能性的细胞团)；(4)任选地，从步骤(3)的内细胞团分选一个或多个细胞培养成集落；优选将内细胞团用胰酶消化后传代培养；(5)任选地，从步骤⑷的集落获得单克隆，进行传代培养。在一个具体的实施例中，所述的方法包括以下步骤选择6周龄以上性成熟的所述的白内障小鼠母鼠与成年公鼠交配使母鼠受孕；从受孕的白内障疾病模型小鼠子宫中冲取囊胚，用培养液培养得到内细胞团，解离出内细胞团，消化成单细胞后，传代培养，获得所述的能无限传代的多潜能细胞；优选地，所述的受孕的白内障疾病模型小鼠为受孕3. 5dpc的小鼠；优选地，所述的培养液为添加了 GSK3抑制剂CHIR99021和蛋白激酶抑制剂 PD0325901 的 N2B27 培养液；优选地，所述的培养液中GSK3抑制剂CHIR99021的终浓度为I 5 μ M，优选为2 4 μ Μ，更优选为3 μ Μ，蛋白激酶抑制剂Η)0325901的终浓度为O. 5 3. 5 μ M，优选为I 3 μ Μ，更优选为2 μ M ;优选地，消化时使用的是胰蛋白酶，浓度为0. 25%，37°C消化I 2min。本发明的第六方面涉及前述任一项的多潜能细胞或嵌合鼠或多潜能细胞群的使用方法，其包括在药物筛选、白内障机理研究、基因治疗细胞、动物模型中在合适的条件下使用所述多潜能细胞或嵌合鼠或多潜能细胞群；优选地，所述使用包括与药物接触、作为对照以及基因导入靶点。优选地，所述的药物为治疗白内障疾病的药物。本发明的第七方面涉及前述任一项的多潜能细胞或嵌合鼠或多潜能细胞群，用于筛选药物的用途，或者用于制备基因治疗药物的用途；优选地，所述的药物为治疗白内障疾病的药物。综上所述，本发明涉及的白内障小鼠多潜能细胞，具有胚胎干细胞特性，其碱性磷酸酶表达呈阳性；胚胎时期细胞表面特异性抗原SSEA-I表达阳性；表达0ct4、Nanog、和 Sox2等多种与多潜能相关的基因；特别的具有产生含有三个原胚层(外胚层、内胚层和中胚层)分化细胞的畸胎瘤的能力以及助于形成嵌合体的能力。在一个具体的实施方案中，所述的来自遗传性白内障小鼠的多潜能细胞，其主要特征是(I)同时表达碱性磷酸酶、SSEAl 以及 0ct4、Nanog、Sox2、Eras、Esgl、Fgf4、Utfl、 Cripto、Rexl、Gdf3等多潜能相关的基因，这些基因的表达证明该细胞株处于未分化状态；(2)可以在无血清无饲养层的培养液内培养；(3)可在体外长期传代和扩增；(4)自然分化形成拟胚体后,外胚层Nestin (+),原始外胚层GATA4(+)、Soxl7 (+), 内胚层标志基因AFP (+)，中胚层Flkl (+)；(5)注入裸鼠后形成畸胎瘤，畸胎瘤具有外胚层、中胚层和内胚层的所有分化细胞；(6)能形成嵌合鼠，且嵌合鼠患有白内障疾病。本发明提供了体外培养白内障动物模型胚胎干细胞的思路，所获得的多潜能细胞可用于白内障发病机制的研究、治疗白内障药物的筛选及提供基因治疗手段的研究载体， 为白内障疾病研究提供了的新的材料和方法。
图I是白内障小鼠内细胞团从透明带中孵化出来贴壁后的形态。图2是白内障小鼠ES经多次传代后的细胞形态。图3是白内障小鼠ES碱性磷酸酶活性检测结果。图4是Reverse Transcription-PCR检测白内障小鼠ES未分化marker表达情况的电泳图，从左到右泳道依次是阳性对照46CES细胞、129小鼠尾巴成纤维细胞、白内障小鼠ES细胞株4、白内障小鼠ES细胞株5、白内障小鼠ES细胞株6。图5是免疫荧光染色检测白内障小鼠ES干细胞相关marker表达情况，其中A为 SSEAl染色结果，B为0ct4染色结果，C为Nanog染色结果，D为Sox2染色结果。图6是Reverse Transcription-PCR检测白内障小鼠ES在体外向三个胚层的分化潜能，从左到右泳道依次是白内障小鼠ES细胞，5天的拟胚体，10天后自然分化的拟胚体。图7是白内障小鼠ES畸胎瘤形成情况，其中A为神经组织(外胚层)，B为肌肉组织(中胚层)，C为上皮组织(内胚层)。
