专利名称：阻断hiv病毒复制及向宿主细胞dna整合的复合生物制剂的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物技术以及医药学领域；更具体地，本发明涉及阻断HIV病毒复制及向宿主细胞DNA整合的新型复合生物制剂。
背景技术：
艾滋病,又称获得性免疫缺陷综合症(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS),是由人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)引起的一种病死率达100%的传染性疾病，于1981年在美国首先被确认。在过去的30年中，全球至少已有2500万人死于该传染病，此外艾滋病的感染者超过6000万人。据国家卫生部最新公布的数据，我国艾滋病毒感染者约为42.9万人，其中艾滋病发病者超过16万人。尽管近年来有关艾滋病的研究已有长足的进步，特别在艾滋病传播途径和预防方法方面取得了较大的进展，全球艾滋病发病率呈下降趋势，但对于艾滋病病人，特别是艾滋病发病的受试者的临床治疗仍缺乏根本性的治疗方法和药物。直至今日，由于HIV病毒存在的高度变异性，科学家仍未研制出切实有效的艾滋病疫苗，针对HIV的系列拮抗制剂也不能真正对病毒进行有效的杀灭作用。2010年7月在奥地利维也纳召开的第18届世界艾滋病大会上，与会代表一致认为尽管全球艾滋病形势继续恶化的总势头正在得到抑制，但人类最终战胜艾滋病仍需付出巨大努力，并呼吁急需增加投入，以继续与艾滋病作斗争。已研究证实，HIV为逆转录病毒，可通过直接和间接作用，致使人⑶4+T淋巴细胞功能受损和大量破坏，导致机体细胞免疫缺陷。CD4+T淋巴细胞受损方式主要包括:(I)病毒直接损伤:HIV感染宿主免疫细胞后以每天产生IO9 IOltl颗粒的速度繁殖，并直接使CD4+T细胞溶解破坏。病毒复制产生的中间产物及gp 120、vpr等可诱导细胞凋亡。(2)非感染细胞受累:感染HIV的⑶4+T细胞表面gpl20表达，与未感染的⑶4+T细胞的CD4分子结合，形成融合细胞使膜通透性改变，细胞溶解破坏。(3)免疫损伤:gpl20与未感染HIV的⑶4+T细胞结合成为靶细胞，被⑶8+细胞毒性T细胞(CTL)介导的细胞毒作用及抗体依赖性细胞毒(ADCC)作用攻击而破坏，致CD4+T细胞减少。(4)来源减少:HIV可感染骨髓干细胞，使⑶4+T细胞产生减少。HIV外膜蛋白gpl20可抑制原始T淋巴细胞向⑶4+T细胞转化，导致⑶4+T细胞减少。表现为对可溶性抗原识别缺陷，细胞因子产生减少，B细胞辅助能力降低，并可丧失迟发型免疫反应等。HIV病毒感染宿主的过程主要分以下几个阶段:[I]病毒外壳蛋白gpl20与人体淋巴细胞⑶4-CCR5的结合，进而与宿主细胞融合；[2]通过融合进入宿主细胞后，HIV病毒经逆转录成为DNA ； [3]非整合的线性DNA进入宿主细胞核与宿主DNA发生整合；[4]整合后的DNA再以mRNA方式重新进入宿主细胞胞浆；[5]在宿主细胞浆内重新合成组装成新的HIV病毒；[6]HIV病毒 成熟后自宿主细胞(淋巴细胞)释放，成熟的病毒颗粒再感染新的细胞。
围绕上述HIV感染周期，人们已研制了大量的抗艾滋病药物，截至目前为止，美国食品药品管理局(FDA)，已批准进入临床应用的药物包括核转录蛋白酶抑制剂、非核转录蛋白酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、病毒整合酶抑制剂、病毒融合抑制剂，以及抑制病毒进入宿主细胞等六大类，共30种药物。尽管上述药物对抑制艾滋病的发生和发展具有较好的效果，可延缓HIV病毒携带者发展成为艾滋病病人的周期，但仍然无法从根本上消除携带者体内的HIV病毒，对于已经发展成为艾滋病的病人无任何明显疗效。迄今为止，HAART(高效抗逆转录病毒治疗，Highly Active Ant1-Retroviral Therapy),也即是所谓的鸡尾酒疗法是目前公认的抗艾滋病一线药物，尽管HAART可延长HIV感染者的生命周期，但对艾滋病病人的病死率的降低仍无有效作用，且受试者需终身服药，一旦停用，2周内病情势必反弹，此夕卜，高昂的价格和明显的药物毒副作用仍然是其难以回避的问题。鉴于以上本技术领域的技术缺陷，研制真正能对艾滋病病人具有根本性治疗效果的药物，乃是当前急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种涉及阻断HIV病毒复制及向宿主细胞DNA整合的新型复合生物制剂。本发明的另一目的在于提供所述符合生物制剂的制备方法和用途。在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，所述的多肽是:(I)SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；(2)⑴多肽的保守性变异体，其是SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过1_2个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的， 且具有(I)多肽功能的由(I)衍生的多肽。在一个优选例中，所述的多肽的N端还包括一药学或生理学上可接受的酸性基团。在本发明的另一方面，提供一种分离的多肽，所述的多肽是:(a) SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；(b) (a)多肽的保守性变异体，其是SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过1_2个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。在一个优选例中，所述的多肽的N端还包括一药学或生理学上可接受的酸性基团⑶。在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码前面所述的多肽。在本发明的另一方面，提供所述的多肽或所述的多核苷酸的用途，用于制备预防、改善或治疗获得性免疫缺陷综合症(艾滋病)的药物。在一个优选例中，所述的药物还用于:抑制人免疫缺陷病毒(HIV)的复制；和/或抑制人免疫缺陷病毒(HIV)与宿主的整合。在本发明的另一方面，提供一种用于预防、改善或治疗获得性免疫缺陷综合症的药物组合物，所述的药物组合物含有:SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异体；和/或
SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异体。在一个优选例中，所述的药物组合物同时含有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异体以及SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异体。在另一优选例中，所述的药物组合物还含有:药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体是生理盐水或注射用水。在本发明的另一方面，提供一种用于预防、改善或治疗获得性免疫缺陷综合症的药盒，所述的药盒中包括:容器1，SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异体；和容器2，SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异体。在一个优选例中，所述的药盒中包括:容器1，SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异体以及药学上可接收的载体；和容器2，SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异体以及药学上可接收的载体。在本发明的另一方面，提供一种预防、改善或治疗获得性免疫缺陷综合症的方法，包括:将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异体和SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异体联合给药于需要预防、改善或治疗获得性免疫缺陷综合症的对象。 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1、受试者PBMC与正常人PBMC共培养第3天、第6天和第10天时，培养上清中HIV-1 P24抗原检测结果。
