由人类滋养层干细胞生成神经干细胞的利记博彩app

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【专利摘要】本发明提供经分离的神经干细胞。还提供使用包含该经分离的神经干细胞的适合的制剂来治疗神经退化疾病的方法。在一个实施方案中，此处所述的经分离的神经干细胞表达尾型同源框2(Cdx2)、Nanog同源框、巢蛋白、八聚物结合转录因子4(Oct-4)、神经丝、神经原素-3(Ngn3)、新霉素缺失基因(Neo-D)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、CD133、视黄酸受体β(RARJ3)、类视黄醇X受体α(RXRa)、类视黄醇X受体β(RXRJ3)、细胞视黄酸结合蛋白2(CRABP-2)、细胞视黄醇结合蛋白l(CRBP-I)、视黄醛脱氢酶2(RALDH-2)或视黄醛脱氢酶3(RALDH-3)中的一种或多种的转录物。
【专利说明】由人类滋养层干细胞生成神经干细胞
相关申请的交叉引用
[0001]本申请主张于2010年11月15日提交的美国临时申请第61/413,892号以及于2011年I月20日提交的美国临时申请第61/434，790号的权益，该申请通过引用并入本文。
【技术领域】 [0002]人类滋养层干(human trophoblast stem, hTS)细胞能够在未分化的状态下在体外(in vitro)无限增殖。hTS细胞维持潜在的多谱系分化能力(potential multilineagedifferentiation capabilities)。hTS细胞制剂在体外或在体内(in vivo)可以被诱导分化成为滋养层谱系的细胞。进一步地，hTS细胞可以被诱导分化成为神经元，诸如多巴胺能神经元(dopaminergic neurons)。hTS细胞可以被用来治疗在黑质纹状体途径(nigrostriatal pathway)中多巴胺能神经元的功能异常或缺失,诸如人类中的神经退化性障石寻(neurodegenerative disorders)。

【发明内容】

[0003]神经退化性障碍在人类族群中具有很深的社会经济影响(socio-economiceffects) ο目前的药物通过减轻神经退化性障碍[诸如，帕金森氏症(Parkinson’ sdisease)、阿尔兹海默症(Alzheimer，s disease)、亨廷顿氏症(Huntington，s disease)等]的某些症状而仅提供有限的益处。帕金森氏症(PD)是由于黑质纹状体途径中多巴胺能神经元的功能异常或缺失所造成的，并且是在人类中常见的神经退化性障碍。此处提供了用于对哺乳动物中的神经退化性障碍[包括帕金森氏症、亨廷顿氏症、阿尔兹海默症、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、多系统萎缩(multiple systematrophy)、路易氏体痴呆(Lewy body dementia)、周边感觉神经病变(peripheral sensoryneuropathies)或脊髓损伤(spinal cord injuries)]进行以细胞为基础的替代治疗的经分离的神经干细胞(isolated neural stem cells)。
[0004]在一个方面，此处提供了经分离的神经干细胞，其中所述经分离的神经干细胞衍生自滋养层组织(trophoblast tissue)。在一些实施方案中，该滋养层组织是人类滋养层组织。
[0005]在一个实施方案中，此处所描述的经分离的神经干细胞表达尾型同源框2 (caudal type homeobox2, Cdx2)、Nanog 同源框(Nanog homeobox)、巢蛋白(nestin)、八聚物结合转录因子 4 (octamer-b inding transcription factor4, Oct-4)、神经丝(neurofilament)、神经原素-3 (neurogenin_3, NgN3)、新霉素缺失基因(Neo-D)、微管相关蛋白-2 (microtubule-associated protein-2, MAP-2)、CD133、视黄酸受体 β (retinoicacid receptor beta, RAR β )、类视黄醇 X 受体 a (retinoid Xreceptor alpha, RXR α )、类视黄醇X受体β (retinoid X receptor beta, RXRP )、细胞视黄酸结合蛋白2 (cellularretinoic acid binding protein2, CRABP-2)、细胞视黄醇结合蛋白 I (cellular retinolbinding proteinl, CRBP-1)、视黄醒脱氢酶 2 (retinaldehyde dehydrogenase2, RALDH-2)或视黄醒脱氢酶3 (retinaldehyde dehydrogenase3, RALDH-3)中的一种或多种的转录物(transcript)。
[0006]在一个实施方案中，该经分离的神经干细胞是人类神经干细胞。在一个实施方案中，该细胞具有正常的核型(karyotype)。在另一实施方案中，该经分离的神经干细胞具有一种或多种免疫豁免的特性(immune-privileged characteristics)。在另一实施方案中，该一种或多种免疫-豁免的特性包含不存在⑶33的表达和/或⑶133的表达。
[0007]此处进一步提供了将该经分离的神经干细胞分化成神经元(neuixms)的方法，该方法包括:将所述经分离的神经干细胞施用至哺乳动物的脑中，其中所述经分离的神经干细胞分化成神经元。在另一实施方案中，该神经元是多巴胺能神经元、谷氨酰胺能神经元(glutaminergic neuron)、5_ 轻色胺能神经兀(serotonergic neuron)或 GABA 能(Y-氨基丁酸)神经元。
[0008]在一个实施方案中，该经施用的(例如，经移植的)经分离的神经干细胞在所述施用之前用诱导药物(induction drug)进行预诱导。在另一实施方案中，该经分离的神经干细胞在所述施用之前不用诱导药物进行预诱导。
[0009]在一个实施方案中，在所述施用之前，所述哺乳动物的脑被损害或已蒙受神经元缺失(neuronal loss)。在另一实施方案中,所述损害是针对多巴胺能神经元、谷氨酰胺能神经元、5-羟色胺能神经元或GABA能(Y-氨基丁酸)神经元的。在另一实施方案中，所述神经元缺失是针对多巴胺能神经元的。
[0010]在一个实施方案中,用表达载体转染所述细胞。
[0011]在另一实施方案中，该经分离的神经干细胞，在被施用至所述个体的脑中之后，移转至该个体的脑的黑质致密部(substantia nigra pars compacta, SNC)区域。在另一实施方案中，所述施用改善 所述哺乳动物中的感觉运动功能(sensorimotor function)。在另一实施方案中，所述施用导致所述哺乳动物的僵硬(rigidity)、运动失能症(akinesia)或平衡障碍(balance impairment)的减轻。
[0012]此处提供了将经分离的神经干细胞分化成多巴胺能神经元的方法，该方法包括:将所述经分离的神经干细胞施用至哺乳动物的脑中，其中所述经分离的神经干细胞表达Cdx2、Nanog、巢蛋白、0ct_4、神经丝、NgN3、Neo-D, MAP-2、CD133、RAR^、RXRa、RXRβ、CRABP-2、CRBP-1、RALDH-2或RALDH-3中的一种或多种的转录物，其中所述哺乳动物的脑被损害或已蒙受神经元缺失，其中所述经分离的神经干细胞中的一种或多种分化成多巴胺能神经元。
[0013]此处提供了将经分离的神经干细胞分化成多巴胺能神经元的方法，该方法包括:将所述经分离的神经干细胞施用至哺乳动物的脑中，其中所述经分离的神经干细胞衍生自滋养层组织，其中所述哺乳动物的脑被损害或已蒙受神经元缺失，其中所述经分离的神经干细胞中的一种或多种分化成多巴胺能神经元。
[0014]在上面所述的方法的一个实施方案中，所述施用改善所述哺乳动物中的感觉运动功能。在上面所述的方法的另一实施方案中，所述施用导致所述哺乳动物的僵硬、运动失能症或平衡障碍的减轻。
[0015]此处提供了将经分离的人类滋养层干细胞分化成神经干细胞的方法，该方法包括:调节 Cdx2、Nanog、巢蛋白、0ct4、神经丝、Ngn_3、Neo-D, MAP-2、CD133、RAR^、RXRa、RXRP、CRABP-2、CRBP-1、RALDH-2 或 RALDH-3 基因的活性。
[0016]此处提供了将经分离的人类滋养层干细胞分化成神经干细胞的方法，该方法包括:调节 Cdx2、Nanog、巢蛋白、0ct4、神经丝、Ngn_3、Neo-D, MAP-2、CD133、RAR^、RXRa、RXRP、CRABP-2、CRBP-1、RALDH-2 或 RALDH-3 转录物的水平。
[0017]此处提供了将经分离的人类滋养层干细胞分化成神经干细胞的方法，该方法包括:调节 Cdx2、Nanog、巢蛋白、0ct4、神经丝、Ngn_3、Neo-D, MAP-2、CD133、RAR^、RXRa、RXRP、CRABP-2、CRBP-1、RALDH-2 或 RALDH-3 蛋白质的水平或活性。
[0018]此处提供了筛选用于治疗或预防疾病的化合物的方法，该方法包括:使经分离的人类滋养层干细胞与所述化合物接触；以及检测所述人类滋养层干细胞中至少一种基因、转录物或蛋白质的活性的改变。在上面所述的方法的一个实施方案中，与未接触所述化合物的可比较的经分离的人类滋养层干细胞相比，所述人类滋养层干细胞中的至少一种基因、转录物或蛋白质的活性降低。在上面所述的方法的另一实施方案中，与未接触所述化合物的可比较的经分离的人类滋养层干细胞相比，所述人类滋养层干细胞中的至少一种基因、转录物或蛋白质的活性增加。在上面所述的方法的另一实施方案中，该疾病是神经退化性障碍。在上面所述的方法的另一实施方案中，该疾病是帕金森氏症、阿尔兹海默症、精神分裂症(schizophrenia)或肌萎缩侧索硬化症。
[0019]此处提供了筛选用于治疗或预防疾病的化合物的方法，该方法包括:使经分离的人类滋养层干细胞与所述化合物接触；以及检测所述人类滋养层干细胞中的至少一种转录物或蛋白质的水平的改变。在上面所述的方法的一个实施方案中，与未接触所述化合物的经分离的人类滋养层干细胞相比，所述人类滋养层干细胞中的至少一种转录物或蛋白质的水平降低。在上面所述的方法的另一实施方案中，与未接触所述化合物的可比较的经分离的人类滋养层干细胞相比，所述人类滋养层干细胞中的至少一种转录物或蛋白质的水平增加。在上面所述的方法的另一实施方案中，该疾病是神经退化性障碍。在上面所述的方法的另一实施方案中，该疾病是帕金森氏症、阿`尔兹海默症、精神分裂症或肌萎缩侧索硬化症。
[0020]此处提供了针对在细胞中诱导改变的能力而筛选化合物的方法，该方法包括:使经分离的人类滋养层干细胞与所述化合物接触；以及检测对所述人类滋养层干细胞的分化的诱导。
[0021]此处提供了针对在细胞中诱导改变的能力而筛选化合物的方法，该方法包括:使经分离的神经干细胞与所述化合物接触；以及检测对所述神经干细胞的分化的诱导。
[0022]此处提供了筛选用于治疗或预防疾病的化合物的方法，该方法包括:使经分离的神经干细胞与所述化合物接触；以及检测所述神经干细胞中至少一种基因、转录物或蛋白质的活性的改变。在上面所述的方法的一个实施方案中，与未接触所述化合物的可比较的经分离的神经干细胞相比，所述神经干细胞中的至少一种基因、转录物或蛋白质的活性降低。在上面所述的方法的另一实施方案中，与未接触所述化合物的可比较的经分离的神经干细胞相比，所述神经干细胞中的至少一种基因、转录物或蛋白质的活性增加。在上面所述的方法的另一实施方案中，该疾病是神经退化性障碍。在特定的实施方案中，该疾病是帕金森氏症、阿尔兹海默症、精神分裂症或肌萎缩侧索硬化症。
[0023]此处提供了筛选用于治疗或预防疾病的化合物的方法，该方法包括:使经分离的神经干细胞与所述化合物接触；以及检测所述神经干细胞中至少一种转录物或蛋白质的水平的改变。在上面所述的方法的一个实施方案中，与未接触所述化合物的可比较的经分离的神经干细胞相比，所述神经干细胞中的至少一种转录物或蛋白质的水平降低。在上面所述的方法的另一实施方案中，与未接触所述化合物的可比较的经分离的神经干细胞相比，所述神经干细胞中至少一种转录物或蛋白质的水平增加。在上面所述的方法的另一实施方案中，该疾病是神经退化性障碍。在上面所述的方法的另一实施方案中，该疾病是帕金森氏症、阿尔兹海默症、精神分裂症或肌萎缩侧索硬化症。
[0024]此处所提供的一个实施方案描述了一种治疗有此需要的哺乳动物中的神经障碍(neurological disorder)的方法，其包括:将至少一神经干细胞施用至所述哺乳动物，其中该细胞是经免疫豁免的。在另一实施方案中，所述哺乳动物是小鼠、大鼠、猪、犬、猴、猩猩或人猿。在另一实施方案中，所述哺乳动物是人类。
[0025]在一个实施方案中，所述有此需要的哺乳动物具有一种或多种与神经障碍有关的症状。在另一实施方案中，所述一种或多种症状选自于由下列所构成的群组:僵硬、运动失能症、平衡障碍、震颤(tremor)、步态障碍(gait disorder)、不良性步态(maldispositional gait)、痴呆(dementia)、过度月中胀(excessive swelling)[水月中(edema)]、肌无力(musc le weakness)、下肢萎缩(atrophy in the lower extremity)、运动障碍(movement disorder)[舞蹈病(chorea)]、肌肉僵直(muscle rigidity)、物理运动的减慢[运动迟缓(bradykinesia)]、物理运动的缺失(运动失能症)、健忘(forgetfulness)、认知(智能)损伤[cognitive (intellectual) impairment]、辨识的缺失(loss of recognition)[失识症(agnosia)]、受损的功能(诸如决策与计划)、单侧面麻瘦(hemifacial paralysis)、感觉缺失(sensory deficits)、麻木(numbness)、剌痛感(tingling)、四肢的疼痛感觉异常(painful paresthesias in the extremities)、虚弱(weakness)、脑神经麻瘦(cranial nerve palsies)、语言障碍(difficultywith speech)、眼球运动(eye movements)、视野缺损(visual field defects)、失明(blindness)、出血(hemorrhage)、分泌物(exudates)、近端肌萎缩(proximal musclewasting)、运动困难症(dyskinesia)、四肢肌肉张力的异常(abnormality of tonus inlimb muscles)、肌强直减少(decrease in myotony)、动作失调(incoordination)、在手指-手指测试或手指-鼻测试中错误的指示、辨距不良(dysmetria)、霍-斯二氏现象(Holmes-Stewart phenomenon)、不完全的或完全的全身性麻瘦(incomplete orcomplete systemic paralysis)、视神经炎(optic neuritis)、视物显多症(multiplevision)、眼球运动障碍(ocular motor disturbance)[诸如眼球震颤(nystagmus)]、疫挛性麻瘦(spastic paralysis)、痛苦的强直发作(painful tonic seizure)、莱尔米特综合征(Lhermitte syndrome)、共济失调(ataxia)、语言困难(mogilalia)、膀胱直肠障石辱(vesicorectal disturbance)、起立性低血压(orthostatic hypotension)、运动功能的减退(decrease in motor function)、尿床(bed wetting)、贫乏的言语表达(poor verbalization)、不充足的睡眠型态(poor sleep patterns)、睡眠障碍(sleepdisturbance)、食欲障碍(appetite disturbance)、体重改变(change inweight)、精神运动性激动或迟滞(psychomotor agitation or retardation)、减少的活力(decreased energy)、无价值的感受或过度或不适当的内疚、思考或全神贯注的困难、反复的死亡意图或者自杀的意念或企图、害怕(fearfulness)、焦虑(anxiety)、兴奋增盛(irritability)、沉思的或强迫性沉思(brooding or obsessive rumination)、过度担心身体健康(excessive concern with physical health)、恐慌发作(panic attacks)以及恐惧症(phobias)。在另一实施方案中，所述神经障碍是帕金森氏症、阿尔兹海默症、亨廷顿氏症、肌萎缩侧索硬化症、弗里德赖希共济失调(Friedreich’ s ataxia)、路易氏体症(Lewy body disease)、脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy)、多系统萎缩、痴呆、精神分裂症、麻痹(paralysis)、多发性硬化症(multiple sclerosis)、脊髓损伤、脑损伤(brain injuries)[例如，中风(stroke)]、脑神经障碍(cranial nervedisorders)、周边感觉神经病变、癫痫(epilepsy)、朊病毒障碍(prion disorders)、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、阿尔拍斯病(Alper's disease)、小脑 / 脊髓小脑退化(cerebellar/spinocerebellar degeneration)、巴滕病(Batten disease)、皮质基底核退化(corticobasal degeneration)、贝尔氏麻痹(Bell ’ s palsy)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre Syndrome)、皮克病(Pick’s disease)以及自闭症(autism)。
[0026]在一个实施方案中，此处还提供了一种治疗有此需要的哺乳动物中的神经障碍的方法，该方法包括:将至少一种神经干细胞施用至所述哺乳动物，其中该细胞是经免疫豁免的并且衍生自滋养层组织。在另一实施方案中，该经免疫豁免的细胞具有低水平的CD33表达。在另一实施方案中，该经免疫豁免的细胞具有低水平的CD133表达。在另一实施方案中，该神经元祖干细胞(neuronal progenitor stem cell)不会引起免疫反应。在另一实施方案中，该神经元祖干细胞不会形成肿瘤。在另一实施方案中，该神经干细胞表达Cdx2、Nanog、巢蛋白、Oct-4、神经丝、NgN3、Neo-D、MAP-2、CD133、RARP ,RXRa、RXRP、CRABP_2、CRBP-1、RALDH-2或RALDH-3中的一种或多种的转录物。
[0027]在另一实施方案中，该方法进一步包括:将所述一种或多种神经干细胞施用至哺乳动物的脑中，其中该细胞分化成神经元。在另一实施方案中，所述施用包括注射(injecting)或植入(implanting)。在另一实施方案中，所述神经元是多巴胺能神经元、谷氨酰胺能神经元、5-羟色胺能神经元或GABA能(Y-氨基丁酸)神经元。在另一实施方案中，所述祖细胞(progenitor cell)在所述施用之前用诱导药物进行预诱导。
[0028]在一个实施方案中，此处还提供了一种诱导或促进干细胞分化成具有神经元特性的细胞的方法，该方法包括:(a)使该干细胞与诱导药物接触；(b)在该干细胞中用该诱导药物来调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质包括:无翅型MMTV整合位点2B (Wnt2B)、卷曲蛋白家族受体6 (Fzd6)、散乱蛋白3 (disheve11ed3，Dvl3)、晚期T细胞淋巴瘤常见重排蛋白I (FRATl)、糖原合酶激酶3 β (651(3 0)、组蛋白脱乙酰酶6 010六06)、β-联蛋白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基α IIGq类(G a q/11)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β (Gi3)、类视黄醇X受体a (RXR α )、视黄酸受体β (RAR β )、谷氨酸受体I (GLuRl)、磷酸肌醇_3_激酶(PI3K)、rac-a丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKtl)、rac_i3丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKt2)、rac- Y丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKt3)、哺乳动物雷帕霉素革巴蛋白(mTOR)、真核翻译起始因子4E结合蛋白(EIF4EBP)、cAMP反应元件结合蛋白I (CREBl)、酪氨酸羟化酶(TH)、磷脂酶Ci3 (PLC-β)、磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)、钙/钙调蛋白依赖型蛋白激酶II抑制剂2(〇&1?11)、真核翻译起始因子48伍正48)、帕金蛋白(parkin)、α-突触核蛋白(SNCA)、微管蛋白(tubulin)、钙依赖磷酸酶(calcineurin)、脑衰蛋白反应调节蛋白2 (CRMP-2)、活化的T细胞的核因子(NFAT1)、输入蛋白(importin)、淋巴样细胞增强子结合因子I (LEFl)、垂体同源框2(Pitx2)、肌细胞增强因子2A(MEF2A)或ElA结合蛋白p300 (EP300);以及(c)诱导或促进该干细胞分化成具有神经元特性的细胞。[0029]在一个实施方案中，该干细胞是哺乳动物滋养层干细胞。在另一实施方案中，该干细胞是哺乳动物胚胎干细胞。在另一实施方案中，该干细胞是哺乳动物经诱导的多能干细胞(mammalian induced pluripotent stem cell)。在另一实施方案中，其中该干细胞是内胚层、中胚层、外胚层或间质干细胞。在另一实施方案中，该干细胞来自小鼠、大鼠、人类、黑猩猩、大猩猩、犬、猪、山羊、海豚或牛。在另一实施方案中，该干细胞来自人类。在另一实施方案中，该干细胞是人类滋养层干细胞。在另一实施方案中，该具有神经元特性的细胞是神经干细胞(NSC)、多巴胺生成细胞(dopamine producing cell)、多巴胺能神经元、单极神经兀(unipolar neuron)、双极神经兀(bipolar neuron)、多极神经兀(multipolar neuron)、维体细胞(pyramidal cell)、浦肯野细胞(Purkinje cell)以及前角细胞(anterior horncell)、篮状细胞(basket cell)、贝茨细胞(betz cell)、闰绍细胞(Renshaw cell)、颗粒细胞(granule cell)或中等棘细胞(medium spiny cell)。
[0030]在一个实施方案中，该诱导药物包括:视黄酸(retinoic acid)、烟酰胺(nicotinamide)或 β -疏基乙酉享(beta-mercaptoethanol)、维生素 B12(vitaminB12)、肝素(heparin)、腐胺(putrescine)、生物素(biotin)或 Fe2+、丁基羟基苯甲醚(butylated hydroxyanisole) > 丙戍酸(valproic acid)、福司柯林(forskolin) >5_氮胞苷(5-azacytidine)、Π引哚美辛(indomethacin)、异丁基甲基黄嘌呤(isobutylmethylxanthine)或胰岛素(insulin)。在另一实施方案中，该调节包括:增加该一种或多种蛋白质中的至少一种的活性。在另一实施方案中，该调节包括:增加该一种或多种蛋白质中的至少一种的表达。在另一个实施方案中，增加表达包括:增加编码该一种或多种蛋白质中的至少一种的mRNA的量，或者增加由mRNA翻译而来的该一种或多种蛋白质中的至少一种的量。在另一实施方案中，该调节包括:降低该一种或多种蛋白质中的至少一种的活性。在另一实施方案中，该调节包括:减少该一种或多种蛋白质中的至少一种的表达。在另一实施方案中，减少表达包括:减少编码该一种或多种蛋白质中的至少一种的mRNA的量，或者减少由mRNA翻译而来的该一种或多种蛋白质中的至少一种的量。
[0031]此处还描述了诱导或促进干细胞分化成具有神经元特性的细胞的方法，其中该神经元特性包括多巴胺(dopamine)、谷氨酸N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)受体的亚基(subunits of the glutamate NMDA receptor)、突触蛋白 I (synapsin I)、a丐离子通道标记(calcium channel marker)、生长相关蛋白43 (GAP-43)、电压依赖的K+通道、电压依赖的Ca+通道或电压依赖的Na+通道的表达。
[0032]在一个实施方案中，该诱导或促进干细胞分化成具有神经元特性的细胞的方法包括:在该干细胞中用该诱导药物调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质是Wnt2B。在另一实施方案中，Wnt2B被活化。在另一实施方案中，Wnt2B被去活化。在另一实施方案中，fct2B被活化，然后被去活化。在另一实施方案中，fct2B被去活化，然后被活化。在另一实施方案中，fct2B促进该干细胞的分化或增殖。在另一实施方案中，Wnt2B促进或诱导多巴胺表达。
[0033]在一个实施方案中，该诱导或促进干细胞分化成具有神经元特性的细胞的方法包括:在该干细胞中用该诱导药物调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质是GSK3i3。在另一实施方案中，GSK3i3被活化。在另一实施方案中，GSK3 β被去活化。在另一实施方案中，GSK30被活化，然后被去活化。在另一实施方案中，GSK3 0被去活化，然后被活化。在另一实施方案中，GSK3 0促进该干细胞的分化或增殖。在另一实施方案中，GSK3 3调节微管装配(microtubule assembly)。
[0034] 在一个实施方案中，该诱导或促进干细胞分化成具有神经元特性的细胞的方法包括:在该干细胞中用该诱导药物调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质是CREB1。在另一实施方案中，CREBl被活化。在另一实施方案中，CREBl被去活化。在另一实施方案中，CREBl被活化，然后被去活化。在另一实施方案中，CREBl被去活化，然后被活化。在另一实施方案中，CREBl促进该干细胞的分化或增殖。在另一实施方案中，CREBl促进或诱导多巴胺表达。
