病毒灭活的血小板提取物及其用途和制剂的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及病毒安全血小板提取物及其制剂和用途。所述提取物包含生物活性血小板衍生因子的混合物。有利的是，所述提取物包含比例平衡的因子并且为不可凝固的。
【专利说明】病毒灭活的血小板提取物及其用途和制剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及来源于多个供体的病毒灭活的血小板提取物及其制剂和用途。
【背景技术】
[0002]血小板是在止血和愈合中发挥着基本作用的小的、形状不规则的无核细胞。血小板包含一整套预先合成的蛋白，其中包括信号蛋白、细胞骨架蛋白、膜蛋白和调节蛋白。它们涉及在损伤部位处的组织再生和愈合过程的关键阶段，这主要是由于包含多个生物活性分子(包括生长因子(GF)、细胞因子和趋化因子)的血小板颗粒的含量。诸如血小板衍生生长因子(TOGF)、转化生长因子(TGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等血小板GF是在全部以下伤口愈合级联阶段中的关键作用者:炎症、增殖和重塑阶段。
[0003]研究已表明，血小板衍生的GF刺激血管生成、有丝分裂发生、细胞增殖(中性粒细胞和巨噬细胞)、胶原合成、伤口收缩、细胞外基质合成、上皮形成和趋化作用。
[0004]血小板通常通过输注用于例如促进止血。最近，血小板越来越多地以富血小板血浆(PRP)的形式使用，其也称为PRP凝胶、血小板凝胶、PRP凝块等。通常，PRP是由在有限体积的血衆中浓缩的自体血小板构成的间接体内制剂(Lacci KM, Dardik A.Platelet-richplasma:support for its use in wound healing.Yale J Biol Med.2010 年 3 月；83(I):1_9)。
[0005]对于局部施用，PRP通常通过添加凝血酶和/或CaCl2从而通过凝血酶(内源性或外源性的)与纤维蛋白原之间的相互作用形成纤维蛋白凝胶而活化。活化时，血小板发生活性脱颗粒作用并释放出各种调节剂，包括GF(Lacci KM, Dardik A, 2010) 0 PRP的注射用途目前构成了小但快速成长的细分市场。将PRP用于软和硬组织填充的基本原理是其可能增强不愈性损伤中的组织再生、加速伤口成熟、血管化和上皮化、减少疤痕形成以及减少术后并发症和发病率(Lacci KM, Dardik A，2010)。
[0006]连同各种细胞类型使用活化的PRP的研究已表明从PRP释放的因子(如，生长因子)可诱导细胞增殖[(如Kanno等人，Platelet-rich plasma enhanceshuman osteoblast-1 ike cell proliferation and differentiation.J OralMaxillofac Surg.2005 年 3 月；63(3):362-9 ；Bertrand-Duchesne 等人，Epidermalgrowth factor released from platelet-rich plasma promotes endothelial cellproliferation in vitr0.J Periodontal Res.2010 年 2 月；45 (I):87-93 ;Kakudo 等人，Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derivedstem cells and human dermal fibroblasts.Plast Reconstr Surg.2008 年 11 月；122(5):1352-60),调节人内皮细胞的血管生成能力(Sulpice等人，Cross-talk betweenthe VEGF-A and HGF signalling pathways in endothelial cells.Biol Cell.2009年9月；101 (9):525-39 ;Rughetti 等人，Platelet gel-released supernatant modulates theangiogenic capability of human endothelial cells.Blood Transfus.2008 年 I 月；6(1):12-7),并且引发骨诱导性能(Intini G.The use of platelet-rich plasma in bonereconstruction therapy.Biomaterials.2009 年 10 月；30 (28):4956-66)]。此外，据发现，在与胎牛血清支持的水平相当或更高的水平下，活化的PRP支持体外细胞生长并维持许多目标细胞的活力，所述目标细胞包括骨髓瘤、杂交瘤、肝细胞、成纤维细胞和上皮细胞(Johansson 等人，Platelet lysate:a replacement for fetal bovine serum in animalcell culture ? Cytotechnology.2003 年 7 月；42(2):67-74)。
