假型淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒糖蛋白的慢病毒载体的利记博彩app

专利名称：假型淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒糖蛋白的慢病毒载体的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种假型淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒糖蛋白的慢病毒载体，属于分子生物技术领域。
背景技术：
逆转录病毒载体在新技术中的应用越来越多，例如基因工程中的基因转移、医学研究以及基因治疗等领域(例如C. Baum等人1998年在Gerson & Lattime学术出版社出版的《肿瘤学术讨论基因治疗对于癌症，翻译方法从临床前期研究到临床实施》)。大部分逆转录病毒是来源于小鼠白血病病毒(MLV)。他们含有保持病毒完整性必需的所有LTR区序列以及负责包装功能的Ψ元件。而编码病毒蛋白的区域则被替换为研究人员想要转入人类细胞的外来基因以及控制序列。这些载体在辅助细胞系(也称为包装细胞系)中表达，这些细胞含有逆转录病毒基因组的完整拷贝。上述细胞系能够合成病毒复制和感染所需的所有蛋白，但是由于它们缺乏Ψ元件，所以不能将病毒的基因组RNA包装到病毒蛋白颗粒中。如果逆转录病毒载体插入到辅助细胞基因组中并发生转录，含有Ψ元件的转基因mRNA能够形成并与辅助病毒蛋白作用,然后被包装到病毒颗粒中。不含病毒任何遗传信息的重组病毒颗粒通过它们的表面蛋白被细胞吸收。病毒衣壳在细胞质中被分解，而转基因RNA被转换为双链DNA并整合到宿主细胞基因组中。这一系统的优势在于基因的整合能够通过细胞分裂稳定地遗传给下一代细胞。而它的劣势在于整合的位点是随机的。逆转录病毒载体采用一种稳定的共轭整合(比如说不对载体基因组序列进行重组和重排)，从而使转入的基因能够长期表达。除上述方法外，目前能够做到基因长期表达的只有游离疱疹病毒载体和腺病毒载体(AAV载体)。而后者的包装系统(包装细胞系)还没有得到优化。此外，腺病毒载体包装能力较弱(腺病毒载体大概能包装5kb遗传信息，而逆转录病毒载体能包装10_12kb)。除了被转移 的基因外，包装系统还表达含有逆转录病毒顺式元件的载体基因组。载体基因组的转录并不能编码逆转录病毒的蛋白，而是在gag-、pol-和env-基因产物的帮助下形成一个有侵袭能力但不能自我复制的病毒，插入到包装细胞系中。这一病毒能够作为逆转录病毒载体，将转移整合到载体基因组中的基因至目标细胞中，而不会在目标细胞中出现新的载体复制现象。换句话说，病毒载体只能感染目标细胞但是不会在目标细胞中进一步复制。逆转录病毒包装系统的开发已经有了很大成果并能在GMP条件下大量生产不具备病毒复制能力的载体上清。基于小鼠白血病病毒的载体(MLV vectors)已经多次用于临床试验(P. Chu et al.，J. Mol. Med. 76 (1998) 184-192) ·两种基本的逆转录病毒包装体系在之前的文献中已经有报道(J.M. Wilson，Clin.Exp.1mmunol. 107 Supp1.1(1997) 31-32 ；C. Baum et al. 1998)，Ioc cit.)。MLV包装细胞系含有逆转录基因gag (图1)，但是pol和env基因以及包装逆转录病毒 RNA 需要的序列被敲除了 (C. Baum et al.，(1998)，loc. cit.)。
另一种已知的包装系统来源于慢病毒(R. Carroll et al.,J. Virol. 68 (1994) 6047-6051 ；P. Corbeau et al. , Proc. Natl. Acad. Sc1. USA93 (1996) 14070-14075 ；L. Naldini et al.，Science 272 (1996) 263-267 ；C. Parolinet al. , J. Virol. 68 (1994) 3888-3895 ；J. Reiser et al. , Proc. Natl. Acad. Sc1. USA93 (1996) 15266-15271 ；J. H. Richardson et al.