图8是白内障小鼠ES参与形成的具有白内障疾病的嵌合鼠。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。以下实施例中，用到的培养基有胚胎干细胞培养基为2i培养基，具体组成为49% DMEM/F12 (购自GIBCO公司)， 49 % Neurobasal Medium (购自 GIBCO 公司)，O. 5 X L-谷氨酰胺(购自 GIBCO 公司)、 IX 巯基乙醇(购自GIBCO公司)、1ΧΝ2(购自GIBCO公司)、1ΧΒ27(购自GIBCO公司)、3 μ M CHIR99021 (购自 Stemgent 公司)、2 μ M PD0325901 (购自 Stemgent 公司)。此培养基用于获取并维持源于白内障小鼠的ES细胞。拟胚体培养基具体成分为79% DMEM/F12(购自GIBCO公司)，20% FBS(购自 PAA公司)，1%非必须氨基酸(购自GIBCO公司)，O. 5 X L-谷氨酰胺(购自GIBCO公司)， IX β-巯基乙醇(购自GIBCO公司)。实施例I、白内障小鼠囊胚的获取取6-8周龄的遗传性BALB/ceat/eat白内障母鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)，于14:00左右，腹腔注射PMSG(孕马血清促性腺激素，Pregnant Mare Serum Gonadotrophin) (10IU/ 只),48h 后注射 HCG(人绒毛膜促性腺激素，human chorionic gonadotrophin) (10IU/只)，挑选有交配经验的同品系白内障公鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)，按公鼠母鼠2 I比例合笼。次日早上见栓记为怀孕0.5d。见栓第4 天(怀孕3. 5d)，断颈处死母鼠，75%乙醇消毒；在无菌环境下暴露子宫，用镊子取出子宫置于无菌培养皿中。用Iml无菌注射器吸入含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum, PAA公司)的DMEM/F12(GIBC0公司)作为冲卵液，从子宫角端进针进行冲胚(具体步骤请参见 安德拉斯，玛丽娜，克里斯蒂娜，等.小鼠胚胎实验操作手册[M].孙青原，陈大元主译.北京化学工业出版社，2005.)。在立体解剖显微镜下寻找处于囊胚期的胚胎，用取卵针(商购，也可自制，只要针口孔径大小较胚胎大小稍大，可吸取胚胎即可)收集。在冲胚前一天,将经丝裂霉素C灭活的MEF (mouse embryof ibroblast,小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养物，第3代)以300个细胞/孔铺在96孔培养板中制备饲养细胞。将收集的囊胚期胚胎置于上述饲养细胞上，每孔I个囊胚，加入100微升添加了 GSK3抑制剂CHIR99021 (Stemgent公司，终浓度3 μ M)和蛋白激酶抑制剂 PD0325901 (Stemgent公司，终浓度2 μ Μ)的Ν2Β27培养液，置于37°C>5% C02、饱和湿度的细胞培养箱中培养，2-3天更换一次培养液。实施例2、内细胞团自然孵化及胚胎干细胞的培养实施例I中获得的囊胚期胚胎在所述的培养条件下培养I 2天后，内细胞团 (ICM)开始向透明带外孵出，继续培养2天后，孵出的内细胞团(ICM)呈克隆团状贴壁生长(参见图I)。