Prrs病毒载体重组疫苗的利记博彩app
【专利摘要】对活性或灭活重组疫苗进行描述，包括病毒载体和药学上可接受的载体、佐剂和/或赋形剂，其特征在于，由于α和/或γ干扰素的增加，病毒载体能够产生细胞免疫应答，并能够进行快速复制，已经插入源自PRRS的ORF5和ORF6核苷酸序列。
【专利说明】PRRS病毒载体重组疫苗
发明领域
[0001]本发明涉及到用于预防和控制猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的技术，更具体地说，它与病毒载体重组疫苗有关，该疫苗插入了对PRRS病毒具有抗原活性的蛋白质外源核苷酸序列编码，并使用药学上可接受的载体、佐剂和/或赋形剂制成。
[0002]发明背景
[0003]猪繁殖与呼吸综合征病毒(vPRRS)是一种有包膜的病毒，属于RNA族中动脉炎系列的动脉炎属。该病毒的大小约为460纳米，其病毒基因组由RNA正链(包含7个开放阅读框架(ORF)，分别为ORFla和ORFlb以及0RF2-0RF7，从而形成7种结构性蛋白组合(gp2a、2b - 5、M和N)和至少13种非结构性蛋白(nspla、nsplb_nspl2),每一种蛋白都具有形成vPRRS的特定功能。特别是,这种病毒选择性地感染负责触发免疫反应并参与免疫反应调节的单核细胞/巨噬细胞系时，表现出一种免疫调节行为。经证实，该病毒能够通过减少干扰素(IFN )的分泌量，延迟中和抗体的分泌并减少免疫诱饵的分泌量，来改变免疫反应(Yoo 等人，2009 年;Sang 等人，2009 年；Patel 等人，2009 年;Chen 等人，2009 年；Lalit, 2009年)。由于vPRRS具有很强的抗原变异性，因此很难使用基于各种疫苗接种策略的传统方法进行抵抗。因此，全球都在不懈努力开发出一种能有效对抗感染扩散的生物制剂，即能够实现这一目标的病毒基因操作产品的最佳方案(Lara，2010年)。人们从这一点出发，正在研究可提供任何类型保护的病毒亚单位。0RF5和0RF6的使用已经显示出了良好的预期效果，因为它们能对病毒毒力的降低起作用，至少起部分作用(Kim等人,2009年；Zuckerman等人，2007年)，但前提条件是利用活细胞(复制)产品实现免疫，因为这些产品是在与病毒对抗过程中唯一能够提供保护的，而且这种保护程度是通过对抗病毒后病毒血症的缓解程度进行衡量的。2005年，通过修改糖基化研发出0RF5突变体，并将其作为免疫原进行测试，结果表明，GP5低糖基化可提高vPRRS在体内诱导产生中和抗体的能力(Ansari等人，2005年)。
[0004]具体就0RF5而言，美国和欧洲菌株的氨基酸残基1-25之间具有很高的变异性，但每个大洲将接近氨基酸末端序列的氨基酸残基26和39之间归为应变区域的高应变区。
[0005]0RF5序列变更可能导致母猪流产和死亡综合征(SAMS)或“高热”综合征非典型疫情的爆发，这曾在中国出现过(Ferrari等人，2003年；Martelli，2003年)。
[0006]目前商业化的抗PRRS的疫苗含有一种弱毒，但它的缺点是有可能使猪感染，从而导致病情恶化及免疫系统的损伤，这主要发生在动物幼崽身上(高度易感，预先没有征兆);此外，结果表明，这种疫苗病毒会变异，本身可与传播当中的病毒重新组合，从而形成新的遗传变种病毒。同样，研究已显示，弱毒活疫苗并不能完全有效地预防疾病，并且此前的研究也表明，抗vPRRS抗体参与抗体依赖性增强(ADE)的增强机制和/或vPRRS引发的免疫病理学机制(Thanawongnuwech和Suradhat, 2010年)，从而导致与预期相反，接种疫苗的动物变得更容易受到PRRS疾病的影响。
[0007]上述研究也获得了一些与对抗此种疾病的重组疫苗相关的专利。
[0008]美国专利号7，722，878中公开了一种抗PRRS的重组疫苗，它由仅包含vPRRS的ORFl或与其他ORF相结合的载体构成。这些疫苗可用于诱导动物体内的免疫反应，防止感染vPRRS，降低病情的严重程度或缓解症状。为确定这些疫苗的效率，对肺部病灶的数目和vPRRS的特征进行了测定，并得出了相关肺部病灶减少幅度达47%的结果。[0009]在美国专利号5，888，513中，公开了与西班牙分离的vPRRS 0RF2 - 0RF7相对应的重组蛋白，这种蛋白是在杆状病毒表达系统中制成的，并可用于疫苗配方。
