可耐受的微创性皮肤电穿孔装置的利记博彩app

专利名称：可耐受的微创性皮肤电穿孔装置的利记博彩app
技术领域：
本发明尤其涉及电穿孔装置和其用于促进将生物分子引入哺乳动物的皮肤组织细胞中的用途。 背景对DNA疫苗的免疫反应幅度时常可能取决于三个主要标准-最佳化的载体设计、使用合适的佐剂和成功地将质粒输送至目标组织并且随后在目标组织中表达质粒。已证明体内电穿孔在有效地将DNA免疫原输送至肌肉和皮肤方面是非常有效的，事实上一些装置已进入人临床试验中。出于许多原因，将药物输送至皮组织(皮内，ID)是在临床环境下的一种引人注意的方法。皮肤是人体最大的器官，最可接近、最易于监测并且具有高免疫能力。然而，皮肤的不透性屏障功能一直是有效进行透皮药物输送的主要障碍。人皮肤延展达到大约2m2的面积并且平均厚度大约为2. 5mm,使其成为人体的最大器官。通常，皮肤具有两种广义的组织类型，表皮和真皮。表皮是不断地发生角质化的复层上皮。皮肤的最外层是角质层(SC)并且起到皮肤的主要屏障功能。SC是无生存力但具有生化活性的角化细胞的15-30个细胞厚度的层。表皮的其它三个层(颗粒层(S. granulosum)、棘层(S. spinosum)、基底层(S.basale))都含有处于不同分化阶段的角质细胞(ketatinocytes)以及免疫朗格汉斯细胞(Langerhans cell)以及真皮树突状细胞。用于透皮药物输送和基因输送的物理及化学方法已在世界范围内由诸多团体进行了详细地研究。离子电渗疗法、脂质输送以及基因枪是这些方法的实例。临时增加皮肤通透性的另一种物理方法是电穿孔。电穿孔涉及施加短暂的电脉冲，从而在哺乳动物细胞的脂质双层膜中产生含水通路。这使得包括DNA的大分子能够越过细胞膜传递，否则细胞膜的通透性将较低。因此，电穿孔增加了吸收，以及将药物和DNA输送至其目标组织的程度。为了进行电穿孔来引起孔隙的形成，需要实现阈值能量，并且由电泳效应产生的移动取决于电场和脉冲长度。在DNA疫苗的情况下，电穿孔已被证明可在数量上增强免疫反应，增大这些免疫反应的范围，以及改善剂量的效率。皮肤输送的诸多优点都是引人注意的，这些优点中最显著的是存在多种免疫相关细胞、作为免疫目标器官容易在临床上接近，以及输送的深度最小(微创)；然而，一直存在关于实现高转染率以及随后出现加强免疫反应的能力的问题。裸DNA通过标准的肌肉内(頂)注射的输送在啮齿类动物模型以外进行实施是出了名地低效的。这导致了在大型哺乳动物和人类中无法实现强大的免疫反应。已开发出一些策略以便增强基于DNA的疫苗的表达，所述策略如密码子最佳化、RNA最佳化、添加前导序列和开发最佳化的共有序列。尽管在载体设计和分子佐剂的使用方面有所改进，但是仍然对于施用DNA疫苗的有效方法存在需要，所述方法引起质粒在所需组织的所需细胞类型中的高水平表达，所需组织最常见的是肌肉、肿瘤或皮肤。此外，仍然需要一种电穿孔装置和输送疫苗的方法，所述装置和方法既可有效地产生保护性免疫反应又具有可耐受性(或接近无痛)。发明概述本发明的一个方面是电穿孔装置，其能够将可耐受的电势输送至受试者的表皮组织层的角质层与基底层之间，从而导致所述组织中的细胞电穿孔，所述电穿孔装置包括电压发生器；以及，具有与电压发生器电连通的多个电极的阵列。多个电极中的每个电极以大约O. 5mm至大约2. 5mm的距离与每个相邻的电极间隔开；电压发生器通过电极将大约O. I伏至大约50伏的电势输送至表皮组织；并且，电极的远端具有钝的尖端，所述尖端具有锋利的尖头从而允许电极穿透表皮组织层到达角质层与基底层之间，并且所述尖端将电势从电压发生器输送至表皮组织。
本发明的另一个方面是电穿孔装置，其能够将可耐受的电势输送至受试者的表皮组织，从而导致所述表皮组织中的细胞电穿孔，所述电穿孔装置包括电压发生器；以及，具有与电压发生器电连通的多个电极的阵列。多个电极中的每个电极以大约O. 5mm至大约2. 5mm的距离与每个相邻的电极间隔开；电压发生器通过电极将大约O. I伏至大约50伏的电势输送至表皮组织；并且电极被调适成以O. Imm或更小的深度穿透表皮组织。本发明的另一个方面是电穿孔装置，其能够将可耐受的电势输送至受试者的表皮组织，从而导致所述组织中的细胞电穿孔，所述电穿孔装置包括电压发生器；以及，具有与电压发生器电连通的多个电极的阵列。多个电极中的每个电极以大约O. 5mm至大约2. 5mm的距离与每个相邻的电极间隔开；电压发生器将大约O. I伏至大约50伏的电场输送至所述阵列；并且，其中电极将通过视觉类比量表测量为接近无痛的可耐受的电势输送至表皮组织细胞。本发明的另一个方面是电穿孔装置，其能够将可耐受的电势输送至受试者的表皮组织，从而导致所述组织中的细胞电穿孔，所述电穿孔装置包括电压发生器；以及，具有与电压发生器电连通的多个电极的阵列。多个电极中的每个电极以大约O. 5mm至大约2. 5mm的距离与每个相邻的电极间隔开；电压发生器将大约O. I伏至大约50伏的电场输送至所述阵列；并且，其中电极将由表皮组织细胞的最小程度损伤所证明的可耐受的电势输送至所述表皮组织细胞。本发明的另一个方面是通过使用本文所述的电穿孔装置的电穿孔辅助输送将生物分子输送至受试者的表皮组织细胞的可耐受方法，所述方法包括将生物分子施用至细胞；使电极与表皮组织接触以使得电极穿透角质层并且位于基底层上方的层中；以及，通过电极将可耐受的电势从电压发生器输送至表皮层细胞。附图