吸去培养液，用0.25%的胰酶37°C消化I 2min，添加FBS (胎牛血清) 终止消化，用移液器轻轻吹打，使内细胞团解离成单个或小细胞团，IOOOrpm离心2min，弃上清，用添加了 GSK3抑制剂CHIR99021 (Stemgent公司，终浓度3 μ M)和蛋白激酶抑制剂 PD0325901 (Stemgent公司，终浓度2 μ Μ)的Ν2Β27培养液重悬，传代至铺有MEF饲养细胞的 96孔板中(原一个96孔的细胞，消化后仍然直接传到一个96孔中培养)，37°C、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。按上述方法胰酶消化传代培养2 3代，此时细胞增殖很快，之后每三天即可传一代(此时传代比率视实际克隆数而定)。传代后的细胞形态镜检结果如图2所示，由图可以看出，获得的细胞生长形态类似胚胎干细胞，呈克隆状生长，边缘清晰，表面平滑，结构致密。实施例3、胚胎干细胞特性检测3. I碱性磷酸酶表达取实施例2中获得的干细胞，用4%多聚甲醛(PAF)固定lOmin，用PBS洗3次，每次所用时间分别为5min、10min、15min,尽可能的去除多聚甲醒。加入O. 5ml α -萘酹Tris base Fast red TR = I : 4 : 5混合染液，室温孵育5 lOmin，吸去染液，用PBS漂洗终止反应。显微镜检测，结果如图3所示。由图3可以看出，细胞被染成红色，而红色表示具有碱性磷酸酶活性，从而说明， 实施例2获得的细胞具有很强的碱性磷酸酶活性，进一步的说，培养的细胞具有胚胎干细胞特性，即表达碱性磷酸酶。3. 2未分化状态检测3.2. IReverse Transcription-PCR方法检测分析实施例2获得的细胞未分化基因表达水平由于未分化的细胞会特异性表达以下基因，包括0ct4、Nanog、Sox2、Eras、Esgl、 Fgf4、UtfI、Cripto、Rexl、Gdf3，所以可以通过检测这些基因的表达情况得知实施例2中所获得的细胞的未分化状态。未分化marker引物序列设计如表I所示，其中以Eif4g2作为内参,引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成(其中F表不正向引物，R表不反向引物)。表I
权利要求
1.一种多潜能细胞，其分离自白内障疾病模型小鼠，优选地，所述的模型小鼠为遗传性白内障疾病模型小鼠，优选地，所述的遗传性白内障疾病模型小鼠选自 a :遗传性BALB/cGat/Gat白内障小鼠； b Philly 小鼠； c =Crybal基因突变小鼠； d:显性白内障小鼠Hif;进一步优选为遗传性BALB/ceat/eat白内障小鼠；优选地，所述的多潜能细胞为胚胎干细胞。
2.权利要求I的多潜能细胞，其分离自白内障疾病模型小鼠的早期胚胎。
3.权利要求I的多潜能细胞，其表达碱性磷酸酶、SSEAl基因和/或选自0ct4、Nanog、 Sox2、Eras、Esgl、Fgf4、Utfl、Cripto、Rexl、Gdf3 中的一种或多种基因；优选地，该多潜能细胞表达0ct4、Nanog和Sox2 ；更优选地，该多潜能细胞表达0ct4、Nanog、Sox2和Eras ；进一步优选地，该多潜能细胞同时表达碱性磷酸酶、SSEAl以及选自0ct4、Nanog、 Sox2、Eras、Esgl、Fgf4、Utf I、Cripto、Rexl、Gdf3 中的一种或多种基因；更进一步优选地，该多潜能细胞同时表达碱性磷酸酶、SSEA1、0ct4、Nanog和Sox2。
