用于治疗血液恶性肿瘤的组合物和方法

专利名称：用于治疗血液恶性肿瘤的组合物和方法
用于治疗血液恶性肿瘤的组合物和方法发明领域
本发明涉及用于治疗血液恶性肿瘤的组合物和方法，并且具体地但非排他性地，涉及融合蛋白及其组合物和使用方法。
发明背景
免疫系统存在两个主要的分支，它们由称为B淋巴细胞和T淋巴细胞(B细胞和T细胞)的不同类型的细胞支持。当B细胞遇见抗原时，它们产生抗体，并且在大多数情况下，这些抗体是保护性的。然而，在自身免疫性疾病中，这些抗体中的一些与个体的组织进行反应。当它们在组织中沉积时，它们引起炎症反应和组织损伤。类似于B细胞，T细胞在遇见抗原时也被活化。随 着T细胞发展，它们经历一个称为“胸腺教育”的过程。在胸腺驯育过程中，多于95%的T细胞死亡。已经具有可以识别并且与个体本身的组织(自体抗原)进行反应的T细胞受体的T细胞被确切地消除。然而，一些自身反应性T细胞逃脱了该消除过程，并且可以启动导致自身免疫性疾病的免疫应答。
T细胞活性的调节仍然是在具有免疫病理学T细胞的疾病中的一个重要的治疗目标。T细胞受体(TCR)刺激之后的T淋巴细胞的命运由共刺激性和抑制性受体输入的整合来引导。抗原递呈细胞(APC)上的共刺激性配体触发了 T细胞上的同源受体分子，结果增强了 T细胞增殖、细胞因子分泌以及分化。相比之下，抑制性配体分子至T淋巴细胞上的同源反受体的结合通过诱导T细胞无应答性或程序性细胞死亡(PCD)(又叫做凋亡)而减少了效应子功能。在共刺激因子阻断的存在下展示出增加的抑制剂活性的实验提示了共刺激性和抑制性受体通路相互作用。
细胞毒性T淋巴细胞相关性蛋白4 (CTLA-4 (⑶152))是在活化的T淋巴细胞的表面上表达的一种抑制性受体分子。在与驻留在APC上的B7-1 (⑶80)和/或B7-2 (⑶86)配体接合之后，CTLA-4反受体经由缔合的SHP-2磷酸酶而抑制T细胞活化。在活化的T细胞上，CTLA-4作为二硫键连接的同型二聚体糖蛋白复合物存在。一种重组的、可溶的CTLA-4:免疫球蛋白G (CTLA-4:1g)嵌合蛋白通过竞争性地阻断⑶80/⑶86分子结合至T细胞表面上的活化CD28受体而展示出抑制功能。CTLA-4:1g还在具有移植排斥和自身免疫性疾病的动物模型中，通过阻断经由CD28的T细胞共刺激而展现出免疫抑制活性。此外，使用CTLA-4:1g的APC处理拮抗了经由⑶28的细胞内T细胞存活信号传导，这可以增加对Fas依赖性PCD的易感性。在美国专利号5，885，776 ;5，885，579 ;5，851，795 ；以及5，968，510中讨论了 CTLA-4以及CTLA-4:1g融合蛋白的作用。
凋亡(或P⑶)是细胞死亡的一种独特形式，它对细胞内稳态的调控是至关重要的。在免疫系统中，Fas (⑶95)受体及其配体FasL (⑶95L)，参与了涉及诱导凋亡(包括免疫细胞介导的细胞毒性)、以及调控细胞免疫应答的多个过程。FasL是肿瘤坏死因子超家族中的一个成员，并且是由免疫细胞的一个受限子集来表达，该子集包括单核细胞、NK细胞、以及活化的B和T细胞。在细胞表面上，FasL被定向作为三聚体复合物内的II型膜蛋白。膜相关性FasL的金属蛋白酶的切割使可溶的FasL (sFasL)三聚体从该膜中释放。该FasL分子触发Fas依赖性P⑶。
分子或分子复合物的化合价可以通过与细胞表面缔合来增加。重组sFasL分子的不同编码序列影响大分子聚集，并且进而又影响sFasL促凋亡功能。具体地说，一种天然加工的sFasL分子形成了三聚体，并且不佳地诱导凋亡。相比之下，一种重组的全长细胞外结构域sFasL多肽形成了更高级的聚集体，并且显示出高效的凋亡活性。另外，由人293细胞中的重组表达所产生的sFasL的复合物需要交联以用于Fas敏感性细胞的溶解。
美国专利号5，830，469披露了单克隆抗体和特异性结合人Fas抗原的结合蛋白；这些抗原和抗体中的一些被报道为刺激T细胞增殖、抑制抗FasCH-1I单克隆抗体介导的细胞溶解、以及阻断Fas配体介导的细胞溶解。还披露了 Fas-Fc融合蛋白。
美国专利号5，242，687 ;5，601，828 ；以及5，623，056披露了含有一个CD8组分的各种融合蛋白，这些融合蛋白结合至一种细胞但是不掩蔽由该细胞产生的信号。
美国专利号5，359，046披露了多种嵌合蛋白，这些嵌合蛋白包含一个能够以非MHC限制性方式结合至配体的细胞外结构域、一个跨膜结构域以及一个能够活化信号传导通路的细胞质结构域。类似的技术披露在美国专利号5，686，281中。
发明概述
背景技术没有传授或建议通过给予对阻断和信号传导均有用的嵌合蛋白来治疗淋巴瘤和多发性骨髓瘤的方法。
本发明在至少一些实施例中通过提供以下方法克服了背景技术的这些缺点，即:通过给予对阻断和信号传导均有用的嵌合蛋白来治疗淋巴瘤和/或多发性骨髓瘤的方法。
在至少一些实施例中，提供的是含有这类嵌合蛋白、被适配成用于治疗淋巴瘤和/或多发性骨髓瘤的药用组合物。
“淋巴瘤”意思是淋巴系统中B或T细胞的恶性生长，任选地包括霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
根据至少一些实施例，该非霍奇金淋巴瘤选自下组，该组由以下各项组成:侵袭性NHL、转化型NHL、惰性NHL、复发性NHL、难治性NHL、低级非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、NK细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、急性成淋巴细胞性淋巴瘤、以及皮肤T细胞癌，包括蕈样真菌病/Sezry综合征。
“惰性”非霍奇金 淋巴瘤是包括淋巴瘤的缓慢生长形式的一个分类。它们包括工作分类(Working Formulation)中的所谓的低级和一些类别的中级NHL。惰性NHL有时不应答于常规的癌症疗法，如化学疗法和放射疗法。惰性NHL和其他恶化前形式的NHL也可以发展成NHL。对于该疾病的恶化前或良性形式，可任选地可以应用这些组合物及其方法用于预防(除治疗之外或代替治疗)，例如可任选地以停止该疾病进展成恶性形式的NHL。
“转化型”非霍奇金淋巴瘤是有时用来描述获得侵袭性的方面并且变得对标准化学疗法更具应答性的惰性NHL的一个分类。
“多发性骨髓瘤”是指特征在于终末分化的B细胞(浆细胞)在骨髓中累积的任何类型的B细胞恶性肿瘤。
根据至少一些实施例，多发性骨髓瘤选自下组，该组由以下各项组成:产生K型轻链和/或λ型轻链的多发性骨髓瘤癌症；和/或侵袭性多发性骨髓瘤，包括原发性浆细胞白血病(PCL);和/或可任选地包括良性浆细胞病症，如MGUS (意义不明的单克隆丙种球蛋白病)和/或可发展成多发性骨髓瘤的瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WaldenstrGm’smacroglobulinemia)(丽，又称为淋巴浆细胞性淋巴瘤);和/或焖燃型多发性骨髓瘤(SMM)、和/或惰性多发性骨髓瘤、也可发展成多发性骨髓瘤的多发性骨髓瘤的恶化前形式；和/或原发性淀粉样变性。对于该疾病的恶化前或良性形式，可任选地可以应用这些组合物及其方法用于预防(除治疗之外或代替治疗)，例如可任选地以停止该疾病进展成恶性形式的多发性骨髓瘤。
根据本发明的至少一些实施例，提供的是一种治疗选自下组的白血病的方法，该组由以下各项组成:急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、成人T细胞白血病、非白血性白血病、白血性白血病(leukocythemic leukemia)、嗜碱细胞性白血病、母细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚细胞性白血病(embryonal Ieukemia)、嗜酸细胞性白血病、格罗斯白血病(Gross’ leukemia)、毛细胞白血病、成血细胞性白血病(hemoblasticleukemia)、血胚细胞性白血病(hemocytoblastic leukemia)、组织细胞性白血病、干细胞白血病(stem cell leukemia)、急性单核细胞白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴原性白血病(lymphogenous leukemia)、淋巴样白血病(lymphoid leukemia)、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞性白血病、小原粒型白血病(micromyeloblastic leukemia)、单核细胞性白血病、成髓细胞性白血病、髓细胞性白血病、髓样粒细胞性白血病、髓单核细胞白血病、内格利型白血病(Naegeli leukemia)、浆细胞白血病、浆细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、里德尔氏细胞性白血病(Rieder cell leukemia)、希林氏白血病(Schilling，s leukemia)、干细胞白血病、亚白血性白血病、以及未分化细胞白血病。
在至少一些实施例中，提供的是含有这类嵌合蛋白、被适配成用于治疗选自上组的白血病的药用组合物。
根据本发明的至少一些实施例，该嵌合蛋白选自下组，该组由CTLA4_FasL和CD40-FasL蛋白组成。