简述本领域技术人员参考附图可以对本发明的无数目标和优点进行更好地理解，附图中图I示出微创EP装置(“MIED”)的组件的一个实施方案的工程图。图2示出MIED的一个实施方案的各部件的三维图。“a”示出一次性无菌阵列外壳，“b”示出耐用外壳并且“c”示出一次性阵列(2a)内的电极外壳。图3示出MIED的一个实施方案的三维图，其为具有可拆卸阵列(用于灭菌)的由电池供电的手持式装置，“a”示出外部视图。“b”示出内部视图(包括电池)。图4示出MIED的实施方案的图片。 图5示出使用MIED来施行GFP表达构建体的由电穿孔促进的输送之后，用于检测GFP表达的豚鼠皮肤组织的荧光图像。图6示出使用MIED来施行GFP表达构建体的由电穿孔促进的输送之后，用于检测GFP表达的各种动物皮肤组织的荧光图像。图7示出展示在小鼠中针对流感激发的保护作用的免疫原性结果的图表。图8示出展示在豚鼠中针对流感激发的保护作用的免疫原性结果的图表。图9示出展示在非人灵长类动物中针对流感激发的保护作用的免疫原性结果的图表。发明详述给出以下简略或简短的定义以便帮助了解本发明的优选实施方案。在此给出的简略定义并非详尽无遗的，也不与如在本领域或字典含义中所理解的定义相矛盾。本文给出的简略定义用来补充或更明确地界定本领域已知的定义。本文使用术语“恒定电流”来定义在输送至组织的电脉冲的持续时间内由同一组织或界定所述组织的细胞所接收或者经历的电流。电脉冲由本文所述的电穿孔装置来输送。因为本文提供的电穿孔装置具有优选具备即时反馈的反馈元件，所以此电流在所述组织中在电脉冲的持续时间内保持在恒定的电流强度下。反馈元件可以在整个脉冲持续时间内测量组织(或细胞)的电阻并且导致电穿孔装置改变其电能输出(例如，增加电压)，以使得同一组织中的电流在整个电脉冲期间(大约几微秒)以及在不同脉冲之间保持恒定。在一些实施方案中，反馈元件包括控制器。所描述的由本文中的装置输送的电流强度值优选为恒定电流强度值。本文使用术语“恒定电压”来定义在输送至组织的电脉冲的持续时间内由同一组织或界定所述组织的细胞所接收或者经历的电压或电势。电脉冲由本文所述的电穿孔装置来输送。因为本文提供的电穿孔装置具有优选具备即时反馈的反馈元件，所以此电压在所述组织中在电脉冲的持续时间内保持在恒定的电压下。反馈元件可以在整个脉冲持续时间内测量组织(或细胞)的电阻并且导致电穿孔装置改变其电能输出，以使得同一组织中的电压在整个电脉冲期间(大约几微秒)以及在不同脉冲之间保持恒定。在一些实施方案中，反馈元件包括控制器。所描述的由本文中的装置输送的电压值优选为恒定电压值。术语“反馈”或“电流反馈”可以互换使用，并且意思是所提供皮肤EP装置的有源响应，该响应包括测量电极之间的组织中的电流和相应地改变EP装置输送的能量输出以便使电流保持在恒定水平。这一恒定水平是在启动脉冲序列或电疗之前由使用者预设的。优选地，反馈由皮肤EP装置的电穿孔部件(例如控制器)来完成，因为所述皮肤EP装置中的电路能够连续地监测电极之间的组织中的电流并且将所监测的电流(或组织内的电流)与预设电流比较并且连续地进行能量输出调整以便将所监测的电流保持在预设水平。在一些实施方案中，反馈回路是瞬时的，因为该反馈是一种模拟的闭环反馈。本文使用的术语“生物分子”是指核酸序列、蛋白质、脂类、微泡(如载有药物的小泡)和药品。优选地，生物分子是疫苗，更优选地，生物分子是DNA疫苗，甚至更优选是DNA质粒疫苗。
如本文可以互换使用的术语“电穿孔”、“电通透作用”或“电动力学增强”(“EP”)是指使用跨膜电场脉冲以便在生物膜中诱导微观通路(孔隙)；所述微观通路的存在允许如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水的生物分子从细胞膜的一侧传递到另一侧。本文使用术语“分散电流”来定义从本文所述的电穿孔装置的各种针状电极阵列中输送的电流的型式，其中所述型式最大限度地减少或优选消除被电穿孔的组织的任何区域上的电穿孔相关的热应力的发生。本文使用的术语“反馈机制”是指由软件或硬件(或固件)执行的过程，这一过程接收所需组织的阻抗(在输送能量脉冲之前、期间和/或之后)并且将该阻抗与优选为电流的预设值比较，并且调整所输送的能量脉冲以便实现预设值。本文在讨论反馈机制时使用术语“阻抗”，并且阻抗可以根据欧姆定律来转换成电流值，从而使得可与预设电流进行比较。在优选的实施方案中，“反馈机制”由模拟闭环电路执行。·如本文使用的术语“微创”是指由所提供的电穿孔装置的针状电极所进行的有限穿透，并且可以包括非侵入性电极(或非穿透性针)。优选地，穿透达到穿过角质层的程度，优选进入到最外层的活组织层即颗粒层中，但不穿透基底层。穿透深度不超过O. 1mm，优选深度在大约O. OlOmm至大约O. 040mm范围内变化，以便穿透角质层。优选地，这种穿透使用具有套管末端的电极来完成，所述套管末端经过研磨以便提供锋利的尖头，从而允许穿透角质层但避免深层穿透。术语“可耐受”或者“接近无痛”在本文中可以互换使用，并且在提及电穿孔时，术语的意思是与现有的电穿孔装置的典型情况相比，与电穿孔相关的疼痛水平大致降低。更具体地说，可耐受(或者接近无痛)的电穿孔是使用本文所述的避免对肌肉进行电穿孔的MIED与将较低电场输送至表皮层的角质层与基底层之间相结合的结果。优选地，电场包括低电压水平，即例如O. OlV至70V，优选地IV至15V。在使用VAS测量时，经历根据本文提供的方法所进行的MIED电穿孔的受试者感受到的疼痛水平在从其无痛或者没有疼痛的得分算起的20%以内(全量表的20%以内)，例如，在0-10分全量表的情况下在2分范围内，优选在从其无痛得分算起的10%以内。本发明的一个方面是电穿孔装置，其能够将可耐受的电势输送至受试者的表皮组织层的角质层与基底层之间，从而导致所述组织中的细胞电穿孔，所述电穿孔装置包括电压发生器；以及，具有与电压发生器电连通的多个电极的阵列。多个电极中的每个电极以大约O. 5mm至大约2. 5mm的距离与每个相邻的电极间隔开；电压发生器通过电极将大约O. I伏至大约50伏的电势输送至表皮组织；并且，电极的远端具有钝的尖端，所述尖端具有锋利的尖头，从而允许电极穿透表皮组织层到达角质层与基底层之间，并且所述尖端将电势从电压发生器输送至表皮组织。在一些情况下，电极的远端具有尖端，该尖端通常是钝的，但是具有一个锋利的尖头，或者换句话说，锋利的尖头后毗邻较浅或较钝的角度。例如，电极可以具有为套管尖端的远端末端，该套管尖端具有离轴10°达到几乎与针轴垂直的磨针(grind)。本发明的另一个方面是电穿孔装置，其能够将可耐受的电势输送至受试者的表皮组织，从而导致所述表皮组织中的细胞电穿孔，所述电穿孔装置包括电压发生器；以及，具有与电压发生器电连通的多个电极的阵列。多个电极中的每个电极以大约O. 5mm至大约