，J. Gen. Virol. 76(1995)691-696 ；T. Shimada et al. , J. Clin.1nvest. 88 (1991) 1043-1047).慢病毒是一种复杂的逆转录病毒，它除了表达gag，pol和env基因产物外还表达一系列调控基因。现有慢病毒包装系统主要来源于人免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。慢病毒包装系统的组成与MLV载体大致相同。慢病毒载体的一大特点是它们能够感染静止期的细胞。而MLV载体基因组只有当细胞分裂时才能转移到细胞核中。不过，由于慢病毒基因组结构复杂，慢病毒来源的包装系统滴度相对较低和稳定性也较差。由于他的基因组结构过于复杂，基因组中的顺式和反式作用原件不能被清晰地区分开。在表达慢病毒gag，pol和env基因的包装结构中，我们也能找到包含在载体基因组中的一些重要的顺式调节序列(例如部分包装信号)。由于上述同源性，载体基因组和包装结构可能发生重组，从而使慢病毒具有复制能力(例如可能会出现野生型的HIV病毒)。所以这一包装系统与MLV包装系统不具备可比性。之前文献中报道的所有载体系统都有一些严重的缺陷，从而使它们不能在基因治疗中成功应用。1.逆转录病毒载体·的滴度往往过低。由于囊膜蛋白的不稳定性，它们也不能被进一步浓缩。2.同样由于囊膜蛋白的不稳定性，病毒颗粒在纯化时也会损失一部分侵袭性。由于含有病毒载体的细胞培养上清液中污染了细胞组分，所以上述纯化过程又是必需的。3.由于囊膜蛋白的特性，逆转录病毒载体会被人血清组分灭活。4.经典双嗜性载体囊膜蛋白的受体几乎在所有细胞系统表达。但是，多种原代人类细胞(例如肝细胞和造血干细胞等基因治疗靶细胞)中缺少有功能的双嗜性受体。因此这些细胞中的基因转染相对困难或者不能实现。

发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种假型淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒糖蛋白的慢病毒载体，而且这一载体没有之前文献报道的载体的缺点。具体来说，本发明的目的就是提供一种能将基因稳定地转入靶细胞中的逆转录病毒包装系统。这种包装系统既能使目的基因稳定地整合到靶细胞基因组中，还能使目的基因稳定地表达。上述目标是通过逆转录病毒与淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)假型包装实现的。本发明是一种含有一个或多个外源基因的重组病毒颗粒。它是通过病毒颗粒与LCMV病毒假型包装得到的。病毒的向性以及稳定性主要是由囊膜蛋白决定的。小鼠逆转录病毒不仅能够整合MLV-env基因编码的糖蛋白，还能够将其他病毒的囊膜蛋白整合到病毒外壳中。因此，我们所说的假型包装就产生了。逆转录病毒假型包装载体是通过在MLV包装细胞系中表达外源病毒囊膜蛋白来获得的。传统的MLV包装细胞系含有逆转录基因gag，pol和env。而包装逆转录病毒基因组RNA所需的序列被敲除了。向上述包装细胞系中引入一个含有目的基因、逆转录病毒包装序列以及其他逆转录病毒顺式原件(LTR，leader)的载体。逆转录病毒基因组RNA在gag、pol和env基因产物的帮助下插入病毒颗粒，形成一个具有侵袭性但是不能复制的病毒。这种病毒能够在细胞转染中用作逆转录载体。假型包装细胞系还含有一个外源病毒的囊膜蛋白。本发明中的假型包装细胞系含有LCMV病毒的囊膜蛋白，并且能够表达LCMV病毒的糖蛋白。本发明首次提供了一种高滴度、浓缩的载体系统。根据本发明得到的载体能够在不损失感染性的情况下被进一步纯化。此外，就目前发明来看，假型包装过程对于包装细胞系没有毒性。因此，我们首次提供了一种能够通过逆转录病毒向靶细胞稳定转移基因的包装细胞系(包装系统)。这一包装系统能够使目标基因稳定地整合到靶细胞或者宿主细胞基因组中并稳定地表达。本发明中的包装细胞系能够适用于跨物种的广泛的宿主细胞(细胞嗜性)。本发明的一大优势在于LCMV病毒囊膜蛋白的个别突变能够引起LCMV病毒细胞嗜性的改变。也就是说，由于gp基因上的个别突变，本来倾向于感染神经细胞的病毒可能变的倾向于感染淋巴细胞或者单核细胞。在本发明中，我们最初采用的是嗜神经细胞的LCMV病毒株系Armstrong，L(ARM)(L. Villarete et al. , J. Virol. 