2009年8月4日授权于Tykocinski等人的美国专利号7，569，663 (其犹如在此完全陈述而通过引用结合在此)描述了同时充当阻断蛋白和信号传导蛋白的嵌合蛋白。这类嵌合蛋白包括CTLA4-FasL和⑶40-FasL蛋白。在此专利中还提供了这样的数据:它证实了 CTLA-4-FasL嵌合蛋白抑制人外周血T细胞针对促有丝分裂抗CD3抗体的多克隆增殖的功效。还描述了使用和生产的方法。
如在此所使用，术语“治疗”是指提供来减轻疾病的护理，并且是指治疗性治疗或预防性(prophylactic/preventative)措施,其中目的是预防或减缓(减少)目标病理病状或病症。需要治疗的那些包括已经具有该病症的那些，以及倾向于具有该病症的那些或其中该病症有待被预防的那些。如在此所使用的术语治疗还指代“维持疗法”，该维持疗法是一种提供来阻止病理病状或病症在初始疗法后已经消失之后复发的治疗。
术语“治疗有效量”是指根据本发明的试剂的有效治疗哺乳动物的疾病或病症的量。
根据嵌合蛋白 和/或其药用组合物(单独或结合其他治疗学或药品(用于组合疗法))的任何以上所述的实施例，根据本发明的至少一些实施例提供了用于治疗如在此所述的血液恶性肿瘤的组合物及其治疗方法。这样的一种或多种另外的治疗学或药品可以容易地由本领域的普通技术人员来选择。
如在此所使用的术语“组合疗法”是指同时或连续给予两种或更多种药物或疗法类型来治疗一种单一的疾病，优选地具有一种协同效应。具体地说，该术语是指根据本发明的至少一些实施例的任何嵌合蛋白或药用组合物与至少一种另外的药物或疗法的组合使用。因此，使用根据本发明的至少一些实施例的试剂进行的疾病治疗可以与本领域熟知的多种疗法相结合，这些疗法包括但不限于放射疗法、抗体疗法、化学疗法或手术，或处于与其他生物剂、常规药品、抗癌剂、免疫抑制剂、用于癌症的细胞毒性药品、化疗剂的组合疗法中。
根据至少一些实施例，使用根据本发明的至少一些实施例的试剂进行的多发性骨髓瘤的治疗可以结合这样的试剂，包括但不限于:美法仑(Melphalan)、沙利度胺(MPT)、或组合硼替佐米(Bortezomib)(万河(Velcade))、美法仑(melphalan)、泼尼松(VMP)、或来那度胺(Lenalidomide)加低剂量地塞米松的组合；和/或生物磷酸盐类；化学疗法(例如，烧化剂、长春新碱、阿霉素)；自体干细胞移植；以及皮质激素类(例如泼尼松和地塞米松)。
根据至少一些实施例，使用根据本发明的至少一些实施例的试剂进行的白血病的治疗可以结合这样的试剂，包括但不限于:α-干扰素；白细胞介素-2 ;阿糖胞苷和米托蒽醌；阿糖胞苷和柔红霉素和6-硫鸟嘌呤；环磷酰胺和2-氯-2’-脱氧腺苷；VP-16和阿糖胞苷和埃得霉素或米托蒽醌；氟达拉滨和阿糖胞苷和Y-CSF ;苯丁酸氮芥；环磷酰胺和长春新碱和(泼尼松龙或泼尼松)和可任选的阿霉素；酪氨酸激酶抑制剂；以及抗体；谷氨酰胺；氯贝酸；全反式维甲酸；人参二炔类似物；KRN8602(蒽环霉素药品);替莫唑胺和聚(ADP-核糖)聚合酶抑制剂；利索茶碱(Iysofylline);阿糖胞苷；chlythorax和富集中链甘油三酯的要素经肠饮食(elemental enteral diet);氨磷汀；以及gilvusmycin。
根据至少一些实施例，使用根据本发明的至少一些实施例的试剂进行的淋巴瘤的治疗可以结合这样的试剂，包括但并不限于:长春花生物碱，如长春新碱、长春碱、长春地辛、或长春瑞宾；蒽环霉素， 如阿霉素；组合，如CHOP (长春新碱、环磷酰胺、阿霉素以及泼尼松)；以及其他合适的生物碱类，包括但不限于鬼白树脂类、鬼白毒素类、及其衍生物(例如，依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷等)、喜树碱类(例如，伊立替康、托泊替康等)、紫杉烷类(紫杉酚等)、及其衍生物。
如在此所使用，术语“协同效应”或“协同作用”是指使用多种治疗剂、包括至少一种根据本发明的任何实施例的治疗剂的组合所见到的更大的作用，其中该治疗作用大于这多种试剂在单独给予时的相加作用。“更大的治疗作用”是指更大的癌症作用和/或一种或多种副作用的减少。
如在此所使用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有的脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
附图简要说明


图1.T和B恶性细胞系上的融合蛋白反受体的表达。将表达⑶40L的(J-⑶40L+)和不表达⑶40L的(J⑶40L-)恶性T细胞系、以及Raji和Daudi恶性B细胞系，使用结合FITC的抗⑶95、抗⑶80、抗⑶86或抗⑶40L单克隆抗体(黑色)、或使用同种型对照抗体(白色)进行免疫染色，并且然后通过流式细胞术进行分析，如在方法中所述。
图2.J-CD40L+ 和 J-CD40L-细胞对 CTLA-4.FasL 和 CD40.FasL 的易感性取决于相关反受体的表达。A.将表达⑶40L的(J-⑶40L+)和不表达⑶40L的(J-⑶40L-)恶性T细胞(上两排)、以及Raji和Daudi恶性B细胞(下两排)，在存在或不存在CTLA-4.FasL,CD40.FasL、或 sFas (各 30ng/ml)、或 CTLA-4.Ig 或 OMO-Fc (各 100ng/ml )、或指定的组合的情况下，铺(0.5x105个)在圆底96孔板中。细胞用[3H]胸苷脉冲处理并孵育18h。测定重复进行三次。数据呈现为生长培养基中孵育的细胞的[3H]胸苷掺入的百分比。显示的结果对于每种细胞系总结了 3个独立的实验。*P〈0.05相对对照物，**P〈0.0l相对对照物。B.将0.5x105个Raji细胞使用(黑条)或不使用(白条)CTLA-4.FasL (30ng/ml),在抗CD80或抗CD86抗体(B7阻断剂)或它们的组合的存在下孵育18小时。增殖如在A中测定并呈现。这些结果总结了三个独立的实验。p〈0.05，**p〈0.01相对培养基。
图3.J-CD40L+ 和 J-CD40L-细胞对由 CTLA-4.FasL 和 CD40.FasL 引起的凋亡诱导的易感性取决于它们的相关反受体的表达。将J-CD40L+、CD40L (J-CD40L-)、Raji以及Daudi 细胞，在存在或不存在CTLA-4.FasUOMO *FasL、或 sFas(各 30ng/ml)、或CTLA-4 *Ig或CD40-Fc (各100ng/ml)、或指定的组合的情况下，孵育4h (T细胞)或16h (B细胞)。收获26个细胞、用膜联蛋白V和PI共染色、并且通过流式细胞术进行分析。A.在存在或不存在CTLA-4.FasL或⑶40.FasL的情况下的这些细胞系的代表性点阵图分析。B-C.从Jurkat恶性T细胞系(B)、Raji和Daudi恶性B细胞系(C)的FACS分析中获得的死亡细胞(膜联蛋白V+/P1-+膜联蛋白V+/PI+)的百分比。显示了三个独立实验的总结。数据呈现为均值土 SD。**ρ〈0.01相对培养基。
图4.CTLA-4.FasL和CD40.FasL各自影响凋亡和抗凋亡信号通路元素。将J-CD40L+、J-CD40L-、Raji 以及 Daudi 细胞，在存在或不存在 CTLA4.FasL、CD40.FasL、sFas、CTLA-4 UgXD^-Fc或如指示的它们的组合的情况下，孵育90分钟。收集细胞，将全细胞溶解产物用10%SDS-PAGE分离，并且用指定的抗体进行免疫印迹。A.Jurkat恶性T细胞系以及Raji和Daudi恶性B细胞系的代表性免疫印迹。显示的数据是对于每种细胞系的至少三个独立实验的代表性实验。B-C.使用针对Raji (B)和Jurkat (C)细胞系的指定抗体的三个独立实验的总结 。显示了半胱天冬酶3、9以及8的活性形式。数据相对GAPDH进行标准化。在培养基(对照物) 中孵育的细胞中的蛋白质的表达被视为100%。数据呈现为均值土SD。*p〈0.05相对培养基，**p〈0.01相对培养基。
图5.CTLA4.FasL在JY恶性B细胞中增加凋亡信号并且减少抗凋亡蛋白cFLIP。将JY细胞在存在或不存在CTLA-4.FasL、⑶40.FasL或抗Fas抗体(CHlI)的情况下孵育90分钟。收集细胞，将全细胞溶解产物用10%SDS-PAGE分离，并且用指定的抗体进行免疫印迹。A.对于每种细胞系的三个独立实验的代表性免疫印迹。B.具有cFLIPs和抗半胱天冬酶8抗体的JY恶性B细胞系的三个独立实验的总结。C.具有抗半胱天冬酶9和3抗体的JY恶性B细胞系的三个独立实验的总结。在培养基(对照物)中孵育的细胞中的蛋白质的表达被视为100%。数据呈现为均值土SD。*p〈0.05相对培养基，林p〈0.01相对培养基。
图6.CTLA-4.Ig减少了表达B7的细胞的增殖并且影响它们半胱天冬酶和cFLIP的表达。A.将Raji恶性B细胞在CTLA-4 -FasL存在或不存在下，在用CTLA-4.Ig预孵育过夜的平底96孔板上进行孵育。测定重复进行三次。细胞用[3H]胸苷脉冲处理、孵育24小时、并且然后评估[3H]胸苷的掺入。将培养基(对照物)中的细胞的[3H]胸苷掺入指定为100%，并且其余的呈现为对照物的％—均值土SD。*P〈0.05相对对照物，**P〈0.01相对对照物。显示的数据是三个独立实验的总结。B-C.将Raji细胞在预涂有CTLA-4.Ig的24孔板上孵育90分钟。收集细胞，将全细胞溶解产物用10%SDS-PAGE分离，并且用指定的抗体进行免疫印迹。B.使用指定抗体的代表性免疫印迹。C.三个独立实验的总结。显示了半胱天冬酶3、9以及8的活性形式。数据相对GAPDH进行标准化。在培养基(对照物)中孵育的细胞中的蛋白质的表达被视为100%。数据呈现为均值土SD。*p〈0.05相对培养基。