[0010]中国的专利申请号CN1554766A和CN1800375A中描述了将腺病毒用作载体的抗PRRS重组疫苗。同样，中国专利申请号CN1778926A公开了一种vPRRS的0RF5改性基因，可将其用于制备抵抗这种疾病的疫苗。
[0011 ] 在美国专利号7，041，443中，描述了欧洲型PRRS病毒、多核苷酸和多肽，用于制备包含弱毒或灭活vPRRS的免疫原性组合物，包括一些精选序列的多核苷酸。
[0012]另一方面，美国专利号6，207，165公开了一种对抗猪生殖和/或呼吸病症致病体的多价疫苗配方，其中一种致病体便是PRRS。该配方至少包括三种类型的疫苗，每种疫苗都由质粒和具有猪病原体原子价的基因构成，对于PRRS，便是E、0RF3或M基因。
[0013]最后，美国专利号5，998，601公开了 vPRRS的VR-2332菌株的核苷酸序列，可编码ORF或其片段以及由此制成的疫苗。
[0014]尽管有上述专利，虽然采用先进技术制成的疫苗能够减弱疾病的影响，但到目前为止，尚未达到足够有效预防vPRRS，从而有效控制疾病的水平。
[0015]发明目的
[0016]考虑到现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种能有效对抗猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的病毒载体重组疫苗。
[0017]本发明的另一个目的是，通过提供抗PRRS的病毒载体重组疫苗，使其产生比以整个PRRS病毒为基础的疫苗更快的免疫反应。
[0018]本发明的目的是提供用于控制PRRS的病毒载体重组疫苗的用法。
[0019]本发明的另一个目的是，提供病毒载体的构建方法，即插入对PRRS病毒具有抗原活性的蛋白质的外源核苷酸序列编码。
[0020]发明概沭
[0021]为实现这一目的，我们发明了重组疫苗，其病毒载体能够由于α和/或Υ干扰素分泌量增加而产生细胞免疫应答，尤其针对新城疫病毒能够快速复制，从PRRS 0RF5、0RF6及两者组合中选择插入了核苷酸序列并使用了药学上可接受的载体、佐剂和/或赋形剂。
[0022]附图简沭
[0023]所附的权利要求书中将特别叙述本发明特征的新颖方面。然而，有些实施例、特征、目的及其优点，只有结合附图才能更好地理解其详细描述。
[0024]图1是与商业疫苗相比较，接种了本发明抗PRRS灭活疫苗的猪的体重增长。
[0025]图2是与商业疫苗相比较，接种了本发明抗PRRS活性疫苗的猪的体重增长。
[0026]发明详沭
[0027]在研究本发明的过程中，我们发现重组疫苗的病毒载体能够由于α和/或Y干扰素分泌量增加而产生细胞免疫应答，能够快速复制，在PRRS病毒(vPRRS)的抗原位点插入了外源核苷酸序列编码，并使用了药学上可接受的载体、佐剂和/或赋形剂，该疫苗能够对猪繁殖与呼吸综合征提供适当的预防作用，这一成果令人惊讶。[0028]使用的病毒载体可以是活病毒(活的)或灭活病毒(死的)。作为病毒载体并在vPRRS抗原位点插入核苷酸序列编码的重组病毒一旦灭活后就失去了复制能力，这一点是可以理解的。可通过采用本【技术领域】中众所周知的物理或化学流程进行灭活，最好用甲醛或β-丙内酯进行化学灭活(国际兽疫局，2008年)。新城疫病。世界动物卫生组织陆生动物诊断试验和疫苗手册。国际兽疫局。法国，第576-589页)。相反，活病毒依旧具有复制能力。
[0029]病毒载体最好是副粘病毒，从任何血清型、基因型或遗传类型的副粘病毒中进行选择，包括低毒型、中毒型和强毒病毒。同样，也可采用能够利用反向遗传技术的副粘病毒，以便去除117位的苯基丙氨酸和导致副粘病毒具有致病性的Q114位附近的碱性氨基酸；或是感染鸟类的病毒属中的副粘病毒，如新城疫病毒或仙台病毒。病毒载体最好是新城疫病毒，本发明所述病毒载体最好从低毒、中毒菌株中选择，例如LaSota、B1、QV4、Ulster、Roakin和Komarov菌株。重组病毒最好是LaSota菌株。
