专利名称：肺癌标志物sbp-1及其用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及分子生物学和肿瘤药物领域。具体地说，本发明涉及一种肺癌标志物SBP-1在肺癌诊断中的用途，及SBP-1作为标志物用于肺癌的检测方法。
背景技术：
研究报道，肺癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，也是全球发病率和死亡率增加最快的肿瘤。据统计，每年约有120万患者被诊断为肺癌，110万人死于肺癌。肺癌依据其组织病理学可分为两大类:小细胞肺癌和非小细胞肺癌。非小细胞肺癌又包含鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等。
迄今为止，全球的肺癌筛查方案尚不成熟。因此，早期筛查和诊断已经成为肺癌防治急需解决的重大科学问题。肿瘤标志物的发现和合理应用是肿瘤早期发现、早期诊断的前提。然而，目前对有关肺癌的发病机制和特性的认识仍然不足，因此，研究者认为，直接从蛋白质整体水平入手研究肺癌的发病机制将有可能寻找出更合适的用于肺癌诊断的分子标志物，这将为肺癌的诊断预防和治疗提供关键依据。
现有的研究中表明，硒是一种具有抗癌效应的元素，它以无机亚硒酸盐或有机硒酸盐的形式存在于植物和其他有机食物中。人类硒基蛋白质组包含35种含硒蛋白质，它们具有广泛的生理功能。其中，(selenium binding protein, SBP-1)是一种细胞溶质蛋白，由Medina等于1990年首次从老鼠的肝脏分离纯化出来，该SBP-1为硒元素在体内的蛋白结合物，位于染色体lq21-22，分子量为56KD。因人类SBP与老鼠SP56基因为同系物，所以又称为hSP56。目前已证实SBP-1在正常肝脏、肺、肾脏、结肠、前列腺、以及胰腺组织中高表达，在胸腺、睾丸、外周血细胞和脑组织中几乎检测不到。
迄今，尚未见有关有效地早期筛查和诊断肺癌的可供临床应用的检测试剂，尤其是以SBP-1作为标志物用于肺癌的检测试剂及方法，这将为深入地研究和大规模验证SBP-1与肺癌的相关性，对癌症进行诊断以及为个体患者提供辅助治疗方案具有重要意义。发明内容
本发明的目的是提供SBP-1的新用途。本发明提供了 SBP-1作为肺癌标志物的用途，以及以SBP-1为靶标筛选抑制肺癌细胞侵袭的药物的应用，为肺癌的诊断和治疗提供参考依据。
本发明提供了 SBP-1作为肺癌标志物的用途，主要针对小细胞肺癌和非小细胞肺癌；尤其是针对非小细胞肺癌的鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等。
相应的，本发明提供了一种肺癌诊断试剂盒，该试剂盒含有SBP-1。较好的，该试剂盒，主要针对小细胞肺癌和非小细胞肺癌的检测；尤其是针对非小细胞肺癌的鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等的检测。
通常，试剂盒中含有标准剂量的SBP-1蛋白对照品，操作手册，稀释液或者缓冲液坐寸ο
本发明中，检测时，通常采用相关抗体等检测样本中SBP-1含量。
本发明中，通过SBP-1抗体来检测SBP-1的存在。
本发明采用比较蛋白质组学方法对肺癌细胞系/组织和正常对照细胞/组织的蛋白质表达谱进行比较分析，质谱鉴定其中部分差异蛋白质点。SBP-1蛋白为其中一个差异点，即其在癌细胞中比正常细胞高表达，且可明显区分。
采用Real-time PCR (以下简称RT-PCR)和免疫组化的技术，分别检测肺癌患者及其配对的正常组织中的SBP-1的mRNA和蛋白表达表达水平，发现SBP-1在肺癌组织中表达明显高于其配对的正常组织。该发现与比较蛋白质组的实验结果一致，表明SBP-1能够作为一种肺癌的诊断标志物。
具体检测时，可以先取待测样本，然后分析比较待测样本与正常对照中SBP-1的表达量。
为此，本发明提供了一种采用上述肺癌诊断试剂盒用于检测肺癌的方法，试剂盒中含有标准剂量的SBP-1蛋白对照品，稀释液或者缓冲液以及容器或液态芯片和标签等，其特征在于，该方法包括以下步骤:
(I)制备含有标准剂量的SBP-1蛋白对照品，稀释液或者缓冲液以及容器或液态芯片和标签的肺癌诊断试剂盒，所述的容器或液态芯片中分别设有:
a、SBP-1蛋白的特异性抗体；
b、PBS缓冲液ρΗ7.2-7.4，或0.0lmol柠檬酸钠缓冲液ρΗ6.0，或3% Η202溶液，或辣根酶检测试剂；
(2)制备重组蛋白，扩增 SBP-1的核苷酸序列，或用含有该核苷的重组表达载体转化或转导至合适的宿主细胞；
(3)在合适的培养基中培养宿主细胞；
(4)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质；
(5)纯化的SBP-1基因产物或者其具有抗原性的片段，注射于动物体内以诱导多克隆抗体制备的产生，同时特异性结合SBP-1蛋白的抗体，也可以是用于检测比较的抗体；
(6)免疫组化:脱蜡和水化:取5μπι的石蜡切片于二甲苯中30min，脱蜡；然后通过一系列不同级别的乙醇浸泡至水化；
(7)抗原修复:将切片置于IOmM pH6.0柠檬酸缓冲液(pH6.0)中，微波炉加热15min ；
(8)微波处理后的切片仍置于柠檬酸缓冲液中15min，然后用流动的水冲洗5min ；
(9)将切片放置于3% H202室温孵育15min,以消除内源性过氧化物酶的活性；
(10)切片置于1/500稀释的SBP-1兔多克隆抗体中温育60min ；
(11)然后通过免疫组化辣根酶系统的DAB ( 二氨基联苯胺)底物染色；
(12)切片用苏木精复染，然后通过一系列不同级别的乙醇浸泡至二甲苯，处理完的切片，镜检，实验中以水或缓冲液代替多克隆抗体做阴性对照，以SBP-1过表达的标本为阳性对照，最后完成检测。
本发明中，重组蛋白制备SBP-1的编码序列通过RT-PCR获得，引物分别是:S100A2-F:5-GGATCC GAACTTCTGCACAAGG-3 和 S100A2-R:5’ -CCGCTCGAGAAAGGCATCAACAGTC-3’，模板用的是肺癌组织cDNA。获得的DNA片段经限制性内切酶BamHI/XohI双酶切后插入经BamHI/Xohl双酶切的pGEX_4T_l中，构建重组质粒PGEX-4T-1-SBP-1。转化重组质粒到BL21 (DE3)中诱导表达，诱导表达的SBP-1重组蛋白经过纯化，并通过SDS-PAGE检测。
本发明中，多克隆抗体制备用生理盐水稀释SBP-1重组蛋白，然后与弗氏不完全佐剂进行等比混合，吹打至抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每次免疫前采血2ml (获得0.5-lml免疫前血清)，并进行ELISA和Western Blotting检测。如果检测为阴性或抗体效价较低，则需要再次免疫。共免疫4次，末次放血20-30ml，纯化混合血样，平均每次纯化可以获得100-150mg抗体，最后进行ELISA和WB等质量检测。
本发明的实验结果用独立实验的平均值和标准差表示，用双侧t检验来比较差异。P < 0.01认为具有统计学差异。所有数据采用SPSS V13.0软件或者具备类似统计功能的软件分析。实际检测时待测样本比正常对照中SBP-1的表达量高为阳性结果，结果显示=SBP-1蛋白为差异蛋白质点其中一个差异点，其在癌细胞中比正常细胞高表达，且可明显区分，表明SBP-1与肺癌肿瘤细胞有关。
从另一个角度说明，本发明的SBP-1可以作为筛选抑制肺癌细胞的药物的药靶。
本发明采用比较蛋白质组学方法对肺癌细胞系/组织和正常对照细胞/组织的蛋白质表达谱进行比较分析，质谱鉴定其中部分差异蛋白质点。SBP-1蛋白为其中一个差异点，即其在癌细胞中比正常细胞高表达，且可明显区分。由此，提供了本发明的肺癌标志物SBP-1在肺癌诊断中的用途，及SBP-1作为标志物用于肺癌的检测试剂及方法，将为深入地研究和大规模验证SBP-1与肺癌的相关性，对癌症进行诊断以及为个体患者提供辅助治疗方案具有重要意义。
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。
具体实施方式
实施例1
采用比较蛋白质组学方法对肺癌细胞系/组织和正常对照细胞/组织的蛋白质表达谱进行比较分析，质谱鉴定其中部分差异蛋白质点；SBP-1蛋白为其中一个差异点，即其在癌细胞中比正常细胞高表达，且可明显区分。采用Real-timePCR(以下简称RT-PCR)和免疫组化的技术，分别检测了肺癌患者及其配对的正常组织中的SBP-1的mRNA和蛋白表达表达水平，发现SBP-1在肺癌组织中表达明显高于其配对的正常组织。