[0035]在一个实施方案中，该诱导或促进干细胞分化成具有神经元特性的细胞的方法包括:在该干细胞中用该诱导药物调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质是CaMKII。在另一实施方案中，CaMKII被活化。在另一实施方案中，CaMKII被去活化。在另一实施方案中，CaMKII被活化，然后被去活化。在另一实施方案中，CaMKII被去活化，然后被活化。在另一实施方案中，CaMKII促进该干细胞的分化或增殖。在另一实施方案中，CaMKII调节微管装配。
[0036]在一个实施方案中，该诱导或促进干细胞分化成具有神经元特性的细胞的方法包括:在该干细胞中用该诱导药物调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质是MAPT。在另一实施方案中，MAPT被活化。在另一实施方案中，MAPT被去活化。在另一实施方案中，MAPT被活化，然后被去活化。在另一实施方案中，MAPT被去活化，然后被活化。在另一实施方案中，MAPT促进该干细胞的分化或增殖。在另一实施方案中，MAPT调节微管装配。
[0037]在一个实施方案中，此处提供了一种诱导或促进干细胞分化成具有降低的免疫原性(immunogenicity)的细胞的方法,该方法包括:(a)使该干细胞与诱导药物接触；(b)在该干细胞中用该诱导药物调节一种或多种蛋白质，其中该一或多种蛋白质包括:fct2B、Fzd6、Dvl3、FRATl、GSK3 β、HDAC6、β _ 联蛋白、G a q/11、G β、RXRa、RARβ、GLuRl、ΡΙ3Κ、AKtl、AKt2、AKt3、mT0R、EIF4EBP、CREBl、TH(酪氨酸羟化酶)、PLC_β、PIP2、CaMKI1、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、钙依赖磷酸酶、CRMP-2、NFATl、输入蛋白、LEFl、Pitx2、MEF2A或EP300 ;以及(c)诱导或促进该干细胞分化成具有降低的免疫原性的细胞。
[0038]在一个实施方案中，该干细胞是哺乳动物滋养层干细胞。在另一实施方案中，该干细胞是哺乳动物胚胎干细胞。在另一实施方案中，该干细胞是哺乳动物经诱导的多能干细胞。在另一实施方案中，其中该干细胞是内胚层、中胚层、外胚层或间质干细胞。在另一实施方案中，该干细胞来自小鼠、大鼠、人类、黑猩猩、大猩猩、犬、猪、山羊、海豚或牛。在另一实施方案中，该干细胞来自人类。在另一实施方案中，该干细胞是人类滋养层干细胞。
[0039]在一个实施方案中，此处描述了诱导或促进干细胞分化成具有降低的免疫原性的细胞的方法，其中该具有降低的免疫原性的细胞是神经干细胞(NSC)、多巴胺生成细胞、多巴胺能神经元、单极神经元、双极神经元、多极神经元、锥体细胞、浦肯野细胞以及前角细胞、篮状细胞、贝茨细胞、闰绍细胞、颗粒细胞或中等棘细胞。在另一实施方案中，该具有降低的免疫原性的细胞不会诱导免疫反应或者可以抑制免疫反应。在另一实施方案中，该具有降低的免疫原性的细胞不会诱导免疫反应，或者可以通过T细胞、B细胞、巨噬细胞(macrophage)、小神经胶质细胞(microglia cell)、肥大细胞(mast cell)或NK细胞来抑制免疫反应。
[0040]在一个实施方案中，该诱导或促进干细胞分化成具有降低的免疫原性的细胞的方法包括:使该干细胞与诱导药物接触，其中该诱导药物包括视黄酸、烟酰胺或β_巯基乙醇、维生素Β12、肝素、腐胺、生物素或Fe2+、丁基羟基苯甲醚、丙戊酸、福司柯林、5-氮胞苷、吲哚美辛、异丁基甲基黄嘌呤或胰岛素。
[0041]在一个实施方案中，该诱导或促进干细胞分化成具有降低的免疫原性的细胞的方法包括:在该干细胞中用该诱导药物调节一种或多种蛋白质，其中该调节包括:增加该一种或多种蛋白质中的至少一种的活性。在另一实施方案中，所述调节包括:增加该一种或多种蛋白质中的至少一种的表达。在另一实施方案中，该增加表达包括:增加编码该一种或多种蛋白质中的至少一种的mRNA的量，或者增加由mRNA翻译而来的该一种或多种蛋白质中的至少一种的量。在另一实施方案中，所述调节包括:降低该一种或多种蛋白质中的至少一种的活性。在另一实施方案中，所述调节包括:减少该一种或多种蛋白质中的至少一种的表达。在另一实施方案中，该减少表达包括:减少编码该一种或多种蛋白质中的至少一种的mRNA的量，或者减少由mRNA翻译而来的该一种或多种蛋白质中的至少一种的量。
[0042]在一个实施方案中，该诱导或促进干细胞分化成具有降低的免疫原性的细胞的方法进一步包括:诱导或促进该干细胞分化成具有神经元特性的细胞，其中该神经元特性包括多巴胺、谷氨酸NMDA受体的亚基、突触蛋白1、α-钙离子通道标记、GAP-43、电压依赖的K+通道、电压依赖的Ca+通道或电压依赖的Na+通道的表达。
[0043]在一个实施方案中，该诱导或促进干细胞分化成具有降低的免疫原性的细胞的方法包括:在该干细胞中 用该诱导药物调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质是NFAT0在另一实施方案中，NFAT被活化。在另一实施方案中，NFAT被去活化。在另一实施方案中，NFAT被活化，然后被去活化。在另一实施方案中，NFAT被去活化，然后被活化。在另一实施方案中，NFAT促进该干细胞的分化或增殖。在另一实施方案中，NFAT调节微管装配。
[0044]此处还描述了诱导或促进人类滋养层干细胞分化成具有降低的免疫原性或者可以抑制免疫反应的tNSC (滋养层神经干细胞)的方法，该方法包括:(a)使该人类滋养层干细胞与诱导药物接触；(b)在该干细胞中用该诱导药物调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质包括:Wnt2B、Fzd6、Dvl3、FRATl、GSK3P、HDAC6、β _ 联蛋白、G a q/11、G β、RXR α、RAR β、GLuRl、ΡΙ3Κ、AKt 1、AKt2、AKt3、mTOR、ELF4EBP、CREBl、TH (酪氨酸羟化酶)、PLC-β、ΡΙΡ2、CaMKI1、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、钙依赖磷酸酶、CRMP-2、NFATU输入蛋白、LEFl、Pitx2、MEF2A或EP300 ;以及(c)诱导或促进该人类滋养层干细胞分化成tNSC ο
[0045]在一个实施方案中，该诱导或促进人类滋养层干细胞分化成具有降低的免疫原性或者可以抑制免疫反应的tNSC(滋养层神经干细胞)的方法包括:使该人类滋养层干细胞与诱导药物接触，其中该诱导药物包括视黄酸、烟酰胺或β -巯基乙醇、维生素Β12、肝素、腐胺、生物素或Fe2+、丁基羟基苯甲醚、丙戊酸、福司柯林、5-氮胞苷、吲哚美辛、异丁基甲基黄嘌呤或胰岛素。在另一实施方案中，该tNSC不会诱导免疫反应，或者可以通过免疫细胞来抑制免疫反应。在另一实施方案中，该免疫细胞是T细胞、B细胞、巨噬细胞、小神经胶质细胞、肥大细胞或NK细胞。
[0046]此处还描述了一种抑制肿瘤细胞的方法，其包括:使肿瘤细胞与化合物接触；调节肿瘤细胞中的芳基烃受体(AhR);以及通过调节来抑制该肿瘤细胞。另外，此处描述了减少肿瘤细胞生长的方法，包括:使肿瘤细胞与治疗剂接触；调节肿瘤细胞中的AhR ;以及通过调节来减少该肿瘤细胞的生长。在一个实施方案中，调节AhR包括抑制所述细胞中的AhR蛋白质活性。在另一实施方案中，调节AhR包括抑制所述细胞中的AhR基因表达。在另一实施方案中，肿瘤细胞被杀死。在另一实施方案中，肿瘤是肺、乳腺、结肠、脑、骨、肝、前列腺、胃、食管、皮肤或白血病肿瘤。在另一实施方案中，肿瘤是实体或液体肿瘤。在另一实施方案中，用AhR促效剂调节AhR。在另一实施方案中，用AhR拮抗剂调节AhR。在另一实施方案中，用具有抗雌激素活性的化合物调节AhR。在另一实施方案中，用具有抗雄激素活性的化合物调节AhR。在另一实施方案中，该肿瘤细胞存在于哺乳动物中。在另一实施方案中，该肿瘤细胞存在于人类中。
援引并入
[0047]本说明书中所提及的所有出版物和专利申请通过引用以同种程度并入本文，如同各个个别的出版物或专利申请被特定地以及个别地指明通过引用而并入。
【专利附图】

【附图说明】
[0048]本发明的新特征在随附的权利要求中被详细地描述。通过参考以下对在其中利用到本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图，可以获得对本文所述的特征和优点的更好的理解，在附图中:
[0049]图1显示hTS细胞中多能性(pluripotence)以及再生(renewal)的特性。(Ia)通过RT-PCR分析所测量的，hTS细胞表达内细胞群(inner cell mass, I CM)与滋养外胚层(trophectoderm)这两者的特定基因。(Ib)说明如通过免疫细胞化学染色法(immunocytochemical stainin`g)所看见的特异性阶段胚胎抗原-1、_3 及-4[specificstage embryonic antigen (SSEA) -1, -3, and-4]的表达以及细胞内定位(暗化的斑点)。在hTS细胞中(上区)，SSEA-1大部分在细胞质中表达(左上区)，SSEA-3在核中表达(中间上面区)，而SSEA-4在细胞质以及膜这两者中表达(右上区)。这些SSEA-表达的细胞在组织学上与异位绒毛细胞滋养层(ectopic villous cytotrophoblasts)相同(下区)。(Ic)通过末端限制片段 Southern 印迹分析[Terminal Restriction Fragment (TRF) Southernblot analysis]所测量的、第3与第7代hTS细胞培养物的未改变的端粒(telomere)长度(上区及下区)。(Id)文氏图(Venn diagram)说明在hTS (859基因)以及滋养层关联性胎盘衍生的间质干细胞(placenta derived mesenchymal stem cells,PDMS cells) (2449基因)中基因表达的微阵列分析(microarray analysis)。总数为2, 140以及3, 730的基因在hTS细胞以及滋养层关联性PDMS细胞中表达(倍数变化> 2倍)。(Ie)说明来自于对不同浓度的白血病抑制因子(LIF)[即500、250、125U/ml ;U:单位/ml，肌动蛋白(Actin):β -肌动蛋白作为对照样品]反应的转录因子表达的反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析的结果。LIF的撤除在hTS细胞中抑制0ct4以及Sox2，但是过度表达Nanog以及Cdx2。(If)LIF(125U/ml)促进hTS细胞中Nanog、Cdx2、Sox2以及0ct4的表达的流式细胞分析(左区)。直方图显示在Nanog与Cdx2中负向剂量-依赖的方式(左区)以及在0ct4与Sox2中正向剂量-依赖的方式(右区)。(Ig)在妇女中输卵管(fallopian tubes)的不同节段中LIF水平的生理学分布图，特别是输卵管中从壶腹(ampulla)朝向峡部(isthmus)的LIF水平的生理学降低。0ct4、Nanog以及Sox2相对于Cdx2的相对比例各自在输卵管的3个不同节段中显示剂量_依赖性(dose-dependency)。(Ih)不同的siRNAs对于hTS细胞中特定的转录物Nanog与Cdx2的效果通过RT-PCR(左边)以及流式细胞分析(右边)进行分析，说明了在hTS细胞的多能性的维持方面Nanog与Cdx2之间的交互关系。数据表示3次分析的平均值土SD。(Ii)基因强度的直方图在hTS细胞中显示均质型，而在PDMS细胞中显示二相的型态(biphasic pattern)。
[0050]图2说明视黄酸(RA)诱导hTS细胞分化成为各种不同的表型的神经干细胞。(2a)各种不同的神经祖细胞亚型(neural progenitor subtypes)的分布，包括神经胶质限制的前体细胞(glial restricted precursors, GRP)、神经元限制的前体细胞(neuronal restricted precursors, NRP)、多倉泛性神经干(multipotent neural stem, MNS)细胞、星形胶质细胞(astrocytes, AST)以及未定义的滋养层巨细胞(trophoblast giantcells, TGC)。在随时间(例如，1、3、5及7天)的RA诱导期间以一致的比例所分布的hTS细胞衍生的神经祖细胞亚型的频率，分别从第I至第4列显示。η:表示被计数的总细胞数。(2b)在I天RA (10 μ Μ)诱导之前与之后hTS细胞的神经干细胞相关的基因的表达的RT-PCR分析，包括由经RA(IOyM)诱导的hTS细胞所生成的巢蛋白、Oct-4、神经丝、Ngn3、Neo-D,MAP-2以及⑶133。(2c)如由流式细胞分析所观察到的，3天和5天RA-诱导的hTS细胞这两者表达阳性的免疫反应性神经干细胞基因，包括神经丝蛋白、巢蛋白以及GFAP，它们在分布上维持相似的比例。(2d)该(神经干细胞)tNSCs所表达的免疫反应性巢蛋白、酪氨酸轻化酶-2(TH_2)以及5-轻色胺(serotonin)的免疫细胞化学分析(Immunocytochemicalanalysis)。(2e)通过流式细胞分析所进行的hTS细胞、tNSCs以及hES(人类胚胎干)细胞中的免疫相关基因的比较性表 达:HLA-ABC(MHC I型)在hTS细胞(99.4%)以及tNSCs中高度表达但是在hES细胞中较低。HLA-DR(MHC II型)在该细胞中不表达。(2f)通过流式细胞分析所进行的hTS细胞、tNSCs以及hES细胞中的免疫相关基因的比较性表达:在该细胞中CD14以及CD44的表达上未观察到差异。增殖因子(Proliferative factor)⑶73在hTS细胞以及tNSCs中高度表达，但是在hES细胞中阴性表达。(2g)通过流式细胞分析所进行的hTS细胞、tNSCs以及hES细胞中的免疫相关基因的比较性表达:跨膜受体CD33 (transmembrane receptor CD33)在 hTS 以及 hES 细胞中表达但未在 tNSCs 中表达。⑶45在所述细胞中不表达。(2h)通过流式细胞分析所进行的hTS细胞、tNSCs以及hES细胞中的免疫相关基因的比较性表达:在hTS细胞、tNSCs以及hES中的间质干细胞标记⑶105的表达上没有发现强度上的差异，然而，相较于hTS细胞(93.6%)以及hES细胞(98.8%)，较少的癌症干细胞标记⑶133 (11.8%)在tNSCs中表达。
[0051]图3说明RA-诱导的基因表达。(3a)说明RA(10 μ Μ)在活化tNSCs中的c_Src/Stat3/Nanog途径上的效果。通过RT-PCR分析所测定的(n=3), RA诱导c_Src的明显的表达，波峰在第15分钟之时，然后维持在较低的水平。(3b)通过Western印迹分析(western blot analysis),显示RA在第30分钟、第I小时、第2小时以及第4小时之时分别刺激RXRa、c-Src以及RARP表达。RA诱导在30分钟内促进G a q/ΙΙ以及G β这两者的表达，暗示G蛋白信号传递(G proteins signaling)的涉入。(3c)免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)分析证明RXRa以及RAR0之间经RA诱导的直接结合；然而，此交互作用被C-Src抑制剂PPl类似物阻断，显示c-Src涉及RXRα与RAR0的结合以形成支架蛋白质复合体(scaffolding protein complex)。(3d) IP测定分析显示:RXR α具有与Ga q/ll的独立的结合交互作用而RAR0具有与GP的独立的结合交互作用。(3e)说明在hTS中经RA诱导的c-Src的早期生成、Stat3在Tyr705位点明显的磷酸化以及Nanog在第I小时之时的活化的Western印迹分析；对照样品使用β _肌动蛋白。(3f)根据Western印迹分析,此c_Src蛋白质的快速生成接着诱导Stat3在Tyr705位点的磷酸化以及Nanog的过度表达。根据Western印迹分析,c-Src抑制剂PPl类似物(4 μ Μ)抑制RA-诱导的Stat3在Tyr705的磷酸化以及Nanog的表达。添加RA不能回复这种抑制作用。(3g)说明RA刺激Stat3与Nanog启动子的结合交互作用的染色质免疫沉淀(chromatinimmunoprecipitation, ChIP)测定分析。输入:裂解产物，C:对照。
[0052]图4说明双免疫金突光透射电子显微术(double immunogold fluorescencetransmission electron microscopy, IEM)分析结果。显示了 RA-诱导的在细胞质膜处小的金粒子标记的RXR α (6 μ Μ)与大的金粒子标记的G a q/11 (20 μ Μ)之间的结合交互作用。根据动态共焦免疫突光显微术(dynamic confocal immunofluorescence microscopy),经免疫染色的RXRa以及Ga q/ΙΙ在细胞质或核中主要呈现均质特征(图4，上区)。通过RA处理5分钟，细胞溶质的RXR α强度在核周区域增加而核的强度减少(第I列)，显示在刺激之后的细胞溶质转位(cytosolic translocation)。核的RXRa强度在第15分钟时变得显著，而细胞溶质的强度减少。这些现象显示:核中活性的增加维持细胞中的稳定状态。在30分钟内再次观察到明显的细胞溶质转位。另一方面，Ga q/ΙΙ表达的区隔变化与RXRa表达的区隔变化相似(第2列)。
[0053]图5说明将GFP-标记的tNSCs (3X IO6)移植至帕金森氏症(PD)大鼠中的分析。(5a)经阿朴吗啡(apomorphine)诱导的旋转测试(rotation test)的分析；a组(深色阴影的圆，n=4)，它是关于接受tNSC s移植的PD大鼠，显示从植入后的第3周至第12周在对侧旋转上显著的减少；b组(浅色阴影的圆，n=4)，它是关于接受5天RA处理的hTS细胞的PD大鼠，显示在植入后的第6周时最初的显著改善，但是此改善在经过第12周期间逐渐减少；以及c组(三角形，n=4)，它是关于作为对照组的未经处理的H)大鼠，显示没有改善。通过重复测量ANOVA所进行的统计学分析:p值=0.001，以及在重复测量ANOVA之后的2组之间的LSD事后比较(LSD post hoc comparisons):在第6周时p=0.037 (a组对c组)以及ρ=0.008 (b组对c组)；在第9周时ρ=0.019 (a组对c组)；在第12周时ρ=0.005 (a组对c组)以及p=0.018 (a组对b组)。*表示P < 0.05。(5b)说明在植入后的第18周时在a组的损伤的纹状体(lesioned striatum)中的TH-阳性免疫组织化学染色(上区)；免疫荧光显微镜分析显示:免疫荧光的GFP-标记的tNSCs仍然存留在损伤的纹状体中，在注射部位处具有斑点形成(下区)。(5c)说明在植入后的第18周时在a组的损伤的黑质致密(substantia nigra compacta, SNC)中所再生的TH-阳性神经元(上区);显示了末端区域的放大(左下区)，比例尺:100 μ M ;免疫荧光显微镜分析显示:免疫荧光的GFP-标记的tNSCs呈散射分布(scattered distribution)存留(右下区，箭头表示GFP-标记的tNSCs)。(5d)说明在植入后的第18周时b组的免疫组织化学染色:没有TH阳性细胞在左边损伤的纹状体(str,上区)或丘脑下核(subthalamic nucleus) (stn,下区)中被发现。(5e)说明在植入后的第18周时c组的免疫组织化学染色:没有TH染色的细胞在左边损伤的纹状体(str，上区)或损伤的SNC (下区)中被发现；箭头表示植入针轨迹。
[0054]图6说明在一个注射部位将tNSCs (1.5X IO6)移植到“老年(aged) ’TD大鼠(n=16 ；体重，630_490gm)的损伤的纹状体中的结果。行为评估(Behavioral assessments)在植入后每3周进行分析。结果显示:从植入后的第3周至第12周所评估的行为障碍(behavioralimpairments)有显著的改善。Student t 检验(Student t test):*p < 0.05 作为统计学显著性。**p < 0.01以及< 0.001。(6a)阿朴吗啡诱导的旋转测试的分析证明:与作为对照组的未经处理的“老年"PD大鼠(i组；η=8，未经填充的圆)相比，接受tNSCs植入的老年H)大鼠(ii组，n=8，经填充的圆)从第3周至第12周显著地改善了旋转数。(6b)说明有关运动失能症(秒)的行为评估结果。^c)说明有关步伐长度(step length) (mm)的行为评估结果。(6d)说明有关跨步长度(stride length) (mm)的行为评估结果。(6e)说明有关步行速度(walking speed) (cm/秒)的行为评估结果。(6f)说明有关支撑的基础(_)的行为评估结果。^g)说明针对行为评估所分析的步态:A与正常大鼠相关，B与在细胞移植之前的偏侧帕金森氏症大鼠(hemiparkinsonian rats)相关,且C与在细胞移植之后的偏侧帕金森氏症大鼠相关。
[0055]图7说明在适当的诱导之后，hTS细胞表达全部3种原胚层(primary germlayers)的组分,包括外胚层(ectoderm)、中胚层(mesoderm)以及内胚层(endoderm);各个区的左列是关于在诱导之前的基因表达；各个区的右列是关于在诱导之后的基因表达。
[0056]图8说明流式细胞分析结果，显示hTS细胞表达间质干细胞标记[⑶90、⑶44、CK7、波形蛋白(Vimentin)以及神经丝]并且对于造血干细胞标记(hematopoietic stem cellmarkers) [CD34、CD45、 a 6-整合蛋白(a 6-1ntegrin)、E_ ?丐黏素(E-cadherin)以及 L-选择素(L-selectin)]是阴性的。
[0057]图9显示在适当的诱导下，hTS细胞会被分化成为各种不同的特定的细胞表型(cell phenotypes)。
[0058]图10说明将hTS细胞皮下移植至雄性严重联合免疫缺陷(severe combinedimmune deficiency, SCID)小鼠中在植入后的第6_8周仅造成与类黏液样奇异型细胞(myxoid-like bizarre cells)的轻微嵌合反应(minor chimeric reaction)的组织学分析(histological analysis)(经填充的、黑色的箭头标示奇异型细胞；未经填充的箭头标示肌纤维；“NT”标示针轨迹)。
[0059]图11染色体分析显示:hTS细胞不会改变核型的型态(46，XY)。为了检查世代中的细胞寿命，根据Southern印迹分析，在第3与第7代培养物之间未观察到端粒长度的显著缩短(图1c)。
[0060]图12说明用于细胞分化的某些培养基。
[0061]图13说明用于RT-PCR的PCR引物。
[0062]图14说明AhR在细胞质膜处作为信号分子的分析，包括通过Huh-7细胞中BBP(I μ M)的导入，在细胞质膜处经转染的pGFP-Cl-AhR的活性。(14a)所显示的图像是通过TIRF显微镜分析所测量的GFP-标记的AhR的相对强度的表达。圆以及箭头表示随着时间的推移所测量的区域:刺激前(第I区)、波峰处(第2区)以及静止时(第3区)。图(第4区)显示在大约第2分钟时发现峰值，以箭头表示添加BBP的时间。(14b)对BBP有反应的memAhR的定量RT-PCR分析显示在第5分钟时快速的上升，在第15分钟时达到波峰，继而在第2小时之时逐渐的下降至较低的平台水平。误差条(Error bars)表示标准偏差(standard deviation)。*, p < 0.05, t_ 检验(n=3)。(14c)Western 印迹分析的分析显示:BBP在第15分钟时促进AhR上升继而在第30分钟时轻微的下降并在第60分钟时再上升。(14d)Western印迹分析的分析显示:BBP在第30分钟时诱导Ga q/11以及GP这两者的生成。(He)免疫沉淀(IP)分析显示在BBP刺激之后AhR与G a q/11之间的交互作用，字母C代表对照。(14f)通过Western印迹分析所测量的，由siRNA所造成的AhR的敲除证明:BBP抑制Huh-7细胞中AhR与G a q/11这两者的表达，字母S代表作为阴性对照的混杂的SiRNA0 [0063]图15说明动态免疫荧光成像的结果。(15a)说明未经处理的对照细胞的免疫染色；观察到AhR以及Ga q/11主要在Huh-7细胞的核中表达并且微弱地在细胞溶质中表达；带状比例尺(bar scale):50 μ M。(15b)用BBP (I μ Μ)处理5以及15分钟的细胞各自显示AhR与G a q/11这两者从核至细胞溶质隔室(cytosolic compartment)的转位。经免疫染色的G a q/11在第15分钟时特异性地聚集在细胞膜处。(15c)用AhRsiRNA转染的细胞强烈地降低细胞溶质与核的隔室这两者中的AhR强度(上区)，而用混杂的siRNA转染不会改变免疫染色强度(下区)。(15d)BBP在15分钟之后回复具有预转染的AhR siRNA的细胞中AhR与6%/11这两者的强度。
[0064]图16说明双免疫金透射电子显微镜分析的结果。(16a)免疫金染色的G a q/11 (白色箭头)会在作为对照的Huh-7细胞中的细胞膜处作为单一的或双重的或三重的实体存在。(16b)在第20分钟时，经BBP (I μ Μ)处理的细胞显示免疫金标记的AhR粒子(呈6nm的大小，黑色箭头)与免疫金标记的Gaqm粒子(呈20nm的大小，白色箭头)的交互作用，其形成复合体，在细胞膜处作为不同的实体出现:单体的(monomeric)(未显示)、二聚体的(dimeric)(未显示)、三聚体的(trimeric)(左边)以及聚合的(polymeric)(右边)实体。(16c)在细胞膜处所出现的AhR以及Ga q/11的三聚复合体。CM:细胞膜，N:核，以及带状比例尺:500nm。
[0065]图17说明“拉与推”机制以及生化过程。(17a)说明在Huh-7细胞中对BBP处理有反应的Ga q/11信号级联(signaling cascades)的测量。Western印迹分析显示:BBP (I μ Μ)在第30分钟时触发G a q/11与G β这两者的生成。经活化的G a q/11导致PIP2减少，造成IP3R水平增加。(17b)说明对免疫突光的Fluo-4-标记的钙(immunofIuorescentFluo-4-labled calcium)在Huh_7细胞中的反应性的分析。显示的是未经标记的细胞(左上区)以及Fluo-4-标记的钙(绿色，左下区)。还显示了在ΒΒΡ(1 μ M)刺激(箭头)之后在BSS培养基(中上区)以及无钙培养基(中下区)中的相对钙水平的变化。培养在具有预处理的IP3R抑制剂2-ΑΡΒ(100μΜ，1小时)的无钙培养基中的细胞(右上区)显示在钙密集上的减少(右上区)，它以剂量反应方式(dose-response manner)发生(y=-0.4x+2.5, R2=0.94)(右下区)。误差条表示平均值的标准偏差(n=5)。(17c) Western印迹分析的结果指示:用2-APB (30 μ Μ，I小时)预处理抑制了经BBP诱导的C0X-2表达，字母C表示对照。(17d)说明Western印迹分析的结果，显示BBP (I μ M)经由AhR/Ca2+/ERK/C0X-2途径诱导C0X-2的过度生产。ERKI/2在BBP处理之后第15分钟时被磷酸化并在第30分钟时被去磷酸化。(17e)说明Western印迹分析的结果，显示用化学品Η)98059 (20 μ M，I小时，Calciochem)预处理抑制了经BBP诱导的C0X-2表达，字母C表示对照。(17f)说明用ΒΒΡ(1 μ Μ)进行处理显著地抑制了 ARNT水平(隔夜所测量的)。数据表示为平均值土SD, η=3,且*:Student 1:检验,口<0.01。(17g)说明“拉与推”机制的示意图，该机制构成经由GPCRs-G蛋白信号传递的配体诱导的非基因组AhR信号传递途径的基础。