[0030]关于vPRRS抗原位点的核苷酸序列编码，在现有技术中已经描述了一些ORF序列，如0RF5和0RF6的序列，它们可用于生产抗PRRS的疫苗，如美国专利号5，885，513和7，041，443以及中国专利申请号CN1778926A中公开的疫苗。对于本发明而言，所用的核苷酸序列选自SEQ ID N0:1(0RF5)、SEQ ID N0:2(0RF6)以及两者的组合。
[0031]通过聚合酶链式反应(PCR)扩增感兴趣的核苷酸序列，并将该已经扩增的核苷酸序列插入副粘病毒的病毒载体，可制备本发明疫苗的病毒载体。利用分子生物学克隆标准技术进行插入。由此获得的感染性克隆转染到细胞培养中，以生成重组病毒。
[0032]病毒在任何适合其不断增长的培养系统中复制，如SPF鸡胚或商业化的细胞系，或明确设计用于繁殖病毒的细胞系，直到达到实现抗原反应所需的病毒浓度，优选浓度介于106_°和10lcl_°DIE P50%/mL之间，最佳浓度在108_°和109 5DIEP50%/mL之间。活疫苗实施例中使用天然低毒力的疫苗活病毒或使用本【技术领域】中熟知的流程将病毒的毒力减弱。另一方面，疫苗灭活时，一旦病毒浓度达到了实现抗原反应所需的浓度，病毒也就失去了活性。最好通过本【技术领域】众所周知的物理或化学流程进行灭活，优选甲醛、β -丙内酯或二乙烯亚胺(Β.Ε.1.)进行化学灭活。
[0033]适用于本发明疫苗的药学上可接受载体最好是水溶液或乳液。更具体地说，优选使用的载体是水一油、油一水或水一油一水(WOW)乳液,最好选用水一油一水乳液。关于疫苗接种，以喷淋、喷雾或溶于饮用水的形式，通过肌肉注射、鼻内途径、皮下注射的方式进行，每种情况根据活疫苗或灭活疫苗的特点，使用适合猪的手段和形式。可以通过肌肉注射或鼻内途径接种，不过最好选用肌肉注射方式。
[0034]为进一步理解本发明，我们提供了以下实施例。这些实施例仅为说明性的，以便更好地理解本发明的优选实施例，而不意味着可根据以上详细描述实施其他未举例的现有实施例。
实施例
[0035]实施例1
[0036]新城疫病毒LaSota载体的制备
[0037]为了克隆新城疫病毒菌株LaSota的基因组，从而生成病毒载体，首先引入称为“PSL1180NDV/LS”的中间载体。为此，通过三唑方法进行病毒总RNA提取。RNA经过纯化，然后将之前纯化的总RNA作为模版,进行病毒基因组的cDNA (互补DNA)合成。为了克隆新城疫病毒基因组的所有基因(15，183个碱基对(bp))，通过PCR方法增强了 7个具有“重叠”末端和粘性酶切位点的基因片段。片段I (Fl)包含核苷酸序列(nt)l-1755，片段2(F2)包含ntl-3321，片段 3(F3)包含 ntl755_6580，片段 4 (F4)包含 nt6, 151-10，210，片段 5 (F5)包含 nt7, 381-11，351，片段 6(F6)包含 ntll, 351-14，995，片段 7(F7)包含 ntl4, 701-15，186。使用连接标准技术在被称为pGEM-pSL1180的克隆载体中进行7个片段的拼接，以便于新城疫病毒LaSota基因组的重建，该基因组克隆后在P和M基因之间存在单一的酶切位点SacII,并且可用于克隆此病毒载体区域内感兴趣的任何基因。
[0038]实施例2
[0039]克隆源自vPRRS的0RF5和0RF6基因 [0040]为克隆vPRRS的0RF5和0RF6基因，使用Triazole法提取病毒总RNA。然后使用经过纯化的总RNA合成cDNA(互补DNA)，通过PCR技术，使用特定的寡核苷酸扩增所述PRRS病毒的基因。随后使用克隆标准技术，将0RF5和0RF6基因插入Fermentas的pJET载体，从而获得质粒:pJET0RF5/0RF6。
[0041]实施例3
[0042]在pSL1180NDV/LS 载体的 SacII 位点克隆 vPRRS 的 0RF5 和
[0043]0RF6 基因，以形成质粒 pNDV-LS (wt) Orf5/6