68 (1994)7490-7496)(region coding for SEQ ID NO 4 ；compare appendix to the sequence protocol,re SEQ ID NO 3)的 gp 基因，以及嗜肝细胞的病毒株系 WE (V. Romanowski et al. , Virus Res. 3. (1985) 101-114) (SEQ ID NO 1)的gp基因。本发明还包括上述两种病毒株系由于gp基因产物中个别氨基酸变化而产生细胞嗜性变化的病毒变种。由于LCMV病毒是一种RNA病毒,它在传播过程中没有核相。因此,在该病毒的RNA序列中很可能存在一段“神秘 的接合区”。移除上述接合区(修正异常剪接)可用于提高表达。因此，上述“剪接修正”后的变种也包含在本发明中。通过优化GP的表达就能够改进假型包装，因此可能不需要其他LCMV蛋白的额外支持。我们推荐的一个变种是WE-HPI，它是根据本发明筛选出来的，它的gp基因序列(开放阅读框(ORF)见SEQ ID No. 25)与LCMV病毒WE株系相比在如下位置发生了突变281，329，385，397，463，521，543，631，793，1039，1363 和 1370。WE 株系(序列见 SEQ IDNO. 26)与 SEQ ID NO. 2 中的序列相比，在 94，110，129，133，155，174，181，211，265，347，455和457位置的氨基酸发生了改变。这一 GP突变株系的优势在于即使没有其他LCMV协助蛋白也很稳定，而且与WE株系相比，能够更好地假型化。本发明也包括一种LCMV病毒的变种，它含有完整的或者一部分gp基因(序列见SEQ ID NO. 25)，但是编码的蛋白序列与SEQ ID NO. 26相同(或者是它的一部分)。本发明还包括一种病毒变种，它含有SEQ ID NO. 26中的氨基酸序列(或它的一部分)，但是编码该蛋白的基因序列与SEQ ID NO. 25相同(或它的一部分)。最后提到的这种突变体的核苷酸和氨基酸序列是从WE株系通过常规手段得到的(例如引入点突变)。总的来说，所有能够在真核细胞中高效率稳定表达的表达载体都能够用于表达LCMV病毒。在载体的选择对于逆转录病毒LCMV假型化非常重要，因为他必须保证能够高水平稳定的表达(例如，表达水平足够高，能够使病毒假型化，同时表达又很稳定，不会关闭启动子)。根据本发明，如下两种表达体系是首选的(CMV启动子)——珠蛋白内含子2)——(gp)——(SV40 polyA信号)(EF-Lalpha 启动子)-(gp)-(G-CSF 基因 polyA 信号)(S. Mizushima,
Nucleic Acids Res. 18(1990)5322，T. Uetsuki, J. Biol. Chem. 264(1989)5791-5798).上述两种表达体系中的序列已经在序列说明中给出或者是被广泛认可的序列CMV 启动子(M. Boshart et al. , CelI 41 (1958) 521-530 ;F. Langle-Rouault et al.,Virol. 72(7)6181-5(1998))珠蛋白内含子2:(Jeffreys, A. J. et al. , Cell 12(1997) 1097-1108)
SV40polyA 信号(M. Boshart et al. , Cell 41 (1958) 521-530 ；F. Langle-Rouault et al.,Virol. 72(7)6181-5(1998))EF-1alpha 启动子SEQ ID NO 9(S. Mizushima, Nucleic Acids Res. 18 (1990) 5322，T. Uetsuki，J. Biol.Chem. 264(1989)5791-5798) ·gp (LCMV)比较SEQ ID NO :1，3，部分编码见SEQ ID NO :4(参见序列附录)。在本发明的范围内，也包括上述表达系统。相关核苷酸序列可能发生变化，只要表达系统的功能保持完整即可。例如，根据本发明使用上述表达系统能够在包装细胞中假型化，病毒颗粒能够感染靶细胞并且转入的基因与宿主基因组能够整合。