专利名称：一种猪主动脉真空冻干脱细胞基质及其制备方法和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及组织工程领域，具体地说，是一种猪主动脉真空冻干脱细胞基质及其制备方法和应用。
背景技术：
我国每年新生15万的先天性心脏病患儿。而先天性心脏病手术中需要大量血管或生物补片替代物。初步估算仅国内医疗市场其前景每年约为上亿元。而临床常用的人工血管和冷冻保存同种血管无生长性且容易引起狭窄钙化多须再次手术治疗，给患者带来莫大痛苦的同时造成大量医疗资源的浪费。而且常用人工血管或生物补片多为进口，价格极其昂贵。20世纪80年代以来，随着生物医学工程技术的发展，各种代血管移植材料被用于心血管疾病外科治疗中。人们长期以来一直在寻找血管的最佳替代品，包括人工材料、生物材料以及复合材料等，但存在排斥、血栓、内皮细胞增生、破裂、钙化等缺点，其治疗效果仍受到很大限制。故人工代血管移植体仍不能完全取代人同种冷冻保存血管的地位和作用。中国专利文献CN101327338A公开了一种多孔的保留有生物活性因子的膀胱无细胞基质及制备方法，取猪、兔、狗或牛的膀胱，经消化液，低渗缓冲液、含表面活性剂的高渗缓冲液、含核酸酶的缓冲液和去离子水等处理后，再经冷冻、冻干和灭菌后得到无菌的膀胱无细胞基质。中国专利文献CN101474426A公开了一种脱除血管组织内细胞的血管基质及其制备方法，提供了一种能够脱除血管组织内的细胞成分并最大程度保护脱细胞基质的结构完整性，包括脱细胞、去除去垢剂和进行酶处理。中国专利文献CN2860403Y公开了一种生物型人工血管，由经固定剂交联固定和去抗原处理过的动物血管所形成的基材，以及键合在基材内表面上的含有抗凝血组分的表面层组成。但是关于一种猪主动脉真空冻干脱细胞基质及其制备方法和应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种猪主动脉真空冻干脱细胞基质。本发明的再一的目的是，提供一种猪主动脉真空冻干脱细胞基质的制备方法。本发明的另一的目的是，提供一种猪主动脉真空冻干脱细胞基质的应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种猪主动脉真空冻干脱细胞基质， 所述的猪主动脉真空冻干脱细胞基质的制备方法包括以下步骤(1)冻干预处理采用预冻速率lK/min，最终温度-42. 9°C对猪主动脉血管进行冻干预处理；(2)脱细胞化冻干血管用O. 25%胰蛋白酶PBS溶液作用，然后O. 5%Tritox X-100 PBS溶液室温下振荡，PBS溶液振荡冲洗；(3)采用步骤(I)的条件再次真空冻干所述的基质，常温保存。所述的猪主动脉真空冻干脱细胞基质的制备方法包括以下步骤(1)冻干预处理采用预冻速率lK/min，最终温度-42. 9°C对猪主动脉血管进行冻干预处理；(2)脱细胞化冻干血管用含EDTA O. 04%的O. 25%胰蛋白酶PBS溶液在37 °C，5%C02培养箱中作用12小时，然后O. 5%Tritox X-100 PBS溶液室温下振荡4小时，PBS溶液振荡冲洗3次，每次30 分钟；(3)采用步骤(I)的条件再次真空冻干所述的基质，常温保存。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是一种猪主动脉真空冻干脱细胞基质的制备方法，所述的猪主动脉真空冻干脱细胞基质的制备方法如下(1)冻干预处理采用预冻速率 κ/min，最终温度-42. 9°C对猪主动脉血管进行冻干预处理；(2)脱细胞化冻干血管用O. 25%胰蛋白酶PBS溶液作用，然后O. 5%Tritox X-100 PBS溶液室温下振荡，PBS溶液振荡冲洗；(3)采用步骤(I)的条件再次真空冻干所述的基质，常温保存。所述的制备方法包括以下步骤(1)冻干预处理采用预冻速率lK/min，最终温度-42. 9°C对猪主动脉血管进行冻干预处理；(2)脱细胞化冻干血管用含EDTA O. 04%的