图7和8示出，CTLA4_FasL以剂量依赖性方式诱导Raji和JY (B细胞淋巴癌细胞系)的死亡。
图9 示出了 CTLA4_FasL 对 RPMI8226 的作用。
图10示出了 CTLA4_FasL对早幼粒细胞性白血病细胞的作用。
图11-14涉及在不同细胞系中结合CTAL4的⑶80和⑶86的表面表达、以及⑶95(Fas受体，它结合FasL)的表达。
图15示出，CTLA4-FasL展现出针对SK-H印I肝癌细胞的细胞毒性作用。
图16示出，泛半胱天冬酶抑制剂zVAD完全废除了 CTLA4_FasL效应。
示例性实施方案的说明
根据本发明的至少一些实施例，提供了通过给予对阻断和信号传导均有用的嵌合蛋白来治疗淋巴瘤和/或多发性骨髓瘤的方法。
根据至少一些实施例，该嵌合蛋白被提供于包含该蛋白以及药学上合适的载体的药用组合物中。
根据本发明的至少一些实施例的药用组合物可以经由一种或多种给药途经、使用本领域已知的一种或多种不同的方法来给予。如将为熟练的业内人士所理解，给药途经和/或方式将随所希望的结果而改变。用于本发明的治疗剂的优选给药途经包括血管内递送(例如，注射或输注)、静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、经脊柱、口服、肠内、经直肠、经肺(例如，吸入)、经鼻、局部(包括，透皮、经颊和舌下)、膀胱内、玻璃体内、腹膜内、经阴道、脑递送(例如脑室内、脑内、以及对流增强扩散)、CNS递送(例如,鞘内、脊柱周(perispinal)、以及脊柱内)或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内以及皮内)、透粘膜(例如，舌下给药)、给予或经由植入物的给予、或其他肠胃外给药途径，例如通过注射或输注、或本领域已知的其他递送途经和/或给药形式。如在此所使用的短语“肠胃外给药”是指非肠内和局部给予的、通常是通过注射的给予方式，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外以及胸骨内注射和输注。
如在此所使用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何以及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、以及类似物。优选地，该载体适合用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、经脊柱或表皮给药(例如，通过注射或输注)。根据给药途经，嵌合蛋白可被包覆在一种材料中以保护该蛋白免受酸和其他可以使该蛋白灭活的天然条件的作用。
根据本发明的至少一些实施例的药用组合物还可以包括一种药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括:(I)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。可以在根据本发明的至少一些实施例的药用组合物中采用的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇类(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)、以及可注射的有机酯类,如油酸乙酯。适当的流动性可以通过以下方式来维持,例如,通过使用包衣材料(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所要求的粒径、以及通过使用表面活性剂。
这些组合物还可以含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂以及分散剂。预防微生物存在可以通过在前的灭菌程序、以及通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等来确保。还可能希望的是将等渗剂，如糖类、氯化钠等包括至这些组合物中。此外，可以通过包含延迟吸收的试剂，如单硬脂酸铝和明胶来引起可注射药物形式的延长吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。这类介质和试剂用于药学上活性物质的用途在本领域中是已知的。只要任何常规介质或试剂与活性化合物相容，就考虑其在根据本发明的至少一些实施例的药用组合物中的使用。补充性的活性化合物也可以被并入这些组合物中。
治疗组合物典型地在制造和储存条件下必须是无菌且稳定的。该组合物可被配制为溶液、微乳液、脂质体、或适合于高药品浓度的其他有序结构。载体可以是含有，例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、以及液体聚乙二醇等)、及其合适的混合物的一种溶剂或分散介质。适当的流动性可以通过以下方式来维持，例如，通过使用一种包衣(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所要求的粒径、以及通过使用表面活性剂。在许多情况下，将优选的是在该组合物中包括等渗剂，例如，糖类、多元醇类如甘露糖醇、山梨糖醇、或氯化钠。可以通过在该组合物中包括一种延迟吸收 的试剂(例如，单硬脂酸盐类和明胶)来引起这些可注射组合物的延长吸收。无菌可注射溶液可以根据需要通过在具有以上所列举的成分中的之一或组合的适当溶剂中以所要求的量并入该活性化合物，随后进行灭菌微孔过滤来制备。通常，分散液是通过将该活性化合物并入含有基础分散介质以及来自以上所列举的那些的所要求的其他成分的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，这些干燥产生了活性成分加来自其先前经无菌过滤的溶液的任何另外的所希望成分的粉末。
无菌可注射溶液可以根据需要通过在具有以上所列举的成分中的之一或组合的适当溶剂中以所要求的量并入该活性化合物，随后进行灭菌微孔过滤来制备。通常，分散液是通过将该活性化合物并入含有基础分散介质以及来自以上所列举的那些的所要求的其他成分的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，这些干燥产生了活性成分加来自其先前经无菌过滤的溶液的任何另外的所希望成分的粉末。
可以与载体材料相组合产生一种单一剂型的活性成分的量将根据正被治疗的受试者、以及具体的给药方式而改变。可以与载体材料相组合产生一种单一剂型的活性成分的量将通常是产生治疗作用的组合物的那个量。通常，基于100%，与药学上可接受的载体相组合，此量的范围将为从约0.01%至约99%的活性成分、可任选地从约0.1%至约70%、可任选地从约1%至约30%的活性成分。
调整给药方案以提供最佳的希望应答(例如，治疗应答)。例如，可以给予快速灌注齐U、可以随着时间的推移给予多个分次剂量、或可以如治疗情况的紧急状态所指示而按比例减少或增加该剂量。为了便于给药和剂量一致性，尤其有利的是配制处于剂量单位形式的肠胃外组合物。如在此使用的剂量单位形式是指适合作为用于待被治疗的受试者的单元剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算与所要求的药物载体联合产生所希望的治疗作用的预定量的活性化合物。根据本发明的至少一些实施例的剂量单位形式的规格受以下两项支配并且直接取决于这两项:(a)该活性化合物的独特特征和有待获得的具体治疗作用、以及(b)在复配这种活性化合物以用于治疗个体敏感性的领域中所固有的限制。
对于嵌合蛋白的给予，剂量范围为从约0.0001至100mg/kg宿主体重、并且更通常是0.01至5mg/kg宿主体重。例如，齐Li量可以是0.3mg/kg体重、lmg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在l-10mg/kg范围内。一个示例性的治疗方案要求每周给予一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每三至6个月一次。
可替代地，该嵌合蛋白可以作为缓释配制品给予，在此情况下要求不太频繁的给予。剂量和频率根据患者体内的嵌合蛋白的半衰期而改变。给予剂量和频率可以根据治疗是预防性的或治疗性的而改变。在预防性应用中，在长时间段内在相对不频繁的间隔下给予相对低的剂量。一些患者在他们的余生中继续接受治疗。在治疗性应用中，有时要求在相对短的间隔下的相对高的剂量，直到疾病的进展被降低或终止为止、并且优选直到患者显示出疾病症状的部分或完全改善为止。此后，可以给予患者预防性方案。
根据本发明的至少一些实施例的药用组合物中的活性成分的实际剂量水平可以改变，以便获得针对具体患者、组合物、以及给药方式而有效达到所希望的治疗应答，而不对该患者产生毒性的活性成分的量。选择的剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括:所采用的根据本发明的至少一些实施例的具体组合物、或其酯、盐或酰胺的活性，给药途径，给药时间，所采用的具体化合物的排泄率，治疗的持续时间，与所采用的具体组合物组合使用的其他药品、化合物和/或材料，正`被治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和先前病史，以及在医学领域中熟知的类似因素。