[0044]A:吿l|备plntNhe中间载体
[0045]为将新城疫病毒名为GE/GS的转录序列引入0RF5和0RF6基因的5’末端，通过将新城疫病毒基因组作为模版，利用PCR方法初次扩增GE/GS序列，然后将这些序列插入PGEM-T的方式，创建新的中间载体。
[0046]B:将0RF5和0RF6某闵亚克降到载体plntNhe
[0047]plntNhe质粒与Spel-Hpal —同消化，然后克隆到plntNhe中，从而获得pintNhe56质粒。
[0048]C:将 GE/GS-0RF5/6 亚克降到载体 PSL1180NDV/LS
[0049]用Nhel酶消化pINTNhe56质粒，并用SacII消化PSL1180NDV/LS质粒；去除消化产物从而剩下相容性连接位点，GE/GS-0RF5/6区域经过纯化后插入pNDV/LS的SacII位点，从而获得名为pNDV-LS (wt) Orf5/6的感染性克隆。
[0050]实施例4
[0051]在细胞培养中制备重组疫苗rNDV-LS (wt) Orf5/6
[0052]使用感染复数(MOI)为I的MAV-7病毒首次感染ifep-2和A-549细胞。在37°C、5%的CO2环境中孵育I小时后，用I微克(g) pNDV-LS (wt) Orf 5/6的DNA和0.2 g表达质粒pNP、pP和pL的DNA进行转染，对病毒蛋白P、NP和L进行编码，从而制备两种细胞类型的重组疫苗。转染四十四小时后，获得两种细胞类型的重组疫苗，然后接种至10日龄的SPF鸡胚，以增强获得的病毒。在Veix)细胞中使用平板法滴度获得尿囊液，从而生成用于制备疫苗的最终重组病毒。
[0053]实施例5
[0054]利用插入了 vPRRS 0RF5和0RF6的新城疫LaSota重组病毒生[0055] 产疫苗pNDV-LS (wt) 0rf5/6vac 的方法:
[0056]从产物开始，将先前确定的感染剂量接种至无特定病原体(SPF)的鸡胚中。在37°C的条件下孵育鸡胚72小时，每日监测其死亡率。之后，将当天的活胚胎冷却至第二天，最好达到24小时，在无菌条件下获得氨基尿囊液(西班牙语缩写FAA)，并用离心法澄清。FAA经过测试，确定其纯度、无菌度和DIEP滴定度。
[0057]在水一油一水类型的乳液中制备活疫苗和灭活疫苗。在准备油相时，使用矿物油和Span80和Tween80类型的表面活性剂。在准备水相时，将FAA与防腐剂溶液(硫柳汞)混合。准备水乳液时，将水相缓慢添加至油相中，并不断搅拌。使用均质器或胶体磨达到规定的粒径。
[0058]以上疫苗经过配置使其最低浓度达到108_ °DIEP50%/0.5mL，每头猪的剂量为
2.0mL0
[0059]根据上述流程，利用具有0RF5和0RF6基因的载体(pSL1180NDV/LS)制备重组实验性疫苗，其名称为pNDV-LS (wt)/0rf5/6vac，在无佐剂的情况下对活疫苗进行了测试(实施例5A)，使用水一油一水佐剂分别对活疫苗(实施例5B)和灭活疫苗(实施例5C)进行了测试，所有情况下均应用两个剂量。
[0060]实施例6
[0061]体内评估重组疫苗pNDV-LS (wt)/Orf 5/6vac的效力
[0062]为确定本发明所述疫苗的效力并证明这些疫苗比商业疫苗(应用I剂)更有效，我们对其功效进行了测试。
[0063]以106_°DICC50%mL/45分钟的剂量使用PRRS病原体活病毒，在不同的实验中进行测试，以确定疫苗的效力。
[0064]为此，本发明使用3到5周、双耳分别标记编号的104头猪，称其体重并随机分配为9个治疗组,如表1所示。
[0065]表1.治疗组
[0066]
【权利要求】
1.病毒载体能够由于α和/或Y干扰素的增加而产生细胞免疫应答，并且能够快速复制，其特征在于，它已为对PRSS病毒具有抗原活性的蛋白质插入了外源核苷酸序列编码。
2.根据权利要求1所述的病毒载体，其进一步的特征在于，它是副粘病毒。