具体实施例方式本发明人经过深入的研究，根据人免疫缺陷病毒(HIV)的致病机制，以及HIV病毒感染周期，设计并合成了 2条多肽，所述多肽以复合给药的方式给予受试者，可极其有效地阻断HIV病毒复制以及HIV病毒与宿主细胞的整合，是迄今为止唯一主动治疗获得性免疫缺陷综合症(艾滋病)病人获得成功的药物。术语如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的多肽(蛋白或肽链)”是指多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
如本文所用，“受试者”、“对象”、“病人”或“患者”指需要进行诊断或治疗的任何目标，尤其是哺乳动物对象，特别是人。特别受关注的是那些易受或已受HIV病毒感染的对象。如本文所用，“核酸”和“核酸序列”指聚合形式的任意长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)。它包括(但不限于)单链、双链的DNA或RNA，基因组DNA和cDNA。如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂或稀释剂。如本文所用，“有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如非人灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构
成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上
由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。多妝及其编码基因目前现有技术中，针对HIV病毒感染疾病的还没有特效药。因此，本发明人根据HIV的致病机制，以及HIV病毒感染周期，设计并合成了 2条多肽。所述的多肽可有效地阻断HIV病毒复制以及HIV病毒 与宿主细胞的整合，对于HIV病毒感染疾病的治疗具有显著疗效。作为本发明的优选方式，所述的2条多肽分别具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽；优选合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明还包括本发明所述的多肽的氨基酸序列的多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的SEQ ID N0:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，术语“本发明的多肽”或“所述的多肽”指具有SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列的多肽。该术语还包括具有与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽相同功能的、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):一个或多个(通常为1-5个，更佳地1-3个，最佳地1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为10个以内，较佳地为5个以内，更佳地为3个以内，更佳地为2个以内，如I个)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或少数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体。本发明还提供了其他多肽，如包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽或其片段的融合蛋白。发明还提供SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽或多肽的类似物。这些类似物与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽 。在本发明中，“SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多I个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生，这类相近氨基酸的替换是本领域公知的。表I
权利要求
1.一种分离的多肽，其特征在于，所述的多肽是: (1)SEQID NO:1所示氨基酸序列的多肽； (2)(I)多肽的保守性变异体，其是SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过1_2个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(I)多肽功能的由(I)衍生的多肽。
2.一种分离的多肽，其特征在于，所述的多肽是: (a)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽； (b)(a)多肽的保守性变异体，其是SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过1_2个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。
3.如权利要求1或2所述的多肽，其特征在于，所述多肽的N端还包括一药学或生理学上可接受的酸性基团。
4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1或权利要求2所述的多肽。
5.权利要求1和2所述的多肽或权利要求3所述的多核苷酸的用途，用于制备预防、改善或治疗获得性免疫缺陷综合症的药物。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的药物还用于 抑制人免疫缺陷病毒的复制；和/或 抑制人免疫缺陷病毒与宿主的整合。
7.一种用于预防、改善或治疗获得性免疫缺陷综合症的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有: 权利要求1所述的多肽；和/或 权利要求2所述的多肽。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物同时含有权利要求I所述的多肽和权利要求2所述的多肽。
9.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还含有:药学上可接受的载体。
10.一种用于预防、改善或治疗获得性免疫缺陷综合症的药盒，其特征在于，所述的药盒中包括: 容器I，权利要求1所述的多肽；和 容器2，权利要求2所述的多肽。
全文摘要
本发明涉及阻断HIV病毒复制及向宿主细胞DNA整合的复合生物制剂。本发明人根据HIV病毒的致病机制，以及HIV病毒感染周期，设计并合成了两条多肽，所述多肽以复合给药的方式给予受试者，可极其有效地阻断HIV病毒复制以及HIV病毒与宿主细胞的整合，是迄今为止唯一主动治疗获得性免疫缺陷综合症病人获得成功的药物。
文档编号A61K38/16GK103159836SQ201110427788
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月19日 优先权日2011年12月19日
发明者李磊, 李丹, 钱斌 申请人:上海汉明波生物科技有限公司