此外，Invitrogen公司提供的游离型EBV表达载体(Epstein-Barr-Virus ；cf. F. Langle-Rouault et al. , Virol. 72(7)6181-5(1998)) (pCep4)也表现出了很高的表达能力，因此也属于本发明推荐的范围内。本发明还提供了一种包装细胞系，它含有逆转录病毒gag基因(SEQ ID No 12 ;附录序列表 re SEQ ID NO: 11)，pol 基因(SEQ ID NO : 13 ;附录序列表 re SEQ ID NO: 11)，有的还含有env基因(SEQ ID NO 14 ;附录序列表re SEQ ID NO 11)和(或者)逆转录病毒调节基因(如果是慢病毒包装系统，则含有编码慢病毒Rev蛋白的基因，该蛋白可防止慢病毒基因组呗剪接)，还含有编码LCMV病毒糖蛋白GP-1和GP-2的gp基因(或该基因的一部分)(SEQ ID NO :4;附录序列表re SEQ ID NO :3)。本发明还包括核苷酸序列发生修饰或者改变(突变、缺失等)后的变种，只要包装细胞的假型化能够正常进行，靶细胞能够稳定转染并且转入的基因能够稳定整合到宿主基因组中。上文提到的序列中的任意一部分也包含在本发明中。下文中提到这一类基因时,也都包括这些衍生出的变种。在本发明的范围内，“GP”或者“GP蛋白”表示GP-C前体蛋白。GP-1和GP_2蛋白都是在该前体蛋白基础上通过蛋白水解剪切得到的，它们在下文中表示为“LCMV糖蛋白”。此外根据本发明，在假型包装系统中，除了 gp基因产物(SEQ ID NO 4)外，LCMV病毒的其他一个或多个基因也有表达。例如编码核蛋白(SEQ ID NO :5;附录序列表re SEQID NO 3)的np基因，编码一个功能未知蛋白(SEQ ID NO 8 ;附录序列表re SEQ ID NO 6)的Z基因和编码RNA聚合酶(SEQ ID NO :7;附录序列表re SEQ ID NO 6)的I基因。由于本发明的体现形式比较特殊，上述基因可能分别来源于LCMV病毒的WE株系或者Armstixrng株系。在这方面，np、z和(或)1基因(SEQ ID Nos :见上文)的全部或者一部分序列都可能用到。本发明还包括核苷酸序列发生修饰或者改变(突变、缺失等)后的变种，只要包装细胞的假型化能够正常进行，靶细胞能够稳定转染并且转入的基因能够稳定整合到宿主基因组中。上文提到的序列中的任意一部分也包含在本发明中。下文中提到这一类基因时，也都包括这些衍生出的变种。本发明提供的包装细胞系除了还有LCMV病毒gp基因外，还含有下列基因中的至少一个编码核蛋白的np基因，编码RNA聚合酶的I基因以及编码一个未知功能蛋白的z基因。根据本发明，包装细胞系能够产生MLV/LCMV假型包装的载体，也就是外壳包被有LCMV糖蛋白的重组逆转录病毒。根据本发明，所有能够产生高滴度逆转录病毒载体的包装细胞系都能够用于生产重组病毒。本发明推荐的细胞系包括NIH3T3，Te671，293T，HT1080(F.L. Cosset etal.，J. Virol.69 (1995)7430-7436 ；D. Markowitz et al.，Virology 167(1988)400-406 ；ff. S. Pear et al.，PNAS 90(1993)8392-8396)。细胞系的选择并不重要，这也是本发明的一项特殊优势。因为在所有已测试的细胞系中，GP蛋白对它们都没有细胞毒性。如果未来发现其他细胞系能够更高效地产生病毒载体(滴度至少要高于上文中提到的水平，> IO6/ml)，那么也可以使用新的细胞系。根据本发明，MLV病毒Moloney株系的gag和pol基因时包装细胞用于假型化的首选基因(gag SEQ ID NO 12, pol SEQ ID NO 11, Nukleotide 1970-5573 ;附录序列表 reSEQ ID NO: 11)。不过依据本发明，其他MLV病毒株系的gag和pol基因只要能够满足上述优点，也能够用于载体制备。特别是上文中提到的衍生基因也包含在本发明中。