[0066]图18说明LIF对Nanog表达的效果。(18a)说明LIF促进Nanog的表达。左区说明:根据hTS细胞中的流式细胞分析，Nanog表达是以负向剂量依赖的方式而显著地被抑制。数据表示为3次分析的平均值土SD。*p < 0.01 (Student t检验，n=3)。右区说明当hTS细胞与RA(IOyM)预孵育过夜接着用不同水平(B卩，各125、250以及500U/mL)的LIF处理I天时的相对Nanog表达。(18b)说明根据流式细胞分析，RA诱导(I天孵育，10 μ Μ)在hTS细胞中刺激Nanog以及0ct4的表达，但不刺激Cdx2以及Sox2的表达。
[0067]图19说明在老年的H)大鼠中对行为改善的评估。(19a)说明在植入后第12周时对一系列的脑部切片(30 μ m)上的TH+神经元进行的免疫组织化学显示:大量重新再生的TH-阳性神经元出现在损伤的黑质纹状体途径中(左边部分)。在SNC区域中，TH-阳性神经元呈现具有从细胞体中突起的多重外生(multiple outgrowths)以与宿主组织一起形成神经元回路(neuronal circuitries)的特征。在一只大鼠中的再生的多巴胺能神经元的数目占相对的正常侧的28.2%(n=5)。(19b)与正常侧相比，大鼠的损伤的SNC中多巴胺能神经元的数目再生至28.2%。
[0068]图20: (20a)说明通过RT-PCR测得的ICM与滋养外胚层(TE)这两者的特定基因的表达；(20b)说明用FlB-GFP质粒构建体的DNA混合物转染hTS细胞以产生超过95%的成功率；(20c)说明经RA诱导的eIF4B的生成的时程；(20d)说明使用eIF4B抑制了 c_Src的活化；(20e)说明IP分析显示:活性的c-Src直接结合至Stat3 (信号转导及转录激活蛋白);(20f)说明 c-Src siRN A 抑制 Stat3 的表达；(20g)说明 Stat3siRNA 抑制 Nanog 的表达；以及(20h)说明在hTS细胞中经由亚细胞c-Src mRNA定位的RA-诱导的c-Src/Stat3/Nanog途径的方案。
[0069]图21说明Ga q/11信号传递途径的活化:(21a)说明通过Western印迹法，在RA处理(10 μ M)之后Gaqm途径相关的组分随着时间的表达；(21b)说明在被培养在无钙培养基中并且在RA处理之前20分钟用配于BSS缓冲液中的Fluo4(l μ Μ)预装填的hTS细胞中的实时活细胞成像显微镜分析(real-time live cell imaging microscopy)(Cell-Rsystem, Olympus, Tokyo)。(a) RA-诱导的细胞内钙的消耗通过以SOCE型态添加CaCl2 (2mM)而被回复。(b) RA-诱导的细胞内钙水平被2-APB (10分钟)以显著的剂量依赖的方式抑制(R2=0.8984)。(c)在ER钙的消耗之后，KCl (60mM)能够激活L-型钙离子通道(L-type calcium channels)。(d)在ER 钙消耗之后，KCl-依赖的L-型钙离子通道被抑制剂硝苯地平(nifedipine) (5 μ Μ)阻断。η:被计数的总细胞；(21c)说明CaMKII直接与CREBl以及eIF4B交互作用；(21d)说明通过Western印迹法，eIF4B siRNA抑制CaMKI1、钙依赖磷酸酶以及eIF4B的表达；(21e)说明根据Western印迹法，KN93 (I μ M，2小时)抑制eIF4B表达；(21f)说明帕金蛋白直接与CaMKII以及MAPT交互作用；(21g)说明SNCA直接与MAPT交互作用；(21h)说明MAPT与GSK3P以及α-微管蛋白(a-tubulin)交互作用；(21i)说明根据Western印迹法，2-APB抑制钙依赖磷酸酶、NFATl以及MEF2A的表达；(21 j)说明输入蛋白与NFATl之间的直接交互作用；(21k)说明根据分离分析(fractionalassay), RA刺激NFATl核转位(nuclear translocation)。核纤层蛋白A/C:核的标记以及α-微管蛋白:细胞质的标记；(211)说明Akt2直接与GSK3i3交互作用；(21m)说明在动态变化中使用不同抗体所显示的，用RA处理4小时(空白的柱)和24小时(黑色的柱)的细胞中GSK30表达的流式分析(flow analysis)。数据显示平均值土SD,n=3 ； (21η)说明流式细胞分析显示Akt2siRNA抑制RA-诱导的GSK3 β表达。
[0070]图22说明转录复合体(transcriptional complex)的形成:(22a)说明β -联蛋白与LEFl之间(上面)以及LEFl与Pitx2之间的交互作用；(22b)说明通过RA处理(4小时),LEFl转录基因Pitx2而不转录基因Pitx3 ； (22c)说明根据Western印迹法,MEF2A直接与NFATl、MEF2A、Pitx2、SNCA以及EP300交互作用；(22d)说明根据Western印迹法，RA诱导MEF2A、EP300以及Pitx2随着时间的生成；(22e)说明根据Western印迹法，NFATlsiRNA抑制MEF2A的表达；(22f)说明CREBl靶向在MEF2A基因的启动子处；(22g)说明MEF2A转录基因SNCA(上面)、TH(中间)以及MEF2A本身(下面)；(22h)说明根据Western印迹法，MEF2A siRNA 抑制 EP300、Pitx2 以及 MEF2A 的表达；(22i)说明 EP300 靶向在 HDAC6 (上面)以及TH(下面)基因的启动子处；(22j)说明通过Western印迹法，在第4小时以及第24小时时间点各种不同的分子活性的鉴定。缩写，IP:免疫沉淀分析；ChIP:染色质免疫沉淀分析。
[0071]图23说明在hTS细胞中RA-诱导的神经生成(neurogenesis)的调节网路示意图(上区)。2种mRNA翻译的机制:帽盖依赖的(cap-dependent)(左下)和不依赖帽盖的(cap-1ndependent)(右下)。灰色的线:时空信号传递途径；黑色的线:转录途径；双向的箭头:分子连接至其它途径。
[0072]图24说明RA信号传递促进Wnt2B/Fzd6/i3-联蛋白途径:(24a)说明流式细胞分析显示:通过经预处理的fct2B siRNA的抑制作用过夜所证明，RA(IOyM)显著地诱导Wnt2B、Dvl3以及FRATl的活化但是抑制GSK3 β。数据显示平均值土SD ；n=3 ； (24b)说明由RART-PCR所造成的增加的Fzd6mRNA表`达。数据显示平均值土SD ;n=3，*:通过Student检验p<0.05 ； (24c)说明通过Western印迹法，RA诱导β -联蛋白以及HDAC6的表达随着时间的改变；(24d)说明IP分析显示--与RA过夜孵育所造成的HDAC6与β -联蛋白之间的物理交互作用；(24e)说明在过夜孵育之后,根据分离测定(fractionation assay), RA诱导β_联蛋白的核/细胞质转位。核纤层蛋白以及α-微管蛋白分别作为核的以及细胞质的标记；(24f)说明共焦免疫荧光显微术显示:RA-诱导的β -联蛋白以及HDAC6的动态变化显示β -联蛋白在第30分钟时的核转位，它被HDAC6siRNA抑制；(24g)说明细状的β -联蛋白在RA处理的第5分钟出现在突触区域中(箭头)。
[0073]图25说明共焦免疫荧光显微镜分析。在对抗HDAC6的siRNA的存在下，β -联蛋白的核定位被阻断。
[0074]图26说明在细胞膜处的分子事件:(26a)说明根据Western印迹法，RA诱导Gaq/11> , RXRa以及RARi3随着时间的生成。β _肌动蛋白作为对照；(26b)说明实时共焦免疫荧光显微镜分析，显示代表性GFP标记的RXRa在RA刺激之后的第0、4.5及13分钟从核周区域朝向细胞膜(箭头)的移动。在核中没有RXRa是可见的。正常相差(左上)和荧光图像(右上)。条(Bar)表示30 μ M ; (26c)说明相对定量的GFP标记的RXR α在时程上从核(N)至细胞膜(M)的强度上的动态移动与变化。正常相差以及荧光成像显示在右上处；(26d)说明代表性成像显示RA在第5分钟时所造成的RXR α以及G a q/11在细胞膜处的共表达；(26e)说明在RA处理20分钟之后在细胞膜处所观察到的双免疫金标记的RXR α (6 μ M ;黑色箭头)以及G a q/11 (20 μ M ；白色箭头)。N:核；(26f)说明RXR a siRNA抑制RA-诱导的G a q/11与RXR α的交互作用(24小时)；(26g)说明RAR β siRNA抑制RA-诱导的与RARii的交互作用以及Gβ与ΡΙ3Κ的交互作用(24小时)。IP:免疫沉淀分析；IgG:阴性对照；C:阳性对照；(26h)说明IP测定分析显示:选择性c-Src抑制剂PPl类似物能够防止RXRa-RARP异型二聚物(heterodimer)的形成；(26i)说明通过双免疫金透射电子显微术所观察到的RA-诱导的 金粒子标记的RXRa在内质网(ER)中的锚定(anchorage)。
[0075]图27说明通过RT-PCR，RA刺激典型Wnt2B途径；在hTS细胞中处理(10 μ M)过夜之后，RA诱导Wnt2B信号传递途径的组分的表达，显示统计学上显著的结果；在过夜处理之后，Wnt2B siRNA抑制RA-诱导的Wnt2B途径的组分。
[0076]图28说明RXRa以及RAR^的局部合成:(28a)说明通过RT-PCR，RA(IOyM)在第15分钟时快速地诱导RXRa mRNA与RARP mRNA这两者的短暂上升。数据显示平均值土 SD, n=3, t检验*:p < 0.05 ； (28b)说明根据Western印迹法，RA诱导PI3K以及Akt异构型(isoforms)随着时间的表达；(28c)说明根据流式细胞术，PI3K抑制剂124005抑制RA-诱导的Akt异构型(24小时)。数据显示平均值土SD,n=3 ; (28d)说明根据Western印迹法，Akt3与mTOR交互作用，但是被Akt3siRNA抑制；(28e)说明根据Western印迹法，RA诱导mTOR的暂时性表达；(28f)说明Akt3siRNA抑制RA-诱导的mTOR的磷酸化；(28g)说明mTOR直接与4EBP1交互作用(4小时)；(28h)说明通过Western印迹法，对使用或未使用mTOR siRNA或4EBPlsiRNA预孵育的、用RA处理(4小时)的hTS细胞进行mT0R、4EBPl、eIF4E以及eIF4B的表达分析；(28i)说明根据Western印迹法，eIF4E siRNA抑制RA-诱导的RXRa与Gaqm之间(上面)以及RARi^与Gi3之间(下面)的交互作用(4小时)。
[0077]图29: (29a)说明通过RT_PCR，PI3K抑制剂在hTS细胞中过夜处理之后抑制RA-诱导的Akt异构型Aktl、2以及3的表达；(29b)通过RT-PCR，Akt2抑制剂抑制β-联蛋白mRNA的表达；(29c)根据流式细胞术，Akt3siRNA抑制mTOR的表达。
[0078]图30说明CREBl促进TH的转录:(30a)说明根据Western印迹法，CREBl直接与Aktl以及β -联蛋白交互作用；(30b)说明AktlsiRNA抑制CREBl的表达。β -肌动蛋白:对照；(30c)说明CREBl靶向在TH基因的启动子处；(30d)说明根据Western印迹法，CREBlsiRNA抑制TH的表达；(30e)说明免疫荧光组织分析显示在tNSCs植入H)大鼠脑后的第12周在治疗的SNC侧中的DA神经元(白色箭头)中TH-FITC(蓝色)以及TH_Cy-3 (红色)的共表达(右区)。在正常侧中(左上)以及在治疗侧中(左下)的经放大的DA神经元。在核中发现阳性CERBl染色；(30f)说明直方图显示DA神经元中所表达的TH以及CREBl在正常(左边；n=86)以及治疗侧(右边；n=114)中的相对平均强度。误差条:平均值土SD ；η:被计数的总细胞；p < 0.05:统计学上显著的。
[0079]图31说明免疫组织突光分析(immunohistofluoresence analysis):对照组的SNC中TH(+)以及NeuN (+)运动神经元(motor neurons)(箭头)(左上)。在6_0HDA损伤之后第I周减少的TH(+)(箭头)(右上)。在损伤后的第6周随着TH-阳性的神经末梢的扰乱，在TH(+)神经元上明显的减少(绿色颗粒)，以及各种不同的退化性空腔形成(红色爆炸性圆)(左下)。在移植之后，在退化性空腔的壁处(红色爆炸性圆；插图)的TH(+)神经元(箭头)带有突出至空腔(右下)中的TH(+)神经末梢(绿色)。
[0080]图32说明具有较少免疫反应的TH(+)以及GFAP(+)细胞的体内(in vivo)再生:(32a)说明在损伤后的第I与第6周时TH (+)细胞的数目分别减少为在损伤的SNC (深灰色)中的48%和13%以及在损伤的纹状体(浅灰色)中的78%和4%。在移植之后，TH(+)细胞在损伤的SNC以及纹状体中分别重新成长至67%以及73%(右区)。数据通过Tissuequest2.0 软件(TissueGnostics Gmbh, Vienna, Austria)进行分析；(32b)说明在损伤的SNC(Tg)中(显示放大图(左上，插图a))与无损伤侧(右上，插图b)相比的多巴胺能神经元的再生；(32c)说明相较于无损伤侧，在第12周时tNSCs的移植在损伤的SNC中的TH阳性神经元(箭头)上产生78.4±8.3%(平均值土SEM ;n=4)的复原率；(32d)说明在损伤后的第6周时在损伤的纹状体中TH-FITC(+)以及GFAP-Cy-3(+)Wilson束(Wilson’spencils)(空白箭头)的退化(左列)。在植入后的第12周(右列)，数个GFAP(+)细胞(箭头)出现在重新建立的Wilson束(空白箭头)的细纤维(fine fibers)内；(32e)说明免疫组织荧光成像分析，在由细胞大小(8-10 μ m的直径)的位置及其对应的GFAP-Cy-3强度所决定的门(gate)(左边的散布图)中的细胞被计数。门(红色散布图):被计数的神经胶质细胞(glial cells);黑色散布图:排除具有异常大小的细胞；蓝色散布图:具有异常GFAP强度的细胞。在纹状体中，相较于无损伤侧，在损伤侧中的GFAP(+)细胞在处理之前是65.5%，而在细胞治疗之后变成93.9%(右边的区)；(32f)说明hTS细胞植入至SCID小鼠中仅引起轻微免疫反应并且未观察到肿瘤形成(tumorigenesis)。类黏液样奇异型细胞(黑色箭头)，肌纤维(空白箭头)以及针轨迹(NT)。
[0081]图33说明通过在慢性H)大鼠中的免疫组织荧光散布图所测量的，利用TH-FITC与NeuN-Cy-3之间的决定系数(coefficient of determination),在细胞治疗之前以及之后SNC中的TH(+)细胞的鉴定。(33左上)说明正常的SNC =R2=0.72 ； (33右上)说明通过
6-0HDA损伤所造成的SNC (I周):R2=0.77 ； (33左下)说明通过6-0HDA损伤所造成的SNC (6周)=R2=0.25 ； (33右下)在tNSCs移植之后的SNC(12周)=R2=0.66。被显示的结果代表2只大鼠的平均值。
【具体实施方式】
[0082]神经组织衍生的干细胞(Neural tissue-derived stem cells)、衍生自多能胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESC)的表型特化的祖细胞(phenotype-specifiedprogenitor cells)以及衍生自各种不同的经转分化的非神经干细胞(transdifferentiated non-neural stem cells)的神经细胞已全部在针对它们生成神经元以及神经胶质(glia)的能力的临床前研究中得到探讨，并且神经干细胞在临床试验中的用途已被描述。虽然胚胎干(ES)细胞已显示作为细胞治疗剂(cell therapeutics)的可能性(Bjorklund, L.Μ.等人.Proc.Nat.Acad.Sc1.2002, 99, 2344-49)，但使用所述治疗是受限的并且与伦理关怀(ethical concerns)有关联。
[0083]干细胞具有自我更新(self-renewal)以及生成定向祖细胞(committedprogenitors)(包括神经干细胞)的能力(Reubinoff B.E.等人，Nat.Biotech.2001, 19，1134-1140)。[0084]此处提供了衍生自滋养层组织的经分离的神经干细胞。此处进一步提供了在细胞培养中是稳健的且存活数代并且还具有多能性(pluripotency)以及免疫豁免(immuneprivilege)的特性的经分离的神经干细胞(tNSCs)。在此处所描述的一个实施方案中，描述了一种用于从衍生自人类滋养层干(hTS)细胞的tNSCs诱导多巴胺能神经元的方法。此处进一步提供了容许经移植的tNSCs能存活并且生长成为多巴胺能神经元的方法，以及用于评估受损的行为的复原以达到与目前的治疗方案相比具有降低的变异性的结果的方法。
[0085]此处还提供了衍生自hTS细胞的经分离的神经干细胞，该hTS细胞没有使用小鼠胚胎饲养细胞(mouse embryonic feeder cells)进行培养，以防止可疑的污染。此处提供了用于有效率地且可再现地生成hTS细胞衍生的tNSCs的方法，该方法导致产生均匀混合的族群的子集合，可区别于其它用于从其它来源的细胞诱导多巴胺能神经元的方法。此处提供了用于将多巴胺能tNSCs以细胞悬浮液(cell suspension)移植至脑内的方法,从而防止与组织移植物有关联的不均匀的生长。
[0086]此处提供了用诱导药物来调节干细胞以分化成具有神经元特性的细胞的方法。在一个实施方案中，该诱导药物调节该干细胞中的一种或多种蛋白质的表达或活性。在一个实施方案中，该一种或多种蛋白质中的一种是Wnt2B、Fzd6、Dvl3、FRATU GSK3 β、HDAC6、β -联蛋白、Ga q/11、、RXRa、RAR^、GLuRU PI3K、AKtU AKt2、AKt3、mTOR、EIF4EBP、CREBl、TH (酪氨酸羟化酶)、PLC- β、PIP2、CaMKI1、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、钙依赖磷酸酶、CRMP-2、NFAT1、输入蛋白、LEFl、Pitx2、MEF2A*EP300。在一个实施方案中，该干细胞可以是滋养层、胚胎的或经诱导的祖干细胞。在一个实施方案中，该具有神经元特性的细胞是NSC、多巴胺生成细胞、多巴胺能神经元、单极神经元、双极神经元、多极神经元、锥体细胞、浦肯野细胞以及前角细胞、篮状细胞、贝茨细胞、闰绍细胞、颗粒细胞或中等棘细胞。
[0087]此处还提供了用诱导药物来调节干细胞以分化成具有降低的免疫原性的细胞的方法。在一个实施方案中，该诱导药物调节该干细胞中的一种或多种蛋白质的表达或活性。在一个实施方案中，该一种或多种蛋白质中的一种是Wnt2B、Fzd6、Dvl3、FRATU GSK3 β、HDAC6、β -联蛋白、Ga q/11、Gβ、RXRa、RARβ、GLuRl、ΡΙ3Κ、AKtU AKt2、AKt3、mTOR、EIF4EBP、CREBl、TH(酪氨 酸羟化酶)、PLC-β、PIP2、CaMKI1、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、钙依赖磷酸酶、CRMP-2、NFATl、输入蛋白、LEFl、Pitx2、MEF2A或EP300。在一个实施方案中，该干细胞可以是滋养层、胚胎的或经诱导的祖干细胞。在一个实施方案中，该具有降低的免疫原性的细胞不会诱导免疫反应，或者可以通过T细胞、B细胞、巨噬细胞、小神经胶质细胞、肥大细胞或自然杀伤(NK)细胞来抑制免疫反应。
人类滋养层干细胞(hTS细胞)
[0088]人类输卵管是妇女中受精的部位以及异位妊娠(ectopic pregnancies)的常见部位，其中有数种生物事件发生，诸如内细胞群(ICM)与滋养外胚层之间的区别化以及具有主要的表观遗传改变(epigenetic changes)的从全能性(totipotency)转换至多能性。这些观察提供有关输卵管在着床前的阶段作为用于获得囊胚关联性干细胞(blastocyst-associated stem cells)的栖位储存处(niche reservoir)的支持。异位妊娠在工业化国家中占全部怀孕的1%至2%，并且在发展中国家中高更多。鉴于在人类胚胎干细胞(hES细胞)以及胎脑组织(fetal brain tissue)的可利用性上的不足,此处描述了来源于异位妊娠的人类滋养层细胞(hTS细胞)作为针对几乎不可利用的hES细胞的替代物以供生成祖细胞的用途。
[0089]在一个实施方案中，来源于异位妊娠的人类滋养层细胞不涉及人类胚胎的破坏。在另一实施方案中，来源于异位妊娠的人类滋养层细胞不涉及活的人类胚胎的破坏。在另一实施方案中，该人类滋养层细胞衍生自与不存活的异位妊娠有关联的滋养层组织。在另一实施方案中，该异位妊娠不能被挽救。在另一实施方案中，该异位妊娠将不会导致产生活的人类胚胎。在另一实施方案中，该异位妊娠威胁母亲的生命。在另一实施方案中，该异位妊娠是输卵管的(tubal)、腹部的(abdominal)、卵巢的(ovarian)或子宫颈的(cervical)。
[0090]在囊胚发育期间，ICM本身接触，或其衍生的可扩散的“诱导物(inducer)”会引起在极性滋养外胚层中的高速率的细胞增殖(cell proliferation),而导致在整个囊胚期朝向壁区域(mural region)的细胞移动,并且甚至在ICM与滋养外胚层区别化之后可能会持续。覆盖ICM的壁滋养外胚层细胞能够保留ICM的“细胞记忆(cell memory)”。通常地，在着床的起始阶段，在ICM对面的壁细胞由于来自子宫内膜(uterine endometrium)的机械性限制而停止分裂。然而，没有此类限制存在于输卵管中，这致使极性滋养外胚层细胞持续分裂而在异位妊娠的停滞的囊胚中形成胚外外胚层(extraembryonic ectoderm,ExE)。在一个实施方案中，ExE-衍生的TS细胞呈增殖状态存在至少4天的时间，这取决于ICM分泌的成纤维细胞生长因子4(FGF4)与它的受体成纤维细胞生长因子受体2 (Fgfr2)的相互作用。在另一实施方案中，ExE衍生的TS细胞呈增殖状态存在至少I天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天的时间。直到临床介入发生，这些细胞过程可能在着床前的胚胎中产生无限数目的hTS细胞；此类细胞保留来自于ICM的细胞记忆，这通过ICM相关基因的表达而反映出来。
[0091]此处所描述的一个方面是在子宫着床之前的hTS细胞以及绒毛膜细胞滋养层(chorionic cytotrophoblasts)。在一个实施方案中，hTS细胞具有内细胞群(ICM) (0ct4、Nanog、Sox2、FGF4)与滋养外胚层(Cdx2、Fgfr_2、Eomes、BMP4)这两者的特定基因(图1a)并且表达全部3种原胚层的组分(图7)。在另一实施方案中，所述hTS细胞表达hES细胞相关的表面标记，诸如特异性阶段胚胎抗原(SSEA)-l、-3与_4(图1b)以及间质干细胞相关的标记(⑶44、⑶90、CK7以及波形蛋白)，而造血干细胞标记(⑶34、⑶45、α 6-整合蛋白、E-钙黏素以及L-选择素)没有表达(图8)。在一个实施方案中，hTS细胞可依据诱导而分化成为3种原胚层的各种不同的特定细胞表型(图9)。将hTS细胞皮下移植至雄性严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠中在植入后的6-8周仅造成组织学上轻微的嵌合反应(图10)。在一个实施方案中，染色体分析显示hTS细胞不会改变核型的型态(46，XY)(图11)。在另一实施方案中，细胞寿命在培养介于第3代与第7代之间的端粒长度上没有被显著地缩短(图1c)。
[0092]此处所提供的一个方面是使用AffymetrixTM平台以询问GeneChip Human GenomeU133plus2.0GeneChip有关hTS细胞与PDMS细胞之间的总体基因比较，来描述hTS细胞与胎盘衍生的间质干(PDMS)细胞之间的区别。在一个实施方案中，该hTS细胞展现出要比在PDMS细胞中的基因表达少大约10%、大约15%、大约20%、大约25%、大约30%、大约35%、大约40%、大约45%、大约50%、大约55%、大约60%、大约65%、大约70%或大约75%的基因表达。在另一实施方案中，该hTS细胞展现出总数为2，140个的基因(倍数变化> 2倍)，它要比PDMS细胞所展现的(3，730个基因)少大约40%(图1d)。在一个实施方案中，hTS细胞的基因强度分布展现出与PDMS细胞中的基因强度分布有区别的均质型(homogenous pattern)。在另一个实施方案中，该hTS细胞代表在着床前的阶段的细胞滋养层的特殊群组，从而使得它们具有内细胞群(ICM)和/或滋养外胚层的分子肖像(molecular portraits) ?在另一实施方案中，该hTS细胞展现与hES细胞相似的多能性及自我更新的特性。
LIF的撤除调控Nanog在hTS细胞中的过度表达
[0093]在人类中，细胞滋养层是融合细胞滋养层(syncytiotrophoblasts)的前 体(Benirschke,K.,Kaufmann,P.1n Pathology of the humanplacenta, 39_51Spring-Verlag New York Inc.，1990)。当胚胎是桑堪胚(morula)时，滋养层特化的区域被建立，这反映在该区域的细胞中的转录因子的特殊组合以及各种不同的环境信号和生长因子对它们的影响。
[0094]许多证据指出早期外胚层以及真实ES细胞的原始多能性(naive pluripotency)取决于 3 个转录组成体(transcriptional organizers) (0ct4、性别决定区 Y_box(Sox2)以及 Nanog)的作用(Chambers 1.等人，Oncogene, 23:7150 - 7160 (2004) ; Niwa H.Development，134:635 - 646(2007))。ES细胞经由具有不同的信号传递途径以及转录因子[包括白血病抑制因子(LIF)、Nanog、Sox2以及八聚物结合转录因子3和4(0ct3/4)]的复杂相互作用来维持多能性。转录因子Nanog在维持小鼠以及人类ES细胞的多能性上扮演关键角色，而LIF与0ct4以及Nanog协调地作用，以支持多能性以及自我更新(Cavaleri，F.等人.Cellll3, 551-552(2003))ο