[0007]PRP及释放的生长因子目前用于多种组织再生外科手术，主要是骨科和牙科手术(Nurden 等人，Platelets and wound healing.Front Biosc1.2008 年 5 月 I 日；13:3532-48)。在骨科手术中，PRP主要用于膝关节成形术、腰椎融合和椎间盘退变(见Nurden等人2008年的综述)。牙科学和颌面外科学PRP应用主要包括钛种植体的巩固、上颌窦提升和骨重塑(见Nurden等人2008年的综述)。PRP还越来越多地用于肌腱和韧带修复、面部整形和重建手术、慢性皮肤伤口愈合、眼科学、面神经再生以及心脏和减肥手术(见Nurden等人2008年的综述)。
[0008]然而，自体PRP及释放因子的当前应用的主要缺点在于缺乏标准化。值得注意的是，可以商购获得参数(诸如制备时间、血小板收率和采集效率)不同的用于制备PRP的不同人工、半自动和全自动系统(Mazzucco等人，Not every PRP-gel is born equal.Evaluation of growth factor availability for tissues through four PRP-gelpreparations:Fibrinet, RegenPRP-Kit, Plateltex and one manual procedure.VoxSang.2009 年 8 月；97(2):110-8)。
[0009]另一个重要的变量是用于血小板活化的技术[自体、异源或重组凝血酶，氯化钙或巴曲酶(Rozman P, Bolta Z.Use of platelet growth factors in treating woundsand soft-tissue injuries.Acta Dermatovenerol Alp Panonica Adriat.2007 年 12 月；16(4):156-65)],其可影响颗粒释放效率和分泌的GF的量(Rozman P7Bolta Z，2007)。此外，由于血小板对机械`应力和周围环境的变化非常敏感，因此，它们可在预期活化步骤前在加工过程中活化并释放GF (Mazzucco等人,2009)。这种不受控制的活化可进一步增加在使用不同PRP制备系统时最终产品组成的变化。另外，自体PRP制剂的一个主要固有弱点在于血小板GF含量在个体中不同，并因此可导致次佳的结果。最后，当处理自体PRP时，应考虑专用设备、一次性PRP加工试剂盒以及需要经培训的人员所造成的经济负担。
[0010]最近的出版物(Su等人，“A virally inactivated functional growth factorpreparation from human platelet concentrates，，.Vox Sang.2009 年 8 月；97 (2):119-128)公开了衍生自混合单采捐献血小板的可凝固功能生长因子提取物的制剂。然而，所公开的可凝固制剂具有只包括尤其对包膜病毒而非对无包膜病毒有效的一个病毒灭活步骤(即溶剂洗涤剂(S/D)病毒灭活)的缺点。该出版物指出了应用纳滤作为第二病毒灭活步骤的可能性。该制剂还包含血浆和白细胞蛋白杂质。通过疏水相互作用色谱(HIC)进行的S/D移除步骤大大减少了制剂中的TOGF。此外，制剂的可凝固潜力可限制其在局部施用方面的用途或阻碍其全身性用途。
[0011]Bumouf 等人(“A novel virally inactivated human platelet lysatepreparation rich in TGF-beta, EGF and IGF, and depleted of PDGF and VEGF，，.Biotechnol Appl Biochem.2010 年 8 月 6 日；56(4):151-60)公开了具有标准化 TGF-β、EGF和IGF含量而不含I3DGF和VEGF的经S/D处理的血小板裂解物。该出版物公开了通过疏水相互作用色谱制备这种避免移除SD的裂解物的方法。
[0012]需要得自多个供体的包含具有生长因子和/或营养因子活性的蛋白质混合物的病毒安全血小板提取物制剂。
【发明内容】
[0013]血小板包含一整套在组织再生和愈合过程的关键阶段中涉及到的因子。目前，将完整的自体活化血小板(来源于患者)用于促进伤口愈合。然而，使用完整的自体血小板存在多个缺点，特别是缺乏标准化；愈合所需的因子在患者自身的血小板中可能缺乏；需要特殊的设备；程序耗时并且需要患者自身进行的额外步骤；以及需要经过医学培训的人员。这些问题可例如通过使用由多个供体制得的血小板提取物而解决。然而，来源于人类血液的产品可存有传播感染原诸如病毒的风险。有效地降低病毒传播风险可通过包括至少两个正交的病毒灭活步骤而实现。另外，血小板提取物的制造过程中的附加步骤可影响其中所含因子的回收率和活性。
[0014]本发明解决对得自多个供体的包含具有生长因子和/或营养因子活性的蛋白质混合物的病毒安全(至少双重病毒灭活)血小板蛋白质提取物的长期以来的需要。