O.25%胰蛋白酶PBS溶液在37°C，5%C02培养箱中作用12小时，然后O. 5%Tritox X-100 PBS 溶液室温下振荡4小时，PBS溶液振荡冲洗3次，每次30分钟；(3)采用步骤(I)的条件再次真空冻干所述的基质，常温保存。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是所述的猪主动脉真空冻干脱细胞基质在制备生物血管中的应用。本发明优点在于
1、本发明以猪主动脉作为研究对象，通过优化制备条件，制得具有合适孔隙率、力学性能和免疫原性的冻干脱细胞血管，通过动物在体实验证明立体构建血管临床血管移植的可行性，为进一步应用于临床提供了实验依据；
2、本发明的制备方法成本极其低廉，无疑会节省数亿元的宝贵的医疗资源；
3、为组织工程主动脉血管的临床应用及脱细胞血管的优化研发提供了实验依据和指
针。
附图I是血管预冻时温度变化曲线。
附图2是不同降温速率下血管孔隙率分析。
附图3是不同降温速率下血管灰度值分析。
附图4是不同预冻速率下血管α值变化曲线。
附图5是猪主动脉血管冻干前后免疫原性的变化。
附图6是冻干复水血管的幼猪在体移植实验。
附图7是冻干预处理提高猪主动脉血管脱细胞效果。
附图8是冻干预处理的脱细胞猪主动脉血管电镜检测照片。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。
实施例II.血管预冻最低温度的实验测量
血管冷冻干燥保存工艺的探索是进行制备研究亟待解决的关键问题。本发明采用升降式微机控制程序降温仪对血管以固定速率降温，主要是为了考察不同的预冻速率对血管冻干保存品质的影响，旨在探索得到一个适合血管冻干保存的工艺控制参数和流程。
目的是为了测量血管在冻干机中预冻时所能达到的最低温度，测量得到的这个温度就是在使用微机控制程序降温仪给血管预冻时设置的最终温度。由实验可知干燥过程中血管的温度最低为-42. 9°C，见图1，图I是血管预冻时温度变化曲线。2.不同预冻速率下血管孔隙率、灰度变化图。见图2和图3，图2、图3分别为不同预冻速率下整个冻干过程的孔隙率、灰度变化图。预冻速率为O. 5K/min, lK/min, 2K/min的血管冻干前后孔隙率的变化率分别为11. 9%， 16.6%, 29. 7 % ;平均灰度值的变化率分别为2. 27 %，3. 64 %，6. 36 %。降温速率越大，变化得越明显。3.不同预冻速率对血管力学性能的影响。血管力学性能的测定。动脉血管使用质构仪对其进行拉伸试验，取宽度为7mm的方块进行穿刺试验。试验中质构仪负载采用500N的力，以lmm/min的速度对样品进行穿刺和拉伸。并将真空冷冻干燥后的血管在生理盐水中浸泡2小时，充分复水浙干后，取相同条件的动脉血管进行拉伸试验和穿刺试验。对比分析不同的预冻速率冷冻干燥前后血管力学性能的变化。见图4，图4是不同预冻速率下血管的α值变化曲线。预冻速率为lK/min时穿刺应力值和周向拉伸应力值增加幅度分别为20. 10%和32. 03%，轴向拉伸应力减小幅度最小， 为-19. 84%。分析后认为预冻速率为lK/min时具有最佳孔隙、孔隙率及力学性能表现。结果表明通过控制冷冻干燥时的降温速率，可以控制血管内部的孔隙大小和孔隙率，同时也能保持血管的较好的力学性能。4.猪主动脉血管冻干前后免疫原性的变化。见图5，图5是猪主动脉血管冻干前后免疫原性的变化。间接免疫荧光法分别检测冻干血管与新鲜血管中MHC I、II类抗原表达的变化。其中A :新鲜猪主动脉，冻干处理前大体观；B :免疫荧光法检测新鲜血管MHC I类抗原情况；C :免疫荧光法检测新鲜血管MHC
II类抗原情况；D :新鲜猪主动脉，冻干处理后大体观；E :免疫荧光法检测冻干血管中MHC I类抗原情况；F :免疫荧光法检测冻干血管中MHC II类抗原情况。结果显示血管冻干后
MHC- I、II类抗原水平明显下降。5.主动脉移植手术和移植后定期血管介入造影观察血管生长情况