根据本发明的至少一些实施例的嵌合蛋白的“治疗有效剂量”优选地导致疾病症状的严重度的降低、无疾病症状的时期的频率和持续时间的增加、寿命增加、疾病缓解、或由疾病痛苦引起的损伤或失能的预防。例如，对于多发性骨髓瘤、淋巴瘤和/或白血病的治疗，相对于未治疗的受试者而言，“治疗有效剂量”可任选地将细胞生长或肿瘤生长抑制了至少约20%、40%、60%、80%。一种化合物的抑制肿瘤生长的能力可以在一种预测在人肿瘤中的功效的动物模型系统中进行评估。可替代地，可以通过经由熟练的从业者已知的测定来检测化合物抑制能力、如体外抑制的能力来评估组合物的此特性。可替代地或另外地，合适的量或剂量还可以任选地至少部分地根据一种或多种另外的多发性骨髓瘤治疗的给予来选择，这些治疗的给予可以任选地并且优选地具有一种协同效应并且因此可任选地使该给药量得以调整。这样的一种或多种另外的治疗可以容易地由本领域的普通技术人员来选择。
可替代地或另外地，“治疗有效剂量”优选引起至少稳定的疾病、优选部分应答、更优选完全应答，如由WHO或RECIST标准对于肿瘤应答所评定(《国家癌症研究所》(NatlCancer Inst) 1999;91:523-8 以及《癌症》(Cancer) 1981;47:207-14)。
治疗有效量的治疗化合物可以减小肿瘤大小、或以其他方式改善受试者的症状、或以其他方式支持部分或完全稳定的疾病和/或部分或完全的应答，如上文所确定。本领域的普通技术人员将能够根据这类因素，如受试者的体型、受试者症状的严重度、以及所选择的具体组合物或给药途经来确定这些量。
治疗组合物可以用本领域已知的医疗装置进行给予。例如，在一个优选实施例中，根据本发明的至少一些实施例的治疗组合物可以使用无针皮下注射装置，如披露在美国专利号 5，399，163 ;5，383，851 ;5，312，335 ;5，064，413 ;4，941，880 ;4，790，824 ；或4，596，556中的装置进行给予。在本发明中有用的众所周知的植入物和模块的实例包括:美国专利号4，487，603，该专利披露了一种用于以受控速率分配药物的可植入微型输注泵；美国专利号4，486，194，该专利披露了一种用于通过皮肤给予药剂的治疗装置；美国专利号4，447，233，该专利披露了一种用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4，447，224，该专利披露了一种用于连续药品递送的可变流量可植入输注设备；美国专利号4，439，196，该专利披露了一种具有多腔室的渗透性药品递送系统；以及美国专利号4，475，196，该专利披露了一种渗透性药品递送系统。这些专利通过引用结合在此。许多其他的这类植入物、递送系统、以及模块是本领域的普通技术人员所已知的。
在某些实施例中，根据本发明的至少一些实施例的嵌合蛋白可以被配制来确保在体内的适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排斥许多高度亲水性化合物。为了确保根据本发明的至少一些实施例的治疗化合物穿过BBB (如果需要的话)，可以将它们配制在例如脂质体中。对于 制造脂质体的方法，参见，例如美国专利号4，522，811 ;5，374，548 ;以及5，399，331。这些脂质体可以包含一个或多个部分，这些部分选择性地被输送到特定的细胞或器官中，从而增强靶向药品递送(参见，例如拉纳德(V.V.Ranade) (1989)《临床药理学杂志》(J.Clin.Pharmacol).29:685)。示例性祀向部分包括叶酸或生物素(参见,例如娄(Low)等人的美国专利号5，416，016);甘露糖苷(梅泽(Umezawa)等人，(1988)《生物化学与生物物理研究通讯》(Biochem.Biophys.Res.Commun.) 153:1038);抗体(布罗曼(P.G.Bloeman)等人(1995) ((FEBS 快报》(FEBS Lett.) 357:140 ;乌韦斯(M.0wais)等人(1995)《抗微生物剂化学疗法》(Antimicrob.Agents Chemother.)39:180);表面活性蛋白A受体(布里斯科(Briscoe)等人(1995)《美国生理学杂志》(Am.J Physiol.) 1233:134)；pl20 (施雷尔(Schreier)等人(1994)《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.> 269:9090);还参见凯纳宁、劳卡宁(K.Keinanen;M.L.Laukkanen) (1994)《FEBS 快报》346:123 ;基利昂、菲德勒(J.J.Killion; 1.J.Fidler) (1994)《免疫方法》(Immunomethods) 4:273。
以下实例仅仅出于说明的目的而提供，并且不意在以任何方式限制本发明的范围。
在本说明书中引用的所有专利和文献参考通过弓I用以其全部内容结合在此。
实例1-嵌合蛋白用于治疗血液恶性肿瘤的功效
材料和方法
细胞、抗体(Ab)、试剂以及融合蛋白
Daudi,Raji和JY以及293人肾细胞系最初是从美国典型培养物保藏中心(ATCC)(美国马里兰州贝塞斯达)获得。两个Jurkat亚系(J-CD40L+和J-CD40L-)由约翰法延(JohnFayen)博士(美国俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学(CWRU，Cleveland, OH, USA))惠赠。每周对所有的细胞系进行随访，以验证它们保留了其原有的外观和生长速率，并保持无污染。
而且，反复测试细胞以验证预期的表面分子的持续表达。如果疑似出现任何变化，则解冻新的批次。使用商用PCR试剂盒(以色列生物产业公司(BiologicalIndustries, Israel))测试培养基的支原体污染。
对⑶40L、⑶80、⑶86以及⑶95特异的FITC结合荧光抗体，连同它们的相匹配的FITC结合IgG同种型，从PharMingen公司(美国加利福尼亚州圣地亚哥购买。重组人CTLA-4.Ig (CTLA-4/Fc)和sFasL分别从安迪生物公司(R & D Systems)(美国明尼苏达州)和Alexis生化公司(AlexisBiochemicals)(加利福尼亚州圣地亚哥)购买。OMO-Fc融合蛋白从Calbiochem公司(德国达姆斯塔特(Darmstadt, Germany))购买。抗人B7-1&B7-2(⑶80和86)抗体从安迪生物公司购买。对于蛋白质印迹分析，抗-β肌动蛋白抗体和抗鼠GAPDH抗体分别从西格玛奥瑞奇公司(Sigma-Aldrich)和Chemicon国际公司(ChemiconInternational)购买。抗FLIPS/L和抗半胱天冬酶8多克隆抗体(pAb)分别从圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)(美国加利福尼亚州圣克鲁斯)和MBL (美国医学生物学实验室有限公司(Medical&Biological Laboratories Co, USA))购买。抗半胱天冬酶3&9多克隆抗体从细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology)(麻萨诸塞州丹弗斯)购买。
用于所有实验的培养基 是RPMI1640 (以色列生物产业公司)，补充有10%FBS (加利福尼亚州英杰生命技术公司(Invitrogen Life Technologies, CA))、2mM L-谷氨酰胺、以及100U/ml青霉素/链霉素(生物产业公司)。
分别如先前在以下各项中所述来制备CTLA-4.FasL的带六聚组氨酸标签的衍生物(his6CTLA-4.FasL)(该标签附接至氨基末端)、以及CD40.FasL:黄(Huang JH)和泰科钦斯基(Tykocinski ML) (CTLA-4-Fas配体充当在桥联抗原递呈细胞和T细胞中的反式信号转换器蛋白(CTLA-4-Fas ligand functions as a trans-signal converterprotein in bridging antigen-presenting cells and T cells,〈〈国际免疫学杂志〉〉(Int Immunol) 2001，13:529-539));阿尔哈莱尔(Elhalel MD)等人(CTLA-4.FasL 诱导同种抗原特异性应答不足(CTLA-4.FasL induces alloantigen-specifichyporesponsiveness),《免疫学杂志》(J Immunol) 2003，170:5842-5850);以及德拉尼特茨基-阿尔哈莱尔(Dranitzk1-Elhalel M)等人(CD40.FasL抑制人T细胞:自抑制性环回机制的证据(CD40.FasL inhibits human T cells:evidence for an auto-1nhibitory loop-backmechanism),国际免疫学杂志(Int Immunol) 2007，19:355-363)。
增殖测定