[0095]LIF[ 一种白 介素_6型细胞因子(interleukin_6class cytokine)]会影响细胞生长以及分化。LIF结合至白血病抑制因子受体α (LIFR-α)，后者与膜糖蛋白130(GP130)共同受体形成异型二聚物受体复合体(heterodimeric receptor complex)。LIF的结合导致janus激酶(JAK)/信号转导与转录激活蛋白(STAT)信号传递途径以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径的活化。LIF通常被表达于发育中的胚胎的滋养外胚层中。LIF被认为在维持未经分化的状态上发挥作用。从干细胞培养物中移除LIF通常会导致培养的干细胞的分化。LIF也会影响Nanog(—种已知在干细胞维持上发挥重要作用的基因)的表达。
[0096]多效性细胞因子一白血病抑制因子(LIF)通常在输卵管中要比在子宫内膜中以更高的浓度表达，这显示从壶腹至峡部节段(isthmic segment)的梯度降低(图1g)。而在异位妊娠中，LIF水平可能在输卵管中会增加2至4倍(W&nggren, K.等人，Mol.Hum.R印rod.2007，13，391-397)。LIF在功能上能整合其它信号以活化多能转录因子(例如，0ct4以及Nanog)，以维持小鼠胚胎干(mES)细胞中的多能性以及自我更新。在撤除LIF时，细胞增殖持续但是尾型同源框转录因子Cdx2 (caudal-related homeobox transcriptionfactor Cdx2)被活化，从而在胚胎干(ES)细胞中引起滋养外胚层分化。
[0097]在一个实施方案中，描述了一种用来确定hTS细胞如何维持多能性以及自我更新的特性的方法。在一个实施方案中，在hTS细胞中检测到LIF与多能转录因子[例如，在 Smith，A.G.等人，Nature336, 688-690 (1998) ;Wi I liams, R.L.等人，Nature336, 684-687，(1998) ；Cavaleri, F.等人，Cel1113，551-552 (2003)；Chambers 1.等人，Cell, 2003; 113:643 - 655 ;Boiani, L.Α.等人，Nature Rev.Mol.CellBiol.6, 872-884 (2005)中所描述的因子]的缔合。[0098]hTS细胞是从在妊娠的第5-8周已蒙受输卵管异位妊娠的妇女体内获得的，并且被视为细胞滋养层的特殊群体，具有ICM衍生的人类胚胎干(hES)细胞以及滋养外胚层的特定基因标记(例如，在Adjaye，J.等人，Stem Cells, 2005，23，1514-1525中所描述的标记)(图1a)。
[0099]在一个实施方案中，此处提供了一种通过调节所述细胞对LIF的暴露来影响hTS细胞分化的方法。例如，hTS细胞被分为3组并且被暴露于不同浓度的LIF。在一个实施方案中，LIF的浓度是大约1000、大约750、大约600、大约550、大约525、大约500、大约450、大约400、大约350、大约300、大约250、大约200、大约150、大约125、大约100、大约75、大约50或大约25单位/mL。在另一实施方案中，LIF的浓度是500、250以及125单位/mL。在一个实施方案中，LIF的浓度是500单位/mL。在另一实施方案中，LIF的浓度是250单位/mL。在另一实施方案中，LIF的浓度是125单位/mL。
[0100]在一个实施方案中，该hTS细胞暴露于不同浓度的LIF历时1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 天。在另一实施方案中，该hTS细胞暴露于不同浓度的LIF历时3、6、12、18、24、30、36、48、60、72、84、96、
108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240 或 252 小时。在另一实施方案中，该hTS细胞暴露于不同浓度的LIF大约I至30、大约I至28、大约I至26、大约I至24、大约I至22、大约I至20、大约I至18、大约I至15、大约I至13、大约I至10、大约I至9、大约I至8、大约I至7、大约I至6、大约I至5、大约I至4或大约I至2天。在另一实施方案中，该hTS细胞暴露于不同浓度的LIF历时3天。
[0101]此处所描述的一个方面是较低浓度的LIF会改变某些基因的表达，这些基因包括但不限于:0ct4、Sox2、Cdx2和Nanog。另一实施方案通过RT-PCR证明:LIF的撤除和/或较低浓度的LIF会抑制0ct4以及Sox2表达，并且相反地,会促进Cdx2以及Nanog (图1e)。在一个实施方案中，这些现象通过流式细胞分析进一步得到确认，其显示0ct4以及Sox2的抑制是呈剂量依赖的方式(图1f)。`
[0102]在另一实施方案中，0ct4/Cdx2的相对表达比例暗示在早期胚胎分化中的细胞命运(cell fate)。在另一实施方案中，LIF暴露的撤除和/或减少导致0ct4的表达减少。在另一实施方案中，LIF暴露的撤除和/或减少以剂量依赖的方式促进Cdx2、Nanog以及Sox2转录因子的表达，这与定量PCR (qPCR)分析是一致的。
[0103]此处所描述的另一个方面是，在hTS细胞中位于壶腹的高0ct4/Cdx2比例朝向峡部节段的梯度降低(图1g)与输卵管中LIF水平的趋势是相容的，从而暗示细胞命运选择趋向hES细胞。在一个实施方案中，相对的Nanog/Cdx2比例的上调(2倍)进一步执行细胞中的多能性。在一个实施方案中，相对的Nanog/CdX2比例的上调(2倍)维持hTS细胞中的多能性。在另一实施方案中，有关hTS细胞的S0x2/Cdx2表达比例不会改变以维持多能性。在另一个实施方案中，Cdx2过度表达有利于hTS细胞维持滋养层的表型。
[0104]此处所描述的一个实施方案是一种用以检测hTS细胞中Nanog与Cdx2之间的关系的方法。在另一实施方案中，通过使用siRNA所造成的Nanog以及Cdx2这两者的敲除研究分别促进Wx2以及Nanog表达(图1h),这支持了在hTS细胞中Nanog与Cdx2之间的相互关系类似于在ES细胞中0ct4与Cdx2对于细胞命运选择所具有的相互关系(Niwa，H.等人，Celll23, 917-929)。在另一实施方案中，Nanog的过度表达与升高的Nanog/Cdx2比例相结合来补偿降低的Oct4/Cdx2比例并且足以维持在hTS细胞中决定细胞分化命运的多能
性和/或更新。
[0105]此处所描述的一个方面显示:在LIF撤除时的Nanog的过度表达是至少一个在维持hTS细胞的多能性上发挥作用的因素。
视黄酸(RA)以及相关的途径
[0106]视黄酸(RA)(—种维生素A的衍生物)在ES细胞的分化以及胚胎形成(embryogenesis)上发挥作用。在ES细胞中，RA通过结合至它的核受体并且诱导特定革巴基因的转录来发挥作用，以生成数种不同的细胞类型。在一个实施方案中，以RA诱导能够使hTS细胞衍生的tNSCs维持具有特定图式形成的稳定地未分化的状态。
[0107]在一个实施方案中，用全反式视黄酸(RA)处理hTS细胞会生成适合用于植入到大鼠疾病模型(例如，帕金森氏症模型)中的神经干细胞。在另一实施方案中，在hTS细胞中LIF暴露的撤除和/或减少会调控Nanog (它负责hTS细胞的多能性以及自我更新的维持)的过度表达。此处还描述了允许经RA诱导的hTS细胞分化成为神经干细胞的某些分子途径，包括在可逆的上皮-间质转变(epithelial-mesenchymal transition, EMT)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)和Wnt信号传递途径的相互作用(cross-talk)以及触发靶基因Pitx2以供神经干细胞形成上发挥作用的途径。因此，一个实施方案描述RA相关的途径的调节子用于由hTS细胞生成神经干细胞的用途。
RA诱导NSC亚型的一致复合体
[0108]在一个实施方案中`，hTS细胞被诱导以生成神经干细胞。在一个实施方案中，该hTS细胞暴露于诱导剂或用诱导剂进行处理。在一个实施方案中，诱导剂包括，但不限于:视黄酸、神经生长因子(nerve growth factor)、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast growth factor)、神经营养蛋白(neurotrophins)(例如，神经营养蛋白3),和/或它们的组合。额外的示范性诱导剂包括，但不限于:促红细胞生成素(erythropoietin,ΕΡ0)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)、无翅型 MMTV整合位点(Wnt)蛋白质(例如，fct3a)、转化生长因子a (transforming growth factoralpha, TGF α )、转化生长因子 β (transforming growth factor beta, TGFP )、骨形态发生蛋白(BMPs)、甲状腺激素(thyroid hormone, TH)(包括T3以及T4型这两者)、促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone, TSH)、甲状腺释放激素(thyroid releasinghormone, TRH)、刺猬蛋白(hedgehog proteins)[例如，音猬因子(sonic hedgehog)]、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor, F1DGF)、环 AMP (cyclic AMP)、垂体腺苷酸环化酶活化多妝(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP)、促卵泡激素(follicle-stimulating hormone, FSH)、生长激素(growth hormone,GH)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors, IGFs)(例如,IGF-1)、生长素释放激素(growth hormone releasing hormone, GHRH)、》必字L素(prolactin, PRL)、》必字L素释放妝(prolactin releasing peptide, PRP)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growthfactor, FGF)、雌激素(estrogen)、5_ 轻色胺、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、促性腺素释放激素(gonadotropin releasing hormone, GnRH)、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)、粒细胞-巨卩遼细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、人类绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)、信息素(pheromones){例如，2_ 仲丁基-4, 5- 二氧喔唑(2-sec-butyl_4, 5-dihydrothiazole)、2，3_ 去氧-西部松小蠹集合信息素(2，3-dehydro-exo-brevicomin)、α与β金合欢烯(alpha andbeta farnesenes)、6-羟基 _6_ 甲基 _3_ 庚酮(6-hydroxy-6-methyl-3-heptanone)、2-庚酮(2-heptanone)、反 _5_ 庚烯 _2_ 酮(trans-5-hepten-2_one)、反-4-庚烯-2-酮(trans-4-hepten-2-one)、乙酸正戍酯(n-pentyl acetate)、顺 _2_ 戍烯-1-基-乙酸酯(cis-2-penten-l-yl-acetate)、2，5_ 二甲基批嗪(2, 5-dimethyIpyrazine)、丙酸十二烧酯(dodecyl propionate)以及(Z) _7_ 十二烯-1-基乙酸酯[(Z) -7-dodecen-l-ylacetate]}，和/或它们的组合。在另一实施方案中，该诱导剂是具有天然诱导剂的活性的类似物或变异体。
[0109]作为非限制性实例，视黄酸被用来化学地诱导hTS细胞。多效性因子全反式视黄酸(RA)经由多重途径而在神经分化(neural differentiation)、图式形成(patterning)以及运动轴突外生(motor axon outgrowth)上发挥体内功能,所述多重途径包括,但不限于:ES细胞中的RA/RARs/RXRs信号传递、Wnt信号传递以及ERK途径(Maden, M.Nat.Rev.Neuroscience8, 755-765 (2007), Lu J 等人，BMC Cell Biol.2009, 10:57, Wichterle H 等A, Cell.2002; 110:385-397)。在 mES 细胞(Wichterle H 等人，Cell.2002; 110:385-397)、hES 细胞(Li，L.等人.Stem Cells22，448-456 (2004))以及成人神经生成(Jacobs S 等K , Proc Natl Acad Sci2006, 103(10):3902-7)中，RA 诱导酪氨酸羟化酶(TH)(多巴胺能神经元的特征酶)的表达以及轴突形成(neurite formation)。
[0110]在一个实施方案中 ，描述了一种用于确定经RA处理的hTS细胞的命运的方法。在另一实施方案中，用 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25、30、35、40、
45、50、55、60或65μΜ的RA处理hTS细胞。在另一实施方案中，用大约0.5_75、大约1_65、大约1-60、大约1-50、大约1-55、大约1-50、大约1_40、大约1_35、大约1_30、大约1_25、大约1-20、大约1-15、大约1-13、大约1-10、大约2-10、大约5-10或大约8-10 μ M的RA处理hTS细胞。在另一实施方案中，用10μ M的RA处理hTS细胞。
[0111]在一个实施方案中，该於5细胞暴露于狀历时1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40天。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于RA历时3、
6、12、18、24、30、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240或252小时。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于RA历时大约I至20、大约I至18、大约I至15、大约I至13、大约I至10、大约I至9、大约I至8、大约I至7、大约I至6、大约I至5、大约I至4或大约I至2天。在另一实施方案中，hTS细胞各自暴露于RA历时下列不同的持续时间:1、2、3、4、5、6、7或8天。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于RA历时I天。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于RA历时2天。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于RA历时3天。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于RA历时4天。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于RA历时5天。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于RA历时6天。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于RA历时7天。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于RA历时8天。
[0112]在一个实施方案中，RA诱导hTS细胞分化成各种不同表型的神经细胞，其包括，但不限于:神经胶质限制的前体细胞(GRP)、神经元限制的前体细胞(NRP)、多能性神经干(MNS)细胞、星形胶质细胞(AST)以及未定义的滋养层巨细胞(TGC)，它们免疫细胞化学地表达神经干细胞标记巢蛋白(图2a)。在另一实施方案中，在I至5天的RA诱导期内，在经混合的RA-诱导的神经祖细胞的分布上产生相似的比例。在另一实施方案中，在7天的RA处理期间，细胞分化变为未定义的滋养层巨细胞。
[0113]因此，在一个实施方案中，此处提供了衍生自hTS细胞的经RA-诱导的神经干细胞。在另一实施方案中，该 RA 诱导期是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、25、30、35 或 40 天。在另一实施方案中，该 RA 诱导期是 3、6、12、18、24、30、36、
48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240或252 小时。在另一实施方案中，该RA诱导期是大约1至20、大约1至18、大约1至15、大约1至13、大约1至10、大约1至9、大约1至8、大约1至7、大约1至6、大约1至5、大约1至4或大约1至2天。在一个实施方案中，该RA诱导期是大约1天至大约7天。在另一实施方案中，该RA诱导期是1天。在另一实施方案中，该RA诱导期是2天。在另一个实施方案中，该RA诱导期是3天。在另一实施方案中，该RA诱导期是4天。在一个实施方案中，该RA诱导期是5天。在一个实施方案中，该RA诱导期是6天。在另一实施方案中，该RA诱导期是7天。在另一实施方案中，该RA诱导期是24小时。在一个实施方案中，该RA诱导期是12小时。在另一个实施方案中，该RA诱导期是1小时至24小时。
[0114]在一个实施方案中，此处描述了表达至少一种神经干细胞基因和标记的tNSC。在另一实施方案中，该tNSC表达至少2种、至少3种、至少4种或至少5种神经干细胞基因。在另一实施方案中，该tNSC表达至少2种、至少3种、至少4种或至少5种神经干细胞标记。神经干细胞基因和标记的非限制性实例包括:巢蛋白、神经丝、Ngn-3、MAP-2、Neo-D,⑶133以及0ct4(图2b)。在一个实施方案中，该tNSCs也表达RA受体基因(其包括，但不限于:RAR^ ,RXRa以及RXR^ )、细胞视黄酸结合蛋白(CRABP)_2、细胞视黄醇结合蛋白(CRBP)-1以及特别地，被发现不存在于ES细胞中的RA合成酶RALDH-2以及RALDH-3。
[0115]因此，一个实施方案描述表达的神经干细胞基因和标记[包括巢蛋白、神经丝、Ngn-3、MAP-2、Neo-D、CD133 和 0ct4、RA 受体基因(诸如 RAR@ ,RXRa 以及 RXR β )、CRABP_2、CRBP-1、RA合成酶RALDH-2和RALDH-3等，和/或它们的调节子]用以促进tNSCs的分化能力的用途。在一个实施方案中，3天与5天RA-诱导的hTS细胞都以相似的比例维持神经干细胞标记，包括巢蛋白、GFAP以及神经丝蛋白(图2c)。在另一实施方案中，这些tNSCs免疫细胞化学地表达酪氨酸羟化酶(TH)以及5-羟色胺(5-HT)(图2d)，这暗示它们分化成多巴胺能神经元以及5-羟色胺能神经元的能力。此处所描述的另一实施方案是将tNSCs分化成多巴胺能神经元以及5-羟色胺能神经元。
[0116]此处进一步提供了由一致地混合的神经上皮祖细胞(neuroepithelialprogenitor cells)[在细胞培养期间能在遗传上以及表型上以稳定状态(steady-state)维持]所构成的tNSCs。这种在产物上的一致性对于任何包含以干细胞为基础的治疗的治疗方案(treatment regimen)是一种理想的特性。
就Nanog表达而言LIF与RA之间的关联性
[0117]在早期胚胎发育中，tNSCs典型地表达RALDH-2。此处所描述的一个实施方案是一种用以评估在hTS细胞中LIF如何影响RA-诱导的神经生成的方法。LIF在小鼠ES (mES)细胞中抑制RA-诱导的神经元分化的能力使得移植更为困难(Martin-1biWez R等人，J.Neuron.Res.85，2686-2710(2007) ;Bain G 等人，Dev Bioll68:342_357)。其它报道主张LIF在ES细胞分化成神经元上的积极作用(Trop印e V, Neuron 2001,30:65-78)。
[0118]在一个实施方案中，描述了一种用于评估hTS细胞中就Nanog表达而言LIF与RA之间的关联性的方法。在另一个实施方案中，tNSCs用LIF处理并且通过流式细胞术而进行Nanog表达的测量(图18a)。在一个实施方案中，tNSCs用大约1000、大约750、大约600、大约550、大约525、大约500、大约450、大约400、大约350、大约300、大约250、大约200、大约150、大约125、大约100、大约75、大约50或大约25单位/mL的LIF处理。在另一实施方案中，tNSCs 用 1-1000、1-500、1-450、1-400、1-350、1-300、1-250、1-200、1-150、1-125、1-100、1-75或1-50单位/mL的LIF处理。在另一实施方案中，tNSCs用500、250和/或125单位/mL的LIF处理。 [0119]在一个实施方案中，hTS细胞暴露于LIF历时1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于LIF过夜。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于LIF历时
3、6、12、15、18、22、24、30、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240或252小时。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于LIF历时大约I至20、大约I至18、大约I至15、大约I至13、大约I至10、大约I至9、大约I至8、大约I至7、大约I至6、大约I至5、大约I至4或大约I至2天。
[0120]在一个实施方案中，用RA处理hTS细胞诱导Nanog过度表达。在另一实施方案中，LIF以剂量依赖的方式抑制RA-诱导的Nanog。在另一实施方案中，LIF对tNSC发育发挥抑制作用。
[0121]此处所描述的一个方面是在ES细胞的神经分化上LIF与RA相互作用。在一个实施方案中，LIF影响RA对hTS细胞中的多能性的效果。结果显示:在hTS细胞中，RA诱导Nanog以及0ct4的过度表现,但不诱导Cdx2以及Sox2的过度表达(图18b)。在脑的峡部区域中，观察到Nanog表达在LIF-诱导的细胞中为62.5% (图1f，左区和右区)，但在RA-诱导的细胞中仅为26.9%(图18b)。还观察到:较高水平的LIF通常抑制RA-诱导的Nanog并且LIF的撤除显著地增强RA-诱导的Nanog表达(图18a)。这些结果暗示hTS细胞朝向峡部移动。在一个实施方案中，RA通过Nanog表达维持细胞多能性。
[0122]在一个实施方案中，在一个RA富集的微环境(RA-enriched microenviroment)中植入tNSCs促进体内干细胞的连续增殖。在另一实施方案中，tNSCs被植入至脑内。在另一个实施方案中，tNSCs被植入或被注射至海马(hippocampus)、大脑皮质(cerebralcortex)、纹状体、间隔(septum)、间脑(diencephalon)、中脑(mesencephalon)、后脑(hindbrain)或脊髓基底神经节(spinal cord basal ganglia)内。在另一实施方案中，tNSCs被植入至脑的纹状体内。在另一实施方案中，tNSCs被植入或被注射至中枢神经系统的任何部位内。在另一实施方案中，tNSCs被植入或被注射至在特定的神经退化性障碍中退化的细胞的神经末梢区域内。在另一实施方案中，tNSCs被植入或被注射至中脑(midbrain)中的黑质致密部内。在另一实施方案中，tNSCs被植入或被注射至前脑(forebrain)中的神经末梢区域内。在另一实施方案中，tNSCs被植入或被注射至脑室系统(ventricular system)内。在另一实施方案中，tNSCs被植入或注射至侧脑室(lateralventricle)内。在维持tNSCs中的多能性(multipotency)上的G蛋白信号传递
[0123]此处描述的另一个方面是一种用以研究tNSCs如何维持它们的多能性状态的方法。在一个实施方案中，RA在大约第15分钟时诱导c-Src mRNA表达波峰(图3a)。此处所描述的另一实施方案是基于RA刺激的RXRa、c-Src以及RARP表达通过Western印迹分析来评估GPCR信号传递途径(图3b)。在一个实施方案中，RA在30分钟内促进G a q/11和
这两者表达。在另一实施方案中，免疫沉淀(IP)分析法的分析证明:RA诱导RXRa与RARP之间的直接结合；然而，此种交互作用被c-Src抑制剂PPl类似物阻断,这表示c-Src参与到RXRa与RARii之间以形成支架蛋白质复合体(图3c)。
[0124]通过免疫沉淀(IP)分析(图3d)，我们独立地观察到RXRa展现出与Gaq/11的结合交互作用，而RARP显示与GP的结合交互作用。这些结果与GPCR-G蛋白信号传递的“拉与推(pull and push) ” 模型一致(Tsai 等人，“The ubiquitin ligasegp78promotes sarcoma metastasis by targeting KAIIfor degradation.Nat.Med.13，1504-1509，(2007))。
[0125]在一个实施方案中，RARs与RXRs的异型二聚物对(heterodimeric pair)发挥核中的配体活化的转录因子(ligand-activated transcription factors)以及内源性细胞表面信号分子(endogenous cell surface signal molecules)的作用。组成型活化的RXRa破坏受体构型并且募集C-Src以与所缔合的Gaq/11交互作用和/或活化所缔合的Gaq/11。在一种情况下，这种非基因组RA信号转导协助解释非视黄酸反应兀件(retinoic acid-response element, RARE)调控的基因表达(Maden, M.，Nat.Rev.Neuroscience8, 755-765(2007))。
[0126]因此，此处提供了用于防止在移植此处所提供的神经干细胞之前以及之后的细胞过度生长的策略。一个实施方案描述调节RA相关的途径从而防止和/或减少和/或缓和过度生长和/或移植物排斥(gr aft rejection)的试剂的用途。
原癌基因酪氨酸蛋白激酶(Src)以及Nanog