2.5mm的距离与每个相邻的电极间隔开；电压发生器通过电极将大约O. I伏至大约50伏的电势输送至表皮组织；并且电极被调适成以O. Imm或更小的深度穿透表皮组织。本发明的另一个方面是电穿孔装置，其能够将可耐受的电势输送至受试者的表皮组织，从而导致所述组织的细胞电穿孔，所述电穿孔装置包括电压发生器；以及，具有与电压发生器电连通的多个电极的阵列。多个电极中的每个电极以大约O. 5mm至大约2. 5mm的距离与每个相邻的电极间隔开；电压发生器将大约O. I伏至大约50伏的电场输送至阵列；并且，其中电极将通过视觉类比量表测量为接近无痛的可耐受的电势输送至表皮组织细胞。本发明的另一个方面是电穿孔装置，其能够将可耐受的电势输送至受试者的表皮组织，从而导致所述组织中的细胞电穿孔，所述电穿孔装置包括电压发生器；以及，具有与电压发生器电连通的多个电极的阵列。多个电极中的每个电极以大约O. 5mm至大约
2.5mm的距离与每个相邻的电极间隔开；电压发生器将大约O. I伏至大约50伏的电场输送 至所述阵列；并且，其中电极将由表皮组织细胞的最小程度损伤所证明的可耐受的电势输送至所述表皮组织细胞。在一些实施方案中，所述装置具有被调适成以O. Imm或更小的深度并且优选以大约O. Olmm至大约O. 04mm的深度穿透表皮组织的电极。优选地，电极以大约I. 5mm的距离与每个相邻的电极间隔开。此外优选地，电压发生器将大约I伏至大约15伏，更优选大约15伏的电势输送至表皮组织。在一些实施方案中，装置输送可耐受的电势，输送所述电势历经的持续时间在在大约5msec至大约250msec范围内变化，以及历经介于所述范围之中的持续时间范围与时间。在一些实施方案中，装置输送的可耐受的电势产生由所述受试者通过视觉类比量表测量所得到的接近无疼痛的疼痛评估。VAS是IOOmm长的水平线，该水平线上的Omm表示无疼痛，并且IOOmm表示最严重的疼痛。接近无痛是使用VAS方法产生的平均得分为大约< 20mm (95%置信区间内)，优选< IOmm (95%置信区间内)的得分。在一些实施方案中，装置输送的可耐受的电势是在受试者的所述细胞中产生最小程度的组织损伤，并且优选根据组织的组织病理学分析是不可见的组织损伤的电势。可以利用组织学分析来评估视觉损伤。组织学分析表明在表皮上层中的转染组织病理学分析是由豚鼠皮肤组织来进行。每个图面都示出已经通过MID电穿孔的组织。所有载玻片均已经用苏木精和伊红染色，并且在荧光显微镜(X20的物镜)下观察，以便观测GFP阳性。示出了治疗之后3天将动物处死后皮肤组织的组织病理学分析没有发现在用微创装置电穿孔后的相关组织损伤。换句话说，经过电穿孔的组织的组织病理学分析显示与未经过电穿孔的组织类似的结果。本发明的另一个方面是通过使用本文所述的电穿孔装置的电穿孔辅助输送将生物分子输送至受试者的表皮组织细胞的可耐受方法，所述方法包括将生物分子施用至细胞；使电极与表皮组织接触以使得电极穿透角质层并且位于基底层上方的层中；以及通过电极将可耐受的电势从电压发生器输送至表皮层细胞。在一些实施方案中，所述方法包括操纵电极以便以O. Imm或更小的深度并且优选以大约O. Olmm至大约O. 04mm的深度穿透表皮组织。所述阵列可在注射部位被手动地来回调整(或摆动)，以确保良好的接触并且导致电极尖端穿破角质层。优选地，输送步骤包括输送可耐受的电势，所述可耐受的电势产生由所述受试者通过视觉类比量表测量所得到的接近无疼痛的疼痛评估。此外，优选地，输送步骤包括输送可耐受的电势，所述可耐受的电势在受试者的所述细胞中产生最小程度的组织损伤。输送步骤优选地将大约O. I伏至大约15伏的电势输送至细胞。在一些实施方案中，所述方法包括输送步骤，该输送步骤包括历经在大约5msec至大约250msec范围内变化的持续时间，以及历经介于所述范围之中的持续时间范围与时间，并优选历经IOOmsec来输送电势。通用的电穿孔装置
提供电穿孔装置发生器或控制器，其可以在产生可耐受的电穿孔的低电场下将电能脉冲输送至表皮组织的角质层与基底层之间。优选地，电穿孔主要或唯一地在颗粒层发生。装置通过所提供的MIED，通过能够穿透角质层的针状电极来输送能量脉冲。在一些实施方案中，优选在所治疗的组织中保持恒定电流的本发明MIED的响应是通过皮肤EP装置中的反馈机制来完成，所述反馈机制防止组织受热、减少组织损伤、疼痛，并且有助于所提供的皮肤电穿孔技术的整体成功。在一些实施方案中，MIED可以进一步包括控制器；与控制器电连通的波形发生器；与控制器电连通的波形记录仪；以及，电连接至波形发生器的电池。控制器可以接收使用者的输入，根据输入来指示波形发生器将能量脉冲输送至所需组织，并且根据所输送的能量脉冲将数据传送至波形记录仪；并且，其中电池将电荷发送至波形发生器，电池是锂离子、镍金属氢化物、铅酸和镍镉电池。优选地，MIED(图3)是便携式的。便携式装置可以通过电池组来操作，并且适合于出于治疗或免疫目的的大规模免疫。MIED可以是所提供的电极阵列和施配器以及各种电场发生(或者电脉冲发生)部件或发生器的组合。在一些实例中，发生器可以选自已知电穿孔装置中的一种电穿孔装置，包括但是不限于以下装置在标题为“Constant Current Electrode Assembly forElectroporation”的美国专利号7，245，963中，以及尤其是美国专利号5，273，525、美国专利号6，110，161、美国专利号6，261，281、美国专利号6，958，060以及美国专利号6，939，862中描述的电穿孔装置。在更优选的实例中，发生器是用于CELLECTRA B EP装置和ElgenEP 装置(均来自 Inovio Pharmaceuticals, Inc.