将处于指数生长期的Jurkat、Daudi或Raji细胞洗漆两次并且以1x106细胞/ml再悬浮在培养基中。将50 μ I细胞悬浮液添加至圆底96孔组织培养板的各个孔中。将CTLA-4.FasL、CD40.FasL、sFasL、CTLA-4.Ig 或 CD40.Fe、或后三项的组合以不同的浓度添加。总培养体积为200 μ I/孔。在一些实施例中，在添加CTLA-4 -FasL20分钟之前添加抗⑶80或抗⑶86抗体。在其他实验中，将PBS中的CTLA4 *Ig添加至平底96孔板中并且在37° C下孵育lh，并且然后在40° C下孵育过夜，以便用CTLA4.Ig预涂覆这些板。第二天，将板用PBS洗涤4次，并且将5x104个Raji细胞添加至每个孔中并孵育24h。培养物然后用0.5 μ Ci的[3Η]胸苷(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆珀金埃尔默公司(PerkinElmer，Waltham, Massachusetts, USA))脉冲处理，并且在 37。C、6%C02 以及 95% 湿度下孵育 18-24小时。随后将细胞收获到玻璃纤维过滤器上以用于闪烁计数。所有的增殖测定重复进行三次。
流式细胞术
将细胞用FACS缓冲液(在IxPBS中的0.5%BSA/0.02%叠氮化钠)洗涤两次，并且在冰上使用以下各项之一孵育30-45分钟:FITC结合的抗⑶40L抗体、抗⑶80抗体、抗⑶86抗体、抗CD95抗体、或它们的相匹配的同种型对照物，所有项从PharMingen公司(美国加利福尼亚州圣地亚哥)购买。流式细胞术使用FACSCalibur流式细胞仪(美国加利福尼亚州圣何塞 BD 公司(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA))来进行，并且数据使用 CellQuest 软件(BD公司)进行分析。对于每个样品收集总计1x105个事件。
为了追踪经历凋亡的细胞，将1x106个Jurkat T细胞或1.5x106个Raji或Daudi B细胞以Iml的总体积在24孔板中、在以下各项的存在或不存在下进行孵育:CTLA-4.FasL、CD40.FasL、sFasL、CTLA4.Ig 或 CD40.Fe 或后三项的组合。4h (T 细胞)或16h (B细胞)之后，收集细胞并用冷FACS缓冲液(在Ix PBS中的0.5%BSA/0.02%叠氮化钠)洗涤两次。为了检测凋亡和坏死，按照制造商的实验方案，使用试剂盒(MBL，美国医学生物学实验室有限公司)利用碘化丙啶(PI)和膜联蛋白-VFITC对细胞进行共染色。使用FACSCalibur流式细胞仪进行流式细胞术，并且使用CellQuest软件分析数据。对于每个样品收集总计1x105个事件。全细胞溶解产物和蛋白质印迹分析
将处于指数生长期的Jurkat、Raj1、JY或Daudi细胞洗涤两次，并且以5x106细胞/ml再悬浮在培养基中，并且以Iml的总体积铺在24孔板中。将CTLA-4.FasUOMO -FasL,sFasL、CTLA4.Ig或⑶40_Fc、或后三项的组合以不同的浓度添加。90分钟后，收集细胞、用冰冷的PBS洗涤两次、并且在溶解缓冲液(0.5%Nonidet P_40、50mM Tris-HCl (pH8.0)、IOOmM NaClUmM PMSF、ImM原钒酸钠、10 μ g/ml亮肽素、以及10 μ g/ml抑肽酶)中在冰上溶解20-30分钟。全细胞溶解产物的蛋白浓度根据制造商的实验方案，使用Bio-Rad蛋白测定试剂盒(加利福尼亚州里士满Bio-Rad公司(Bio-Rad, Richmond, CA))来测定。将全细胞溶解产物与Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad公司)以1:1的比例混合、在95° C下加热10分钟，并且将等量的蛋白质加载到10%SDSPAGE上。
电泳后，将凝胶印迹到硝酸纤维素膜(Schleicher & Schuell公司)上、用5%牛奶/PBS封闭、并用初级抗体探测过夜。充分洗涤之后，将印迹用HRP结合的相匹配的次级抗体(Bio-Rad公司)孵育，并在暴露于X射线胶片之前用增强型化学发光底物(西格玛奥瑞奇公司)显影。扫描胶片并通过ImageMaster VDS-CL (安发玛西亚生物技术公司(AmershamPharmacia Biotech))来量化。将所有的膜用抗_β肌动蛋白单克隆抗体(mAb)或抗GAPDH单克隆抗体再印迹，以验证相似量的蛋白质被加载到凝胶上。
结果
融合蛋白介导的 对细胞增殖的抑制是取决于同源受体的表面表达
作为第一步，确立CTLA-4 -FasL和⑶40 -FasL融合蛋白的组成部分的功能性。为此，使用在针对这些融合蛋白元素的反受体一即B7 (⑶80和⑶86)、⑶40配体(⑶40L)以及Fas受体(CD95) —的表达方面不同的恶性B (Raj1、JY以及Daudi)和T (Jurkat)细胞。在Jurkat的情况下，使其CD40L (J-CD40L+对比J_CD40L_)26的表达不同的两个亚系成对。开始，通过免疫荧光法和流式细胞术来验证在这些不同细胞系上的分子的表面表达(图1)。如所预期，这些B和T细胞系分别对B7分子呈阳性和阴性，并且Daudi细胞表达出可忽略不计的Fas受体水平。J-⑶40L+和J-⑶40L-T细胞亚系之间的⑶40L表达的差异也得到证实。
接着，确定同源表面受体表达方面的差异是否与CTLA-4.FasL和⑶40.FasL抑制肿瘤系增殖的能力有关系(图2A)。确切来说，在CTLA-4 ^FasUOMO WasUCTU^.Ig、⑶40-Fc、sFasL、或后三项的不同组合的存在或不存在下，将这些不同的细胞系用[3H]胸苷脉冲处理16_20h。如所预期，表达了极少的Fas受体的Daudi细胞的增殖既未被含FasL的融合蛋白一CTLA-4.FasL和⑶40.FasL中的任一个抑制，也未被sFasL抑制(图2A，最底排)，从而突出了它们的抑制活性的Fas依赖性。相比之下，这些融合蛋白显著抑制了其他两种恶性B细胞系一Raj (图2A)和JY (未显示)的增殖，这两种细胞系确实表现出Fas死亡受体。在抑制表达B7的恶性B细胞的增殖方面，CTLA-4.FasL实质上比单独的或组合的sFasL和CTLA4.Ig更有力。事实上，CTLA4.Ig在高达100ng/ml的浓度下对增殖没有作用。
应注意，针对B细胞系(它们对CD40L呈阴性)，CTLA_4FasL比CD40FasL显著更有效。实际上，在高达30ng/ml的浓度下，⑶40FasL对B细胞系没有抑制作用。
为了进一步探索针对⑶40 -FasL活性而言对于靶细胞上的⑶40L表达的要求，利用了在CD40L表达方面不同的Jurkat T细胞衍生系(J-CD40L+对比J-CD40L-)。与RajiB细胞相比，这两种T细胞系均受到sFasL和含FasL的融合蛋白的更大程度的抑制(图2A，上两排)，其中J⑶40L-系是最敏感的。有趣的是，如先前所示，虽然在更高的⑶40.FasL浓度(例如，>100ng/ml)下，所有表达Fas的细胞都受到某种程度的抑制(未显示)，但只有表达CD40L (J-CD40L+)的细胞受到低浓度的CD40.FasL的影响。
鉴于T细胞对所有形式的sFasL都高度敏感，不可能将它们用作B7阴性对照物来确立在CTLA-4.FasL活性方面对于B7表面表达的要求。因此，使用B7阳性B细胞作为靶标来进行抗体阻断实验。具体来说，比较了在不存在或存在针对CD80和CD86的拮抗性抗体下的CTLA-4.FasL的抑制作用(图2B)。抗CD80阻断抗体(0.5或I μ g/ml)显著减弱了 CTLA-4.FasL (30ng/ml)的抑制作用。相比之下,抗⑶86抗体在相同的浓度下，对Raji细胞增殖的CTLA-4 -FasL抑制没有作用。这两种阻断抗体的组合添加完全废除了CTLA-4 -FasL的抑制作用。总之，这些数据显示，当靶恶性淋巴样系对于每个融合蛋白的两个结构域表达同源反受体时，CTLA-4.FasL和⑶40.FasL展现出极大的抑制效力。
融合蛋白介导的对凋亡的诱导是取决于同源受体的表面表达
先前的研究已经确立，CTLA-4.FasL和0)40.FasL均经由Fas介导的凋亡来诱导它们的抑制作用。然后考虑的是，当靶细胞共表达可以结合各自蛋白质的两端的表面分子时，由这些融合蛋白引起的凋亡诱导是否伴有更有效的增殖抑制。为此，将同组的恶性细胞系在CTLA-4.FasUOM0.FasL、CTLA4-1g、CD40-Fc、sFasL、或后三项的不同组合的存在或不存在下孵育4 (T细胞)或16 (B细胞)小时。在处理期结束时，使用Annexine/PI染色和流式细胞术评定细胞的凋亡和坏死。再次如所预期，含FasL的融合蛋白或sFasL对缺乏Fas受体的Daudi B细胞没有作用，并且CTLA-4.Ig或⑶40_Fc也不诱导Daudi细胞中的凋亡(图3A，B)。相比之下，并且与增殖测定中的情况相同，CTLA-4.FasL在第16h显著增加了凋亡或坏死的Raji细胞的百分比(图3A，B)。而且，与sFasL、CTLA_4_Ig或这后两项的组合形成对照，当用CTLA-4.FasL孵育Raji细胞时，检测到更多的凋亡。⑶40.FasL没有诱导Raji细胞的显著凋亡(图3A，C)。
当用CTLA-4.FasL 孵育 Jurkat T 细胞(J-CD40L+ 或 J-CD40L-)时，随之发生了显著的凋亡，尽管与J-CD40L-相比，J-CD40L+受到较小的影响(图3A，C)。当使用sFasL或抗Fas抗体CHll (未显示)时，这些成对的细胞系之间的在对凋亡诱导的易感性方面的相同差异是明显的。然而，当在CD40.FasL的存在下孵育Jurkat细胞系时，仅可以在J-CD40L+细胞中检测到显著的凋亡，尽管事实是，sFasL在诱导J-CD40L-细胞中的凋亡方面更加有力(图3A，C)。这组实验突出了每种各自融合蛋白的两端对于有效的凋亡诱导的功能上的重要性。