[0127]c-Src维持ES细胞处于未分化的状态(Anner6n C.等人，J BiolChem.279，590-598 (2004)) Janog和Stat3协同地结合以活化Stat3依赖的启动子(TorresJ.等人，Nat Cell Biol.10，194-201 (2008))。在一个实施方案中，c_Src诱导信号转导及转录激活蛋白3(Stat3)在Tyr705位点的磷酸化,并且此作用被c-Src抑制剂蛋白磷酸酶I (PP-1)类似物阻断，从而连结了 C-Src与Stat3分子之间的关联性(图3f)。在另一实施方案中，Stat3直接作用于Nanog启动子(图3g)。在另一实施方案中，Stat3不直接作用于Nanog启动子。在另一实施方案中，RXRa直接作用于Nanog启动子。在另一实施方案中，RXRa未直接作用于Nanog启动子。在另一实施方案中，RARP直接作用于Nanog启动子。在另一实施方案中，RARP不直接作用于Nanog启动子。在另一实施方案中，RA在hTS细胞中诱导c-Src、pStat3(图3e)以及Nanog(图le)的过度表达。在另一实施方案中，RXR α以及RARP这两者经由GPCR-G蛋白信号传递响应于RA发挥转导作用。
[0128]在一个实施方案中，此处描述了一种用以在tNSCs中维持多能性的方法，该方法包括活化c_Src/Stat3/Nanog转录途径。在另一实施方案中，c_Src与Ga q/11的交互作用活化c_Src/Stat3/Nanog途径。为了进一步通过成像研究证实RXR α与G a q/11之间的直接交互作用，使用双免疫金荧光透射电子显微术(IEM)。RA诱导细胞质膜(plasma membrane)处小的金粒子标记的RXRa (6μΜ)与大的金粒子标记的Gaqm (20 μ Μ)之间的结合交互作用(图4)。根据动态共焦免疫荧光显微术，经免疫染色的RXR α与Gaq/11这两者主要地呈均质特征出现在细胞质或核中(图4)。通过用RA处理5分钟，细胞溶质RXR α强度在核周区域处增加而核RXRa强度降低(图4，第I列)，这表示在刺激之后的细胞溶质转位。在第15分钟时，核RXRa强度变得显著，而细胞溶质RXRa强度降低(图3a)。
[0129] 在一个实施方案中，细胞核中的活性增加在细胞中维持稳定状态。在30分钟内再次观察到明显的细胞溶质转位。另一方面，Gaq/11表达的区隔变化类似于RXRa表达的区隔变化(图4，第2列)。在一个实施方案中，在刺激之后的第30分钟，在细胞膜处观察到Gaqm的明显聚集。在另一实施方案中，RA能够促进RXRα与Gaq/11这两者在hTS细胞中的组成性合成以及转位。
[0130]因此，此处提供了 RA在细胞质膜处经由G蛋白偶联受体(GPCR)-G蛋白信号传递而作用于hTS细胞(这与基因组RA/RXRs/RARs途径是可区别的)以供生成tNSCs的用途。如此处所显示的，RA在使hTS细胞分化成为tNSCs方面是经由Nanog和0ct4，而非Cdx2和Sox2途径来发挥作用的。此处还提供了 RA-诱导的Nanog活化在维持tNSCs中的多能性以及自我更新方面的用途。此处提供了 G蛋白偶联受体(GPCR)-G蛋白信号传递的RA活化以及伴随的RXRa /Ga q/ll/c-SrC/Stat3/Nanog途径活化在维持tNSCs中的多能性方面的用途。此处提供了 RXRa和RARii的异型二聚物在细胞质膜处作为信号分子发挥功能以维持tNSCs中的多能性的用途。此处还提供了 RA通过Nanog的过度表达来诱导hTS细胞分化成神经干细胞(NSC)以维持多能性以及再生的用途。
[0131]此处所描述的tNSCs表达帮助神经生成的视黄醛脱氢酶(RALDH)-2以及RALDH-3。此处所描述的tNSCs中存在RALDH以及不存在⑶33暗示tNSCs在分化成感觉运动神经元(sensorimotor neurons)上要优于hES细胞。因此,此处提供了此处所描述的tNSCs用于神经生成和/或再生医学(regenerative medicine)的用途。
[0132]在发育的纹状体以及海马中，增加的Src激酶活性与神经元分化以及生长的尖峰期相一致。然而，RA可以通过24小时孵育来抑制核糖体S6激酶(ribosomal S6kinase)及其下游真核起始因子4B (eukaryotic Initiation factor4B, eIF4B)的磷酸化，以造成许多细胞类型的生长停滞(growth arrest)。RA诱导hTS细胞中的c_Src mRNA的快速瞬时表达，在15分钟时达到峰值(图3a)，继而在第I小时生成c-Src蛋白质(图3e)。在一个实施方案中，c-Src mRNA含有内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site)。在另一实施方案中，RA短暂地产生eIF4B，在第4小时达到峰值，但在第24小时消退(图20c)。此作用通过使用eIF4B siRNA而被抑制(图20d)。排除了 mT0R/eIF4EBPl信号传递[雷帕霉素 / 真核起始因子 4E 结合蛋白 I (rapamycin/eukaryotic Initiation factor4Ebinding proteinl)的机械祀标]的参与(图20b)。在另一实施方案中，RA活化eIF4B以供亚细胞mRNA定位以生成c-Src。
[0133]活性c-Src通过Tyr705位点的磷酸化而直接地结合至Stat3 (信号转导及转录激活蛋白)(图20e)以生成蛋白质(图3e)。在一个实施方案中，此作用通过使用c-SrcsiRNA而被抑制(图20f)。在另一实施方案中，此作用被选择性c-Src抑制剂PP-1类似物抑制(图3f)。在另一实施方案中，通过染色质免疫沉淀(ChIP)分析而观察到Stat3对Nanog基因启动子的直接作用(图3g)。在另一实施方案中，Nanog在4小时内生成(图3f及20f)，它可通过使用PPl类似物(图3f)以及Stat3siRNA(图20g)而被阻断。
[0134]在一个实施方案中，此处描述了一种用以维持tNSCs的多能性的方法，其包括使细胞暴露于诱导剂以调节非基因组eIF4B/c-Src/Stat3/Nanog信号传递途径所调控的c-Src亚细胞mRNA定位(图20h)。在另一实施方案中，该诱导剂是RA。
RA及Wnt信号传递
[0135]此处还提供了一种用以诱导hTS细胞成为神经干细胞的方法。
在一个实施方案中，该方法包括调节fct2B/i3_联蛋白信号传递途径。在另一实施方案中，该方法包括调节RARs-Akt信号传递途径。在另一实施方案中，该方法包括调节Wnt2B/i3-联蛋白以及RARs/Akt信号传递途径。在另一实施方案中，通过用视黄酸(RA)处理来诱导hTS细胞。在另一实施方案中，该用以诱导hTS细胞成为神经干细胞的方法进一步包括活化转录因子Pitx2。在另一实施方案中，该用以诱导hTS细胞成为神经干细胞的方法进一步包括活化转录因子导蛋白(netrin) (NTN)。在另一实施方案中，该用以诱导hTS细胞成为神经干细胞的方法进一步包括活化转录因子Pitx2以及NTN。在另一实施方案中，RAR以及RXR作为异型二聚物而存在，该异型二聚物经由它的DNA结合域(DNA-binding domain, DBD)与视黄酸反应元件(RARE)DR-5结合。在另一实施方案中，辅阻遏物(corepressors)结合至RAR并且募集组蛋白脱乙酰酶(HDAC),造成转录抑制(transcriptional repression)。在另一实施方案中，用以诱导hTS细胞成为神经干细胞的方法进一步包括活化转录因子Pitx2和NTN。在另一实施方案中，向hTS细胞添加RA并通过RA与RAR的结合来激活转录。在另一实施方案中，RAR与RA结合，接着募集共活化子(coactivators)以及 HAT。
[0136]RA-调控的Wnt信号传递途径在成人神经生成以及体内存活期间是重要的贡献者。存在于神经干细胞微环境中的fct蛋白质在早期胚胎形成中是细胞行为的关键调节子，并且可维持神经干细胞潜力。在成人神经生成中，fct蛋白质结合至它们的受体卷曲蛋白(Frizzled)(例如，Fzd6)以转`导许多信号级联(signaling cascades),例如通过针对特定的靶基因来活化β_联蛋白/LEF信号传递。
[0137]fct信号在神经发育(neurodevelopment)期间涉及细胞周期控制(cell cyclecontrol)以及形态发生(morphogenesis)。在它们之中，fct2B可抑制视网膜神经元的分化，并且使用比较性integromics分析(comparative integromics analysis)已经提不是有关NSC的干细胞因子。在一个实施方案中，Wnt2B调节卷曲蛋白家族受体6(Fzd6)的表达。在另一实施方案中，Wnt2B诱导Fzd6的表达。在另一实施方案中，Fzd6在Wnt2B的存在下过度表达。在一个实施方案中，RA调节针对hTS细胞中的多巴胺能分化的典型Wnt2B/Fzd6/ β -联蛋白信号传递途径。在一个实施方案中，RA诱导针对hTS细胞中的多巴胺能分化的典型Wnt2B/Fzd6/ β -联蛋白信号传递途径。
[0138]此处所提供的一个实施方案将典型Wnt途径描述为诱导抑制性GSK3 0，导致β-联蛋白稳定化以供在细胞中的核转位。在另一实施方案中，RA快速地诱导GSK33在Tyr216位点[Akt2的下游效应子(effector)]的磷酸化。在另一实施方案中，RA快速地诱导GSK3 β在Tyr216位点的磷酸化，导致在最初的数小时的β _联蛋白磷酸化，这发挥针对随后的典型fct途径的“促发(priming) ”效应。在另一实施方案中，这些经活化的Fzd6以及Dvl3能够促进c-Jun N-末端激酶(JNK)与细胞骨架(cytoskeleton)的交互作用或增加细胞内的Ca2+水平，接着在非典型Wnt/Ca2+信号传递途径中活化用于突触功能的CaMKII。随着时间的推移，发生从非典型至典型Wnt途径的转换，这归因于GSK3 0在Ser9/21位点处的磷酸化。在一个实施方案中，G蛋白在起始阶段调节非典型Wnt2B信号传递的转导。在另一实施方案中，典型fct2B信号传递在早期发育的神经元分化中的后期阶段发生。
HDAC6
[0139]此处还提供了一种用以诱导hTS细胞成为神经干细胞的方法，该方法包括调节组蛋白脱乙酰酶6 (histone deacetylase6,HDAC6)。组蛋白脱乙酰酶6 (HDAC6)( 一种主要位于细胞质中的酶)调节许多生物过程(biological processes),包括细胞迁移、免疫突触形成(immune synapse formation)、病毒感染以及错误折叠的蛋白质的降解。例如,HDAC6可使微管蛋白、Hsp90以及皮层蛋白(cortactin)去乙酰化,并与其它伙伴蛋白质(partnerproteins)形成复合体。
[0140]HDAC6能运输β -联蛋白以供核定位。在一个实施方案中，根据细胞分离分析，HDAC6与β-联蛋白交互作用而导致β-联蛋白的核转位。在另一个实施方案中，RA诱导新的典型Wnt2B/Fzd6/ β -联蛋白信号传递途径，而允许在hTS细胞中的β -联蛋白的核转位。在核内，β_联蛋白涉及调控关键的基因表达程序，或作为对接平台(dockingplatform)以供各种不同的转录共活化子(transcriptional co-activators)来刺激转录。
HDAC4
[0141]组蛋白脱乙酰酶4(HDAC4)是功能性hTS细胞诱导的神经干细胞的一种重要表观遗传调节子(epigenetic regulator)。HDAC4抑制细胞周期进展并且保护神经元免于细胞死亡。RARs所造成的转录调节涉及由HDACs[它们通过核的辅阻遏物(nuclearco-repressors)被募集至RA祀基因]对染色质的修饰，这决定了对RA的差别反应。`
LEF/TCF/Pitx2
[0142]Lef-1以及PITX2通过募集并且与β -联蛋白交互作用来活化靶基因而在Wnt信号传递途径中发挥作用。ΡΙΤΧ2与Lef-1蛋白质内的2个位点交互作用。此外，β-联蛋白与ΡΙΤΧ2同源域(homeodomain)交互作用，而Lef-1与PITX2C-端尾部交互作用。Lef-1以及β -联蛋白经由2个不同的位点同时地并且独立地与ΡΙΤΧ2交互作用，以调节ΡΙΤΧ2转录活性。这些数据支持ΡΙΤΧ2经由差异的Lef-1异构型表达以及与Lef-1和β-联蛋白的交互作用而在细胞增殖、迁移和细胞分裂(cell division)中的作用。
导蛋白I (NTNl)
[0143]NTNl的分子机制被认为主要涉及轴突导引(axonal guidance)以及对神经元细胞迁移的控制。
ffnt/PSl/PI3K/Akt途径的活化以及RA所造成的GSK3- β的抑制
[0144]由于增殖性祖细胞的数目增加及相应的经分化的神经元的减少，增加的fct信号传递扩张干细胞库(stem cell pool)并且强化稳定化的β_联蛋白的表达而致使产生大的脑(Chenn, A.等人，Science297, 365-369，(2002) )。β -联蛋白作为接合蛋白(junctional protein)起双重作用，并且在典型Wnt信号传递中，表型可能是由于增加的Wnt信号传递(它与NSC自我更新有关联)或增加的接合稳定性(junctional stability)。
PI3K/Akt信号传递[0145]在一个实施方案中，此处描述了一种用于维持tNSCs的多能性的方法,该方法包括调节PI3K/Akt信号传递途径。G-蛋白β/Y异型二聚物也活化磷酸肌醇-3-激酶的调节亚基 5 (Phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit5) [PI3K regclass IB(plOl)]，后者导致磷酸肌醇-3-激酶催化Y多肽[PI3K cat class IB (pllO-Y )]调控的磷脂酰肌醇 4，5_ 二憐酸[phosphatidylinositol4, 5-biphosphate, PtdIns (4, 5) P2]至憐脂酸肌醇 3, 4, 5-三憐酸[phosphatidylinositol3, 4, 5-triphosphate, PtdIns (3, 4, 5) P3]的转换
[3]。PtdIns (3, 4, 5)P3是直接地与3-磷酸肌醇依赖的蛋白激酶-1 (3-phosphoinositidedependent protein kinase-1) [PDK (PDPKl)]以及V_akt鼠胸腺瘤病毒致癌基因同源物I (V-akt murine thymoma viraloncogene homologl) [AKT (PKB)]结合的第二信使(secondmessenger)。Η)Κ(Η)ΡΚΙ)磷酸化 AKT (PKB)并且活化 AKT 信号传递[4]。
[0146]PI3K/Akt信号传递在下面的干细胞系统中调节自我更新以及分化能力。从原生殖细胞(primordial germ cells,PGC)到多能胚胎生殖(embryonic germ,EG)细胞的衍生在PGC-特异的Pten-缺乏的小鼠(PGC-specific Pten-deficient mice)中得到增强(KimuraT 等人，Developmentl30:1691-1700，(2003))。
[0147]在一个实施方案中所显示的是:利用Akt信号传递的条件活化，PI3K/Akt信号传递在静息干细胞的活化上发挥作用。在另一实施方案中，PI3K/Akt信号传递在成人表皮中的祖细胞的增殖上发挥作用。
[0148]在一个实施方案 中，PI3K/Akt信号传递在这些适应培养的干细胞中促进干细胞的自我更新，而不是定向祖细胞的生成。在一个实施方案中，RA在hTS细胞中调节Akt3/mT0R信号传递的活化，而引起编码蛋白质RXRa以及RARP的亚细胞mRNAs的翻译。在一个实施方案中，RA在hTS细胞中诱导Akt3/mT0R信号传递的活化，而引起编码蛋白质RXRa以及RARii的亚细胞mRNAs的翻译。在另一个实施方案中，诱导剂抑制Akt3/mT0R信号传递的活化。在另一实施方案中，RXRa/Gaq/11以及RARi3/Gi3信号传递途径的选择性移动与交互作用被独立地启动。
[0149]在另一实施方案中，RA调节有关细胞功能的遗传程序转录活性，这取决于多效性及细胞环境依赖的方式(cellular context-dependent manner);即，产出表型(outputphenotype)是AP-1和/或β -联蛋白-LEF/TCF抑制以及RARE活化的效果的组合。
GSK3 3调节微管装配
[0150]hTS细胞包括主要的GSK3 0功能，在神经发育中GSK3 0的起始活化促进神经元分化并且随后的失活促进祖细胞增殖。在静息细胞中，GSK3的基础活性通常是相对较高的，而将细胞暴露于引导信号会在10分钟内降低其比活性(specific activity)达30_70%。GSK30对于其已磷酸化的底物具有强烈的偏好；因此，在典型fct2B信号传递中先前经促发的β-联蛋白对于随后的抑制性GSK3 0变成适合的。
[0151]在一个实施方案中，快速时空活性的GSK3 0对局限在轴突生长核心中的MAPT进行磷酸化，而导致促进微管装配、神经元极性(neuronal polarity)以及轴突外生的微管蛋白异型二聚物的活化(图21a以及21b)，这与GSK3 β的活化参与轴突微管装配的概念是一致的。此外，GSK3 β也能够调节CRMP-2的磷酸化而促使微管装配，由此CRMP-2优先地与微管蛋白异型二聚物结合，这明显地不同于MAPT。CRMP-2的突变体以显性阴性的方式抑制轴突生长以及分支。[0152]在一个实施方案中，此处提供了一种用以帮助解释在体内GSK-3信号传递是稳态控制(homeostatic control)的重要调节物而在发育的脑中调节神经祖细胞的机制基础。在另一实施方案中，PI3K/Akt途径的初始的局部活化诱导hTS细胞中的GSK3 β在Tyr216处的活化。在一个实施方案中，PI3K/Akt途径的初始的局部活化与通过从E18大鼠胚胎分离的海马神经元(hippocampal neurons)中的Ser9/21磷酸化所诱导的GSK3 β的失活是有区别的。在一个实施方案中，在GSK3 0中的不同位点上的磷酸化导致不同的细胞命运，这取决于时间因素。磷酸化的GSK30通过促进核输出来防止钙依赖磷酸酶诱导的NFATl的DNA结合。NFAT在促进基因转录(包括在免疫反应期间T细胞中的细胞因子基因)上发挥核心作用。这些事实至少部分地解释了为何hTS细胞与tNSCs这两者具有促进H)大鼠中的颉内移植(intracranial transplantation)的免疫优势。
G蛋白与神经兀可塑性(Neuronal Plasticity)
[0153]在NSCs中高度的自主性通过在神经生成期间mRNAs子集的选择性定位以及翻译而允许针对引导信号的快速局部反应，其中mTOR典型地在NSCs中经由对mRNA翻译以及核糖体合成的关键调节子进行磷酸化来上调蛋白质合成。在hTS细胞中，活性Akt3/mTOR信号传递触发mRNA翻译以独立地合成RXRa以及RARii蛋白质，这两种蛋白质分别活化Gaqm以及Gi3信号传递途径，其中局部CREBl被活化并且发挥诱导型基因表达的作用，该基因表达短暂地祀向TH基因以供转录，以生成神经递质多巴胺(neurotransmitterdopamine)。已显示:RA促进树突RNA颗粒中的RARa表达并且活化局部的谷氨酸受体I (glutamate receptorl, GluRl)合成，这意味着稳态的突触可塑性(homeostaticsynaptic plasticity)。因此，多巴胺D1/D5受体(CREB的上游增强子)的活化会诱导GluRl嵌入神经元中的突触位点。
[0154]在一个实施方案中，此处提供了一种分子模型以供研究RA信号相关的可塑性。 用于多巴胺能神经生成的转录因子
[0155]在一个实施方案中，β-联蛋白与CREBl在核中的交互作用代表了 TH转录中的主流。在一个实施方案中，活性的β-联蛋白结合至淋巴样细胞增强因子1/Τ细胞因子I (lymphoid enhancer factorl/T cell factorl) (LEFl),而导致 LEFl 从转录的抑制子转换为活化子。LEFl接着募集并且与PitX2(bicoid相关因子超家族的成员)交互作用。在一个实施方案中，LEFl促进Pitx2基因转录。在另一实施方案中，LEFl促进Pitx3基因转录。在另一实施方案中，LEFl促进Pitx3和Pitx2这两者的基因转录。在一个实施方案中，β-联蛋白、Pitx2以及LEFl协同地交互作用以调节LEF-1启动子。
[0156]此外，短暂核活性NFATl作为转录因子发挥作用以生成用于免疫反应的细胞因子以及TNF- α。然而，因为经磷酸化的GSK3 β能够抑制钙依赖磷酸酶诱导的NFATl在核中的DNA结合并且促进核输出，此作用不太可能在本情况中发生。因此，由于此作用能够被NFATlsiRNA抑制(图22e)，活性细胞质NFATl将会交互作用并且活化细胞质转录因子肌细胞增强因子2A (myocyte enhancer factor2A,MEF2A)(图22c以及22d)。特别地，快速诱导型0^81进入核内并且转录可生成1^?24蛋白质的1^?2么基因(图22f)。MEF2A可能在基因转录上以多种方式起作用(图22g)，包括经由自动调节的自身转录以生成更多MEF2A、转录TH基因以供多巴胺能特化(dopaminergic specification)、转录SNCA基因以供SNCA/MAPT/帕金蛋白复合体形成，以及与EP300和Pitx2交互作用(它被MEF2A siRNA抑制)(图 22h)。
[0157]在一个实施方案中，活性的EP300靶向HDAC6基因以及TH基因。在一个实施方案中，活性的EP300靶向HDAC6基因。在另一实施方案中，活性的EP300靶向TH基因。在一个实施方案中，活性的EP300促进HDAC6基因以及TH基因的转录。在另一实施方案中，活性的EP300抑制HDAC6基因以及TH基因的转录。在另一实施方案中，HDAC6运输β -联蛋白以供核转位。
[0158]在一个实施方案中，此处提供了所形成的并且指定用于TH基因转录的执行性转录复合体的表征。例如，CREBU ΕΡ300以及MEF2A能够靶向TH基因的启动子，而β -联蛋白、LEFl以及Pitx2在转录过程期间作为增强子的共活化子行使功能。在一个实施方案中，此处提供了用以了解这些基因如何在多巴胺能NSCs中的分化与增殖之间操纵平衡的方法，这对于评估疾病机制(例如，PD)具有意义。
CaMKII的多面性
[0159]在发育NSCs中，经由电压门控的钙离子通道(voltage-gated calcium channels)或神经递质受体(neurotransmitter receptors)的局部钙流入(local calcium influx)导致CaMKII的活化，而向前传送数种信号。在一个实施方案中，针对兴奋-转录偶合(excitation-transcription coupling),时空CaMKII 在hTS细胞中经由活化的 eIF4B触发c-SrcmRNA定位以合成c_Src蛋白质,导致Nanog的活化以供自我更新以及增殖。在另一实施方案中，CaMKII触发局部CREBl的活化,而导致回向运输(retrograde trafficking)至核内以靶向基因MEF2A以供转录。MEF2A不仅在神经元分化以及增殖上，而且在骨骼肌以及心肌发育上调控细胞功能。在一个实施方案中，CaMKII活化MAPT来调控帕金蛋白蛋白质，并且MAPT转而活化用于 微管装配的微管蛋白异型二聚物(图22a以及22j)。这些结果暗示:早期时空CaMKII信号对于微管蛋白的活化以在早期发育的NSCs中促进微管装配、神经元迁移以及神经元极化(neuronal polarization)是足够的,这确保与脑内的纹状体革巴标(striatal targets)的适当连接性。
[0160]L型钙离子通道以另一种方式来调节细胞内钙以供体内稳态，这涉及成人NSCs中的兴奋-神经生成(excitation-neurogenesis)。升高的氯化钾(KCl)水平导致膜去极化(membrane depolarization),而导致钙经由L-型电压敏感的钙离子通道的流入,这足以经由神经元中的ER以及粒线体之间的相互作用来诱导粒线体功能异常(mitochondrialdysfunction)。在一个实施方案中，RA调节与L-型钙离子通道有关联的细胞内ER钙。
[0161]CaMKII { 钙调蛋白(CaM)依赖的蛋白激酶 II [calmodulin (CaM)-dependentprotein kinase II]} (L型Ca2+通道的下游效应子)响应于短暂的低幅度钙离子峰(transient 1w-amplitude calcium spikes)展现出针对Ca2+/钙调蛋白的较低亲和力。在一个实施方案中，RA调节CaMKII的时空活化。在另一实施方案中，RA诱导CaMKII的时空活化。在另一实施方案中，RA抑制CaMKII的时空活化。
[0162]根据IP分析，CaMKII直接地磷酸化并活化CREBl (图21c)，这与CaMKII在兴奋-转录偶合上局部地将L-型钙离子通道活性编码为针对核CREB的信号的先前研究是一致的。因为轴突含有各种不同的局部地编码特定蛋白质合成的mRNA，包括在发育的神经元中的CaMKI1、钙依赖磷酸酶以及CREBl，这显示外来的RA触发的mRNA翻译机制发生在它们身上，因为它们能被真核起始因子4B(EIF4B) siRNA抑制(图21d)。因此，此局部的CREBl能够回向运输以供在核中负责末梢轴突的信号的特定转录过程。这些结果显示了基于细胞外信号的快速诱导型基因转录。
[0163]这些结果首次探究的是:Ga q/11信号衍生的CaMKII兴奋涉及tNSCs的自我更新的维持。同时，这些结果显示轴突行为(axonal behaviors)在早期神经生成中的重要性。SNCA与磷脂膜(phospholipid membranes)交互作用并且在神经退化性障碍(包括F1D以及阿尔兹海默症)的致病机制(pathogenesis)上发挥重要作用。 钙依赖磷酸酶/NFATl信号传递
[0164]在一个实施方案中，RA调节钙依赖磷酸酶的生成。在一个实施方案中，RA诱导钙依赖磷酸酶的生成。在另一实施方案中，ER钙与钙依赖磷酸酶/NFATl信号传递相关联，这与先前的研究是一致的。在另一实施方案中，根据细胞分离分析，RA诱导NFATl与输入蛋白[核质细胞质转运蛋白(nucleocytoplasmic transporter)]的短暂交互作用，导致NFATl核转位。这种NFATl的短暂效应被认为是细胞由此辨别持续的以及短暂的钙信号的一种机制。在一个实施方案中，RA-诱导的钙依赖磷酸酶/NFATl信号传递涉及到早期神经生成。
在初始神经生成时的细胞重建(Cellular Remodeling)
[0165]在一个实施方案中，此处提供了一种用于在hTS细胞向tNSCs转变期间诱导分子过程的方法。在一个实施方案中，该分子过程由RA来诱导。在一个实施方案中，在2个时间点检测分子级联(molecular cascade):第4小时(早期)以及第24小时(晚期)。在一个实施方案中，分子事件发生于2个时期内。在特定的实施方案中，一个时期包括在形态发生中的时空反应(例如，图23 ;早期；灰线)。在另一个特定的实施方案中，一个时期包括在细胞分化以及增殖中的基因转录(例如，图23 ;晚期；黑线)。
[0166]在一个实施方案中，表征了早期神经元形态发生中的机制。一旦干细胞感测到外来的引导信号，各种不同的特定亚细胞mRNA定位快速地启动，而作为反应在核中转录过程的极远处局部地制造特定蛋白质。经由蛋白质-蛋白质交互作用以及“感觉经验(sensoryexperience) ",这些局部蛋白质聚集在亚细胞区域处以在早期发育的NSCs中启动生长锥(growth cone)形成。不对称分裂(asymmetric division)伴随着基因转录而开始。例如，β -联蛋白的存在在RA处理5分钟之后于突触膜(synaptic membrane)处是可见的(图23g)，并且局部活化的CREBl移动回到核内以靶向基因MEF2A以供转录。