[0015]本发明涉及活性的并且病毒安全的来源于多个供体的血小板提取物，及其制剂和用途。
[0016]病毒安全血小板提取物包含活性血小板细胞生长因子和/或营养因子的混合物。
[0017]在一个方面，本发明涉及用于制备病毒安全血小板提取物的方法，该方法包括至少两个正交的病毒灭活处 理，例如溶剂洗涤剂(S/D)病毒灭活处理和热灭活。该方法包括以下步骤:提供来自多个供体的富血小板成分，例如得自多个供体的混合单采经洗涤和/或白细胞减除的血小板成分；
[0018]制备血小板裂解物；
[0019]进行溶剂洗涤剂(S/D)病毒灭活处理；
[0020]通过疏水相互作用色谱(HIC)移除S/D，其中HIC包括以下步骤:将裂解物上样到HIC，并收集在非等度条件下洗脱的材料；以及
[0021]进行第二正交病毒灭活处理。
[0022]在本发明的一个实施例中，制备血小板裂解物在S/D病毒灭活处理过程中进行。
[0023]在本发明的又一个实施例中，在S/D病毒灭活处理过程中，例如通过过滤进行减少聚集体的子步骤。
[0024]在本发明的某些实施例中，HIC包括以下步骤:将裂解物上样到HIC ;用等度溶液洗涤HIC ;收集未结合的材料；用非等度溶液洗涤HIC ;以及收集洗脱的材料。
[0025]另外，在本发明的又一个实施例中，等度溶液由醋酸盐-甘氨酸缓冲液和人血清白蛋白组成；并且其中非等度溶液包含有机溶剂和/或能够结合血小板衍生因子的分子。
[0026]另外，在本发明的又一个实施例中，在S/D移除前使裂解物与能够结合血小板衍生因子的分子(如肝素、硫酸葡聚糖以及它们的组合)接触。
[0027]另外，在本发明的又一个实施例中，将提取物冻干。
[0028]在另一方面，本发明涉及可根据本发明的方法获得的病毒安全血小板提取物。[0029]本发明提供来源于多个供体的包含生物活性血小板细胞生长因子和/或营养因子的混合物的病毒安全血小板提取物。
[0030]在本发明的一个实施例中，提取物包含TOGF-AB、VEGF和TGFb I，其中TOGF-AB:TGF-bl的比率为至少0.2 ;和/或PDGF-AB =VEGF的比率为至少45。
[0031]在本发明的一个实施例中，提取物富含TOGF-AB和/或bFGF。
[0032]在本发明的一个实施例中，提取物为不可凝固的。
[0033]在本发明的一个实施例中，提取物具有低聚集体含量。
[0034]在本发明的一个实施例中，提取物为固体形式。 [0035]在本发明的一个实施例中，提取物提供有由选自以下的天然和/或合成材料制成的递送剂:聚合物、水凝胶、聚乙烯醇、聚乙二醇、透明质酸、硫酸软骨素、明胶、藻酸盐、胶原蛋白基质、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)、琼脂、氧化再生纤维素、自组装肽、聚乙醇酸、聚乳酸、纤维蛋白以及它们的组合。
[0036]在另一方面，本发明涉及该提取物在组织愈合、器官重建、组织再生和/或炎症治疗中的用途。
[0037]在另一方面，本发明涉及组织愈合、器官重建和/或组织再生的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据本发明的提取物。
[0038]在另一方面，本发明涉及治疗有需要的受试者的炎症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据本发明的提取物。
[0039]在本发明的一个实施例中，将提取物通过递送剂施用。
[0040]本发明提供通过疏水相互作用色谱(HIC)从生物液体混合物中移除溶剂洗涤剂(S/D)的方法，包括以下步骤:
[0041 ] 提供生物液体混合物；以及
[0042]将混合物上样到HIC，收集未结合的材料和非等度条件下洗脱的材料。
[0043]本发明还提供通过HIC从生物液体制剂中移除溶剂洗涤剂(S/D)的方法，包括以下步骤:
[0044]提供制剂；
[0045]将制剂上样到HIC ；以及
[0046]收集非等度条件下洗脱的材料。
[0047]在本发明的一个实施例中，生物制剂为血小板衍生的制剂。
[0048]在本发明的一个实施例中，方法包括以下步骤:将制剂上样到HIC ;用等度溶液洗涤HIC ;收集未结合的材料；用非等度溶液洗涤HIC ;以及收集洗脱的材料。
[0049]在本发明的一个实施例中，方法包括由醋酸盐-甘氨酸缓冲液和人血清白蛋白组成的等度溶液；以及包含有机溶剂和/或能够结合血小板衍生因子的分子的非等度溶液。
[0050]在另一方面，本发明提供可根据本发明的方法获得的病毒安全的制剂或混合物。
[0051]而在另一方面，本发明提供一种试剂盒，其包括包含根据本发明的提取物、任选地包含递送剂的容器。
[0052]在一个实施例中，递送剂由选自以下的天然和/或合成材料制成:聚合物、水凝胶、聚乙烯醇、聚乙二醇、透明质酸、硫酸软骨素、明胶、藻酸盐、胶原蛋白基质、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)、琼脂、氧化再生纤维素、自组装肽、聚乙醇酸、聚乳酸、纤维蛋白以及它们的组合。
【专利附图】
【附图说明】