，Blue Bell, PA)的发生器。上述专利参考文件通过引用整体结合在此。电穿孔针各种已知的能够输送电荷的电穿孔针可以并入MIED中。电穿孔针是微创的，其包括非侵入性针。优选地，所述针是锋利的，例如一些实施例使用套管磨针以使得其可以穿透角质层并且到达颗粒层。套管末端可以经过研磨以便形成锋利的尖头，该尖头允许穿透角质层但是避免深层穿透。在一些实施例中，电极的远端具有尖端，该尖端通常是钝的，但是具有一个锋利的尖头，或者换句话说，锋利的尖头后毗邻较浅或较钝的角度。例如，电极可以具有为套管尖端的远端末端，该套管尖端具有离轴10°达到几乎与针轴垂直的磨针。阵列多种已知的针阵列形成物可以与当前MIED—起使用。所涵盖的这些针阵列形成物包括呈大体平面布置的任何数量的电极、任何几何型式的电极。优选地，电极经过布置均匀地分布在电极阵列上(或在电极所连接的基座或衬底上)。更优选地，针状电极以正方形样布置形式来进行布置，其中每个相邻的针状电极以大约相同的距离间隔开(除正方形边缘上的电极以外)。在一些实施方案中，阵列由以三角形型式等距离间隔开的至少三个针、以圆形型式等距离间隔开的至少四个针，或者以2X2、3X3、4X4、5X5或更大的方形型式来布置的针。或者，所述型式可以是长方形或菱形。优选地，针状电极以4X4针阵列布置形式来布置。4X4针阵列的实施例不于图I中。图2不出了 MIED外壳、阵列外壳和电极外壳的实施例。每个针状电极都可以150mm或更小、IOOmm至lmm、50mm至1 mm、40mm至lmm、30mm至1mm、20mm 至 1mm、10mm 至 1mm、5mm 至 1mm、5mm 至 2mm> 5mm 至 2mm 并且优选 2mm 并且更优选地I. 5mm的距离与每个相邻的针状电极间隔开。 电脉冲(所输送的电势)与典型EP方法相比，所提供的装置在更低的电压和电流下操作以便增强耐受性， 同时维持生物分子的成功转染(如由表达和随后免疫反应所证明的)。装置通常是与被设计来根据需要输送恒定电压、电流或两者组合的脉冲发生器一起使用。由MIED用于实现皮肤组织中的细胞转染的电脉冲是提供用于产生可耐受电穿孔所需低电能的任何已知的脉冲型式。在一些实施方案中,MIED以O. OlV至70V、0. OlV至50V、0. OlV至40V、0. OlV至30V、0. OlV 至 20V、0. OlV 至 15V、0. IV 至 70V、0. IV 至 50V、0. IV 至 40V、0. IV 至 30V、0. IV 至20V、0. IV至15V并且优选IV至15V的电压水平将电脉冲输送至所需组织。更优选地，当MIED的相邻电极间隔开大约2mm并且优选I. 5mm时，电压水平为15V。在一些实施方案中，MIED输送可耐受的电能，该电能的特征为电脉冲将以下电流输送至所需组织0. 2mA 至 100mA、0. ImA 至 100mA、0. 5mA 至 100mA、ImA 至 100mA、ImA 至80mA、ImA 至 60mA、ImA 至 50mA、ImA 至 40mA、ImA 至 30mA、但是优选 ImA 至 IOOmA,并且更优选ImA至30mA,并且更优选10mA。与MIED相关的可耐受电脉冲的特征都是每次脉冲的短持续时间，该短持续时间包括以下脉冲长度5msec 至 250msec、IOmsec 至 250msec 脉冲、20msec 至 250msec、40msec至 250msec、60msec 至 250msec、80msec 至 250msec、IOOmsec 至 250msec、20msec 至 200msec、40msec 至 200msec、60msec 至 200msec、80msec 至 200msec、IOOmsec 至 200msec、20msec 至150msec、40msec 至 150msec、60msec 至 150msec、80msec 至 150msec、IOOmsec 至 150msec、IOOmsec 至 140msec、IOOmsec 至 130msec、IOOmsec 至 120msec、IOOmsec 至 110msec,并且更优选 100msec。与MIED相关的可耐受电脉冲的特征还有低重复脉冲。重复进行由MIED输送的脉冲以便针对每次疫苗接种来输送以下数量的脉冲1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次，并且优选I至6次脉冲，并且更优选2次脉冲。施用疫苗+EP的组织MIED用于将实现电穿孔的电能输送至皮肤组织细胞以便辅助将生物分子输送至所述组织中的细胞，并且优选地辅助用DNA疫苗进行的疫苗接种。优选地，电极仅仅穿透作为恰好位于角质层下方并且位于基底层上方的活组织层的皮肤组织；并且优选地仅进入颗粒层中。通常使用Mantoux技术将生物分子输送至目标组织。在手柄中具有电子元件的电池供电型式(参见图3)
MIED可为便携式EP装置。提供便携式独立MIED装置，其中所述装置是手持式的并且其中电脉冲的电能来源是至少一个具有I. 5V与12V之间的电压电位的电池。便携式MIED可包括外壳，该外壳中含有所述电池、包括与所述电池电连通并且由所述电池供电的电路的电路板，以及至少一个能够保持IOOOuF与lOOOOOuF(微法拉)之间的电容的电容器。在相关的实施方案中，各部件(即，电池、电路以及电容器)通常在所述外壳中以线性或并排布置形式在空间上进行放置，以使得所述外壳可具有能够握在操作装置的人的手中的大体上长方形或圆柱形形状。例如，所述外壳具有近端和远端以使得所述长方形的圆柱体或较长部分位于所述近端与所述远端之间，并且其中所述电池位于所述外壳的所述近端内并且可经由可移除的罩盖从此末端来接近。在所述外壳的远端可安置有电导管，该电导管与所述电路电连通并且充当用于连接至用以完成电路的至少一个阴极和至少一个阳极的连接器，所述电路包括通过所述电容器与电路由所述电池来供电的电穿孔脉冲。