[0167]在一个实施方案中，一系列的分子过程协同地发生以调节粒线体功能(mitochondrial function)、膜的脂质代谢(lipid metabolism of membrane)、轴突生长(axonal growth)、神经兀迁移与可塑性(neuronal migration and plasticity)以及微管装配，这些分子过程包括，但不限于:RXRa、RAR@、β -联蛋白、Akt、CREB1、mTOR、CaMKI1、钙依赖磷酸酶、c-Src、GSK3 0、SNCA以及MAPT。在另一实施方案中，通过MEF2A、EP300以及CREBl所造成的在TH基因上的转录代表诱导型基因表达，其从染色体区域诱导染色质环(chromatin looping),以促进之后的基因转录。在另一实施方案中，RA-诱导的G蛋白信号传递的组分在神经元形态发生上发挥关键作用，并且在活化TH基因处的转录中也是不可或缺的部分。
[0168]此处描述了分化与增殖之间的平衡以在体外维持呈稳定状态的tNSCs。在一个实施方案中，神经分化是通过调节RA信号转导来控制的。在进一步应用于再生医学或药物发现之前，通过对这些调节机制的了解，能够在体外更有效地进行hTS细胞的操作。tNSCs具有免疫豁免
[0169]此处提供的一个实施方案描述了一种使用至少一种tNSC治疗神经障碍的方法，其中该细胞是经免疫豁免的。在另一实施方案中，该tNSC不会引起免疫反应。在另一实施方案中，该tNSC不会引起来自于T细胞、B细胞、巨噬细胞、小神经胶质(miciOglia)、NK细胞或肥大细胞的免疫反应。在另一实施方案中，该tNSC抑制免疫反应。在另一实施方案中，该tNSC具有降低的免疫原性。在另一实施方案中，该tNSC不会导致肿瘤形成。在另一实施方案中，该tNSC被设计为经免疫豁免的。在此处所提供的另一实施方案中描述了一种使用tNSC细胞的族群来治疗神经障碍的方法，其中所述细胞是经免疫豁免的。在另一实施方案中，干细胞或它们的衍生物作为细胞治疗的应用得益于了解它们的免疫原性以帮助确定免疫抑制剂(immunosuppression agents)植入后的应用。
[0170]此处所描述的另一个方面是一种用以检测以及比较在hTS细胞、tNSCs以及hES细胞中的免疫相关基因以及标记的表达的方法。在一个实施方案中，通过流式细胞分析来检测表达。
[0171]在hTS细胞、tNSCs以及hES细胞中的免疫相关基因以及标记的实例包括，但不限于:HLA-ABC、HLA-DR、CD14、CD44、CD73、CD33、CD34、CD45、CD105 以及 CD133。在另一实施方案中，HLA-ABC在hTS细胞以及tNSCs中的表达在tNSCs中要比在hES细胞中更高。在一个实施方案中，在全部3种干细胞中观察到HLA-DR的阴性表达(图2e)。在另一实施方案中，HLA-ABC在hTS细胞(99.4%)以及tNSCs (99.7%)中的表达在tNSCs中要比在hES细胞中(12.9%)高得多(图2e)。在另一实施方案中，在hTS细胞、tNSCs以及hES细胞中未观察到⑶14和⑶44表达上的差异。在另一实施方案中，与hES细胞中的阴性表达水平相比，高水平的⑶73在hTS细胞以及tNSCs中表达(图2f)。在一个实施方案中，该tNSCs具有间质干细胞的特性，其有利于神经胶质细胞的增殖。
[0172]在另一实施方案中，CD33(它在细胞外部分处含有免疫球蛋白结构并且是跨膜受体)在hTS以及hES细胞中表达但 在tNSCs中没有表达(图2f)。在另一实施方案中，在tNSCs中的⑶33的不存在有利于细胞治疗，因为它与免疫防御(immune defense)有关。因此，此处提供了具有低水平的⑶33表达并且因而具有低免疫原性的tNSCs。
[0173]在一个实施方案中，在间质干细胞标记⑶105的表达上没有发现它们之间在强度上的差异。在另一实施方案中，与hTS细胞以及hES细胞相比，在tNSCs中发现了癌症干细胞标记⑶133 (cancer stem cell marker⑶133)的低水平表达。在另一实施方案中，与hTS细胞(93.6%)以及hES细胞(98.8%)相比，在tNSCs中发现了癌症干细胞标记CD133的低水平表达(11.8%)(图2h)。因此，此处提供了具有低水平的⑶133表达并且因而具有低致肿瘤性(tumorigenicity)的 tNSCs。
[0174]此处进一步提供了⑶133+tNSCs的选择性族群，它们可用于移植以及组织再生(tissue regeneration)以供干细胞治疗。此处还提供了具有免疫豁免状态的tNSCs,它们对于以细胞为基础的治疗而言是可行的候选者。
[0175]在一个实施方案中，RA诱导免疫相关的标记的表达上的改变，例如，具有⑶34(+)的细胞增加但具有CD133(+)的细胞减少。在另一实施方案中，RA诱导CD34(+)hES细胞分化成为平滑肌祖细胞(smooth muscle progenitor cells)。在另一实施方案中，以⑶34(+)免疫选择的移植物来进行tNSCs的自体移植(autologous transplantation)在具有高危神经母细胞瘤(neuroblastoma)的儿童中是可行的。
植入后分化与增殖
[0176]在神经生成上，RA与视黄酸反应元件(RARE)之间的关联是已知的(Maden，M.等人，Nat.Rev.Neuroscience.8，755-765，(2007))，然而对非RARE作用的存在知之甚少。在一个实施方案中，RA经由G蛋白偶联受体(GPCRs)信号传递的“拉与推”机制诱导RXRa /RARi3/c-Src复合体的活化。在另一实施方案中，在2小时内，RXRa通过与G a q/11的交互作用最先被活化，继而是c-Src以及之后的RARP的活化，从而形成复合体(图3a以及3b)。在它们之中，c-Src随后经由Stat3诱导Nanog过度表达以维持那些hTS细胞衍生的NSCs的多能性和自我更新。
[0177]这种信号传递途径暗示-M没有必要进入细胞来触发典型RA/RXR/RAR/RARE途径，替代地，RA经由GPCR信号传递来活化G蛋白Gaqm，这与信号转导(signaltransduction)的概念是相容的。因此，在一个实施方案中，此处提供了用于控制RA-调控的NSCs的多能性以及自我更新的调节，以及在移植之前与之后操控hTS细胞和/或神经干细胞的方法。在另一实施方案中，Wnt以及RA在近端启动子中分别经由非典型的RARE以及Lef/转录因子(Tcf)-反应元件(LRE)而影响尾型同源框I (Cdxl)。
[0178]在一个实施方案中，RA经由典型RA/RARE信号传递途径诱导hTS细胞分化成为多巴胺能NSCs以维持干细胞性质。在另一实施方案中，是非RARE信号传递途径经由Wnt/β-联蛋白信号级联的活化而生成功能性多巴胺能NSCs。在另一实施方案中，非RARE信号传递的损害造成多巴胺生成的功能异常或缺失，而导致多巴胺能神经元的进行性退化性变化(progressive degenerative change)。因此,在另一实施方案中，此处提供了一种经由活化非RARE信号传递途径而分化为多巴胺能神经元的神经干细胞。
[0179]RA在诱导RAR-β表达之前于第`6小时活化蛋白激酶C(PKC)途径。RA在第2分钟时引起细胞内二酰基甘油(diacylglycerol,DG)的短暂的1.3倍增加以及在5分钟之内的PKC 的 Y 同工酶(gamma isozyme) (PKC- y)的转位(Kurie J.Μ.等人，Biochim BiophysActa.1993，1179(2): 203-7)。这些发现显示:PKC途径活化是RA调控的人类TC分化中的早期步骤，并且PKC-Y会加强RA对RAR转录活化的效果。因此，此处提供了用以控制hTS细胞分化的方法。在一个实施方案中，PKC信号传递途径的调节控制hTS细胞分化。
[0180]骨形态发生蛋白4(BMP4)与LIF—起来支持未分化的mES细胞的扩充。BMP4诱导hES细胞的滋养层分化(Qi X等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2004; 101:6027 - 6032)。Id蛋白质的BMP诱导与STAT3合作来抑制分化并且维持胚胎干细胞自我更新(Ying，Q.L.等人，Cell.2003; 115:281-292)。骨形态发生蛋白(BMPs)与LIF结合来作用以维持自我更新并保持多谱系分化、嵌合体聚落形成(chimera colonization)以及种系传递(germlinetransmission)性质(Xu RH 等人，Nat Biotechnol.2002; 20:1261-1264)。因此，在一个实施方案中，此处提供了一种通过调节PKC和/或骨形态发生蛋白(BMP)来诱导此处所描述的tNSCs的多巴胺能分化的方法。
疾病的治疗
[0181]此处提供了一种用于治疗障碍的方法，其中该方法包括将神经元的纯族群或特定的神经干细胞族群的复合体移植至患者，其中该患者是有此需要的。在一个实施方案中，该患者被诊断为患有神经疾病。在另一实施方案中，该患者被诊断为患有神经精神障碍(neuropsychiatric disorder)。在另一实施方案中，该患者被诊断为患有神经退化性障碍。在另一实施方案中，该神经元的纯族群包含多巴胺能神经元。
[0182]此处所描述的任何方法可以用来治疗疾病(disease)或障碍(disorder)。在一个实施方案中，该疾病是神经疾病。在另一实施方案中，该疾病是神经退化疾病或障碍。神经障碍的非限制性实例包括:帕金森氏症、阿尔兹海默症、亨廷顿氏症、肌萎缩侧索硬化症、弗里德赖希共济失调、路易氏体症、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆、精神分裂症、麻痹、多发性硬化症、脊髓损伤、脑损伤(例如，中风)、脑神经障碍、周边感觉神经病变、癫痫、朊病毒障碍、克雅氏病、阿尔珀斯病、小脑/脊髓小脑退化、巴滕病、皮质基底核退化、贝尔氏麻痹、格林-巴利综合征、皮克病 以及自闭症。
[0183]因此，此处所描述的tNSCs适合用于治疗神经退化性障碍，包括但不限于:帕金森氏症、阿尔兹海默症、亨廷顿氏症、脊髓损伤、青光眼(glaucoma)等。
[0184]此外，tNSCs也表达神经递质5-羟色胺。因此，一个实施方案描述tNSCs在治疗神经精神障碍中的用途。神经精神障碍的非限制性实例包括:忧郁(d印ression)、精神分裂症、痴呆、自闭症、注意力缺陷伴多动障碍(attention deficit hyperactivity disorder)以及躁郁症(bipolar disorder)。
[0185]此处所描述的任何方法可以用来改善或改进神经疾病或障碍的症状。与神经疾病或障碍有关的症状的非限制性实例包括:震颤、步态障碍、不良性步态、痴呆、过度肿胀(水肿)、肌无力、下肢萎缩、运动障碍(舞蹈病)、肌肉僵直、物理运动的减慢(运动迟缓)、物理运动的缺失(运动失能症)、健忘、认知(智能)损伤、辨识的缺失(失识症)、受损的功能(诸如决策与计划)、单侧面麻痹、感觉缺失、麻木、刺痛感、四肢的疼痛感觉异常、虚弱、脑神经麻痹、语言障碍、眼球运动、视野缺损、失明、出血、分泌物、近端肌萎缩、运动困难症、四肢肌肉张力的异常、肌强直减少、动作失调、在手指-手指测试或手指-鼻测试中错误的指示、辨距不良、霍-斯二氏现象、不完全的或完全的全身性麻痹、视神经炎、视物显多症、眼球运动障碍(诸如眼球震颤)、痉挛性麻痹、痛苦的强直发作、莱尔米特综合征、共济失调、语言困难、膀胱直肠障碍、起立性低血压、运动功能的减退、尿床、贫乏的言语表达、不充足的睡眠型态、睡眠障碍、食欲障碍、体重改变、精神运动性激动或迟滞、减少的活力、无价值的感受或过度或不适当的内疚、思考或全神贯注困难、反复的死亡意图或者自杀的意念或企图、害怕、焦虑、兴奋增盛、沉思的或强迫性沉思、过度担心身体健康、恐慌发作以及恐惧症。
[0186]此处描述了具有下列某些所需特性的tNSCs:首先，该tNSCs是由具有表型一致性、稳定的基因表达以及多能特性的异质性亚型(heterogeneous subtypes)所组成的混合的细胞族群；其次，它们含有实质上加强多巴胺能神经生成的神经胶质祖细胞(gliaprogenitor cells)以及星形胶质细胞；第三，它们具有用于“挽救”功能异常的多巴胺能神经元的内在能力以及免疫豁免的性质；最后，来自宿主组织上的不同的神经前体的神经滋养效果将会促进结构修复(structural repair)。
[0187]在一些实施方案中，此处提供了具有允许在移植治疗中适当操作的下列某些所需特性的tNSCs:1)该独特的tNSCs在品质上的一致性以及充足的细胞来源方面被RA简单且有效地诱导；2)经移植的tNSCs在损伤的黑质纹状体途径(nigrostriatal pathway)中功能性地新生成多巴胺能神经元，它在植入后可以存活至少18周；3)感觉运动损伤(sensorimotor impairments)早在植入后的第3周就得到显著地改善；4)该tNSCs具有免疫豁免，促进干细胞治疗；5)如此处所描述的对细胞增殖的分子机制的操控允许发展用于在移植之后预防肿瘤形成的策略；6)该tNSCs经由数个细胞传代能够在培养中生长；以及7)该tNSCs能够在无小鼠胚胎饲养细胞的培养基中培养。
[0188]在一个实施方案中，此处提供了一种用于治疗急性以及慢性疾病的方法，其中该方法包括植入hTS细胞衍生的tNSCs。在一个实施方案中，该tNSCs被植入到患有神经障碍的患者的脑内。在另一实施方案中，该tNSCs被植入到患有神经障碍的患者的纹状体内。
[0189]此处所描述的一个方面是一种用于治疗神经疾病的方法，其中该方法包括tNSCs的位点特异性整合(site-specific integration)。在一个实施方案中，该tNSCs衍生自hTS细胞。在另一实施方案中，与hES细胞治疗相比，肿瘤形成的可能性是较低的。
通过多巴胺能神经元的再生来治疗神经退化疾病
[0190]此处提供了用于在哺乳动物中诱导多巴胺能神经元的方法，其中此处所描述的神经元祖细胞作为细胞悬浮液进行移植，从而产生与组织块的移植物相比更均质的神经再支配(reinnervation)。在一个实施方案中，如此处所描述的多巴胺能神经元的诱导降低运动失调(dyskinesias)的风险并且增加临床上有益的效果的可能性。在一个实施方案中，该哺乳动物是人类。在另一实施方案中，该哺乳动物是大鼠、小鼠、猪、犬、猴、猩猩或人猿。
[0191]tNSCs的移植在黑质纹状体途径中诱导新生成的多巴胺能神经元并且实质上改善了帕金森氏症大鼠中的行为 障碍。这些结果提供的证据证明了 hTS细胞是适合在临床应用中使用以治疗神经退化疾病的人类多能干细胞。
[0192]进行第一实验以检测:1)用RA处理不同持续时间的tNSCs是否会影响改善H)大鼠中的行为缺陷(behavioral deficits)的效力；以及2)如此植入的tNSCs在脑中能存活多久。根据阿朴吗啡诱导的旋转分析，将GFP标记的tNSCs (1.5X IO6)移植到损伤的纹状体的2个部位内从第3周直到第12周显著地改善行为缺陷(图5a)。接受5天RA-诱导的tNSCs的H)大鼠在植入后6周的开始时显著地改善，然而，此效果在第12周后消失而与对照组相似。此原因可以被解释为大多数的神经遗传命运限制的GRP (Gmz)在诱导超过5天
之后处于向未定义的滋养层巨细胞分化的脊(ridge)处。如有行为改善，大鼠在第18周时处死以检测那些GFP标记的tNSCs的活力。脑部切片以免疫组织化学方式显示了在黑质纹状体途径中大量新生成的多巴胺能神经元，它们具有从细胞体中突起的多重外生长，再支配周围的脑区域(图5b)。然而，在接受5天RA-诱导的tNSCs (图5c)以及对照H)组(图5d)的大鼠中，未观察到此现象。在第18周，免疫荧光显微术证明GFP标记的tNSCs仍然存在于损伤的区域中，且呈散布的或斑点模式分布在注射部位。未发现畸胎瘤形成(teratomaformation),也未使用免疫抑制剂。
[0193]为了避免来自多巴胺能过度生长以及不均匀且不一致的神经再支配的不利影响，第二实验试图将较少的tNSCs (I X IO6)通过注射在一个部位上来移植至“老年”H)大鼠(η=16 ;体重630-490gm)的损伤的纹状体内。行为评估在植入后每3周进行分析。结果显示:在阿朴吗啡诱导的旋转测试中，从植入后的第3周至第12周对侧的旋转得到显著改善(图6a)。为了评估细胞治疗对姿势不平衡(postural imbalance)以及步态障碍(PI⑶)(特征为运动失能症、僵硬以及步伐与平衡障碍)的效果，进行数种测试(诸如步行速度、步伐长度、跨步长度以及支撑的基础)。受影响的前肢在杠上的抓握时间显著地缩短了 3周并且在“杠测试(bar test) ”中于第12周结束时持续改善(图6b)，这表明前肢的抓取力量得到非常快速的改善。步伐长度(图6c)、跨步长度(图6d)、步行速度(图6e)以及支撑的基础(图6f)的测量显示tNSCs的移植从第3周早期至第12周在功能上显著地改善感觉运动障碍。在一个实施方案中，该tNSCs在再生医学上是合适的候选物，以用于在神经退化疾病(例如，帕金森氏症)患者中以干细胞为基础的治疗。在第12周结束时，处死大鼠并且对脑部切片进行酪氨酸羟化酶(TH)免疫染色。实验显示在黑质纹状体途径中出现的新的多巴胺能神经元的再生(图19)。新生成的多巴胺神经元使用密度测定法(densitometry)进行评估，其显示28.2%的复原。在一个实施方案中，在神经退化疾病患者的治疗中，该tNSCs是hES细胞以及胎儿中脑组织(fetal mesencephalic tissue)这两者的备选替代物。
[0194]在一个实施方案中，此处提供了一种hTS细胞，它是除了 hES细胞之外的人类多能干细胞，但在早期胚胎形成中具有多能性以及自我更新的相似特性。在体内，经移植的tNSCs在损伤的黑质纹状体途径中功能性地新生多巴胺能神经元，它们在植入后能在ro大鼠中存活至少18周。根据在年轻以及老年ro大鼠这两者中进行的一组行为评估，感觉运动障碍早在植入后的第3周就得到显著的改善。将hTS细胞衍生的NSCs移植至脑的神经毒素-神经切除的纹状体(neurotoxin-denervated striatum)中能够使缺失的多巴胺能神经元再生，并改善患有H)的大鼠中的主要行为缺陷。
[0195]在一个实施方案中，黑质纹状体途径中的DA神经元再生。在另一实施方案中，植入的tNSCs增加纹状体中的神经胶质细胞。在另一实施方案中，RA诱导GRAP以及GFAP-阳性的祖细胞的表达，这产生遍及CNS的神经元以及少突胶质细胞(oligodendrocytes)。
阿尔兹海默症的治疗
[0196]此处提供了用于治疗阿尔兹海默症的方法，其中该方法包括将神经元祖细胞移植到哺乳动物的脑中。在一个实施方案中，该哺乳动物是人类。在另一实施方案中，该人类是经诊断患有阿尔兹海默症或处于发展阿尔兹海默症的风险中的患者，例如，具有该疾病的家族史或已被鉴定为具有关于`该疾病的风险因子的人。在另一实施方案中，该哺乳动物是猪、犬、猴、猩猩或人猿。在另一实施方案中，该哺乳动物是小鼠。在另一实施方案中，该哺乳动物是大鼠。在另一实施方案中，该大鼠或小鼠展现阿尔兹海默症的症状。在一个实施方案中，神经元祖细胞被移植到该疾病的非人类动物模型(例如，其中AD7C-NTP过度表达的小鼠模型、阿尔兹海默症大鼠模型、转基因小鼠模型等等)中。
[0197]在一个实施方案中，用诱导剂处理hTS细胞以提供具有生物标记(biomarker)特征的神经元细胞族群。在一个特定的实施方案中，该诱导剂是RA。在一个实施方案中，调节分子机制或信号传递途径以维持多能性。在另一实施方案中，调节分子机制或信号传递途径以预防在移植之后的肿瘤形成。
[0198]在另一实施方案中，该tNSCs被移植或嵌入到哺乳动物的脑中。在一个实施方案中，该神经元祖细胞作为细胞悬浮液进行移植，从而产生更均质的神经再支配。在另一实施方案中，该神经元祖细胞被注射到所述哺乳动物的脑内。在另一实施方案中，衍生自hTS细胞的tNSCs被嵌入到脑的脑室下区(subventricular zone)。在一个实施方案中，该哺乳动物是人类。
[0199]在一个实施方案中，如此处所描述的神经元的诱导减少肿瘤形成的风险并且增加临床上有益的效果的可能性。在另一实施方案中，tNSCs的接受者显示与阿尔兹海默症有关的症状得到改善。在另一实施方案中，脑中的神经元之间的连接得到增加并且加强。 精神分裂症的治疗
[0200]此处提供了用于治疗精神分裂症的方法，其中该方法包括将神经元祖细胞移植到哺乳动物的脑中。在一个实施方案中，该哺乳动物是人类。在另一实施方案中，该人类是经诊断患有精神分裂症或处于发展精神分裂症的风险中的患者，例如，具有该疾病的家族史或已被鉴定为具有关于该疾病的风险因子的人。在另一实施方案中，该哺乳动物是小鼠。在另一实施方案中，该哺乳动物是大鼠。在另一实施方案中，该哺乳动物是猪、犬、猴、猩猩或人猿。在另一实施方案中，该大鼠或小鼠展现精神分裂症的症状。 [0201]在一个实施方案中，该神经元祖细胞被移植到该疾病的非人类动物模型(例如，精神分裂症大鼠模型、转基因小鼠模型等等)中。在一个实施方案中，模型小鼠具有改变的神经元系统的正常生理学调节。在另一实施方案中，该模型动物或组织可用于筛选在细胞内水平上发挥作用的潜在的治疗剂和/或治疗性方案。
[0202]在一个实施方案中，用诱导剂处理hTS细胞以提供具有生物标记特征的神经元细胞族群。在特定的实施方案中，该诱导剂是RA。在一个实施方案中，调节分子机制或信号传递途径以维持多能性。在另一实施方案中，调节分子机制或信号传递途径以预防在移植之后的肿瘤形成。
[0203]在另一实施方案中，tNSCs被移植或嵌入到哺乳动物的脑中。在一个实施方案中，该神经元祖细胞作为细胞悬浮液进行移植，从而产生更均质的神经再支配。在另一实施方案中，神经元祖细胞被注射到所述哺乳动物的脑内。
[0204]在一个实施方案中，如此处所描述的神经元的诱导减少肿瘤形成的风险并且增加临床上有益的效果的可能性。在另一实施方案中，tNSCs的接受者显示与精神分裂症有关的症状得到改善。
给药(Dosing)及施用(Administration)
[0205]此处所描述的经分离的神经干细胞制剂的施用模式包括，但不限于:全身性静脉注射(systemic intravenous injection)以及直接注射到预期的活性位点。该制剂可通过任何便利的途径[例如，通过输注(infusion)或浓注(bolus injection)]来施用，并且可与其它生物活性剂(biologically active agents) 一起施用。在一个实施方案中，施用是全身性定位施用(systemic localized administration)。
[0206]在一个实施方案中，神经干细胞制剂或组合物被配制为适用于静脉内施用至哺乳动物(包括人类)的药物组合物(pharmaceutical composition)。在一些实施方案中,用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液(sterile isotonic aqueous buffer)中的溶液。在必要时，该组合物也包含局部麻醉剂(local anesthetic)以减轻注射部位处的任何疼痛。当该组合物通过输注施用时，它可使用含有无菌药学级水或盐水(saline)的输液瓶(infusion bottle)进行分配。当该组合物通过注射施用时，可提供用于注射的无菌水或盐水的安瓿(ampoule)以使得所述成分在施用之前被混合。
[0207]在一个实施方案中，适合的药物组合物包含治疗有效量的祖干细胞和药学上可接受的载体(carrier)或赋形剂(excipient)。此载体包括,但不限于:盐水、缓冲盐水(buffered saline)、右旋糖(dextrose)、水及其组合。
[0208]在一个实施方案中，此处所描述的分离的tNSCs通过适合用于将细胞靶向至特定组织的递送系统而被递送到靶部位(例如，脑、脊髓或任何其它神经损伤和/或退化的部位)。例如，所述细胞被囊封在输送载体(delivery vehicle)中，其允许所述细胞在祀部位处缓慢地释出。该输送载体经修饰使得其特异性地靶向至特定的组织。靶向递送系统的表面以各种不同的方式进行修饰。在脂质体靶向的递送系统的情况下，脂质基团被并入到该脂质体的脂双层(lipid bilayer)中，以维持祀向配体与脂质体双层(liposomal bilayer)稳定缔合。
[0209]在另一个实例中，使用胶体分散系统(colloidal dispersion system)。胶体分散系统包括大分子复合体(macromolecule complexes)、纳米胶囊(nanocapsules)、微球体(microspheres)、珠粒(beads)以及以脂质为基础的系统,包括水包油乳液(oil-1n-wateremulsions)、微胞(micelles)、混合的微胞(mixed micelles)以及脂质体。
[0210]此处所描述的tNSCs的施用任选地通过下列方式对个体进行定制:(I)增加或减少注射的细胞数量；(2)改变注射的数量；(3)改变所述细胞的递送方法；或(4)改变细胞的来源，例如通过基因工程细胞或来自体外细胞培养物。
[0211]tNSC制剂以有效促进细胞植入接受者中的量来使用。在医师的裁量下，调整施用以满足最佳的效力以及药理给药。
筛选的方法
[0212]此处提供了筛选用于治疗或预防疾病的化合物的方法。在一个实施方案中，该方法包括使经分离的人类滋养层干细胞与所述化合物接触。在另一实施方案中，该方法包括使经分离的神经干细胞与所述化合物接触。在另一实施方案中，该方法进一步包括检测所述人类滋养层干细胞中至少一种基因、转录物或蛋白质的活性改变。在另一实施方案中，该方法进一步包括检测所述人类滋养层干细胞中至少一种转录物或蛋白质的水平改变。在另一实施方案中，该方法包括检测所述神经干细胞中至少一种基因、转录物或蛋白质的活性改变。
[0213]此处所提供的一个实施方案描述了一种针对诱导细胞中的改变的能力来筛选化合物的方法。在一个实施方案中，该方法包括使经分离的人类滋养层干细胞与所述化合物接触。在另一实施方案中，该方法包括使经分离的神经祖干细胞与所述化合物接触。在另一实施方案中，该方法进一步包括检测对所述人类滋养层干细胞的分化的诱导。在另一实施方案中，该方法进一步包括检测对所述神经干细胞的分化的诱导。
[0214]此处还提供了一种针对细胞毒性(cellular toxicity)或细胞的调节来筛选化合物的方法，该方法包括使本发明的经分化的细胞与化合物接触。在另一实施方案中，该方法进一步包括确定该细胞中任何起因于与该化合物接触的表型或代谢改变，以及将该变化与细胞毒性或任何其它细胞功能或生物化学上的改变进行关联。在另一实施方案中，促进了对分化的药剂(pharmaceuticals)、毒素或潜在调节子的筛选。可以向培养基添加这些物质(例如，药剂、毒素或潜在调节子)。
[0215]此处所提供的一个实施方案描述了一种筛选增殖因子(proliferationfactors)、分化因子(differentiation factors)以及药剂的方法。在一个实施方案中，人类滋养层干细胞或神经干细胞被用来筛选影响人类滋养层干细胞或神经干细胞在培养中的特性的因子[诸如小分子药物、肽(peptides)、多核苷酸(polynucleotides)等]或条件(诸如培养条件或操作)。在一个实施方案中，此系统具有不会被由测试化合物所造成的饲养细胞的干扰而引起的次级效应(secondary effect)所复杂化的优点。在另一实施方案中，测试了影响生长的物质。在另一实施方案中，从该培养物中撤除条件培养基(conditioned medium)并用较单纯的培养基予以取代。在另一实施方案中，接着用不同的可溶性因子的混合物(cocktails)(它们是用于取代该条件培养基的组分的候选物)处理不同的孔。若经处理的细胞被维持并且以满意的方式增殖(最佳地与在条件培养基中一样)，则每种混合物的效力得以确定。可以通过依据测试操作程序来处理细胞，并且接着确定经处理的细胞是否发展特定谱系的经分化的细胞的功能性或表型特性，来测试潜在的分化因子或条件。