[0053]图1显示了不同血小板提取物制剂的SDS-PAGE蛋白图谱表征。分子量标记[Bio-Radl61-0374(泳道I)];人血清白蛋白[Plasbumin25 (泳道2)]8μ g ;得自全血的洗涤血小板(泳道3) 11 μ g ；WAP (泳道4) 8 μ g ；S/D处理后的WAP (泳道5) 14 μ g ；S/D处理并通过SDR HyperD色谱树脂纯化而移除SD后的WAP (泳道6) 10 μ g。
[0054]图2显示了用“混合WAP”、“LYO I”处理或未处理(O)的3T3细胞的增殖。实验一式三份地进行。将在饥饿培养基(标记为“O”)中生长的细胞用作对照< 0.001(t检验分析，与“O”比较)。
[0055]图3显示了㈧未处理的对照细胞(在饥饿培养基中生长的细胞)或⑶用LYOI处理的细胞的3T3-Swiss albino细胞形态的代表性光学显微图像(放大200倍)。
[0056]图4 显示了添加 LYO I (B)、2IU/ml 凝血酶(C)、LYO I+2IU/ml 凝血酶(D)、BAC 组分(E)、或LYO I+BAC组分(F)时HUVEC形态的代表性光学显微图像(放大200倍)。(A)未处理的对照细胞。
[0057]图5 显示了 LYO 11( A )或混合的 WAP II ( )对 3T3_Swiss albino 成纤维细胞的增殖作用。实验一式三份地进行。
[0058]图6显示了在用LYO I1、凝血酶(T，孔中最终浓度为lIU/ml)和lIU/ml凝血酶+LYO II诱导后的HUVEC增殖。星号表示通过t检验分析(给出了 P值)评价时与无LYO
II的相关处理相比显著不同的结果。
[0059]图7显示了通过接种在基底膜提取物(BME)包被孔(阳性对照)上的HUVEC获得的血管样结构。图片使用530nm荧光滤光片在放大100倍下采集。
[0060]图8显示了通过LYO II处理后的HUVEC获得的血管样结构(B)。㈧对照细胞。图片使用530nm荧光滤光片在放大200倍下采集。
[0061]图9A-9F显示了接种在纤维蛋白原(A-C)或纤维蛋白包被(D-F)的细胞中并用LYO II (B, E)或混合WAP II (C，F)处理的或未处理的(A，D) HUVEC的形态学外观。图片使用530nm荧光滤光片在放大100倍下采集。
[0062]图10显示了 LYO III或混合的WAP III对3T3_Swiss albino成纤维细胞的增殖作用。将MasterMix (MM)用作阳性对照。针对通过特异性ELISA评估的TOGF-AB浓度进行归一化。
[0063]图11显示了用凝血酶(B ；lIU/ml的最终浓度)、纤维蛋白原(C ;11.3mg/ml的总蛋白)、LY0 III (D)、纤维蛋白(凝血酶和纤维蛋白原)(E)以及纤维蛋白和LYO III(F)处理的HUVEC的形态学外观。A-未处理的对照细胞。图片使用530nm荧光滤光片在放大100倍下米集。
[0064]图12显示了在不同处理后的3T3-Swiss albino成纤维细胞的增殖水平。将MasterMix(MM ；?)用作参照。针对通过特异性ELISA评估的TOGF-AB浓度进行归一化。所有测试均一式三份地进行。
[0065]图13显示了通过LYO IV⑶、混合的WAP IV (C)和MasterMix (MM ；D)诱导后的3T3-Swiss albino形态学外观。(A)未处理的细胞。图片使用相差显微镜在放大200倍下米集。
[0066]图14A-0显示了通过3T3_Swiss albino成纤维细胞进行的体外刮伤测定的代表性相差图像(放大100倍)。将细胞铺在不同的表面(未包被(A，D，G，J，M)、胶原蛋白(B，E，H，K，N)或纤维蛋白原(C，F，I，L，0)包被的孔)上，并用p200吸头刮伤。在用LYO IV(G,H，I)、混合的 WAP IV(J，K，L)或 PRP-R(M，N，O)处理后 “O”(A，B, C)和 24 小时(D-O)时间点捕获伤口。
[0067]图15显示了在不同的处理组中开始处理后24小时表示为剩余百分比的伤口闭合定量评估。将细胞铺在不同的表面(未包被、胶原蛋白或纤维蛋白原包被的孔)上，并在通过P200吸头将单层刮伤后用LYO IV、混合的WAP IV或PRP-R处理。将剩余的伤口百分比计算为各位置中24h后的剩余距离与开始距离的比率。结果表示为6个重复样的平均值土S.D.。进行了 t检验分析，统计显著性经确定为P <0.05。*根据每个表面的与未处理的孔(O)比较)；#与未包被表面上的相关处理比较。
[0068]图16显示了接种在BME包被孔上并用LYO IV(B)或混合的WAP IV(C)处理的HUVEC的形态学外观。(A)接种在BME包被层上的未处理的HUVEC。图片使用530nm荧光滤光片在放大60倍下采集。
[0069]图17显示了 LYO V或混合的WAP V对3T3_Swiss albino成纤维细胞的增殖作用。将重组的人I3DGF-AB用作对照。
[0070]图18显示了 LYO VI或混合的WAP VI对3T3_Swiss albino成纤维细胞的增殖作用。将混合的PRP释出液(releasate)用作对照。