本发明中，通过SBP-1抗体来检测SBP-1的存在。
基于此，提供一种肺癌诊断试剂盒，该试剂盒中含有标准剂量的SBP-1蛋白对照品，操作手册，稀释液或者缓冲液等。该试剂盒主要针对小细胞肺癌和非小细胞肺癌的检测；尤其是针对非小细胞肺癌的鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等的检测。
所涉及的SBP-1蛋白质的两种亚型(酸性型457和天然型460)，相对分子质量均为56KD，在人肺癌中近似等电点为6.3 6.6 ;另外，只存在于正常的肺脏组织中的SBP-1的相对分子质量相同的其他两种亚型中，带有更多的酸性基团，甚至有两个或三个磷酰基。
采用上述肺癌诊断试剂盒检测肺癌细胞:
I,通过重组DNA技术,表达或生产重组SBP-1蛋白，包括步骤:
(I)扩增SBP-1的核苷酸序列，或用含有该核苷的重组表达载体转化或转导至合适的宿主细胞；
(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
所述的纯化的SBP-1基因产物或者其具有抗原性的片段，可注射于动物体内以诱导多克隆抗体的产生，同时特异性结合SBP-1蛋白的抗体，也可以是商业化的抗体；
所涉及的免疫组化包括步骤:(I)脱蜡和水化:取5μπι的石蜡切片于二甲苯中30min，脱蜡；然后通过一系列不同级别的乙醇浸泡至水化。(2)抗原修复:将切片置于IOmMpH6.0朽1檬酸缓冲液(pH6.0)中，微波炉加热15min。(3)微波处理后的切片仍置于朽1檬酸缓冲液中15min，然后用流动的水冲洗5min。(4)将切片放置于3% H2O2室温孵育15min，以消除内源性过氧化物酶的活性。(5)切片置于1/500稀释的SBP-1兔多克隆抗体中温育60min。(6)然后通过免疫组化辣根酶系统的DAB (二氨基联苯胺)底物染色。(7)切片用苏木精复染，然后通过一系列不同级别的乙醇浸泡至二甲苯；处理完的切片，镜检；实验中以水或缓冲液代替多克隆抗体做阴性对照，以SBP-1过表达的标本为阳性对照。
2，制备重组蛋白
通过RT-PCR获得SBP-1的编码序列，引物分别为:S100A2-F:5，-GGATCCGAACTTCTGCACAAGG-3，和 S100A2-R:5，-CCGCTCGAGAAAGGCATCAACAGTC-3，，以肺癌组织cDNA为模板；获得的DNA片段经限制性内切酶BamHI/Xohl双酶切后插入经BamHI/XohI双酶切的pGEX-4T-l中，构建重组质粒pGEX-4T-l-SBP-l ;转化重组质粒到BL21 (DE3)中诱导表达，诱导表达的SBP-1重 组蛋白经过纯化，并通过SDS-PAGE检测。
所述的多克隆抗体的制备免疫用生理盐水稀释SBP-1重组蛋白，然后与弗氏不完全佐剂进行等比混合，吹打至抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每次免疫前采血2ml (获得0.5-lml免疫前血清)，并进行ELISA和Western Blotting检测。如果检测为阴性或抗体效价较低，则需要再次免疫。共免疫4次，末次放血20-30ml，纯化混合血样，平均每次纯化可以获得100-150mg抗体，最后进行ELISA和WB等质量检测。
所述的免疫组化收集肺癌患者及其配对的正常组织切片各20例，通过下述步骤:
(I)脱蜡和水化:取5μπι的石蜡切片于二甲苯中30min，脱蜡；然后通过一系列不同级别的乙醇浸泡至水化；(2)抗原修复:将切片置于IOmM pH6.0柠檬酸缓冲液(pH6.0)中，微波炉加热15min ;(3)微波处理后的切片仍置于柠檬酸缓冲液中15min，然后用流动的水冲洗5min ； (4)将切片放置于3% H2O2室温孵育15min，以消除内源性过氧化物酶的活性；(5)切片置于1/500稀释的SBP-1兔多克隆抗体中温育60min ； (6)然后通过免疫组化辣根酶系统的DAB(二氨基联苯胺)底物染色；(7)切片用苏木精复染，然后通过不同级别的乙醇浸泡至二甲苯；处理切片，镜检。