[0216]在一个实施方案中，该人类滋养层干细胞或神经干细胞被用来筛选细胞分化的潜在调节子。在一个实施方案中，该细胞分化是神经分化。例如，在一个用于筛选细胞分化的调节子的分析中，该人类滋养层干细胞或神经干细胞可在无血清、低密度条件(根据情况需要，在LIF的存在或缺少下、在调节子的存在下，以及在RA的存在或缺少下)下培养，并且可检测对分化的效果。在另一实施方案中，此处所描述的筛选方法可用来研究与细胞发育有关的条件以及筛选有关该条件的潜在治疗剂或矫正药物或调节子。例如，在一个实施方案中，将正常的人类滋养层干细胞或神经干细胞的发育与具有该条件的细胞的发育相比较。
[0217]在一个实施方案中，基因以及蛋白质表达可在从人类滋养层干细胞或神经干细胞获得的不同细胞族群之间进行比较，并且被用来鉴定和表征在分化过程中上调或下调的因子，并且生成受影响的基因的核苷酸拷贝(nucleotide copies)。
[0218]在一个实施方案中，无饲养细胞的人类滋养层干细胞或神经干细胞培养物也可在药物研究中用于测试药学化合物(pharmaceutical compounds)。候选药学化合物的活性的评估通常涉及将本发明的经分化的细胞与该候选化合物组合，确定任何所产生的改变，并且接着将该化合物的效果与观察到的改变进行关联。在另一实施方案中，完成了筛选，例如，因为该化合物被设计成对某些细胞类型具有药理作用(pharmacological effect),或因为被设计为在别处具有效果的化合物具有非预期的副作用。在另一实施方案中，两种或多种药物组合地(通过同时地或`依序地与细胞组合)进行测试，以检测可能的药物-药物交互作用效应(interaction effects)。在另一实施方案中，最初针对潜在的毒性筛选化合物。在另一实施方案中，根据对细胞活力(cell viability)、存活、形态学(morphology),对某些标记、受体或酶的表达或释放，对DNA合成或修复的作用来确定细胞毒性。
[0219]本文中的术语“治疗(treating) ”、“治疗(treatment) ”用于指获得所需的药理和/或生理效果。在一些实施方案中，个体(例如，疑似患有神经退化性障碍和/或在遗传上有神经退化性障碍患病倾向的个体)用此处所描述的tNSCs制剂进行预防性治疗，并且该预防性治疗完全地或部分地预防神经退化性障碍或者它的征兆或症状。在一些实施方案中，个体接受治疗性治疗(例如，当个体患有神经退化性障碍时)，该治疗性治疗造成对于障碍的部分或完全治愈(cure)，和/或逆转可归因于该障碍的副作用，和/或稳定该障碍，和/或延缓该障碍的进展，和/或造成该障碍的消退。
[0220]将tNSCs施用(例如，移植)至有治疗需要的区域是通过，例如并且不受限地，手术期间的局部输注、通过注射、通过导管(catheter)的方式,或通过植入物(implant)的方式来完成的，所述植入物是多孔性(porous)、非孔性(non-porous)或凝胶状材料,包括膜，诸如硅胶膜(silastic membranes)或纤维。
[0221]将组合物“移植(transplanting) ”至哺乳动物中意指通过本领域所建立的任何方法来将该组合物导入到该哺乳动物的体内。被导入的组合物是“移植物(transplant)”，并且该哺乳动物是“接受者(recipient)”。该移植物以及该接受者可以是同源的(syngeneic)、同种异体的(allogeneic)或异种的(xenogeneic)。此外,该移植可以是自体移植。
[0222]“有效量(effective amount) ”是足以达到预期目的的治疗剂的量。例如，用于增加hTS细胞或tNSCs数目的因子的有效量是足以在体内或在体外(视情况而定)导致神经干细胞数目增加的量。用于治疗或改善神经退化疾病或病况的组合物的有效量是足以减少或消除神经退化疾病或病况的症状的组合物的量。给定的治疗剂的有效量将会随着诸如试剂的性质、施用的途径、要接受治疗剂的动物的大小与物种以及施用的目的等因素而变化。
[0223]在一个实施方案中，此处进一步提供了遗传修饰的tNSCs。操控改变了细胞的各种不同的性质，例如，使它更适应于或抵抗特定环境条件，和/或诱导由其生成一种或多种特定物质，所述物质可以例如改善细胞的活力。可以进行此类遗传改变以使该细胞更适合在移植中使用，例如，以避免接受者对该细胞的排斥(有关基因治疗操作程序的综述，参见 Anderson, Science, 256:808 ；Mulligan, Science, 926 ；Miller, Nature, 357:455 ；VanBrunt, Biotechnology, 6 (10): 1149 ；以及 Yu 等人,Gene Therapy, 1:13)。
[0224]“载体(vector) ”意指重组DNA或RNA构建体，诸如质粒(plasmid)、卩遼菌体(phage)、重组病毒，或者其它的载体，当导入到适当的宿主细胞中会产生对此处所描述的祖细胞的修饰。适当的表达载体是本领域普通技术人员所熟知的，并且包括那些在真核和/或原核细胞中可复制的表达载体和维持游离型(episomal)的表达载体或整合至宿主细胞基因组内的表达载体。
[0225]载体的构建使用此 处所描述的技术来完成，例如，如在Sambrook等人，1989中所描述的。在一个实施方案中，经分离的质粒或DNA片段以希望生成质粒的形式进行切割、裁剪以及再连接。若需要，使用任何适合的方法执行用于确认所构建的质粒中的正确序列的分析。用于构建表达载体、制备体外转录物、将DNA导入宿主细胞中以及执行有关评估基因表达及功能的分析的适合方法是已知的。基因呈现、扩增和/或表达直接在样品中进行测量，例如，通过传统的Southern印迹法(Southern blotting)、用以定量mRNA的转录的Northern 印迹法(Northern blotting)、斑点印迹法(dot blotting) (DNA 或 RNA 分析)或原位杂交法(in situ hybridization)(使用可以此处所提供的序列为基础的适当标记的探针)。
[0226]如此处所用的，诸如“转染(transfection) ”、“转化(transformation) ”等术语意指将核酸以功能形式转移到细胞或生物体。此类术语包括各种不同的将核酸转移到细胞的方法，包括用 CaP04 转染、电穿孔(electroporation)、病毒转导(viral Iransductionhi^转染(Iipofection)、使用脂质体和/或其它输送载体递送。
[0227]通过亲和力技术(affinity techniques)或通过细胞分选(cell sorting)[诸如突光活化细胞分选(fluorescence-activated cell sorting)]对细胞进行分选，其中它们用适合的标记物进行标记，诸如偶联至例如反义核酸分子或免疫球蛋白或其一部分上的荧光团(f Iuorophore),或者内生性突光蛋白质(intrinsically fluorescent protein),诸如绿色突光蛋白(green fluorescent protein,GFP)或它的变异体。如此处所用的，“分选(sorting)”意指第一细胞类型与第二细胞类型的至少部分物理分离。
[0228]如此处所用的，术语“大约(about)”意指±15%。例如，术语“大约10”包括8.5至 11.5。
实施例
材料
[0229]抗体。用于免疫印迹法(immunoblot)以及免疫细胞化学法(immunocytochemistry):第一抗体:SSEA-1、-2、_3、CD90 以及巢蛋白(Chemicon)。神经丝以及 GFAP (BioGenex)。Nanog、0ct4、Cdx2 以及 Sox2 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) ?Ga q/11(C-19, sc-392)、GP (T-20, sc-378) ,RXRa ,RAR^、c_Src、pStat3、Stat3、PPl 类似物以及 β 肌动蛋白(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) > TH(Sigma-AldrichSt.Louis, MO and Temcoula, CA)以及 5-轻色胺(Sigma-Aldrich St.Louis, MO)。[0230]第二抗体:[0231]siRNAs:Nanog siRNA 以及 Cdx2siRNA (Sigma-Aldrich St.Louis, MO)。[0232]用于流式细胞术的第一抗体:HLA-ABC、CD9、CD14、CD34、CD45、CD73、CD90、CK7、波形蛋白、6-整合蛋白、E-1丐黏素、L-选择素、Nanog、0ct4、Cdx2以及Sox2购自于BDBiosciences, San Jose, CA, USA ;HLA_DR、CD33、CD44 以及 CD105 来自于 eBioscience, SanDiego, CA, USA ；CD133 来自于 Miltenyi Biotec, Germany?[0233]为了进行TH-2以及5-羟色胺免疫染色，细胞用PBS洗涤之后在4 °C下于0.1M PBS中孵育过夜。在室温下与封闭溶液(50mL0.1MPBS、0.05g叠氮钠、1%马血清以及10%Triton X-100)孵育I小时之后，再次洗涤细胞。细胞与第一抗体，即TH-2 (1:200, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)以及 5-轻色胺(1:100, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)孵育2小时并且用PBS洗涤。通过与带有FITC或PE的抗小鼠IgG(Sigma-Aldrich, St.Louis，MO)孵育I小时，用PBS彻底地洗涤细胞并且进行免疫荧光分析。
实施例1:分离、分化以及细胞培养[0234]胚胎绒毛膜绒毛(Embryonic chorionic villous)经由腹腔镜手术(laparoscopic surgery)从妇女体内的早期异位妊娠(孕龄:6_8周)的输卵管获得，由人体研究及伦理委员会的机构审查委员会(Institutional Review Boardon Human Subjects Research and Ethics Committees)所批准。组织在无血清的α -MEM(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)中被绞碎并且用0.025%胰蛋白酶/EDTA(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)胰蛋白酶化 15 分钟，通过添加含有 10%FBS 的 a -MEM终止该消化。重复此操作程序数次。在离心之后，收集细胞并且在37°C下于5%C02中用含有 20%FBS(JRH, Biosciences, San Jose, CA)和 1% 青霉素-链霉素的 a-MEM 培养。在培养2代之后通过商业试剂盒(Dako，Carpinteria，CA)测量，培养基中的hCG表达变得无法检测。[0235]细胞分化:hTS细胞在37°C下于5%C02中被培养于含有20%FBS、1%青霉素-链霉素和 10yg/mL bFGF 的条件 a-MEM(CytoLab Ltd, Rehovot, Israel)中。培养基每 3 天更换。在5代之后，使用经过改良的已公开的操作程序启动向各种不同的特化表型的分化。关于在Transwell板(Corning, New York, NY)中的细胞培养,上层小室涂覆有500 μ L的4:1比例的含有PureCol的胶原蛋白凝胶(Inamed Biomaterials, Fremont, CA)以及条件L-DMEM(Gibco1Grand Island, NY)(使用 IM NaHCO3 调整至 ρΗ7.4)。细胞(4X IO5)培养于上层小室上的条件L-DMEM(ImL)中。下层小室含有条件H-DMEM(3mL)。初步的实验显示:在这两个小室中的葡萄糖水平可能在4小时内达到平衡状态。
[0236]亚表型的细胞分化:细胞在37°C下于5%C02中被培养于含有20%FBS、1%青霉素-链霉素和 10 μ g/mL bFGF 的条件 a -MEM(CytoLab Ltd, Rehovot, Israel)中。一般而言，培养基每3天更新。在培养5代之后，通过如图12的表中所示的各种不同的策略进行向各种不同的特定细胞表型的分化。对于成骨分化(osteogenic differentiation),使用菌素红 S 试验(Alizarin red S assay) (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)来分析细胞化学矿物基质(cytochemical mineral matrix)以检测钙矿物质含量。为了鉴定钙沉积物,将细胞固定并且在黑暗中与2%硝酸银溶液(w/v)孵育10分钟，接着用去离子水彻底地洗涤并暴露于亮光下15分钟。使用商业试剂盒(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)以von Kossa染色处理细胞，以检测碱性磷酸酶活性。在酸性pH水平下使用阿尔新蓝染色(Alcian blue staining)(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)来确认成软骨分化(Chondrogenic differentiation)。对于成肌分化(myogenic differentiation),细胞与配于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的3%过氧化氢孵育10分钟以消除内源性过氧化酶酶活性。非特异性位点用含有10%人血清和0.l%Triton X-100的PBS封闭60分钟并且用封闭缓冲液洗涤5分钟。细胞在含有骨豁肌肌球蛋白重链特异性单克隆抗体(skeletal muscle myosin heavy chain-specificmonoclonal antibody)的封闭缓冲液(Vector Laboratories, Burlingame, CA)中孵育 I小时，接着使用VectaStain ABC试剂盒(Vector Laboratories)进行染色。对于脂肪生成性分化，用条件培养基诱导细胞，并且在含有1%1 丐的4%低聚甲醒(paraformaldehyde)中固定60分钟，接着以70%乙醇洗涤。在暴露于2%油红O试剂(Oil red O reagent)(Sigma-Aldrich, St.L ouis，MO) 5分钟之后，用70%乙醇继而通过水漂洗来移除过度的染色。油红O染剂用作细胞内脂质积累的指示剂。神经干细胞用配于乙醇中的ΙΟμΜ全反式视黄酸(all-trans retinoic acid) (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)来诱导。
实施例2:质粒转染
[0237]为了进行质粒转染，hTS细胞如先前所述用全反式视黄酸(ΙΟμΜ)(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)诱导过夜，继而在FlB-GFP的DNA混合物中共转染(Myers)。简言之，在4°C下将DNA混合物缓慢地添加到含有DOTAP (30 μ L)脂质体转染试剂(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)和 70 μ L HBSS 缓冲液[含有 NaCl (867g配于 80mLH20 中)]的 DOTAP (100 μ L)溶液加 2mL HEPES 溶液(1M, ρΗ7.4，Gibco)中，历时15分钟。在用PBS洗涤之后，细胞与DNA混合物充分地混合。在孵育过夜之后，通过培养2-3周直到集落形成为止经G418选择(400 μ g/mL, Roche Applied Science)而获得稳定的细胞株。合并和裂解G418-抗性细胞并且通过使用单克隆抗GFP抗体(Stratagene, LaJolla, CA)的Western印迹法(Western blotting)进行分析以定量表达GFP的转染子的百分比。通过传代培养(subcultures),经转染的hTS细胞用甲醇固定(10分钟)以通过免疫突光法(immunofluorescence)来检测GFP的表达。转染率获得超过95%的效力。
实施例3 =RT-PCR及定量PCR(qPCR)[0238]为了进行RT-PCR，使用TRIZOL试剂(Invitrogen)提取来自于IO5-1O6个细胞的总 RNA，并且使用 Ready-To-Go RT-PCR Beads 试剂盒(Ready-To-Go RT-PCR Beads kit)(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)来测定 mRNA 表达。简言之，反应产物于1.5%琼脂糖凝胶上解析并且用溴化乙锭(ethidium bromide)来显影。β-肌动蛋白或β-2微球蛋白(β-2microglobulin)用作阳性对照。全部实验执行3个重复。关于qPCR,基因表达用 iQ5 实时 PCR 检测系统(iQ5Real-Time PCR Detection System) (Bio-RadLaboratories)进行测量并且用 Bio-Rad iQ5 光学系统软件 2.0 版(Bio-Rad iQ50pticalSystem Software, version2.0) (Bio-Rad Laboratories)进行分析。相对mRNA 水平使用比较Ct法(comparative Ct method) (Bio-Rad,使用手册)进行计算并且表示为相对于生物对照的比例。全部引物对经确认在一个循环内大约使产物的量加倍并且产生预期大小的单一产物。
实施例4:ffestern印迹法
[0239] 将细胞接种至具有无血清培养基的IOcm皿中过夜，并且用或不用RA(IOyM)处理如所指示的多个时间间隔。在刺激之后，细胞用冰冷的PBS洗涤两次并且用RIPA裂解缓冲液(RIPA lysis buffer) (Minipore)裂解。蛋白质浓度通过BCA蛋白质检测试剂盒(BCAprotein assay kit) (Thermo)来测定。等量(30 μ g)的蛋白质通过 8%SDS_PAGE 来解析，转移至PVDF膜上并且在室温下用5%脱脂奶粉封闭I小时。在封闭之后，该膜在4°C下与第一抗体孵育4小时。细胞用PBST洗涤3次，接着在室温下与HRP偶联的第二抗体孵育I小时。在用PBST缓冲液洗涤6次之后，该膜与化学发光底物(chemiluminescentsubstrate) (GE Healthcare)孵育I分钟。特定的条带使用增强化学发光试剂盒(enhancedchemi luminescence kit, ECL) (Amersham)来显影。
实施例5: Southern印迹法
[0240]hTS细胞的端粒长度如先前所述在第3代和第7代通过Southern免疫印迹分析进行测量(Tsai)。简言之,将片段转移到Hybond N+尼龙膜(Hybond N+nylon membranes)(Amersham Biosciences)并且在 65 °C 下与使用 Ready-To-Go 标记珠粒(Ready-To-Golabeling beads) (Amersham Biosciences)以 a-32P_dCTP 标记的 TTAGGG 重复序列的探针杂交。末端限制片段通过与互补于端粒重复序列的标记的寡核苷酸杂交进行显影。TRF的大小分布与DNA长度标准进行比较。
实施例6:末端限制片段(TRF)Southern印迹法
[0241]自细胞启动它的癌变以后，它的端粒将会变得非常短。端粒长度在hTS细胞的培养中于第3以及第7代进行测量。简言之，将片段转移到Hybond-N+尼龙膜(AmershamBiosciences)并且在 65°C下与使用 Ready-To-Go 标记珠粒(Amersham Biosciences)以a -[32P]-dCTP标记的TTAGGG重复序列的探针杂交。末端限制片段通过与互补于端粒重复序列的标记的寡核苷酸杂交进行显影。末端限制片段的大小分布与DNA长度标准进行比较。关于电子显微术，hTS细胞衍生的葡萄样细胞群(hTS cell-derived grape-like cellmass)通过透射电子显微术(JEM-2000EXII，JEOL，Tokyo，Japan)进行检测以鉴定细胞的基础结构。
[0242]0ct4、Sox2、NANOG、fgfr2、FGF4、BMP4、Cdx2 以及内源性对照 β -肌动蛋白(ACTB)在hTS以及用500单位LIF(Chemicon，Temecula, CA)处理的hTS细胞中的差异性基因表达通过使用突光素(fluorescein)作为用于标准化孔间光学偏差(well_to_welloptical variation)的内部被动参考染料(internal passive reference dye)的 IQ5 实时 PCR 检测系统(Bio-Rad Laboratories)进行测量。在含有 12.5yL 的 2X SYBR Greensupermix(Bio-Rad)、0.5 μ L的10 μ M的各个引物以及0.5 μ L的cDNA样品并与无菌水混合的25 μ L总体积中进行PCR扩增。反应开始于95°C，3分钟；接着是60个由95°C下变性(denaturation) 30s、6CTC下退火(annealing) 30s、72°C下延伸(extension) 15s 所构成的 3步扩增循环。在最终解离阶段，运行以生成用于确认扩增产物特异性的解链曲线(meltingcurve) ο 通过 Bio-Rad IQ5 光学系统软件 2.0 版(Bio-Rad IQ5optical system softwareversion2.0) (Bio-Rad)监测并分析实时qPCR。相对mRNA水平使用比较Ct法(Bio-Rad使用手册)进行计算并且表示为相对于生物对照的比例。ACTB转录物水平经确认与总RNA量非常相关，因而始终用于标准化。全部使用的引物对经确认在一个循环内大约使产物的量加倍并且产生预期大小的单一产物。0ct4、Sox2、NAN0G、fgfr2、FGF4、BMP4、Cdx2以及内源性对照肌动蛋白(ACTB)的引物序列示于所附的数据表3中。
【权利要求】
1.一种经分离的神经干细胞，其中所述经分离的神经干细胞衍生自从滋养层组织中所得到的干细胞。
2.—种经分离的神经干细胞,其中所述神经干细胞表达Cdx2、Nanog、巢蛋白、0ct_4、神经丝、Ngn3、Neo-D, MAP-2、CD133、RARP、RXRa、RXRβ、CRABP-2、CRBP-K RALDH-2 或RALDH-3中的一种或多种的转录物。
3.如权利要求1或2所述的经分离的神经干细胞，其中所述细胞是人细胞。
4.如权利要求1或2所述的经分离的神经干细胞，其中所述细胞具有正常的核型。
5.如权利要求1或2所述的经分离的神经干细胞，其中所述细胞具有一种或多种免疫豁免的特性。
6.如权利要求5所述的细胞，其中所述一种或多种免疫豁免的特性包括不存在CD33表达和/或⑶133表达。
7.—种使权利要求1或2的经分离的神经干细胞分化成神经元的方法，该方法包括:将所述经分离的神经干细胞施用至哺乳动物的脑中，其中所述经分离的神经干细胞分化成神经元。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述神经元是多巴胺能神经元、谷氨酰胺能神经元、5-羟色胺能神经元或GABA能(Y -氨基丁酸)神经元。
9.如权利要求7所述的方法，其中在所述施用之前，用诱导药物预诱导所述祖细胞。
10.如权利要求7所述的方法，其中该诱导期为至少I天。
11.如权利要求7所述的方法，其中在所述施用之前，未用诱导药物预诱导所述祖细`胞。
12.如权利要求7所述的方法，其中在所述施用之前，所述哺乳动物的所述脑被损害或蒙受神经元缺失。
13.如权利要求7所述的方法，其中所述损害是针对多巴胺能神经元、谷氨酰胺能神经元、5-羟色胺能神经元、GABA能(Y -氨基丁酸)神经元的。
14.如权利要求7所述的方法，其中所述神经元缺失是针对多巴胺能神经元的。
15.如权利要求7所述的方法，其中所述细胞用表达载体转染。
16.如权利要求7所述的方法，其中所述干细胞在被施用至所述个体的脑中之后，会移转至该个体的脑的黑质致密部(SNc)区域。
17.如权利要求7所述的方法，其中所述施用改善所述哺乳动物中的感觉运动功能。
18.如权利要求7所述的方法，其中所述施用导致所述哺乳动物的僵硬、运动失能症或平衡障碍的减轻。
19.一种使经分离的神经干细胞分化成多巴胺能神经元的方法，该方法包括:将所述经分离的神经干细胞施用至哺乳动物的脑中，其中所述经分离的神经干细胞表达Cdx2、Nanog、巢蛋白、Oct-4、神经丝、NgN3、Neo-D、MAP-2、CD133、RARP ,RXRa、RXRP、CRABP_2、CRBP-1、RALDH-2或RALDH-3中的一种或多种的转录物，其中所述哺乳动物的所述脑被损害或已蒙受神经元缺失，其中所述经分离的神经干细胞中的一种或多种分化成多巴胺能神经J Li ο
20.一种使经分离的神经干细胞分化成多巴胺能神经元的方法，该方法包括:将所述经分离的神经干细胞施用至哺乳动物的脑中，其中所述分离的神经干细胞衍生自滋养层组织，其中所述哺乳动物的所述脑被损害或已蒙受神经元缺失，其中所述经分离的神经干细胞中的一种或多种分化成多巴胺能神经元。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述施用改善所述哺乳动物中的感觉运动功倉泛。
22.如权利要求19或20所述的方法，其中所述施用导致所述哺乳动物的僵硬、运动失能症或平衡障碍的减轻。
23.如权利要求19或20所述的方法，其中在所述施用之前，用诱导药物预诱导所述祖细胞。
24.如权利要求19或20所述的方法，其中该诱导期为至少I天。
25.如权利要求19或20所述的方法，其中在所述施用之前，未用诱导药物预诱导所述祖细胞。
26.一种使经分离的人类滋养层干细胞分化成神经干细胞的方法，其包括:调节Cdx2、似11(^、巢蛋白、神经丝、呢11-3、獻?-2、他0-0、0)133、0(^4、狀1^ ,RXRa、RXRP、CRABP_2、CRBP-1、RALDH-2 或 RALDH-3 基因的活性。
27.一种使经分离的人类滋养层干细胞分化成神经干细胞的方法，其包括:调节Cdx2、似11(^、巢蛋白、0(^4、神经丝、呢11-3、獻?-2、他0-0、0)133、狀1^ ,RXRa、RXRP、CRABP_2、CRBP-1、RALDH-2 或 RALDH-3 转录物的水平。
28.一种使经分离的人类滋养层干细胞分化成神经干细胞的方法，其包括:调节Cdx2、似11(^、巢蛋白、0(^4、神经丝、呢11-3、獻?-2、恥0-0、0)133、狀1^ ,RXRa、RXRP、CRABP_2、CRBP-1、RALDH-2或RALDH-3蛋白质的水平或活性。