所述外壳的远端还可包含与所述外壳相关联或作为所述外壳一部分的用于半永久性或永久性地连接头部组件和/或将所述头部组件拆卸的机构，所述头部组件本身包括以下任何一个用于容纳液体治疗剂的储槽；与所述储槽流体连通的孔口，所述液体可穿过所 述孔口被引导至身体组织；将来自所述储槽的所述液体移动穿过所述孔口的能量来源；以及，至少一个电极，该至少一个电极包括至少一个阳极和一个阴极。在一些实施方案中，便携式MIED能够向哺乳动物的皮肤组织输送能够对所述组织内的细胞进行电穿孔的电脉冲，所述电脉冲具有通常介于0. IV与70V之间、优选0. IV至50V、更优选IV至15V的电压。此外，装置能够输送所述场强度的电穿孔脉冲历经介于5毫秒与250毫秒之间，并且更通常介于10毫秒与100毫秒之间、更通常介于30毫秒与70毫秒之间并且更优选50毫秒的时间。另外，装置能够经由其微处理器来输送电穿孔电能的双极脉冲或单极脉冲，所述双极或单极脉冲可包括预定序列的多次脉冲，和/或电压成形脉冲，或甚至指数放电脉冲。这种可变脉冲能力提供电穿孔过程的潜在最佳化，包括电穿孔脉冲的电压、脉冲波形、持续时间以及极性的最佳化。
实施例本发明进一步在以下实施例中说明。应理解，这些实施例虽然指示本发明的优选实施方案，但只是为了说明而给出。从以上讨论和这些实施例，本领域技术人员可确定本发明的本质特征，并且在不背离本发明精神和范围的情况下，可作出本发明的各种变化和修改以便使其适应各种用途和条件。因此，根据以上描述，除了本文示出和描述的修改方案以夕卜，本发明的各种修改方案对于本领域技术人员来说是显而易知的。这些修改方案也意图落入附加权利要求的范围内。可进行试验来评估由本文所述的电穿孔装置产生的耐受性或减少的疼痛。在施行电穿孔时，研究人员可对每位患者起动秒表。每位患者将在经过训练的研究人员的监督下执行标准疼痛评估，并且患者将这些评估记录在日记册中，记录时间为电穿孔后5、10、15,20,30和45分钟、一小时以及一个半小时，然后在电穿孔后12小时内每小时记录一次，并且在电穿孔后16小时和24小时进行记录。患者使用分类量表和VAS来测量疼痛强度。如之前的说明，分类量表包括四个类别O =无疼痛，I =轻度疼痛，2 =中度疼痛，以及3 =重度疼痛。
VAS是IOOmm长的水平线，该水平线上的Omm表示无疼痛，并且IOOmm表示最严重的疼痛。使用这种IOOmm量表，接近无疼痛的得分是从指示无疼痛(无疼痛感觉)的得分算起20mm内的得分。在一些情况下，接近无疼痛是从无疼痛得分算起IOmm的得分。方法以下方法用于以下每个实施例中，在适当情况下进行讨论。微创装置设计-构造由以I. 5mm间隔的直径为O. 0175英寸的4X4镀金套针组成的电极阵列以便与 ELGEN1000 (Inovio Pharmaceuticals, Inc.，Blue Bell, PA)脉冲发生器或电池供电低压电路结合使用。质粒制剂-gWizGFP质粒购自Aldevron (Fargo ND)。NP质粒编码源自波多黎各8 (HlNl)流感菌株的全长NP。M2质粒编码源自新加勒多尼亚/99 (HlNl)流感菌株的全长M2 ο构建体具有突变的核祀向信号并且通过GeneArt (Germany)来最佳化与合成。所有质 粒在注射之前在I XPBS中进行稀释。将SYNC0N (合成DNA构建体)流感疫苗质粒混合物(100微克/质粒)在注射之前在IXPBS中进行稀释，所述混合物含有pGX2005(SYNC0N 疫苗构建体，其编码HlHA的共有序列)和pGX2009 (SYNC0N 疫苗构建体，其编码猪HlHA的共有序列)。动物-雌性Hartley豚鼠(品系代码051)、雌性New Zealand兔和雌性Balb C小鼠购自Charles River实验室。雌性Wistar大鼠购自Charles River实验室。雌性约克郡猪购自S&S Farm’ s (Ramona, CA)。豚鼠、大鼠、兔和小鼠豢养于BioQuant (San Diego,CA)。雄性(4)和雌性(4)称猴(穆拉托称猴(Macaca mulatto))单独豢养于BIOQUAL, Inc.(Rockville, MD)，并且自由取用食物和水。在实验之前，使猕猴在检疫中适应新环境至少30天。所有动物根据机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee ;IACUC)的标准来豢养和操作。动物预备-毛发去除之后，对Hartley豚鼠观察到的GFP报道基因结果与先前实验中对IAF无毛豚鼠观察到的结果相同。由于毛发去除似乎对于所得转染没有影响并且由于成本方面的考虑，我们选择在Hartley动物中进行其余部分的研究。在治疗之前24小时，将Hartley豚鼠剃毛并且将残巷通过脱毛霜(dilapatory cream) (VEET)来去除。将小鼠、大鼠、兔、猪和猕猴在治疗之前剃毛。DNA注射-猕猴通过注射氯胺酮来镇静。所有其它动物通过吸入异氟醚来镇静。向所有动物皮内注射(Mantoux方法-29号胰岛素针)50 μ I的含有所需剂量质粒的I XPBS。向小鼠肌肉内注射50 μ I的含有所需剂量质粒的IXPBS至四头肌。向猕猴肌肉内注射400 μ I的含有所需剂量质粒的IXPBS至四头肌。添加空载体以便维持每一组的相等DNA量。皮肤装置电穿孔-注射DNA之后立即将皮肤装置施加至皮肤注射部位。将阵列在注射部位处“摆动”以便确保良好接触并且通过来自Elgen 1000或低电压电池电路的脉冲发生来实现电转移。所使用的参数是IOOrns持续时间的三次15伏特脉冲。肌肉电穿孔-M注射之后立即通过将具有4mm电极间距的27G、2针阵列插入被注射的肌肉部位来执行电穿孔。使用Elgen 1000来输送各自持续60ms的两次125V/cm脉冲。对皮肤进行成像-在终止之后，从死后的动物中取出皮肤样品或活检并且存放在冰上直到在480nm下用OV 100成像显微镜(Anti Cancer Inc. , San Diego, CA)成像。