[0071]图19显示了LYO VI和混合的WAP VII ;或1^0 VII和混合的WAP VII对3T3_Swissalbino成纤维细胞的增殖作用。
【具体实施方式】
[0072]本发明涉及来源于多个供体的活性和病毒安全(至少双重病毒灭活)的血小板提取物及其制剂和用途。病毒安全血小板提取物包含生物活性血小板细胞生长因子和/或营养因子的混合物。
[0073]根据本发明发现，经洗涤的白细胞减除单采血小板(WAP)相对于得自全血捐献的洗涤血小板包含极少量的白蛋白并可能包含少量的其他血浆杂质。还发现，经受S/D处理(裂解和病毒灭活)、S/D移除、冻干和复原(如LYO I提取物)的WAP具有生物活性并且能够诱导例如人脐静脉内皮细胞(HUVEC)或3T3成纤维细胞的细胞系中的增殖和/或形态变化，例如血管样结构的形成(与血管生成相关)或纺锤样结构的形成(运动性增强的属性)。据观察，提取物的活性可通过添加凝血酶、生物活性组分(BAC;如EVICEL?纤维蛋白密封剂中的纤维蛋白原组分，(Omrix Biopharmaceuticals Ltd.))或凝血酶+BAC(纤维蛋白)而增强。
[0074]来源于人类血液的产品可存有传播感染原诸如病毒的风险。通常采取多种措施以便最大程度降低病毒和/或未知病原体传播的风险，包括对捐献样品是否存在某些病毒的常规测试以及制造工艺过程中的病毒灭活/移除步骤。有效降低病毒传播风险可通过包括至少两个不改变产品有益性质的正交病毒灭活步骤而实现。诸如HIV、乙肝病毒、丙肝病毒和西尼罗河病毒的脂质包膜病毒通过破坏病毒脂膜的S/D处理而被快速有效地灭活。[0075]接着，让提取物经受第二病毒灭活处理，例如热处理(巴氏灭菌)步骤或纳滤。根据本发明发现，提取物不能轻易地通过纳滤系统。
[0076]令人惊讶地，根据本发明发现，热处理(巴氏灭菌)病毒灭活步骤是可行的并得到生物活性提取物(例如LYO II)，如通过细胞增殖测定法和形态变化诱导(例如诱导血管生成或诱导纺锤样形状)测定法所测试。据发现，凝血酶、纤维蛋白原或纤维蛋白的添加显著增强了提取物活性(通过促进管状结构形成的纤维蛋白原或纤维蛋白的添加，以及通过增强增殖的凝血酶)。
[0077]在本发明的一个实施例中，对于热处理，让S/D处理的材料经受稳定化步骤。可将蔗糖和甘氨酸添加到溶液中，用作巴氏灭菌步骤过程中的稳定剂。然后可例如在恒定混合下通过60±0.5°C热处理9至10.5小时进行溶液的巴氏灭菌。接着可将溶液例如用醋酸盐-甘氨酸缓冲液稀释，并可例如通过针对醋酸盐-甘氨酸缓冲液渗滤而从溶液中除去稳定剂。如果存在聚集材料，则可通过一个或多个连续过滤阶段(例如使用20、5和1.2μπι过滤器，然后使用0.45 μ m过滤器)过滤而移除。可使用0.2μπι过滤器在无菌条件下进行无菌过滤。可将溶液在经过高压灭菌的小瓶中冻干，然后在氮气氛围下并以部分真空(0.6巴)用经过高压灭菌的橡胶塞密封。
[0078]根据本发明发现，双重病毒灭活的提取物与原料浓度相比可浓缩(例如在LYOIII中)例如4倍或32倍。浓缩可例如通过溶液渗滤和/或将冻干提取物以与冻干前的提取物体积相比较低的体积复原而实现。
[0079]如果存在聚集材料，则可通过如上所述的连续过滤而移除。据发现，浓缩的提取物(例如LYO III)包含极 低量的血浆蛋白。据发现，浓缩的提取物(例如LYO VI和LYOVII)为不可凝固的。提取物表现出具有少量水平的或完全不存在凝血蛋白。浓缩的提取物不含生理活性的纤维蛋白原，因为生理活性的纤维蛋白原的水平无法通过本领域目前使用的灵敏方法加以检测。如通过非活化的部分凝血活酶时间测量试验(NAPTT)所评估，提取物缺乏促凝活性。NAPTT 可基本上如 European Pharmacopoeia7.0.;2.6.22 !Activatedcoagulation factors monograph (01/2008:20622) ；in European PharmacopoeiaStrasburg (France), Council of Europe, 2009中所述而进行。不存在凝血因子还通过活化的部分凝血活酶时间(APTT)测试加以确定。该测试表明，根据本发明的血小板提取物缺乏凝血因子父1131、^、￥111、乂、￥、11和I中的一种或多种，从而使得提取物为不可凝固的。
[0080]根据本发明发现，提高提取物的浓度影响了 3T3_Swiss albino小鼠成纤维细胞的增殖水平，当归一化到样品中存在的TOGF-AB量时浓缩提取物的影响比原料裂解物的影响更显著。要注意的是，浓缩提取物的影响比阳性对照(MasterMix,通过TGF-β I 200ng/ml、b-FGF0.5ng/ml、VEGF5ng/ml和roGF_AB300ng/ml制备的重组人生长因子的定制混合物)更显著。另据发现，向人脐静脉内皮细胞(HUVEC)单层添加浓缩提取物促进了管型形成。通过添加结合纤维蛋白密封剂的浓缩提取物，显示出了 HUVEC单层的管型形成中的协同效应。