4.权利要求I的多潜能细胞，其可形成畸胎瘤或畸胎癌，优选地，所形成的畸胎瘤或畸胎癌中含有源于外胚层、中胚层和内胚层三个胚层的分化细胞。
5.权利要求I的多潜能细胞，其在培养基中可作为单个细胞生长和/或增殖。
6.权利要求I的多潜能细胞，其可形成嵌合体；优选地，所述嵌合体中的所有细胞与所述多潜能细胞源于同一亲本；进一步优选地，所述的嵌合体为嵌合鼠；更进一步优选地，所述的嵌合鼠患有白内障疾病。
7.一种多潜能细胞，其是保藏号为CCTCC C201217、于2012年2月15日保藏在地址是中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心的胚胎干细胞。
8.一种嵌合鼠，由权利要求I至7任一项的多潜能细胞与受体胚胎聚合后，培育获得。
9.一种多潜能细胞群，其包含权利要求I至7任一项所述的多潜能细胞；优选地，其包含至少95%的权利要求I至7任一项所述的多潜能细胞。
10.一种分离多潜能细胞的方法，该方法从白内障疾病模型小鼠中分离获得多潜能细胞，优选地，从白内障疾病模型小鼠的早期胚胎中分离获得多潜能细胞；优选地，该方法包括以下步骤(1)使白内障小鼠母鼠与白内障小鼠公鼠交配，使母鼠受孕；(2)从受孕母鼠的子宫中获得囊胚；(3)从步骤(2)的囊胚获得内细胞团；(4)任选地，从步骤(3)的内细胞团分选一个或多个细胞培养成集落；优选将内细胞团用胰酶消化后传代培养；(5)任选地，从步骤(4)的集落获得单克隆，进行传代培养。
11.权利要求10的方法，包括以下步骤选择6周龄以上性成熟的权利要求I所述的白内障小鼠母鼠与成年公鼠交配使母鼠受孕；从受孕的白内障疾病模型小鼠子宫中冲取囊胚，用培养液培养得到内细胞团，解离出内细胞团，消化成单细胞后，传代培养，获得所述的能无限传代的多潜能细胞；优选地，所述的受孕的白内障疾病模型小鼠为受孕3. 5dpc的小鼠；优选地，所述的培养液为添加了 GSK3抑制剂CHIR99021和蛋白激酶抑制剂Η)0325901 的Ν2Β27培养液；优选地，所述的培养液中GSK3抑制剂CHIR99021的终浓度为I 5 μ Μ，优选为2 4 μ Μ，更优选为3 μ Μ，蛋白激酶抑制剂Η)0325901的终浓度为O. 5 3. 5 μ M，优选为I 3 μ Μ，更优选为2 μ M ;优选地，消化时使用的是胰蛋白酶，浓度为0. 25%，37°C消化I 2min。
12.权利要求I至7任一项的多潜能细胞或权利要求8的嵌合鼠或权利要求9的多潜能细胞群的使用方法，其包括在药物筛选、白内障机理研究、基因治疗细胞、动物模型中在合适的条件下使用所述多潜能细胞或嵌合鼠或多潜能细胞群；优选地，所述使用包括与药物接触、作为对照以及基因导入靶点；优选地，所述的药物为治疗白内障疾病的药物。
13.权利要求I至7任一项的多潜能细胞或权利要求8的嵌合鼠或权利要求9的多潜能细胞群，用于筛选药物的用途，或者用于制备基因治疗药物的用途；优选地，所述的药物为治疗白内障疾病的药物。
全文摘要
本发明涉及一种源于遗传性白内障小鼠的多潜能细胞，本发明的多潜能细胞来源于白内障疾病模型小鼠，经检测确定具有胚胎干细胞特性。本发明可用于白内障发病机制的研究、治疗白内障药物的筛选及提供基因治疗手段的研究载体，为白内障疾病研究提供了的新的材料和方法。
文档编号A61K48/00GK102586174SQ201210044230
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月24日 优先权日2012年2月24日
发明者刘韬, 周秀梅, 张丽青, 李林芳, 钱其军 申请人:中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院