LCMV-GP蛋白能够假型包装慢病毒核衣壳也属于本发明的范围(见范例)。作为本发明的一种特殊表现形式，包装系统也可能含有慢病毒gag和pol基因的产物，也就是说慢病毒包装系统(包装细胞系)也可能应用于本发明。包装系统来源于哪种慢病毒无关紧要。根据本发明，合适的慢病毒包装细胞系包括人免疫缺陷病毒(HIV)来源的，猴免疫缺陷病毒(SIV)来源的以及猫免疫缺陷病毒(FIV)来源的。在这方面，高效率地制备具有侵染能力的慢病毒可能还需要表达一些附属基因，例如HIV载体中的rev基因(SEQ ID NO:21;附录序列表re SEQ ID NO 15)或者tat基因(SEQ ID NO :20 ;附录序列表re SEQ IDNO 15)。在本发明的范围内，LCMV病毒蛋白可能在所有慢病毒包装系统中用于假型包装。本发明还提供了一种病毒包装细胞或者一个假型包装的病毒，这种病毒是从逆转录病毒家族中筛选出来的，特别是MLV相关的病毒和慢病毒。作为本发明的一种特殊表现形式，逆转录病毒包装细胞是选自以下几种病毒的包装细胞系MLV，HIV, SIV和FIV。此外，根据本发明，用LCMV病毒突变体L(ARM)假型包装一个不表达ENV蛋白的MLV逆转录病毒株系，能够得到一种假型包装的病毒。同理，其他LCMV株系也可以这样使用。本发明还提供了建立包装细胞系的方法。这种包装细胞系是用常规方法(Maniatis, Sambrook, Fritsch Molecular cloning, a laboratory manual ；Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1982)转入了一个或多个外源基因，并且携带LCMV病毒的细胞系。外壳包被有LCMV糖蛋白的病毒就是有这些包装细胞系表达的。作为本发明的一个特殊的表现形式，假型包装细胞系是在逆转录病毒包装细胞系的基础上转入了一个含有LCMV病毒gp基因(或该基因的一部分)的质粒。转入的基因还可以包括下述基因的一个或多个LCMV病毒np基因，I基因和z基因。本发明还包括逆转录病毒假型包装载体在逆转录病毒包装细胞中制备的过程。这些包装细胞至少含有LCMV病毒gp基因或者该基因的一部分(如上文所述)，在合适的条件下能够产生病毒载体。在现在发明的序列中，使用的逆转录病毒包装细胞系是MLV(鼠白血病病毒)包装细胞系。这个细胞系不会表达功能性的ENV(包膜蛋白基因)，并且被用来做假性模型的LCMV (淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)是被删除了突变的L(ARM)。被von Laer et al. (J.Virol. 72(1998) 1424-1430)描述的细胞系也可以被用来作为ENV阴性的包装细胞系。这项发明的病毒体或者包装细胞系可以方便的被用来制作假性病毒载体，这种病毒载体可以方便的用来转导细胞系或者低等的真核细胞用在体外试验研究，或用在基因治疗上。用病毒体或者包装细胞系进行基因治疗也在这项发明的考虑范围之内。在这一点上，基因治疗可以被用来治疗传染性疾病比如艾滋病，肿瘤比如乳腺癌，或者黑色素瘤等其它疾病。这项发明也考虑到将这项技术应用到造血干细胞的转导中。本发明中的重组病毒体或重组包装细胞系是由一或多个转基因构成。转基因是从一些基因中筛选出来的，这些基因包括标志性基因，例如neo，IacZ或EGFP(绿色荧光增强蛋白)；或者是被用来进行基因治疗的基因，例如单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)，胞嘧啶脱氨酶(CD);或者一些具有抗病毒作用的序列，例如核酶，反义核酸序列转录优势阴性的基因；或者是用来进行肿瘤治疗的基因，例如被用来保护化疗过程中的造血功能的多药耐药-l(mrd-l)或细胞 因子基因。除此之外，所有与靶基因相关的转基因或体外细胞中表达且与基因治疗相关的转基因都可以被应用。本发明还包括基因治疗的一个制药学的准备，使得本发明的假膜性病毒载体或是逆转录包装细胞可以找到具有兼容性的药物赋形剂或是载体。基因治疗必须在体内使靶细胞得到基因的改变，而其它的细胞不发生变化。比如说，自杀基因进入肿瘤细胞而不是健康的细胞，化疗耐受基因应该进入正常的血液干细胞而不是肿瘤细胞。更多的靶基因转录进入特定细胞已经合并配体进入逆转录病毒受体的表面或者脂质体。尽管如此，一个靶基因的转运，不可能只是利用那些配体结合靶基因的方法，也不是载体基因进入细胞质(F.L.Cosset et al.，J. Virol. 69 (1995) 6314-6322)，且没有与溶酶体膜的融合。