[0081]对于最佳的S/D病毒灭活，可在S/D处理过程中增加聚集体移除子步骤(例如，如在LYO IV中所进行的)。聚集体移除可例如通过离心、过滤、制备性尺寸排阻色谱(SEC)、超滤(例如使用100KD聚醚砜(PES)膜、100KD聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、300KD PES膜、聚丙烯膜、醋酸纤维素膜)和/或通过本领域已知的任何其他方法进行。
[0082]任选地，包括通过添加氯化钙或其他钙盐并澄清过滤而进行的聚集体移除附加步骤。例如，可添加40mM最终浓度的氯化钙(以促进聚集体沉淀)，然后例如使用20、5、1.2和0.45 μ m过滤器进行澄清过滤。在一个实施例中，在S/D处理后增加该步骤。
[0083]根据本发明发现，这些聚集体移除附加步骤是可行的并得到生物活性提取物。具有低聚集体含量的血小板提取物可有利地用于静脉内施用。另外，具有低聚集体含量的血小板提取物可与包含相对高浓度钙的组分一起使用。
[0084]据发现，在包含成纤维细胞的未包被的细胞培养孔中以及在胶原蛋白或纤维蛋白原包被的孔中，用经受了聚集体移除的提取物处理细胞以与原料裂解物以及与PRP-R[PRP-释出液，通过钙和凝血酶(得自EVICEL?)活化]相似的方式促进了成纤维细胞运动和伤口闭合(在刮伤测定中)。据报道，PRP-R在体内环境中有益于伤口愈合(LacciKM, Dardik A，2010)。
[0085]此外，根据本发明发现，经受了聚集体移除的提取物诱导了与血管生成相关的HUVEC强形态变化。[0086]根据本发明发现，某些血小板因子可在S/D移除步骤过程中通过增加在S/D移除所用HIC柱中的至少一个洗脱步骤并通过也收集洗脱的材料而加以回收。一个这样的因子为TOGF-AB。据发现，根据本发明通过用非等度溶液洗涤HIC，可以得到至少3倍的TOGF-AB回收或富集(如在LYO V、VI和VII中)。在用4ml重蒸馏水(DDW)复原后测量了最终冻干材料中的I3DGF-AB浓度。据发现，PDGF-AB的浓度在LYO VI中为4，578pg/ml，在LYO V中为15，028pg/ml并且在LYO VII中为194，353pg/ml，它们对应于用作原料的每个血小板为约 7XKT7Pg(在 LYO VI 中)、2.26XKT6Pg(在 LYO V 中)以及 3.12X l(T5pg(在 LYOVII中)的TOGF-AB。要注意的是，富含I3DGF-AB的提取物对细胞增殖的影响比单独的重组TOGF-AB更显著，从而表明血小板的其他提取组分可协同地增强成纤维细胞增殖。使用本发明的方法富集/增加的另一个因子为bFGF(也称为FGF-2或b_FGF)。另据发现，根据本发明通过用非等度溶液洗涤HIC，可以得到至少1.8倍的bFGF回收或富集(如在LYO VI中)。据发现，bFGF的浓度为36-127pg/ml，对应于用作原料的每个血小板为约5.4X 10_9至 1.95 XKT8Pg 的 bFGF。
[0087]这些发现为制备根据本发明的提取物铺平了道路。本发明的提取物包括以下特征中的一个或多个:包含具有生长和/或营养因子(例如TGF-bl、b-FGF、VEGF和TOGF-AB)的蛋白质，其组成比本领域已知的其他血小板因子混合物更平衡；为双重病毒灭活的，例如经S/D处理和巴氏灭菌的；具有降低的聚集体含量；包含与相同因子的生理比例相似的因子比例；包含TGF-bl、VEGF与TOGF-AB之间的生理平衡比例；以及表现出减少的血浆杂质(例如降低的IgG和纤维蛋白原水平)。
[0088]术语“生理平衡比例”是指例如PDGF-AB:TGF-bl和/或PDGF-AB =VEGF之间的比例，该比例与血小板、浓缩血小板、混合血小板、白细胞减除血小板、混合的白细胞减除血小板、洗涤血小板、白细胞减除的洗涤单采血小板(WAP)制剂、血小板提取物、富血小板血浆释出液(PRP-R)、血清和/或血小板释出液的生理组成中这些因子的比例相似。“血清”通常是指包含通过活化的血小板释放的生长/营养因子而不含纤维蛋白原或其他凝结因子的血浆。就血清而言，生理比率可根据血清中存在的生长/营养因子值(根据商业ELISA试剂盒的包装说明书)来计算。在这样的例子中，据发现，PDGF-AB:TGF-bl和TOGF-AB =VEGF之间的生理比率分别为0.5和90.9。[0089]在一个实施例中，WAP (原料)中TOGF-AB:TGF-bl之间的生理比率为至少0.2或在约0.2至约0.5的范围内，诸如约0.2,0.3,0.36,0.4,0.44和0.47。
[0090]在另一个实施例中，WAP (原料)中TOGF-AB:VEGF之间的生理比率为至少45或在约45至约103的范围内，诸如约45、64、73、76和103。
[0091]在本发明的一个实施例中，根据本发明的提取物包含至少0.2的TOGF-AB:TGF-bl比率；和/或至少45的PDGF-AB =VEGF比率。
[0092]在本发明的一个实施例中，根据本发明的提取物包含至少约0.56的I3DGF-AB:TGF-bl比率；和/或至少约74的PDGF-AB =VEGF比率(如在LYO VII中)。