组织病理学-在终止之后，从死后的动物中取出皮肤样品或活检并且立即保存在10%中性缓冲福尔马林中并且送至Pacific Pathology, San Diego, CA进行处理和组织病理学分析。将适当组织予以修整、处理、包埋于石蜡中、以大约5μπι进行切片，并且用苏木精和伊红染色。所得载玻片由委员会认证的病理学家来检查。在Burnham Institute, SanDiego, CA，使用具有IOX物镜的Zeiss Axioplan显微镜观测切片。检测经过免疫的小鼠血清中的NP抗体-针对NP的抗体反应是通过ELISA，使用来自经过免疫的小鼠的血清来评估。将小鼠在最后一次免疫之后两周做眼球后放血。在4°C下，用 NP (5 μ g/mL, Imgenex IMR-274)涂布 Nunc Maxi-Sorp Immuno 板过夜。未结合的抗原通过使用具有O. 05%吐温-20的PBS的自动板清洗液来从板上清洗掉。在37°C下，通过添加具有O. 5%834的200此PBS来针对非特异性结合将板阻断一小时。如上清洗之后，将血清在具有O. 2% BSA和O. 05%吐温-20的PBS中I : 50稀释并且添加至第一孔中。通过对每个孔I : 3至I : 5稀释来进行连续稀释。在清洗之前，在37°C下将血清孵育两小时。将抗小鼠 IgG-生物素(B9904-5ml ；Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) I 10000 稀释并且将50 μ L添加至每个孔并且在清洗之前，在37°C下孵育一小时。随后将I : 1000稀释的50μ L链霉抗生物素蛋白-HRP (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA)添加至每个孔，并 且在清洗之前在37°C下孵育一小时。通过添加50 μ L HRP底物(Ρ-9187，Sigma-Aldrich)并且在室温下在黑暗中孵育10分钟，然后在450nm下读取光密度(OD)来完成最终步骤。如果OD比来自原始小鼠血清的OD高三倍，那么读数被认为是阳性的。结果以终点效价来表示，即OD大于或等于比原始血清高三倍的最后一次稀释。ELISpot分析-免疫之后两周，将来自每一组小鼠的脾细胞分离。使用RBC溶解缓冲液(eBioscience)将单一细胞混悬液中的红细胞予以清除。ELISP0T分析试剂盒购自R&DSystems。用抗小鼠干扰素(IFN)I单克隆抗体涂布96孔ELISP0T板(Millipore)。在4°C下孵育过夜之后，根据来自R&D Systems的实验方案将孔清洗并用阻断缓冲液来阻断。将来自每一组的汇集脾细胞添加至孔中并且用I μ g/mLNP147 (TYQRTRALV Biosynthesis Inc.)孵育48h。然后遵循如制造商描述的实验方案将板清洗并显影。通过Cellular TechnologyLtd对点计数并分析。鼻内流感激发-将每组10只小鼠的各组中的Balb/c小鼠在第0、3和6周进行免疫。将小鼠免疫在第O周进行初免30+30ug，在第3周进行加强30+30ug，在第10周进行加强100+100ug。在第12周，使用BSL IV实验方案，在The National Microbiology实验室，Public Health Agency of Canada, Winnipeg, MB, Canada 根据其伦理委员会的伦理准则进行流感激发实验。将100XLD50剂量的H5N1A/越南/1203/04菌株用于鼻腔激发。然后，在激发之后每天监测小鼠的存活和体重进行21天。HAI分析-将动物放血并且立即将血清样品存放于干冰上，然后装运至BI0QUAL，Rockville,MD以便处理。将血清用受体破坏酶通过将I份血清用3份酶稀释来进行处理，并且在37°C水浴中孵育过夜。将酶在56°C下孵育30分钟来灭活，随后添加6份磷酸盐缓冲盐水以便进行1/10的最终稀释。HAI分析如前所述使用4个血凝单位的病毒和1%红细胞，在V形底部96孔微量滴定板中执行。用于HAI分析的病毒从CDC的流感分支获得。实施例I使用微创装置的电穿孔产生加强的报道基因转染
微创电极装置(MIED)被设计来供DNA疫苗输送使用。这种新型施配器由呈4X4阵列型式的以I. 5_间隔的具有套管研磨部分的镀金不锈钢针状电极组成(电极的远端具有钝的尖端，所述尖端具有锋利的尖头)(图4a和图4c)。四个电极的交替行可以相反极性进行发射(fired):阳性比阴性。电极被接纳于塑料手柄内的电插座中，以使得每个电极可被单独地定址以便实现交替的发射模式。装置被设计来只接触皮肤表面并且不直接穿透组织。在适当接触后，电极的锐度可使得装置阵列破坏角质层屏障层，确保一致的阻抗测量值，从而产生可重复的电穿孔治疗。原型装置构建有连接线绳以便连接至脉冲发生器(图4b)。研究了使用这种新型微创式针状电极装置(MIED)进行成功转染和免疫反应所需的电压参数的下限。使用Mantoux技术用50 μ I的lmg/ml GFP质粒注射豚鼠侧腹上的独立皮肤部位，并且立即使用设定在低至15V的电压下的MIED进行脉冲处理(图5A)。在治疗之后8小时，可见加强和可重现的GFP转染，而在第3天则达到最高点。在单独GFP质粒注射之后，可检测到最小程度的转染或检测不到GFP转染(数据未示出)。虽然一系列电参数和电压产生了 GFP转染，但是15伏下的脉冲更具有可重现性(数据未示出)。遵循标准 化条件下的荧光显微术通过正性像素计数来量化和评估可重现性。在10-15伏特参数下获得被界定区域内的最一致的像素计数量。实际GFP转染型式表现为在与每个电极进行接触的点周围的明显不同的“岛”(图5b)。在低电压下，有效EP较浅并且高度定位于电极尖端周围，因此，在表皮的基底层下方不存在有意义的转染。为了确保加强的转染并非豚鼠特异性现象，在一系列物种中进行了 GFP定位。