实验中以水或缓冲液代替多克隆抗体做阴性对照，以SBP-1过表达的标本为阳性对照；结果显示，肺癌患者中16例均有不同程度高表达，而正常组织中未见高表达，结果表明，SBP-1高表达与肺癌有紧密的相关性，可供临床对癌症进行诊断及为个体患者提供更好的辅助治疗的有效方法。
权利要求
1.SBP-1蛋白在制备肿瘤标志物中的用途，其中，所述的肿瘤为肺癌。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肺癌是小细胞肺癌和非小细胞肺癌，包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。
3.一种肺癌诊断试剂盒，其特征在于，试剂盒中含有标准剂量的SBP-1蛋白对照品，操作手册，稀释液或者缓冲液以及容器或液态芯片和标签。
4.一种采用权利要求3的肺癌诊断试剂盒检测肺癌的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)制备含有标准剂量的SBP-1蛋白对照品，稀释液或者缓冲液以及容器或液态芯片和标签的肺癌诊断试剂盒，所述的容器或液态芯片中分别设有: a、SBP-1蛋白的特异性抗体； b、PBS缓冲液pH7.2-7.4，或0.0lmol柠檬酸钠缓冲液pH6.0，或3% H202溶液，或辣根酶检测试剂； (2)制备重组蛋白，扩增SBP-1的核苷酸序列，或用含有该核苷的重组表达载体转化或转导至合适的宿主细胞； (3)在合适的培养基中培养宿主细胞； (4)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质； (5)纯化的SBP-1基因产物或者其具有抗原性的片段，诱导产生多克隆抗体； (6)免疫组化:脱蜡和水化:取5μπι的石蜡切片于二甲苯中30min，脱蜡；通过不同的乙醇浸泡至水化；(7)抗原修复:将切片置于IOmMpH6.0柠檬酸缓冲液(pH6.0)中，微波炉加热15min ； (8)微波处理后的切片置于柠檬酸缓冲液中15min，用流动水冲洗5min； (9)将切片放置于3%H202室温孵育15min，消除内源性过氧化物酶的活性； (10)切片置于1/500稀释的SBP-1兔多克隆抗体中温育60min； (11)免疫组化辣根酶系统DAB底物染色； (12)切片用苏木精复染，不同级别的乙醇浸泡至二甲苯，处理切片，镜检，以水或缓冲液做阴性对照，以SBP-1过表达标本为阳性对照，完成检测。
5.如权利要求4方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，通过RT-PCR获得重组蛋白SBP-1的编码序列，引物分别是:S100A2-F:5-GGATCC GAACTTCTGCACAAGG-3’和 S100A2-R:5’ -CCGCTCGAGAAAGGCATCAACAGTC-3’， 模板为肺癌组织cDNA。
6.SBP-1在制备抑制肺癌细胞侵袭的药物的应用。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肺癌细胞是小细胞肺癌和非小细胞肺癌细胞。
全文摘要
本发明涉及分子生物学和肿瘤药物领域。涉及一种肺癌标志物SBP-1在肺癌诊断中的用途，及SBP-1作为标志物用于肺癌的检测方法。本发明采用比较蛋白质组学方法对肺癌细胞系/组织和正常对照细胞/组织的蛋白质表达谱进行比较分析，质谱鉴定其中部分差异蛋白质点。SBP-1蛋白为其中一个差异点，其在癌细胞中比正常细胞高表达，且可明显区分，本发明采用RT-PCR和免疫组化的技术，分别检测肺癌患者及其配对的正常组织中的SBP-1的mRNA和蛋白表达表达水平，结果显示SBP-1在肺癌组织中表达明显高于其配对的正常组织，表明SBP-1能作为肺癌的诊断标志物。进一步本发明提供一种肺癌诊断试剂盒及用于肺癌的检测方法。
文档编号A61K38/17GK103217534SQ20121001982
公开日2013年7月24日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日
发明者宋言峥, 张舒林, 孙战强 申请人:上海市公共卫生临床中心