[0093]根据本发明的提取物具有以下优点中的一个或多个:为标准化的，并允许稳健的(一致的)生物性能；在细胞中表现出生物活性，例如诱导增殖和/或形态变化；在与单独的重组TOGF-AB的浓度相比较低的TOGF-AB浓度下表现出增加的活性，从而降低非增殖组织中转化变化的可能性；具有最佳的病毒安全性；具有改善的免疫安全性，例如因其相对于通过富含血小板的成分(未经受血浆蛋白移除步骤，例如洗涤步骤)制得的提取物包含低水平的血浆 杂质；并且为不可凝固的。
[0094]术语“病毒安全血小板提取物”是指经受了至少两次正交病毒灭活处理的提取物。
[0095]“至少两次正交病毒灭活处理”涉及执行至少两次用于灭活病毒的不同和独立处理。可以使用以下非限制性处理例子中的两种或更多种的组合:巴氏灭菌、溶剂洗涤剂(S/D)、纳滤、低pH处理、紫外线辐照和硫氰酸钠处理。
[0096]术语“灭活病毒或病毒灭活”是指其中将病毒维持在溶液中但使之无活性(例如通过溶解其脂质衣壳)的情形；和/或其中将病毒例如通过尺寸排阻技术从溶液中物理移除的情形。
[0097]术语“血小板提取物”是指包含血小板衍生因子的混合物。通常，提取物不含细胞。
[0098]术语“裂解物”是指当细胞通过破坏其细胞膜而毁坏时产生的溶液。
[0099]术语“活性血小板提取物”是指包含诸如生长因子和/或营养因子的生物活性物质并表现出包括但不限于诱导细胞增殖、细胞运动性、细胞间相互作用和/或细胞形态变化的生物活性的血小板提取物。
[0100]术语“来源于多个供体的血小板提取物”是指由至少两个个体制得的血小板提取物。个体可以是人或其他哺乳动物。
[0101]术语“生长因子”通常是指促进细胞生长、增殖和/或分化的物质。生长因子的例子包括但不限于转化生长因子(TGF)(例如TGF-bl)、成纤维细胞生长因子(FGF)(例如bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(TOGF)(例如TOGF-AB)等。
[0102]术语“营养因子”通常是指刺激细胞分化和/或存活的物质。营养因子的例子包括但不限于粘附分子、骨形态发生蛋白、细胞因子、eph受体酪氨酸激酶、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子(FGF)、GDNF、肝素结合生长因子、胰岛素样生长因子、神经营养因子、脑信号蛋白、转化生长因子(TGF) β、酪氨酸激酶受体配体等。
[0103]血小板因子可具有生长活性和营养活性。
[0104]术语“聚集体”是指包含诸如蛋白质聚集体的固体的一大块材料。蛋白质聚集可在生物治疗剂的制造过程中遇到(Protein aggregation and bioprocessing.Cromwell ME,Hilario E, Jacobson F.AAPS J.2006 年 9 月 15 日；8(3):E572_9，综述)。蛋白质的聚集体可以为可溶/不溶、共价/非共价、可逆/不可逆和/或天然/变性蛋白质的形式。如果需要，例如，对于静脉内施用，聚集体可通过本领域已知的不同技术从提取物中移除，例如通过离心、过滤、制备性尺寸排阻色谱(SEC)、超滤(例如使用IOOKD聚醚砜(PES)膜、100KD聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、300KD PES膜、聚丙烯膜、醋酸纤维素膜)和/或通过本领域已知的任何其他方法。
[0105]有利的是，在本发明的一个实施例中，提取物表现出低聚集体含量并可用于静脉
内施用。在本发明的一个实施例中，聚集体水平(浊度)可根据以下公式计算:
[0106]
[0107]
【权利要求】
1.一种用于制备病毒安全血小板提取物的方法，所述方法包括至少两次正交病毒灭活处理并包括以下步骤: 提供来自多个供体的富含血小板的成分； 制备血小板裂解物； 进行溶剂洗涤剂(S/D)病毒灭活处理； 通过疏水相互作用色谱(HIC)移除所述S/D，其中所述HIC包括以下步骤:将所述裂解物上样到HIC，并收集在非等度条件下洗脱的材料；以及进行第二正交病毒灭活处理。
2.根据权利要求1所述的方法，其中制备所述血小板裂解物在所述S/D病毒灭活处理过程中进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述S/D病毒灭活处理过程中进行减除聚集体的子步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述聚集体减除通过过滤进行。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述HIC包括以下步骤:将所述裂解物上样到HIC ;用等度溶液洗涤HIC ;收集所述未结合的材料；用非等度溶液洗涤HIC ;以及收集所述洗脱的材料。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述等度溶液由醋酸盐-甘氨酸缓冲液和人血清白蛋白组成；并且其中所述非等度溶液包含有机溶剂和/或能够结合血小板衍生因子的分子。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，还包括在S/D移除之前使所述裂解物与能够结合血小板衍生因子的分子接触。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述分子选自肝素、硫酸葡聚糖以及它们的组口 ο