气静复合麻醉下，将冻干脱细胞处理的血管植入幼猪降主动脉处。沿左侧第四肋间进胸，结扎1-2根肋间动脉，阻断降主动脉近心端与远心端，切除一段降主动脉，植入2cm左右的冻干辐射复水动脉血管，连续缝合两个吻合口，排气，开放主动脉阻断钳。止血，冲洗胸腔，鼓肺，关胸。手术的成功是后期研究的关键。移植手术后定期多次进行血管介入造影观察血管生长情况。为了验证冻干处理后的血管的力学强度是否能够满足应用要求，我们将冻干的血管移植到猪体内，替代部分主动脉，结果发现猪可以长期存活，表明冻干处理并不影响血管的应用。证实冻干处理后的血管虽然力学性能有所降低但能承受长期生活考验，幼猪均长期存活7个月以上。虽然冻干处理后血管免疫原性有所下降但仍有钙化趋势，还要结合脱细胞化处理进一步降低其免疫原性。见图6，图6是冻干复水血管的幼猪在体移植实验。其中A :冷冻干燥的猪主动脉经过重新复水处理；B :冻干处理的血管移植修复缺损；C :冻干处理后的血管移植后猪存活良好；D :三个月时，行导管检测，移植处依然保持畅通(箭头所指为移植血管处)。6.血管经冻干预处理后用低浓度去垢剂复水同时进行脱细胞化
冻干血管用O. 25%胰蛋白酶PBS溶液(含EDTA O. 04%)在37°C，5%C02培养箱中作用12 小时，然后O. 5%Tritox X-100 PBS溶液室温下振荡4小时，PBS溶液振荡冲洗3次，每次30 分钟。冻干处理增加血管孔隙，提高血管通透性的同时，也更有利于脱细胞溶液进入到管壁内发挥脱细胞作用，与未经过冻存村里的血管相比，冻存后的血管脱细胞效率大大提高，脱细胞效果非常理想，即使管壁内部的细胞成份也完全能够脱除干净。请参照附图7， 附图7是冻干预处理提高猪主动脉血管脱细胞效果。其中A :未经冻干处理的猪主动脉脱细胞前HE染色；B :经冻干处理的猪主动脉脱细胞前HE染色；C :未经冻干处理的猪主动脉经过脱细胞后HE染色，动脉管壁内部依然残留有部分细胞；D :经冻干处理的猪主动脉经过脱细胞后HE染色，动脉管壁内部未见细胞残留；E :未经冻干处理的猪主动脉经过脱细胞后 Hoechst染色，动脉管壁内部依然残留有部分细胞；F :经冻干处理的猪主动脉经过脱细胞后Hoechst染色，动脉管壁内部未见细胞残留；G :DNA定量检测表明血管经过冻干处理后再脱细胞，残留DNA含量明显减少。7.新鲜血管、冻干血管与冻干脱细胞化后血管电镜照片
见图8，图8是冻干预处理的脱细胞猪主动脉血管电镜检测照片。其中A :新鲜血管透射电镜显示大量细胞存在；B :经过冻干后，透射电镜显示依然有细胞存在，但是已经死亡； C :冻干血管经过O. 25%胰蛋白酶处理12小时后，透射电镜显示血管内部已无细胞存在；D 新鲜血管扫描电镜显示大量细胞存在；E:经过冻干后，扫描电镜显示依然有细胞存在，但是已经死亡；F :冻干血管经过O. 25%胰蛋白酶处理12小时候后，扫描电镜显示血管内部已无细胞存在。电镜检测结果显示，经过冻干后，透射电镜显示依然有细胞存在，但是已经死亡； 而冻干血管经过O. 25%胰蛋白酶处理12小时后，透射电镜和扫描电镜都显示血管内部已无细胞存在。实施例2猪主动脉真空冻干脱细胞基质的制备方法
1.冻干预处理采用预冻速率lK/min，最终温度-42.9°C对猪主动脉血管进行冻干预处理；
2.脱细胞化采用低浓度去垢剂复水基质同时行脱细胞处理，冻干血管用O.25%胰蛋白酶PBS溶液(含EDTA O. 04%)在37°C，5%C02培养箱中作用12小时，然后O. 5%Tritox X-100 PBS溶液室温下振荡4小时，PBS溶液振荡冲洗3次，每次30分钟；