促凋亡和抗凋亡通路均受到CTLA-4.FasL和CD40.FasL的影响
然后考虑这种可能性:CTLA-4FasL和⑶40Fas的凋亡诱导活性可能不仅仅依赖于Fas死亡受体的触发。为了测试这种假设，将T和B细胞系用CTLA-4.FasL、⑶40.FasL、sFasL、CTLA-4.Ig、⑶40或后三项的组合孵育90-180分钟。在孵育期结束时，通过免疫印迹来评估全细胞溶解产物的抗凋亡蛋白cFLIP、半胱天冬酶8 (作为外源性通路的标志物)、半胱天冬酶9 (作为内源性、线粒体通路的标志物)、以及半胱天冬酶3的表达。应注意，半胱天冬酶原形式(未显示)和裂解的、活性半胱天冬酶形式都被检测。一个代表性实验显示在图4A中，并且使用不同细胞系进行的3个独立实验的总结显示在图4B-D中。
Daudi B细胞系(具有可忽略不计的Fas受体)中不同半胱天冬酶的表达在使用含FasL的蛋白进行孵育后没有改变(图4A)。另外，当用CTLA-4 -1gXD^-Fc或后者与sFasL的组合孵育Daudi细胞时，没有发现变化(图4A)。相比之下，共表达B7分子和Fas受体的B细胞系产生了完全不同的图像。在CTLA-4.FasL的存在下孵育90或180分钟之后，cFLIPL表达被消除，并且观察到这些半胱天冬酶中的两种(9和3)的活化(裂解)形式的明显增加。因为发现半胱天冬酶8在这些细胞中主要处于其活性的、切割的形式，即使当Fas受体未被触发并且cFLIP基础水平为非常低时，将另一种也共表达B7分子和Fas受体的恶性B细胞系JY考虑在内。
当用CTLA-4.FasL孵育时，存在cFLIP丰度的明显降低、和半胱天冬酶3、9、以及8的活化形式的显著增加(图5A-C)。相比之下，CD40.FasUsFasUCTLAI *Ig或CD40-Fc对恶性B细胞系的任一种中的cFLIP表达或半胱天冬酶活化都没有作用(图4和5)。
下一个焦点是具有一个适当的细胞靶标J-CD40L+的CD40FasL。当用CTLA-4 -FasL或CD40.FasL孵育J-CD40L+和J-CD40L-T细胞系时，凋亡和抗凋亡蛋白表达的模式表达与在B细胞系中所见到的那种截然不同(图4A，上两排；图4C)。在两种表达Fas的Jurkat细胞系中，CTLA-4.FasL和⑶40.FasL各自活化半胱天冬酶级联反应，显示出活化形式的半胱天冬酶9和3的增加的丰度。
半胱天冬酶8在这些细胞系中呈现其活化形式。没有注意到cFLIP丰度的变化。然而，虽然J-CD40L+细胞对CTLA-4.FasL不如对J-CD40L-敏感(如在半胱天冬酶9和3的活化形式的更少的增加中所反映的)，但它对CD40-FasL处理应答出cFLIP丰度的显著减少、以及半胱天冬酶8、3以及9的另外的活化。⑶40-FasL在这方面比⑶40-Fc、sFasL或这两项的组合更有力。总之，这些实验确立了 CTLA-4.FasL和⑶40.FasL各自对凋亡(半胱天冬酶)和抗凋亡(cFLIP)通路具有双重和增强作用。
CTLA-4 *Ig抑制B细胞系增殖并且降低cFLIP水平。对这些融合蛋白的特殊特性(对抗凋亡信号传导具有独特影响)的一个可能的解释是，通过对于这些融合蛋白组分的非Fas表面反受体的回信号传导(back-signaling)。事实上,通过‘共刺激性配体’ B7 (在抗原递呈细胞上)和⑶40L (在T细胞上)的回信号传导已经由其他人予以记录。因此考虑，与Fas受体触发同时发生的、分别通过B7和⑶40L的回信号传导，是否可以至少部分解释CTLA-4 *FasL和⑶40 -FasL融合蛋白的异常效力。出于那个目的，在板结合的CTLA-4 *Ig的存在或不存在下，将Raji B细胞用CTLA-4.FasL处理24h，并且评定增殖。如图6A所示，板结合的CTLA-4.Ig独自显著 抑制了 Raji细胞增殖。在板结合的CTLA-4.Ig的存在下，CTLA-4.FasL介导的对Raji细胞增殖的抑制被减弱，这表明对CTLA-4.FasL结合至B7造成干扰(图6B)。重要的是，类似于CTLA-4.FasL，板结合的CTLA-4.Ig减少了 Raji细胞中的cFLIP表达，并且增加了这些细胞中的半胱天冬酶9和3的表达(图6C)。这些发现表明，CTLA-4.Ig可以将抑制性回信号递送至恶性B细胞，并且减少这些细胞中的抗凋亡性cFLIP。
考虑了⑶40.FasL是否可以介导通过⑶40L的类似的回信号传导。为了测试这一可能性，用CD40-Fc孵育J-CD40L+细胞。CD40_Fc将J-CD40L+的增殖增加了约20% (未显示)。然而，当在高达1200ng/ml的浓度下使用⑶40_Fc时，没有观察到对凋亡和抗凋亡蛋白的表达的作用(数据未显示)。
讨论
在此研究中，已经考虑了两种融合蛋白CTLA-4.FasL和⑶40.FasL作为恶性淋巴样细胞系中的凋亡诱导物的独特功能特性，焦点为相关的细胞内信号传导级联反应。不希望受单一假设或封闭列表的限制，这些发现包括:l)CTLA-4.FasL和⑶40.FasL诱导B和T谱系的表达Fas受体的恶性淋巴样系中的死亡；2)与⑶40.FasL相比，CTLA-4.FasL更具效力地诱导表达B7的B细胞系中的凋亡；3)⑶40.FasL以⑶40L依赖性方式诱导表达CD40L的J-CD40L+T细胞中的凋亡；4)CTLA_4.FasL在表面上共表达B7和Fas受体的细胞中降低cFLIP表达并且活化半胱天冬酶级联反应；5)⑶40.FasL在共表达⑶40L和Fas受体的细胞中降低cFLIP表达并且活化半胱天冬酶级联反应；以及6) CTLA-4.FasL和⑶40.FasL在诱导凋亡方面，各自比它们的任何组成部分(单独或组合)更有效。
这些发现合起来确认了这些独特的融合蛋白的更高级功能性，并且提示它们可以通过协调地影响凋亡和抗凋亡通路而具有诱导恶性淋巴样细胞中的凋亡的特殊优势。使恶性细胞能够逃脱凋亡，并且从而保持治疗难治性的机制之一是抗凋亡蛋白的上调。内源性(作为cFLIP)或外源性(作为vFLIP)表达的FLIP在若干恶性淋巴瘤中已经作为关键抗凋亡蛋白而受到牵连。先前已经表明，CTLA-4.FasL阻止通常伴有T细胞活化的cFLIP表达的上调。通过消除这种抗凋亡蛋白的上调，CTLA-4.FasL能够相比sFasL在更早的时期诱导活化的T细胞中的凋亡。本研究将CTLA-4.FasL的此功能特征延伸到转化细胞。
对于在此研究的大多数细胞系(B卩，J-CD40L+、J-CD40L-以及JY细胞)而言，cFLIP表达的减少与半胱天冬酶3、8以及9的活化有关系。半胱天冬酶8的活化取决于其与死亡复合物FADD的结合。此结合引起半胱天冬酶3和Bid的活化，这进而导致细胞色素c和半胱天冬酶9活化。半胱天冬酶9的活化然后引起更多的半胱天冬酶3活化和有效的凋亡。cFLIP蛋白通过与半胱天冬酶8竞争以结合死亡复合物FADD而抑制半胱天冬酶8活化的能力是广为人知的。
关于cFLIP的两个剪接变体:cFLIP短(cFLIPs )和cFLIP长(cFLIPL)的作用，在文献中存在矛盾的数据。cFLIPL在系统中的作用似乎更加复杂，数据指示，高水平的表达导致凋亡，而中度水平产生相反结果，即，在体外和体内抑制Fas介导的凋亡。然而，在cFLIPL低表达的情况下，数据更清晰在于，cFLIPL mRNA的选择性沉默加强了半胱天冬酶8招募、活化、加工、以及从死亡复合物的释放，并因此增强凋亡。在Raji B细胞系中仅检测到cFLIPL剪接变体，并且能够结合这些细胞上的B7-1 (⑶80)和Fas受体(⑶95)的CTLA-4 FasL降低了此cFLIP亚型的表达。重要的是，不顾这些Raji细胞中的半胱天冬酶8的活化形式的组成型表达，CTLA-4.FasL驱使的cFLIPL减少与半胱天冬酶9和3的活化以及有效的凋亡诱导有关系。不希望受单一假设的限制，CTLA-4.FasL和⑶40.FasL引起的c-FLIP的减少可以在转化的淋巴样细胞中导致促凋亡和抗增殖作用。
通过将FasL嵌合至CTLA-4和⑶40，创造了引人注目的分子桥联可能性。转化的B细胞引入了一种新的情境，其中同一融合蛋白可以潜在地桥联被共表达在同一细胞上的反受体。CTLA-4 -FasL和CD40 -FasL引起的细胞间和细胞内桥联必定不是相互排斥的，并且人们可以预想在局部肿瘤生长的背景下两者都发生。
顺式环回自信号传导(cis loop-back auto-signaling)机制可以基于多种依据而导致更有效的抑制。首先，这些融合蛋白用于将FasL拴系到膜上，这是经由B细胞上的CTLA-4:B7结合或T细胞上的⑶40:⑶40L结合。表面锚定的FasL的效力已经在将其外生地引入到APC表面上以产生缺失的APC56-59的背景中清楚地确立。因此人们将期望融合蛋白栓系的FasL在自信号传导(auto-signaling)模式中同样具有高度功能性。其次，CTLA-4.FasL和⑶40.FasL均具有通过触发同一细胞表面上的邻近反受体而充当双重信号传导剂的潜力。
通过B7分子⑶80和⑶86的回信号传导已经对于B细胞23予以描述，在⑶80的情况中引起了对B细胞的增殖抑制，而对于⑶86，情况相反。由于CTLA-4对⑶80具有更高的亲合力，人们可以预期对于CTLA-4.FasL,与⑶80相关的作用占主导。在此显示CTLA-4.Ig抑制表达⑶80的 Raji细胞的增殖的数据与此回信号传导功能相一致。