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述第二正交病毒灭活处理包括热灭活。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述富含血小板的成分为得自多个供体的混合单采经洗涤和/或白细胞减除的血小板成分。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，还包括冻干所述提取物。
12.一种能够根据权利要求1至11中任一项所述的方法获得的病毒安全血小板提取物。
13.一种来源于多个供体的病毒安全血小板提取物，包含生物活性血小板细胞生长因子和/或营养因子的混合物。
14.根据权利要求13所述的提取物，包含PDGF-AB,VEGF和TGFbI，其中PDGF-AB:TGF-bl的比率为至少0.2 ;和/或PDGF-AB: VEGF的比率为至少45。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的提取物，富含TOGF-AB。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的提取物，富含bFGF。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的提取物，为不可凝固的。
18.根据权利要求12至17中任一项所述的提取物，具有低聚集体含量。
19.根据权利要求12至18中任一项所述的提取物，其中所述提取物为固体形式。
20.根据权利要求12至19中任一项所述的提取物，其提供有递送剂。
21.根据权利要求20所述的提取物，其中所述递送剂由选自以下的天然和/或合成材料制成:聚合物、水凝胶、聚乙烯醇、聚乙二醇、透明质酸、硫酸软骨素、明胶、藻酸盐、胶原蛋白基质、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)、琼脂、氧化再生纤维素、自组装肽、聚乙醇酸、聚乳酸、纤维蛋白以及它们的组合。
22.根据权利要求12至21中任一项所述的提取物，其用于组织愈合、器官重建、组织再生和/或治疗炎症。
23.—种组织愈合、器官重建和/或组织再生的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求12至21中任一项所述的提取物。
24.一种治疗有需要的受试者的炎症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求12至21中任一项所述的提取物。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述提取物通过递送剂施用。
26.—种通过疏水相互作用色谱(HIC)从生物液体混合物中移除溶剂-洗涤剂(S/D)的方法，包括以下步骤: 提供所述生物液体混合物；以及 将所述混合物上样到HIC，收集所述未结合的材料和非等度条件下洗脱的材料。
27.一种通过HIC从生物液体制剂中移除溶剂-洗涤剂(S/D)的方法，包括以下步骤: 提供所述制剂； 将所述制剂上样到HIC;以及 收集非等度条件下洗脱的材料。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述生物制剂为血小板衍生的制剂。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述方法包括以下步骤:将所述制剂上样到HIC ;用等度溶液洗涤HIC ;收集所述未结合的材料；用非等度溶液洗涤HIC ;以及收集所述洗脱的材料。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述等度溶液由醋酸盐-甘氨酸缓冲液和人血清白蛋白组成；并且其中所述非等度溶液包含有机溶剂和/或能够结合血小板衍生因子的分子。
31.一种能够根据权利要求26至30中任一项所述的方法获得的病毒安全制剂或混合物。
32.—种试剂盒，包括包含根据权利要求12至19中任一项所述的提取物的容器。
33.根据权利要求32所述的试剂盒，还包含递送剂。
34.根据权利要求32或33所述的试剂盒，其中所述递送剂由选自以下的天然和/或合成材料制成:聚合物、水凝胶、聚乙烯醇、聚乙二醇、透明质酸、硫酸软骨素、明胶、藻酸盐、胶原蛋白基质、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)、琼脂、氧化再生纤维素、自组装肽、聚乙醇酸、聚乳酸、纤维蛋白以及它们的组合。
【文档编号】A61K35/14GK103648508SQ201180068151
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2011年12月20日 优先权日:2010年12月21日
【发明者】L.维斯曼, N.拉维-沙皮拉, I.努尔, O.贝雅伊夫 申请人:奥姆里克斯生物药品有限公司