3.根据权利要求2所述的病毒载体，其进一步的特征在于，副粘病毒选自包括血清型、基因型或遗传型在内的任何副粘病毒，包括弱毒型、中毒型和强毒病毒；可采用反向遗传技术去除117位置的苯基丙氨酸和导致副粘病毒具有致病性的Q114位置附近的碱性氨基酸的副粘病毒；或是感染鸟类的副粘病毒属中的副粘病毒。
4.根据权利要求3所述的病毒载体，其进一步的特征在于，副粘病毒源自新城疫病毒和仙台病毒。
5.根据权利要求4所述的副粘病毒病毒载体，其进一步的特征在于，副粘病毒属于新城疫病毒。
6.根据权利要求5所述的病毒载体，其进一步的特征在于，新城疫病毒选自LaSota、B1、QV4、Ulster、Roakin 和 Komarov 菌株。
7.根据权利要求1所述的病毒载体，其进一步的特征在于，外源核苷酸序列选自0RF5、0RF6以及它们的组合物。
8.根据权利要求7所述的病毒载体，其进一步的特征在于，0RF5和0RF6的序列分别是SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2。
9.重组疫苗的特征在于，由能够产生细胞免疫应答的病毒载体(原因在于α和/或Y干扰素的增加)制成，并能够快速复制，已经为针对PRRS病毒具有抗原活性的蛋白质插入一个外源核苷酸序列编码，并使用药学上可接受的载体、佐剂和/或赋形剂。
10.根据权利要求9所述的重组疫苗，其进一步的特征在于，病毒属于副粘病毒。
11.根据权利要求10所述的重组疫苗，其进一步的特征在于，副粘病毒是活的或经过灭活处理。
12.根据权利要求11所述的重组疫苗，其进一步的特征在于，副粘病毒源自任何血清型、基因型或遗传类型，包括低毒、中等毒和强毒性病毒；可采用反向遗传技术去除117位置的苯基丙氨酸和导致副粘病毒具有致病性的Q114位置附近的碱性氨基酸的副粘病毒；或是感染鸟类的副粘病毒属中的副粘病毒。
13.根据权利要求12所述的重组疫苗，其进一步的特征在于，副粘病毒源自新城疫病毒和仙台病毒。
14.根据权利要求13所述的重组疫苗，其进一步的特征在于，副粘病毒属于新城疫病毒。
15.根据权利要求14所述的重组疫苗，其进一步的特征在于，新城疫病毒源自LaSota、B1、QV4、Ulster、Roakin 和 Komarov 菌株。
16.根据权利要求9所述的重组疫苗，其进一步的特征在于，外源核苷酸序列选自0RF5、0RF6以及它们的组合物。
17.根据权利要求16所述的重组疫苗，其进一步的特征在于，0RF5和0RF6的序列分别是 SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2。
18.根据权利要求9所述的重组疫苗，其进一步的特征在于，药学上可接受的载体最好是水溶液或乳液。
19.根据权利要求18所述的重组疫苗，其进一步的特征在于，药学上可接受的载体选自水一油，油一7K或水一油一水乳液。
20.根据权利要求19所述的重组疫苗，其进一步的特征在于，药学上可接受的载体最好是水溶液或乳液。
21.根据权利要求9所述的重组疫苗，其进一步的特征在于，实现抗原反应所需的病毒浓度介于 106_° 和 10lcl_°DIEP50%/mL 之间。
22.根据权利要求21所述的重组疫苗，其进一步的特征在于，实现抗原反应所需的病毒浓度介于108_°和109 5DIEP50%/mL之间。
23.根据权利要求9所述的重组疫苗，其进一步的特征在于，它是通过肌肉注射、鼻腔途径、皮下注射、喷淋、喷雾或溶于饮用水的方式接种。
24.根据权利要求23所述的重组疫苗，其进一步的特征在于，它是通过肌肉注射的方式接种。
25.根据权利要求9所述，使用重组疫苗的目的是控制PRRS。
26.根据权利要求9所述，使用重组疫苗的目的是控制PRRS，其特点在于，应用两个剂量的疫苗后，免疫接种动物的肺部病灶低于12%。
【文档编号】A61K39/12GK103649320SQ201180072146
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2011年5月7日 优先权日:2011年5月7日
【发明者】B.洛扎诺-杜伯纳德, E.索托-普里安特, D.萨法蒂-米兹拉西, J.H.拉拉-普恩特 申请人:阿维-梅克斯实验室公司