29.—种筛选用于治疗或预防疾病的化合物的方法，其包括: a.使经分离的人类滋养层干细胞与所述化合物接触；以及 b.检测所述人类滋养层干细胞中至少一种基因、转录物或蛋白质的活性的改变。
30.如权利要求29所述的方法，其中与未接触所述化合物的可比较的经分离的人类滋养层干细胞相比，所述人类滋养层干细胞中至少一种基因、转录物或蛋白质的所述活性降低。
31.如权利要求29或30所述的方法，其中与未接触所述化合物的可比较的经分离的人类滋养层干细胞相比，所述人类滋养层干细胞中的至少一种基因、转录物或蛋白质的所述活性增加。
32.如权利要求29至31所述的方法，其中所述疾病是神经退化性障碍。
33.如权利要求29至32所述的方法，其中所述疾病是帕金森氏症、阿尔兹海默症、亨廷顿氏症、肌萎缩侧索硬化症、弗里德赖希共济失调、路易氏体症、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆、精神分裂症、麻痹、多发性硬化症、脊髓损伤、脑损伤(例如，中风)、脑神经障碍、周边感觉神经病变、癫痫、朊病毒障碍、克雅氏病、阿尔珀斯病、小脑/脊髓小脑退化、巴滕病、皮质基底核退化、贝尔氏麻痹、格林-巴利综合征、皮克病和自闭症。
34.一种筛选用于治疗或预防疾病的化合物的方法，其包括: a.使经分离的人类滋养层干细胞与所述化合物接触；以及 b.检测所述人类滋养层干细胞中至少一种转录物或蛋白质的水平的改变。
35.如权利要求34所述的方法，其中与未接触所述化合物的可比较的经分离的人类滋养层干细胞相比，所述人类滋养层干细胞中至少一种转录物或蛋白质的所述水平降低。
36.如权利要求34或35所述的方法，其中与未接触所述化合物的可比较的经分离的人类滋养层干细胞相比，所述人类滋养层干细胞中至少一种转录物或蛋白质的所述水平增加。
37.如权利要求34至36所述的方法，其中所述疾病是神经退化性障碍。
38.如权利要求34至37所述的方法，其中所述疾病是帕金森氏症、阿尔兹海默症、亨廷顿氏症、肌萎缩侧索硬化症、弗里德赖希共济失调、路易氏体症、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆、精神分裂症、麻痹、多发性硬化症、脊髓损伤、脑损伤(例如，中风)、脑神经障碍、周边感觉神经病变、癫痫、朊病毒障碍、克雅氏病、阿尔珀斯病、小脑/脊髓小脑退化、巴滕病、皮质基底核退化、贝尔氏麻痹、格林-巴利综合征、皮克病和自闭症。
39.一种针对诱导细胞中的改变的能力筛选化合物的方法，其包括: a.使经分离的人类滋养层干细胞与所述化合物接触；以及 b.检测对所述人类滋养层干细胞的分化的诱导。
40.一种针对诱导细胞中的改变的能力筛选化合物的方法，其包括: a.使经分离的神经干细胞与所述化合物接触；以及 b.检测对所述神经干细胞的分化的诱导。
41.一种筛选用于治疗或预防疾病的化合物的方法，其包括: a.使经分离的神经干细胞与所述化合物接触；以及 b.检测所述神经干细胞中至少一种基因、转录物或蛋白质的活性的改变。
42.如权利要求41所述的方法，其中与未接触所述化合物的可比较的经分离的神经干细胞相比，所述神经干细胞中至少一种基因、转录物或蛋白质的所述活性降低。
43.如权利要求41或42所述的方法，其中与未接触所述化合物的可比较的经分离的神经干细胞相比，所述神经干细胞中至少一种基因、转录物或蛋白质的活性增加。
44.如权利要求41至43所述的方法，其中所述疾病是神经退化性障碍。
45.如权利要求41至44所述的方法，其中所述疾病是帕金森氏症、阿尔兹海默症、亨廷顿氏症、肌萎缩侧索硬化症、弗里德赖希共济失调、路易氏体症、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆、精神分裂症、麻痹、多发性硬化症、脊髓损伤、脑损伤(例如，中风)、脑神经障碍、周边感觉神经病变、癫痫、朊病毒障碍、克雅氏病、阿尔珀斯病、小脑/脊髓小脑退化、巴滕病、皮质基底核退化、贝尔氏麻痹、格林-巴利综合征、皮克病和自闭症。
46.一种筛选用于治疗或预防疾病的化合物的方法，其包括: a.使经分离的神经干细胞与所述化合物接触；以及 b.检测所述神经干细胞中至少一种转录物或蛋白质的水平的改变。
47.如权利要求46所述的方法，其中与未接触所述化合物的可比较的经分离的神经干细胞相比，所述神经干细胞中至少一种转录物或蛋白质的所述水平降低。
48.如权利要求46或47所述的方法，其中与未接触所述化合物的可比较的经分离的神经干细胞相比，所述神经干细胞中至少一种转录物或蛋白质的所述水平增加。
49.如权利要求46至48所述的方法，其中所述疾病是神经退化性障碍。
50.如权利要求46至49所述的方法，其中所述疾病是帕金森氏症、阿尔兹海默症、亨廷顿氏症、肌萎缩侧索硬化症、弗里德赖希共济失调、路易氏体症、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆、精神分裂症、麻痹、多发性硬化症、脊髓损伤、脑损伤(例如，中风)、脑神经障碍、周边感觉神经病变、癫痫、朊病毒障碍、克雅氏病、阿尔珀斯病、小脑/脊髓小脑退化、巴滕病、皮质基底核退化、贝尔氏麻痹、格林-巴利综合征、皮克病和自闭症。
51.一种用于治疗有需要的哺乳动物中的神经障碍的方法，其包括将至少一种神经干细胞施用至所述哺乳动物，其中该细胞是经免疫豁免的。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述哺乳动物是小鼠、大鼠、猪、犬、猴、猩猩或人猿。
53.如权利要求51所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。
54.如权利要求51所述的方法，其中所述有需要的哺乳动物具有一种或多种与神经障碍有关的症状。
55.如权利要求54所述的方法,其中所述一种或多种症状选自于由下列所构成的群组:僵硬、平衡障碍、震颤、步态障碍、不良性步态、痴呆、过度肿胀(水肿)、肌无力、下肢萎缩、运动障碍(舞蹈病)、肌肉僵直、物理运动的减慢(运动迟缓)、物理运动的缺失(运动失能症)、健忘、认知(智能)损伤、辨识的缺失(失识症)、受损的功能诸如决策与计划、单侧面麻痹、感觉缺失、麻木、刺痛感、四肢的疼痛感觉异常、虚弱、脑神经麻痹、语言障碍、眼球运动、视野缺损、失明、出血、分泌物、近端肌萎缩、运动困难症、四肢肌肉张力的异常、肌强直减少、动作失调、在手指-手指测试或手指-鼻测试中错误的指示、辨距不良、霍-斯二氏现象、不完全的或完全的全身性麻痹、视神经炎、视物显多症、眼球运动障碍如眼球震颤、痉挛性麻痹、痛苦的强直发作、莱尔米特综合征、共济失调、语言困难、膀胱直肠障碍、起立性低血压、运动功能的减退、尿床、贫乏的言语表达、不充足的睡眠型态、睡眠障碍、食欲障碍、体重改变、精神运动性激动或迟滞、减少的活力、无价值的感受或过度或不适当的内疚、思考或全神贯注困难、反复的死亡意图或者自杀的意念或企图、害怕、焦虑、兴奋增盛、沉思的或强迫性沉思、过度担心身体健康、恐慌发作以及恐惧症。`
56.如权利要求51所述的方法，其中所述神经障碍是帕金森氏症、阿尔兹海默症、亨廷顿氏症、肌萎缩侧索硬化症、弗里德赖希共济失调、路易氏体症、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆、精神分裂症、麻痹、多发性硬化症、脊髓损伤、脑损伤(例如，中风)、脑神经障碍、周边感觉神经病变、癫痫、朊病毒障碍、克雅氏病、阿尔珀斯病、小脑/脊髓小脑退化、巴滕病、皮质基底核退化、贝尔氏麻痹、格林-巴利综合征、皮克病和自闭症。
57.如权利要求51所述的方法，其中该神经干细胞衍生自滋养层组织。
58.如权利要求51所述的方法，其中该经免疫豁免的细胞具有低水平的CD33表达。
59.如权利要求51所述的方法，其中该经免疫豁免的细胞具有低水平的CD133表达。
60.如权利要求51所述的方法,其中该神经干细胞表达Cdx2、Nanog、巢蛋白、0ct_4、神经丝、NgN3、Neo-D, MAP-2、CD133、RAR^、RXRa、RXRβ、CRABP-2、CRBP-K RALDH-2 或RALDH-3中的一种或多种的转录物。
61.如权利要求51所述的方法，其中该方法进一步包括将所述一种或多种神经干细胞施用到哺乳动物的脑中，其中该细胞分化成神经元。
62.如权利要求51所述的方法，所述施用包括注射或植入。
63.如权利要求56所述的方法，其中所述神经元是多巴胺能神经元、谷氨酰胺能神经元、5-羟色胺能神经元或者GABA能(Y -氨基丁酸)神经元。
64.如权利要求56所述的方法，其中在所述施用之前，用诱导药物进行预诱导所述祖细胞。
65.如权利要求56所述的方法，其中该神经祖干细胞不会引起免疫反应。
66.如权利要求56所述的方法，其中该神经祖干细胞不会形成肿瘤。
67.一种诱导或促进干细胞分化成具有神经元特性的细胞的方法，其包括: a.使该干细胞与诱导药物接触； b.在该干细胞中用诱导药物来调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质包括:Wnt2B、Fzd6、Dvl3、FRATl、GSK3P、HDAC6、β _ 联蛋白、G a q/11、G β ,RXRa、RARP ,GLuRUPI3K、AKtl、AKt2、AKt3、mT0R、EIF4EBP、CREBl、TH(酪氨酸羟化酶)、ΡΙΧ_β、PIP2、CaMKI1、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、钙依赖磷酸酶、CRMP-2、NFATl、输入蛋白、LEFl、Pitx2、MEF2A 或 EP300 ；以及 c.诱导或促进该干细胞分化成具有神经元特性的细胞。
68.如权利要求67所述的方法，其中该干细胞是哺乳动物滋养层干细胞。
69.如权利要求67所述的方法，其中该干细胞是哺乳动物胚胎干细胞。
70.如权利要求67所述的方法，其中该干细胞是哺乳动物经诱导的多能干细胞。
71.如权利要求67所述的方法，其中该干细胞是内胚层、中胚层、外胚层或间质干细胞。
72.如权利要求67所述的方法，`其中该干细胞来自于小鼠、大鼠、人类、黑猩猩、大猩猩、犬、猪、山羊、海豚或牛。
73.如权利要求67所述的方法，其中该干细胞来自于人类。
74.如权利要求67所述的方法，其中该干细胞是人类滋养层干细胞。
75.如权利要求第67所述的方法，其中该具有神经元特性的细胞具有与下列细胞相似的表型:神经干细胞(NSC)、多巴胺生成细胞、多巴胺能神经元、单极神经元、双极神经元、多极神经元、谷氨酰胺能神经元、5-羟色胺能神经元、GABA能(Y-氨基丁酸)神经元、锥体细胞、浦肯野细胞以及前角细胞、篮状细胞、贝茨细胞、闰绍细胞、颗粒细胞、GRP细胞、NRP细胞、丽S细胞、AST细胞或TGC细胞或中等棘细胞。
76.如权利要求67至75所述的方法，其中所述诱导药物包括:视黄酸、烟酰胺或β-巯基乙醇、维生素Β12、肝素、腐胺、生物素或Fe2+、丁基羟基苯甲醚、丙戊酸、福司柯林、5-氮胞苷、吲哚美辛、异丁基甲基黄嘌呤或胰岛素。
77.如权利要求67至75所述的方法，其中所述调节包括:增加该一种或多种蛋白质中的至少一种的活性。
78.如权利要求67至75所述的方法，其中所述调节包括:增加该一种或多种蛋白质中的至少一种的表达。
79.如权利要求78所述的方法，其中增加表达包括:增加编码该一种或多种蛋白质中的至少一种的mRNA的量，或增加由mRNA翻译而来的该一种或多种蛋白质中的至少一种的量。
80.如权利要求67至75所述的方法，其中所述调节包括:降低该一种或多种蛋白质中的至少一种的活性。
81.如权利要求67至75所述的方法，其中所述调节包括:减少该一种或多种蛋白质中的至少一种的表达。
82.如权利要求81所述的方法，其中减少表达包括:减少编码该一种或多种蛋白质中的至少一种的mRNA的量，或减少由mRNA翻译而来的该一种或多种蛋白质中的至少一种的量。
83.如权利要求67至75所述的方法，其中所述神经元特性包括:多巴胺、谷氨酸NMDA受体的亚基、突触蛋白1、α -钙通道标记、GAP-43、电压依赖的K+通道、电压依赖的Ca+通道或电压依赖的Na+通道的表达。
84.如权利要求67至75所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质是Wnt2B。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述Wnt2B被活化。
86.如权利要求84所述的方法，其中所述Wnt2B被去活化。
87.如权利要求84所述的方法，其中所述Wnt2B被活化，并接着被去活化。
88.如权利要求84所述的方法，其中所述Wnt2B被去活化，并接着被活化。
89.如权利要求84所述的方法，其中所述Wnt2B促进该干细胞的分化或增殖。
90.如权利要求84所述的方法，其中所述Wnt2B促进或诱导多巴胺表达。
91.如权利要求67至75所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质是GSK33。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述GSK3β被活化。
93.如权利要求91所述的方法，其中所述GSK30被去活化。
94.如权利要求91所述的方法，其中所述GSK3β被活化，并接着被去活化。
95.如权利要求91所述的方法，其中所述GSK3β被去活化，并接着被活化。
96.如权利要求91所述的方法，其中所述GSK30促进该干细胞的分化或增殖。
97.如权利要求91所述的方法，其中所述GSK30调节微管装配。
98.如权利要求67至75所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质是CREBl。
99.如权利要求98所述的方法，其中所述CREBl被活化。
100.如权利要求98所述的方法，其中所述CREBl被去活化。
101.如权利要求98所述的方法，其中所述CREBl被活化，并接着被去活化。
102.如权利要求98所述的方法，其中所述CREBl被去活化，并接着被活化。
103.如权利要求98所述的方法，其中所述CREBl促进该干细胞的分化或增殖。
104.如权利要求98所述的方法，其中所述CREBl促进或诱导多巴胺表达。
105.如权利要求67至75所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质是CaMKII。
106.如权利要求105所述的方法，其中所述CaMKII被活化。
107.如权利要求105所述的方法，其中所述CaMKII被去活化。
108.如权利要求105所述的方法，其中所述CaMKII被活化，并接着被去活化。
109.如权利要求105所述的方法，其中所述CaMKII被去活化并接着被活化。
110.如权利要求105所述的方法，其中所述CaMKII促进该干细胞的分化或增殖。
111.如权利要求105所述的方法，其中该CaMKII调节微管装配。
112.如权利要求67至75所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质是MAPT。
113.如权利要求112所述的方法，其中所述MAPT被活化。
114.如权利要求112所述的方法，其中所述MAPT被去活化。
115.如权利要求112所述的方法，其中所述MAPT被活化并接着被去活化。
116.如权利要求112所述的方法，其中所述MAPT被去活化并接着被活化。
117.如权利要求112所述的方法，其中所述MAPT促进该干细胞的分化或增殖。
118.如权利要求112所述的方法，其中所述MAPT调节微管装配。
119.一种诱导或促进干细胞分化成具有降低的免疫原性的细胞的方法，其包括: a.使该干细胞与诱导药物接触； b.在该干细胞中用诱导药物来调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质包括:Wnt2B、Fzd6、Dvl3、FRATl、GSK3P、HDAC6、β -联蛋白、G a q/11、G β ,RXRa、RARP ,GLuRUPI3K、AKtl、AKt2、AKt3、mT0R、EIF4EBP、CREBl、TH(酪氨酸羟化酶)、ΡΙΧ_β、PIP2、CaMKI1、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、钙依赖磷酸酶、CRMP-2、NFATl、输入蛋白、LEFl、Pitx2、MEF2A 或 EP300 ；以及 c.诱导或促进该干细胞分化成具有降低的免疫原性的细胞。
120.如权利要求119所述的方法，其中该干细胞是哺乳动物滋养层干细胞。
121.如权利要求119所述的方法，其中该干细胞是哺乳动物胚胎干细胞。
122.如权利要求119所述的方法，其中该干细胞是哺乳动物经诱导的多能干细胞。
123.如权利要求119所述的方法，其中该干细胞是内胚层、中胚层、外胚层或间质干细胞。
124.如权利要求119所述的方法，其中该具有降低的免疫原性的细胞具有与下列细胞相似的表型:神经干细胞(NSC)、多`巴胺生成细胞、多巴胺能神经元、单极神经元、双极神经元、多极神经元、谷氨酰胺能神经元、5-羟色胺能神经元、GABA能(Y -氨基丁酸)神经元、锥体细胞、浦肯野细胞以及前角细胞、篮状细胞、贝茨细胞、闰绍细胞、颗粒细胞、GRP细胞、NRP细胞、丽S细胞、AST细胞或TGC细胞，或中等棘细胞。
125.如权利要求119所述的方法，其中该干细胞来自于小鼠、大鼠、人类、黑猩猩、大猩猩、犬、猪、山羊、海豚或牛。
126.如权利要求119所述的方法，其中该干细胞来自于人类。
127.如权利要求119所述的方法，其中该干细胞是人类滋养层干细胞。
128.如权利要求119至127所述的方法，其中该具有降低的免疫原性的细胞不会诱导免疫反应或可以抑制免疫反应。
129.如权利要求119至127所述的方法，其中该具有降低的免疫原性的细胞不会诱导免疫反应或可以抑制免疫反应。
130.如权利要求119至127所述的方法，其中该具有降低的免疫原性的细胞不会诱导免疫反应，或者可以通过T细胞、B细胞、巨噬细胞、小神经胶质细胞、肥大细胞或NK细胞来抑制免疫反应。
131.如权利要求119至127所述的方法，其中所述诱导药物包括:视黄酸、烟酰胺或β-巯基乙醇、维生素B12、肝素、腐胺、生物素或Fe2+、丁基羟基苯甲醚、丙戊酸、福司柯林、5-氮胞苷、吲哚美辛、异丁基甲基黄嘌呤或胰岛素。
132.如权利要求119至127所述的方法，其中所述调节包括:增加该一种或多种蛋白质中的至少一种的活性。
133.如权利要求119至127所述的方法，其中所述调节包括:增加该一种或多种蛋白质中的至少一种的表达。
134.如权利要求133所述的方法，其中增加表达包括:增加编码该一种或多种蛋白质中的至少一种的mRNA的量，或增加由mRNA翻译而来的该一种或多种蛋白质中的至少一种的量。
135.如权利要求119至127所述的方法，其中所述调节包括:降低该一种或多种蛋白质中的至少一种的活性。
136.如权利要求119至127所述的方法，其中所述调节包括:减少该一种或多种蛋白质中的至少一种的表达。
137.如权利要求136所述的方法，其中减少表达包括:减少编码该一种或多种蛋白质中的至少一种的mRNA的量，或减少由mRNA翻译而来的该一种或多种蛋白质中的至少一种的量。
138.如权利要求119至127所述的方法，其中该方法进一步包括:诱导或促进该干细胞分化成具有神经元特性的细胞，其中所述神经元特性包括:多巴胺、谷氨酸NMDA受体的亚基、突触蛋白1、α -钙离子通道标记、GAP-43、电压依赖的K+通道、电压依赖的Ca+通道或电压依赖的Na+通道的表达。
139.如权利要求119至127所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质是NFAT。
140.如权利要求139所述的方法，其中所述NFAT被活化。
141.如权利要求139所述的方法，其中所述NFAT被去活化。
142.如权利要求139所述的方法，其中所述NFAT被活化并接着被去活化。
143.如权利要求139所述的方法，其中所述NFAT被去活化并接着被活化。
144.如权利要求139所述的方法，其中所述NFAT促进该干细胞的分化或增殖。
145.如权利要求139所述的方法，其中所述NFAT调节微管装配。
146.一种诱导或促进人类滋养层干细胞分化成tNSC(滋养层神经干细胞)的方法，其包括: a.使该人类滋养层干细胞与诱导药物接触； b.在该干细胞中用诱导药物来调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质包括:Wnt2B、Fzd6、Dvl3、FRATl、GSK3P、HDAC6、β _ 联蛋白、G a q/11、G β ,RXRa、RARP ,GLuRUPI3K、AKtl、AKt2、AKt3、mTOR、EIF4EBP、CREBl、TH(酪氨酸羟化酶)、ΡΙΧ_β、PIP2、CaMKI1、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、钙依赖磷酸酶、CRMP-2、NFATl、输入蛋白、LEFl、Pitx2、MEF2A 或 EP300 ；以及 c.诱导或促进该人类滋养层干细胞分化成tNSC。
147.如权利要求146所述的方法，其中该诱导药物包括:视黄酸、烟酰胺或β-巯基乙醇、维生素Β12、肝素、腐胺、生物素或Fe2+、丁基羟基苯甲醚、丙戊酸、福司柯林、5-氮胞苷、吲哚美辛、异丁基甲基黄嘌呤或胰岛素。
148.如权利要求146所述的方法，其中该tNSC具有降低的免疫原性。
149.如权利要求146所述的方法，其中该tNSC不会诱导免疫反应，或可以抑制免疫细胞所引起的免疫反应。
150.如权利要求148所述的方法，其中该免疫细胞是T细胞、B细胞、巨噬细胞、小神经胶质细胞、肥大细胞或NK细胞。
151.一种诱导或促进人类滋养层干细胞分化成具有与神经干细胞(NSC)、多巴胺生成细胞、多巴胺能神经元、单极神经元、双极神经元、多极神经元、谷氨酰胺能神经元、5-羟色胺能神经元、GABA能(Y-氨基丁酸)神经元、锥体细胞、浦肯野细胞以及前角细胞、篮状细胞、贝茨细胞、闰绍细胞、颗粒细胞、GRP细胞、NRP细胞、MNS细胞、AST细胞或TGC细胞或中等棘细胞相似的表型的细胞的方法，其包括: a.使该人类滋养层干细胞与诱导药物接触； b.在该干细胞中用诱导药物来调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质包括:Wnt2B、Fzd6、Dvl3、FRAT l、GSK3P、HDAC6、β -联蛋白、G a q/11、G β ,RXRa、RARP ,GLuRUPI3K、AKtl、AKt2、AKt3、mT0R、EIF4EBP、CREBl、TH(酪氨酸羟化酶)、ΡΙΧ_β、PIP2、CaMKI1、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、钙依赖磷酸酶、CRMP-2、NFATl、输入蛋白、LEFl、Pitx2、MEF2A 或 EP300 ；以及 c.诱导或促进该人类滋养层干细胞分化成神经干细胞(NSC)、多巴胺生成细胞、多巴胺能神经元、单极神经元、双极神经元、多极神经元、锥体细胞、浦肯野细胞以及前角细胞、篮状细胞、贝茨细胞、闰绍细胞、颗粒细胞、GRP细胞、NRP细胞、MNS细胞、AST细胞或TGC细胞，或中等棘细胞。
152.—种通过使哺乳动物干细胞与LIF接触而维持其增殖能力的方法。
153.如权利要求152所述的方法，其中该LIF的浓度介于1-1000U/ML之间。
154.如权利要求152所述的方法，其中该LIF的浓度是大约125至大约250U/ML。
155.如权利要求152所述的方法，其中该LIF的浓度是大约125至大约500U/ML。
156.如权利要求152所述的方法，其中该LIF的浓度是大约125至大约1000U/ML。
157.如权利要求152至156所述的方法，其中该干细胞是滋养层、胚胎或经诱导的多能干细胞。
158.如权利要求152至156所述的方法，其中该干细胞是人类、小鼠、大鼠、人类、黑猩猩、大猩猩、犬、猪、山羊、海豚或牛干细胞。
159.如权利要求1或2所述的经分离的神经干细胞，其中所述经分离的神经干细胞表达高水平的HLA-ABC(MHC-1)。
160.如权利要求159所述的方法，其中所述水平高于人类胚胎干细胞所表达的水平。
161.如权利要求159所述的方法，其中所述水平与人类滋养层干细胞所表达的水平相似。
162.如权利要求1或2所述的经分离的神经干细胞，其中所述经分离的神经干细胞表达低水平的⑶33。
163.如权利要求162所述的方法，其中所述水平低于人类胚胎干细胞所表达的水平。
164.如权利要求162所述的方法，其中所述水平低于人类滋养层干细胞所表达的水平。
165.如权利要求1或2所述的经分离的神经干细胞，其中所述经分离的神经干细胞不表达⑶33。
166.如权利要求1或2所述的经分离的神经干细胞，其中所述分离的神经干细胞表达低水平的⑶133。
167.如权利要求164所述的方法，其中所述水平低于人类胚胎干细胞所表达的水平。
168.如权利要求164所述的方法，其中所述水平低于人类滋养层干细胞所表达的水平。
169.如权利要求1或2所述的经分离的神经干细胞，其中所述经分离的神经干细胞表达低水平的⑶34。
170.如权利要求1或2所述的经分离的神经干细胞，其中所述经分离的神经干细胞在施用至受体哺乳动物中之后不会形成畸胎瘤。
171.如权利要求1或2所述的经分离的神经干细胞，其中所述经分离的神经干细胞在施用至受体人类中之后不会形成畸胎瘤。
172.如权利要求51所述的方法，其中该经免疫豁免的细胞表达CD34。
173.—种抑制肿瘤细胞的方法，其包括: a.使该肿瘤细胞与化合物接触； b.调节该肿瘤细胞中的AhR;以及 c.通过该调节来抑制该肿瘤细胞。
174.—种减少肿瘤细胞生长的方法，其包括: a.使该肿瘤细胞与治疗剂接触； b.调节该肿瘤细胞中的AhR;以及 c.通过该调节来减少在该肿瘤细胞中的生长。
175.如权利要求173或174所述的方法，其中调节AhR包括:抑制所述细胞中的AhR蛋白质活性。
176.如权利要求173或174所述的方法，其中调节AhR包括:抑制所述细胞中的AhR基因表达。
177.如权利要求173或174所述的方法，其中该肿瘤细胞被杀死。
178.如权利要求173或174所述的方法，其中该肿瘤是肺、乳腺、结肠、脑、骨、肝、前列腺、胃、食道、皮肤或白血病肿瘤。
179.如权利要求173或174所述的方法，其中该肿瘤是实体或液态肿瘤。
180.如权利要求173或174所述的方法，其中AhR用AhR促效剂进行调节。
181.如权利要求173或174所述的方法，其中AhR用AhR拮抗剂进行调节。
182.如权利要求173或174所述的方法，其中AhR用具有抗雌激素活性的化合物进行调节。
183.如权利要求173或174所述的方法，其中AhR用具有抗雄激素活性的化合物进行调节。
184.如权利要求173或174所述的方法，其中该肿瘤细胞存在于哺乳动物中。
185.如权利要求173或174所述的方法，其中该肿瘤细胞存在于人类中。
【文档编号】A61K35/12GK103561751SQ201180065283
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2011年11月15日 优先权日:2010年11月15日
【发明者】李昭男, 李东颖, 李育达, 蔡英美 申请人:李昭男, 李东颖, 李育达, 蔡英美