对于T细胞上的⑶40L，回信号传导也得以证实，并且因此也有助于⑶40.FasL的所观察到的功效。在⑶40.FasL、但非⑶40-Fc的情况中，⑶40部分被呈现在一个细胞结合模式(经由FasL:Fas锚定)中，并且具有处于三聚体或两个三聚体配置(相对于假定的⑶40-Fc 二聚体)中的可能性。
事实上，已经显示，与⑶40的低聚物相比，⑶40-FC具有对于⑶40L的更低的亲和力，并且此更高的亲和力伴有更强的生物活性。总之，但是不希望受单一假设的限制，这些不同的数据表明，不是只有CTLA-4.FasL和⑶40.FasL各自可以在相同的细胞上递送双重信号，而是在两种情况中，Fas信号传导也可以通过经由其他反受体(B7-1或⑶40L)的回信号传导得以加强。
应注意，CTLA-4.FasL被发现是Jurkat T细胞中凋亡的有力诱导物，即使这些细胞对于B7蛋白呈阴性。这有可能反映了它们对可溶的FasL介导的凋亡的整体更高的易感性，如由它们(尤其是J-CD40L-亚系)对sFasL和激动型(agonistic)抗Fas抗体(CH11 ;数据未显示)的高敏感性所证实。
本研究突出了适当配置的融合蛋白的功能丰富度。CTLA-4.FasL和⑶40.FasL融合蛋白调节正常和转化的淋巴样细胞、用于细胞间和细胞内地桥联分子、设置人工顺式环回自信号传导回路、并且递送正在增强的双重信号。这两种蛋白均可以下调抗凋亡cFLIP亚型一用于加强由这些相同蛋白所递送的FasL促凋亡信号的一种作用。因此，人们可以利用融合蛋白来同时传递死亡信号并且使这些细胞对此信号敏感。
实例2-用于治疗血液恶性肿瘤的嵌合蛋白的临床试验
在此所述的针对患有选自下组的血液恶性肿瘤的受试者的嵌合蛋白(治疗剂)的I期试验可被设计来评估对疾病进展和可能毒性的两种作用，该组由以下各项组成:淋巴瘤、多发性骨髓瘤以及在此所述的白血病。如在本领域中众所周知的，患有疑似血液恶性肿瘤的受试者可以在该血液恶性肿瘤的阳性诊断之后登记在内。
治疗可以作为单一疗法来提供或与公认的治疗组合来提供。例如，对于多发性骨髓瘤的治疗策略被评述在拉季库马尔(Rajkumar)等人，2002，梅奥临床学报(Mayo Clin.Proc).77:814中，该案通过引用以其全部内容结合在此)。对该疾病急性或不寻常的进展的识别可能会停止给予治疗剂。
初始受试者接受合适剂量的治疗剂，该治疗剂是例如作为I小时静脉输注来给予、或适当时单独或与如将由本领域的普通技术人员所选择的一种或多种其他已知的试剂结合而给予。如果有足够的耐受性，则将在随后的受试者中逐步增加剂量。此外，给药方法可改变为弹丸式注射。
根据世界卫生组织毒性标准，在受试者中评估治疗剂的毒性:在输液过程中，每隔10分钟监测一次血压、体温以及心率，然后每隔一小时一次持续3小时、并且最后每隔3小时一次持续24小时进行监测。每隔一天进行血液、肾和肝功能试验，持续一个星期；并且在注射后第15、30、60和120天进行这些试验。
血清和/或组织样品每周取一次，持续两个月，以使得该治疗剂的效果可以通过本领域已知的方法来确定，例如，M蛋白的血清浓度的变化、血红蛋白值的变化、溶骨性病变的存在/消退等。病理 研究将评定对与血液恶性肿瘤相关联的组织损伤的治疗作用。
实例3-对肿瘤细胞系的作用
材料和方法.
除非另外说明，否则所有的化学品均从西格玛公司(SIGMA)(以色列)获得。DMEM培养基、FBS、PBS、胰蛋白酶-EDTA、青霉素、链霉素以及L-谷氨酰胺是获得自生物产业公司(以色列 Beit Haemek)ο
细胞系.Raji (EBV转化的B细胞淋巴瘤系)、JY (EBV转化的B细胞淋巴瘤系)、Daudi (EBV转化的B细胞淋巴瘤系)、RPMI8226 (人多发性骨髓瘤细胞系)、HL60 (人早幼粒细胞性白血病细胞)购自ATCC (美国)。SK-HEP-1 (HTB-52 ;肝腺癌细胞系)购自ATCC(美国)。最初来自ATCC的H印G2、Huh7肝细胞癌细胞系是由以色列耶路撒冷的哈达萨希伯来大学医学中心的肝脏病学组(Hepatology Unit, Hadassah Hebrew University MedicalCenter in Jerusalem, Israel)惠赠。除非另外说明，否则所有细胞系在补充有lOU/ml青霉素、0.111^/1111链霉素以及292 4 8/1111 L-谷氨酰胺的10%FBS DMEM中生长。所有细胞系在37° C下在6%C02中培养，并且使用EZ-PCR支原体测试试剂盒(生物产业公司)来定期测试培养物的支原体污染。
活性测定.为了评定KAHR-102 (CTLA4_FasL)活性，将0.2x106个细胞/ml重复三次接种在96孔板(NUNC，丹麦罗斯基勒(Roskilde，Denmark))中并且在使用或不使用不同浓度的KAHR-102的带组氨酸标签的版本(his6CTLA4-FasL)下来培养；细胞用指定的蛋白浓度在37° C下在6%C02中孵育24h ;并且使用MTS测定(美国麦迪逊普洛麦格公司(Promega, Madison, USA))来评估细胞活力。
流式细胞术.为了评定凋亡，将0.2x106个细胞/ml重复两次接种在24孔培养板(NUNC)中并且在使用或不使用不同浓度的his6CTLA4-FasL (KAHR-102)、可溶FasL、CTLA4-Fc或组合的后者下孵育24小时。然后收获细胞，并根据制造商的实验方案，使用膜联蛋白V/PI MEBCYT0凋亡试剂盒(MBL，日本名古屋(Nagoya))，通过流式细胞计量分析来检测凋亡细胞。使用FACSCalibur流式细胞仪(美国加利福尼亚州圣何塞BD公司)来计数每个样品的20，000个事件,并且使用CellQuest软件(BD公司)来分析数据。
为了检测在不同细胞系中的Fas受体和B7分子(⑶80和⑶86)的表达，将细胞取回，在染色缓冲液(含1% BSA和0.1 %叠氮化钠的PBS)中洗涤，并且在由生产商CeBioscience公司)建议的浓度下，使用对以上提及的分子具有特异性的藻红蛋白标记的单克隆抗体或相关对照抗体进行染色。流式细胞术使用FACSCalibur流式细胞仪(BD公司)来进行，并且使用CellQuest软件(BD公司)来分析数据。对于每个样品收集总计20，000个事件。
统计分析.数据呈现为均值土 SD。通过双尾未配对的学生t检验进行均值的统计比较。p〈0.05的差异被认为是统计学上有意义的。
肿瘤异种移植物的确立.将使用4-6周龄的、维持在确定的菌群条件下在希伯来大学无病原体动物设施中的无胸腺的B ALB/c nu/nu裸雄性小鼠(以色列哈伦(Harlan))。所有实验都由希伯来大学动物保健委员会(Animal Care Committee of the HebrewUniversity)批准。将Raj1 、JY或RPMI8226生长至80%汇合、收获、用PBS洗涤、并皮下注射(2x107/小鼠)到小鼠的右侧或经腹膜内给予。一旦可触知，对于皮下肿瘤，将使用测微计测量肿瘤它们的宽度和长度，并计算肿瘤体积(《2χ长度/2)，或者，对于腹膜内肿瘤，将测量腹部直径，并且将称量小鼠。每天以皮下注射his6CTLA4-FasL (KAHR-102) (200 μ g)来治疗老鼠，持续8天。如果肿瘤再生长或重新出现，另一种治疗将在两个星期内跟进。对照组将被注射类似体积的his6CTLA4-FasL (KAHR-102)稀释缓冲液。肿瘤体积将监测约3个月，或者直到肿瘤大小超过了需要动物牺牲的阈值为止。实验结束时，将牺牲小鼠，并且肿瘤将被收获、测量及称重，并且分析。
结果
针对不同的淋巴瘤细胞，评估CTLA4_FasL的细胞毒性活性。如图7和8所示，CTLA4-FasL以剂量依赖性方式诱导Raji和JY的死亡，这两种细胞都是B细胞淋巴癌细胞系。应注意，在低至0.lng/ml的浓度下检测到显著的细胞死亡,该浓度对应于0.4nmol/l的EC50。细胞死亡在第24h时检测到，并且在第48h时更强烈，而在3ng/ml CTLA4_FasL下几乎没有活细胞可检测到。重要的是，取自健康志愿者的原代B细胞对CTLA4-FasL的毒性活性具有抗性(未显示)。
然后测试人骨髓瘤细胞系RPMI8226，并且如在图9中所见，发现，尽管它们对CTLA4-FasL的敏感性低于B细胞淋巴瘤细胞系对此的敏感性，但它们确实应答于更高浓度的CTLA4-FasL。相比之下，早幼粒细胞性白血病细胞对CTLA4_FasL的细胞毒性作用具有抗性(图10)。
对CTLA4_FasL的作用的易感性方面的差异可以通过能够结合融合蛋白的表面分子的不同表达来解释。然后在这四种细胞系上测试结合CTAL4的⑶80和⑶86的表达、以及⑶95 (Fas受体，它结合FasL)的表达。如可在图11_14中所见，这两种高度敏感的细胞系，即Raji和JY，表达所有三种表面分子。显示出对CTLA4-FasL的中等敏感性的人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226表达Fas受体和⑶86 (但表达水平低于B细胞系)，并且完全不表达⑶80。不受CTLA4-FasL影响的早幼粒细胞性白血病细胞显示出低水平的⑶86表达、和非常低水平的Fas受体。
将此分析延伸到其他癌细胞系，S卩，SK-Hepl肝癌细胞。如可在图15中所见，CTLA4-FasL展现出针对这种肿瘤系的细胞毒性作用，尽管具有稍微不同的动力学；CTLA4-FasL比CTAL4_Fc、可溶FasL或后者的组合远远有效得多。使用这种细胞系，测试了由半胱天冬酶介导的凋亡抑制对CTLA4-FasL的作用的影响。如图16中所示，泛半胱天冬酶抑制剂zVAD完全废除了 CTLA4-FasL效应，这表明它的细胞毒性作用是基于凋亡的。