小鼠、兔、大鼠和猪上的皮肤部位用50 μ I (在小鼠中30 μ I)的lmg/ml GFP质粒注射并且立即使用MIED进行脉冲处理。在电穿孔之后，所有物种表明了加强的皮肤GFP转染，而在单独GFP质粒注射之后检测到最小程度的转染或检测不到转染(图6)。在所有物种中，在所有电穿孔皮肤样品中检测到强GFP阳性。然而，只有兔样品表明与在豚鼠样品中观察到型式明显不同的“岛”型式(图5)。大鼠、小鼠和猪皮肤上的GFP定位表现得更具有扩散性。大鼠、兔与猪之间的实际转染面积是相似的(大约4_2)，因为该面积随着注射微泡大小而变。由于注射体积较小，因此小鼠皮肤上的转染面积稍微较小。在小鼠图面中，示出小鼠的整个皮肤以使得可了解到相对大小。GFP阳性细胞只在大鼠、兔和猪样品中的皮肤表面上被检测到。在这些样品的下方未观察到GFP信号。小鼠皮肤的下方似乎具有阳性GFP信号。然而，这似乎是与皮肤样品的薄度相关。此数据暗示出MIED可在较小和较大动物模型中有效地将质粒转移至皮肤。实施例2使用微创装置的电穿孔-组织学分析表明在表皮上层中的转染为了研究通过MIED进行的电穿孔在细胞水平下的效果，执行组织学分析。豚鼠上的部位用50ul的lmg/ml GFP质粒注射并且立即使用MIED进行脉冲处理的。活检样品在治疗后3天加以取出、固定、做石蜡切片并且进行H&E染色(未示出载玻片)。在用微创装置进行电穿孔之后，病理学分析未显示相关的组织损伤。高功率显微术显示大部分GFP转染在表皮的颗粒层细胞层中发生(未示出载玻片)。还在基底层中检测到GFP阳性细胞。相比之下，只在接受单独GFP质粒注射的活检样品中检测到少许GFP阳性细胞。这与已经接受电穿孔的组织的活检样品中观察到的加强信号形成直接对比。基于相对于单独DNA的GFP阳性细胞的数量，表达增强的视觉估算将超过100-1000倍。实施例3使用微创装置的电穿孔-在小鼠中产生加强的细胞反应并且提供针对致死激发的100%保护将小鼠用编码NP和M2流感抗原的DNA进行免疫在第O周进行初免30+30ug，在第3周进行加强30+30ug，在第10周进行加强100+100ug。来自波多黎各/39菌株的匹配NP抗原和来自新加勒多尼亚/99菌株 的匹配M2抗原最佳化,合成,然后克隆至临床认可的哺乳动物表达载体PMB76. 5的骨架中。选择NP和M2e抗原以便主要评估细胞免疫性。这些蛋白质未能够诱导中和抗体反应。小鼠群组用微创皮肤装置或用Elgen 1000肌肉内装置(InovioPharmaceuticals, Inc.，Blue Bell, PA)进行电穿孔。在所有小鼠中观察到小鼠模型中的有效力的细胞和体液反应的诱导，如抗原特异性T细胞ELISPot分析和抗体效价所测量。对于MIED，抗原特异性CTL反应是针对NP的200+/-57. 9SFU/10~6个脾细胞，并且对于頂，抗原特异性CTL反应是针对NP的85+/-36. 3SFU/10~6个脾细胞(图7A)。经过皮内电穿孔的那些动物显示较高效价和细胞反应，但是在统计学上是不显著的。为了尝试确定是否诱导的免疫反应能够影响感染，经由鼻内(i.n.)接种用致命剂量的流感A/H5N1/越南/1203/04来激发小鼠(图7B)。流感的VN/1203/04 (H5N1)菌株已知可引起快速发病和死亡。虽然在第11天100%的雏期小鼠出现感染，但是100%的用MIED免疫的小鼠受到针对发病和死亡的保护直至第15天(实验结束)。同样地，在第15天，90 %的IM免疫的阳性对照动物存活。实施例4使用微创装置的电穿孔产生体液免疫原性和保护性HI效价豚鼠由于极薄的皮肤结构和紧邻下方肌肉，因此很难以将小鼠的真皮作为目标。出于这个原因，通常在小鼠中诱导的免疫反应是皮肤和肌肉的组合。因此，在具有界限更分明的皮肤结构的较大动物模型-豚鼠中测试MIED。通过经由MIED的皮内电穿孔，用之前描述的共有SYNC0N 流感疫苗对豚鼠进行免疫。用在IXPBS中稀释的体积为50 μ I的疫苗质粒混合物(100微克/质粒)对动物进行疫苗接种，所述混合物含有PGX2005 (SYNC0N 疫苗构建体，其编码HlHA的共有序列)和PGX2009 (SYNC0N 疫苗构建体，其编码猪HlHA的共有序列)。两次免疫之后两周，每个动物显现超过I : 40的针对HlNl大流行性墨西哥/2009菌株，和针对Α/Η3Ν2布里斯班菌株，以及在一定程度上针对Α/Η5Ν1越南/2005菌株的加强的HAI效价(图8)。猕猴通过皮内(MIED)或肌肉内电穿孔(Elgen 1000)，用体积为50 μ I的之前描述的共有流感疫苗质粒混合物(iooyg/质粒)对猕猴进行疫苗接种，所述混合物含有PGX2005 (SYNC0N 疫苗构建体，其编码HlHA的共有序列)和pGX2009 (SYNC0N 疫苗构建体，其编码猪HlHA的共有序列)。在用MIED皮内免疫时，在两次免疫之后，四只动物中的四只都显现超过I : 40的针对HlNl/墨西哥/2009菌株，和针对A/H1N1/新加勒多尼亚菌株的HAI效价(图9)。
实施例5微创装置的耐受性研究为了评估EP的疼痛水平，将微创EP装置施加至表皮层的角质层与基底层之间。用经过麻醉的动物进行测试的视觉反应不会产生在使用较高功率脉冲或侵入性电极阵列时所观察到的肌肉抽搐，同时表明报道基因的有效转染和抗原性质粒的免疫反应。高达15V的脉冲电压和高达大约30mA的电流只产生轻度感觉，同时在豚鼠和恒河猴中诱导针对流感的保护性免疫反应。与肌肉内装置的侵入性阵列相比，使用侵入性皮肤装置阵列来施加体内EP已经展示明显减少的疼痛。预期MIED引起疼痛的甚至更大的减少。在ID注射O. 9%盐水至颗粒层中之后，使用MIED阵列施加体内EP。向患者的颗粒层中注射O. 15mL盐水，然后使用CELLECTRA 2000(适应性恒定电流装置(AdaptiveConstant Current Device)或替代地，Elgen 1000 装置，Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA)来执行EP。EP参数为15V、100msec脉冲，总共3次脉冲。对于每个受试者，注射部位疼痛将通过使用在EP之后立即确定的视觉类比得分(VAS)来评估。