3.采用步骤I的条件再次真空冻干该基质，常温保存。本发明以猪主动脉作为研究对象，以立体构建血管临床移植为远期目标而对猪主动脉血管进行真空冷冻干燥脱细胞再冻干并细胞悬液序贯复水处理。通过真空冻干脱细胞方法处理猪主动脉血管，旨在从传热传质、低温生物、细胞学、分子生物学等多种研究领域探讨脱细胞动脉基质制备、保存及移植后修复机制。通过优化制备条件，制得具有合适孔隙率及力学性能的冻干血管，联合酶、化学除垢剂进一步降低血管的免疫原性，在实验中研究血管冻干脱细胞过程的相关机理及立体构建的操作流程，通过动物在体实验研究立体构建血管将来临床血管移植的可行性，为进一步应用于临床提供实验依据。方法成本极其低廉，无疑会节省数亿元的宝贵的医疗资源。冻干脱细胞猪主动脉血管基质制备流程和该基质体外立体构建生物血管流程的制定，可为组织工程主动脉血管的临床应用及脱细胞血管的优化研发提供了实验依据和指针。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种猪主动脉真空冻干脱细胞基质，其特征在于，所述的猪主动脉真空冻干脱细胞基质的制备方法包括以下步骤(I)冻干预处理采用预冻速率 κ/min，最终温度-42. 9°C 对猪主动脉血管进行冻干预处理；(2)脱细胞化冻干血管用O. 25%胰蛋白酶PBS溶液作用，然后O. 5%Tritox X-100 PBS溶液室温下振荡，PBS溶液振荡冲洗；(3)采用步骤(I)的条件再次真空冻干所述的基质，常温保存。
2.根据权利要求I所述的猪主动脉真空冻干脱细胞基质，其特征在于，所述的猪主动脉真空冻干脱细胞基质的制备方法包括以下步骤(1)冻干预处理采用预冻速率lK/min， 最终温度-42. 9°C对猪主动脉血管进行冻干预处理；(2)脱细胞化冻干血管用含EDTAO.04%的O. 25%胰蛋白酶PBS溶液在37°C，5%C02培养箱中作用12小时，然后O. 5%Tritox X-100 PBS溶液室温下振荡4小时，PBS溶液振荡冲洗3次，每次30分钟；(3)采用步骤(I) 的条件再次真空冻干所述的基质，常温保存。
3.—种猪主动脉真空冻干脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述的猪主动脉真空冻干脱细胞基质的制备方法如下(1)冻干预处理采用预冻速率lK/min，最终温度-42. 9°C对猪主动脉血管进行冻干预处理；(2)脱细胞化冻干血管用O. 25%胰蛋白酶 PBS溶液作用，然后O. 5%Tritox X-100 PBS溶液室温下振荡，PBS溶液振荡冲洗；(3)采用步骤(I)的条件再次真空冻干所述的基质，常温保存。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤(1) 冻干预处理采用预冻速率lK/min，最终温度-42. 9°C对猪主动脉血管进行冻干预处理；(2)脱细胞化冻干血管用含EDTA O. 04%的O. 25%胰蛋白酶PBS溶液在37°C，5%C02培养箱中作用12小时，然后O. 5%Tritox X-100 PBS溶液室温下振荡4小时，PBS溶液振荡冲洗3 次，每次30分钟；(3)采用步骤(I)的条件再次真空冻干所述的基质，常温保存。
5.根据权利要求I或2任一所述的猪主动脉真空冻干脱细胞基质在制备生物血管中的应用。
全文摘要
一种猪主动脉真空冻干脱细胞基质及其制备方法和应用。本发明涉及一种猪主动脉真空冻干脱细胞基质，所述的猪主动脉真空冻干脱细胞基质的制备方法包括采用最佳预冻速率真空冻干猪主动脉血管得到最佳孔隙，用低浓度去垢剂复水基质同时行脱细胞处理，再次真空冻干该基质常温保存。本发明优点在于以猪主动脉作为研究对象，通过优化制备条件，制得具有合适孔隙率、力学性能和免疫原性的冻干脱细胞血管，通过动物在体实验证明立体构建血管临床血管移植的可行性，为进一步应用于临床提供了实验依据；制备方法成本极其低廉，无疑会节省数亿元的宝贵的医疗资源；为组织工程主动脉血管的临床应用及脱细胞血管的优化研发提供了实验依据和指针。
文档编号A61L27/36GK102600508SQ201210031969
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月14日 优先权日2012年2月14日
发明者刘萌芳, 刘锦纷, 孙锟, 张海波, 徐志伟, 曹清, 殷猛, 殷秋明, 范新东, 董凌燕, 郑景浩, 陶乐仁 申请人:上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心