虽然出于说明的目的已经在上文描述了本发明的具体实施例，但对于本领域的普通技术人员而言将明显的是，在并不脱离由所附权利要求限定的本发明的情况下，本发明的细节可做出诸多改变。
应理解，出于清楚而在多 个单独的实施例的背景中描述的本发明的某些特征还可以结合在一个单一的实施例中来提供。相反地，出于简洁而在一个单一的实施例的背景中描述的本发明的不同的特征还可以单独地或以任何合适的子组合来提供。
尽管本发明已经结合其具体的实施例进行描述，但很明显很多替代方案、修改和变化对本领域的普通技术人员将是清楚的。因此，意在包含所有落入所附权利要求书的精神和宽的范围内的所有这类替代方案、修改和变化。
在本说明书中提及的所有出版物、专利、以及专利申请通过引用以其全部内容在此结合在本说明书中，其程度如同是每个单独的出版物、专利、或专利申请被确切地且单独地指出为通过引用结合在此。此外，在本申请中引用或识别的任何参考文献不应被解释为承认这个参考文献作为本发明的现有技术是可得的。
权利要求
1.一种选自由CTLA4-FasL和⑶40_FasL蛋白组成的组中的嵌合蛋白用于治疗包括淋巴瘤的病症的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述淋巴瘤包括淋巴系统中B或T细胞的恶性生长一霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
3.如权利要求2所述的用途，其中该非霍奇金淋巴瘤选自下组，该组由以下各项组成:侵袭性NHL、转化型NHL、惰性NHL、恶化前NHL、复发性NHL、难治性NHL、低级非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、NK细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、急性成淋巴细胞淋巴瘤、皮肤T细胞癌、以及蕈样真菌病/Sezry综合征。
4.如权利要求3所述的用途，其中所述惰性非霍奇金淋巴瘤(NHL)包括淋巴瘤的缓慢生长形式，低级NHL或中级NHL。
5.如权利要求4所述的用途，该用途是停止该病症进展成多发性骨髓瘤的恶性形式。
6.一种选自由CTLA4-FasL和⑶40_FasL蛋白组成的组中的嵌合蛋白用于治疗包括多发性骨髓瘤的病症的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述多发性骨髓瘤选自下组，该组由以下各项组成:产生K型轻链和/或λ型轻链的多发性骨髓瘤癌症；侵袭性多发性骨髓瘤；良性浆细胞病症；焖燃型多发性骨髓瘤(SMM)、惰性多发性骨髓瘤、也可发展成多发性骨髓瘤的多发性骨髓瘤的恶化前形式；以及原发性淀粉样变性。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述良性浆细胞病症选自下组，该组由以下各项组成:MGUS (意义不明的单克隆丙种球蛋白病)和/或可发展成多发性骨髓瘤的瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(丽，又称为淋巴浆细胞性淋巴瘤)。
9.如权利要求8所述的用途，该用途是停止该病症进展成多发性骨髓瘤的恶性形式。
10.如权利要求7所述的用途，其中所述侵袭性多发性骨髓瘤是原发性浆细胞白血病(PCL)0
11.一种选自由CTLA4-FasL和⑶40_FasL蛋白组成的组中的嵌合蛋白用于治疗包括选自下组的白血病的病症的用途，该组由以下各项组成:急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、成人T细胞白血病、非白血性 白血病、白血性白血病、嗜碱细胞性白血病、母细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚细胞性白血病、嗜酸细胞性白血病、格罗斯白血病、毛细胞白血病、成血细胞性白血病、血胚细胞性白血病、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴原性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞性白血病、小原粒型白血病、单核细胞性白血病、成髓细胞性白血病、髓细胞性白血病、髓样粒细胞性白血病、髓单核细胞白血病、内格利型白血病、浆细胞白血病、浆细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、里德尔氏细胞性白血病、希林氏白血病、干细胞白血病、亚白血性白血病、以及未分化细胞白血病。
12.如以上权利要求中任一项所述的用途，进一步包括通过将所述嵌合蛋白给予已经患有所述病症、倾向于患所述病症的受试者来使用、或用作维持疗法、或用于停止该病症的进展。
13.一种药用组合物，包含选自由CTLA4-FasL和⑶40_FasL蛋白组成的组中的嵌合蛋白、以及药物载体，该组合物被适配成用于治疗淋巴瘤。
14.如权利要求13所述的药用组合物，其中所述淋巴瘤包括淋巴系统中B或T细胞的恶性生长一霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
15.如权利要求14所述的药用组合物，其中该非霍奇金淋巴瘤选自下组，该组由以下各项组成:侵袭性NHL、转化型NHL、惰性NHL、恶化前NHL、复发性NHL、难治性NHL、低级非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、NK细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、急性成淋巴细胞淋巴瘤、皮肤T细胞癌、以及蕈样真菌病/Sezry综合征。
16.如权利要求15所述的药用组合物，其中所述惰性非霍奇金淋巴瘤(NHL)包括淋巴瘤的缓慢生长形式，低级NHL或中级NHL。
17.如权利要求15所述的药用组合物，用于停止该病症进展成多发性骨髓瘤的恶性形式。
18.一种药用组合物，包含选自由CTLA4-FasL和⑶40_FasL蛋白组成的组中的嵌合蛋白、以及药物载体，该组合物被适配成用于治疗多发性骨髓瘤。
19.如权利要求18所述的药用组合物，其中所述多发性骨髓瘤选自下组，该组由以下各项组成:产生K型轻链和/或λ型轻链的多发性骨髓瘤癌症；侵袭性多发性骨髓瘤；良性浆细胞病症；焖燃型多发 性骨髓瘤(SMM)、惰性多发性骨髓瘤、也可发展成多发性骨髓瘤的多发性骨髓瘤的恶化前形式；以及原发性淀粉样变性。
20.如权利要求19所述的药用组合物，其中所述良性浆细胞病症选自下组，该组由以下各项组成=MGUS (意义不明的单克隆丙种球蛋白病)和/或可发展成多发性骨髓瘤的瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM，又称为淋巴浆细胞性淋巴瘤)。
21.如权利要求20所述的药用组合物，用于停止该病症进展成多发性骨髓瘤的恶性形式。
22.如权利要求19所述的药用组合物，其中所述侵袭性多发性骨髓瘤是原发性浆细胞白血病(PCL)。
23.一种药用组合物，包含选自由CTLA4-FasL和⑶40_FasL蛋白组成的组中的嵌合蛋白、以及药物载体，该组合物被适配成用于治疗选自下组的白血病，该组由以下各项组成:急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、成人T细胞白血病、非白血性白血病、白血性白血病、嗜碱细胞性白血病、母细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚细胞性白血病、嗜酸细胞性白血病、格罗斯白血病、毛细胞白血病、成血细胞性白血病、血胚细胞性白血病、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴原性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞性白血病、小原粒型白血病、单核细胞性白血病、成髓细胞性白血病、髓细胞性白血病、髓样粒细胞性白血病、髓单核细胞白血病、内格利型白血病、浆细胞白血病、浆细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、里德尔氏细胞性白血病、希林氏白血病、干细胞白血病、亚白血性白血病、以及未分化细胞白血病。
24.如以上权利要求中任一项所述的用途或药用组合物，其中所述嵌合蛋白的作用包括抗增殖作用或凋亡作用、或其组合。
25.如权利要求24所述的用途或药用组合物，其中所述作用进一步包括通过所述嵌合蛋白使癌细胞对嵌合蛋白的所述作用敏 感。
全文摘要
一种选自由CTLA4-FasL和CD40-FasL蛋白组成的组中的嵌合蛋白用于治疗如在此所述的淋巴瘤和/或多发性骨髓瘤和/或白血病的用途、以及其药用组合物和治疗方法。
文档编号A61P35/00GK103153332SQ201180046070
公开日2013年6月12日 申请日期2011年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者迈克尔·德兰尼茨基埃尔哈勒 申请人:卡尔医疗有限公司, 哈达斯特医疗研究服务和开发有限公司