权利要求
1.一种电穿孔装置，其能够将可耐受的电势输送至受试者的表皮组织层的角质层与基底层之间，从而导致所述组织中的细胞电穿孔，所述电穿孔装置包括 电压发生器；以及 具有与所述电压发生器电连通的多个电极的阵列； 其中所述多个电极中的每个电极以大约O. 5mm至大约2. 5mm的距离与每个相邻的电极间隔开； 所述电压发生器通过所述电极将大约O. I伏至大约50伏的电势输送至所述表皮组织；并且 所述电极的远端具有钝的尖端，所述尖端具有锋利的尖头从而允许所述电极穿透表皮组织层到达角质层与基底层之间，并且所述尖端将所述电势从所述电压发生器输送至所述表皮组织。
2.一种电穿孔装置，其能够将可耐受的电势输送至受试者的表皮组织，从而导致所述表皮组织中的细胞电穿孔，所述电穿孔装置包括 电压发生器；以及 具有与所述电压发生器电连通的多个电极的阵列； 其中所述多个电极中的每个电极以大约O. 5mm至大约2. 5mm的距离与每个相邻的电极间隔开； 所述电压发生器通过所述电极将大约O. I伏至大约50伏的电势输送至所述表皮组织；并且 所述电极被调适成以O. Imm或更小的深度穿透所述表皮组织。
3.一种电穿孔装置，其能够将可耐受的电势输送至受试者的表皮组织，从而导致所述表皮组织中的细胞电穿孔，所述电穿孔装置包括 电压发生器；以及 具有与所述电压发生器电连通的多个电极的阵列； 其中所述多个电极中的每个电极以大约O. 5mm至大约2. 5mm的距离与每个相邻的电极间隔开； 所述电压发生器将大约O. I伏至大约50伏的电场输送至所述阵列；并且其中所述电极将通过视觉类比量表测量为接近无痛的可耐受的电势输送至所述表皮组织的所述细胞。
4.一种电穿孔装置，其能够将可耐受的电势输送至受试者的表皮组织，从而导致所述表皮组织中的细胞电穿孔，所述电穿孔装置包括 电压发生器；以及 具有与所述电压发生器电连通的多个电极的阵列； 其中所述多个电极中的每个电极以大约O. 5mm至大约2. 5mm的距离与每个相邻的电极间隔开； 所述电压发生器将大约O. I伏至大约50伏的电场输送至所述阵列；并且其中所述电极将由所述表皮组织的所述细胞的最小程度损伤所证明的可耐受的电势输送至所述表皮组织细胞。
5.如权利要求1、3和4中任一项所述的装置，其中所述电极被调适成以O.Imm或更小的深度穿透所述表皮组织。
6.如权利要求I至4中任一项所述的装置，其中所述电极被调适成以大约O.Olmm至大约O. 04mm的深度穿透所述表皮组织。
7.如权利要求1、2和4中任一项所述的装置，其中所述可耐受的电势产生由所述受试者通过视觉类比量表测量所得到的接近无疼痛的疼痛评估。
8.如权利要求I至3中任一项所述的装置，其中所述可耐受的电势是在所述受试者的所述细胞中产生最小程度组织损伤的电势。
9.如权利要求I至8中任一项所述的装置，其中所述电极以大约I.5mm的距离与每个相邻的电极间隔开。
10.如权利要求I至9中任一项所述的装置，其中所述电压发生器将大约I伏至大约15伏的电势输送至所述表皮组织。
11.如权利要求I至10中任一项所述的装置，其中所述电压发生器以在大约ImA至大约50mA范围内变化电流将电势输送至所述表皮组织。
12.如权利要求I至10中任一项所述的装置，其中所述电压发生器历经在大约5msec至大约250msec范围内变化的持续时间将电势输送至所述表皮组织。
13.—种通过使用如权利要求I所述的电穿孔装置的电穿孔辅助输送将生物分子输送至受试者的表皮组织细胞的可耐受方法，所述方法包括 将所述生物分子施用至所述细胞； 使所述电极与所述表皮组织接触以使得所述电极穿透所述角质层并且位于所述基底层上方的层中；以及 通过所述电极将可耐受的电势从所述电压发生器输送至所述表皮层的所述细胞。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述接触步骤包括操纵所述电极以便以O.Imm或更小的深度穿透所述表皮组织。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述接触步骤包括操纵所述电极以便以大约.O.Olmm至大约O. 04mm的深度穿透所述表皮组织。
16.如权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述输送步骤包括输送可耐受的电势，所述可耐受的电势产生由所述受试者通过视觉类比量表测量所得到的接近无疼痛的疼痛评估。
17.如权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述输送步骤包括输送可耐受的电势，所述可耐受的电势在所述受试者的所述细胞中产生最小程度组织损伤。
18.如权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述输送步骤包括将大约O.I伏至大约15伏的电势输送至所述细胞。
19.如权利要求13至18中任一项所述的方法，其中所述输送步骤包括以在大约ImA至大约50mA范围内变化的电流将电势输送至所述细胞。
20.如权利要求13至19中任一项所述的方法，其中所述输送步骤包括历经在大约5msec至大约250msec范围内变化的持续时间来输送电势。
全文摘要
一种用于输送疫苗的新型电穿孔装置，该装置可有效地产生保护性免疫反应和对受试者的可耐受输送(或接近无疼痛)；以及，使用所述装置以接近无疼痛的方式针对各种传染病和癌症类型对受试者进行疫苗接种的方法。
文档编号A61N1/32GK102905755SQ201180011473
公开日2013年1月30日 申请日期2011年3月1日 优先权日2010年3月1日
发明者K.布罗德里克, J.麦科伊, S.V.坎梅雷, 林峰, R.克杰肯 申请人:因诺维奥制药公司