这个问题可以用病毒外膜或者是外膜蛋白来解决，病毒外膜蛋白可以作为融合蛋白越过溶酶体膜。LCMV GP的利用是本项目的一个优势，因为这种病毒包膜蛋白在低PH时构象发生变化，在靶细胞的核内占优势。构象的改变可以激活融合作用，尽管没有必需的LCMV GP的受体结合。由于相对于其他融合蛋白，LCMV GP没有介导细胞膜的融合，它也没有细胞毒性且不会诱发巨细胞的构型(cf. C. di Simone et al. , Virology198(1994)455-465)。根据本发明，包括逆转录病毒包装细胞，它包括逆转录基因gag，pol, env和/或调节逆转录基因，LCMC或它一部分编码糖蛋白GP-1，GP-2的gp基因。其中env基因被修饰来编码Env蛋白，Env蛋白介导与靶细胞之间的特定结合，即所谓的env靶向；gp是一种变异，编码的GP蛋白具有融合活性，被称为融合辅助。进一步的相关的方法对于准备那些包装细胞，包括逆转录病毒基因env，被修饰后编码Env蛋白，Env蛋白介导与靶细胞之间的特定的结合；gp基因是一个变异基因，编码具有融合活性的GP蛋白。在这种情况下，为了阻止或减少GP和其细胞受体的结合，有必要改变编码LCMV GP受体结合位点的序列(没有损害融合活性)。作为另一种方法，考虑用中和抗体对抗GP，可以中和受体结合而不用通过GP来抑制PH依赖性的融合。根据本发明第一次提供的稳定的包装细胞系，现在有可能通过GP-1的靶向变异来确定受体结合位点。专业人士对这种方法提到的中和抗体隔离是非常熟悉的。本发明第一次提出可以在高滴定度和高浓度条件下制造载体系统。载体颗粒可以在没有任何传染性物质损失的情况下被纯化。本专利的细胞系具有宽且跨种系的宿主细胞谱(细胞趋性)。令人惊奇的是，本发明中的假性模型对于包装细胞系来说没有细胞毒性。第一次出现稳定的细胞系，可以使逆转录病毒将目的转录基因稳定的向靶细胞中转移。这将是转移的靶基因与宿主细胞稳定的整合，从而使该基因稳定的表达。


图1、逆转录病毒基因gag，pol及env稳定的融入逆转录病毒包装细胞系的示意图；其中①载体基因组和转基因、调控顺式元件一同表达，该载体的基因组RNA包括一个包装信号，这个信号已在gag、pol及env基因上删除；②逆转录病毒蛋白选择性的包裹载体基因组—个完整的逆转录病毒核衣壳形式—个逆转录病毒以出芽的方式从细胞膜释放；⑤通过蛋白裂解核衣壳上的逆转录病毒前体蛋白病毒在细胞外成熟。

图2、LCM病毒的基因组RNA不意图；LCM病毒的基因组由2个双义RNA分子组成，每个分子包括2个开放阅读框架。图3、逆转录病毒包装细胞系不产生病毒包膜蛋白但仍释放无感染性逆转录病毒载体示意图；如果无env基因的细胞系被LVM病毒感染，则逆转录病毒能将LCMV的糖蛋白插入到他们的包膜中，另外，LCM野生型病毒能在LCMV复制过程中释放。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。举例材料和方法细胞和病毒由 F.-L. Cosset (F. L. Cosset et al. J. Virol. 69 (1995) 7430-7436)提供的env阴性包装细胞系TELCeB。Env阴性的细胞系293gp2被(D. Von Laer et al.,J. Virol. 72 (1997) 1424-1430) ·小鼠的成纤维细胞系Sc-1在最小量的必需培养液中培育(Sigma, Deisenhofen, Germany),培养液中含有 10% 的胎牛血清(FCS, PAN Systems,Aidenbach，Germany).人肾细胞系293，人肝癌细胞系HUH-7，人类成纤维细胞系Te671和TELCeB和小鼠的成纤维细胞系L-929在含10%胎牛血清的杜尔贝科培养液(DMEM，Gibco，Paisley, Great Britain).人类造血前细胞系TF-1在含有10%胎牛血清和IL-3的伊斯科夫杜尔贝科培养液(Gibco，Paisley，Great Britain)。一个含有IL-3基因的BPV载体转染至NIH3T3细胞，作为溶液中IL-3的来源，它是TF-1 (H. Karasuyama et al.，Eur.J.1mmunol 18(1988)97-104).最快生长所必须的。人前体细胞系K562在含有10%胎牛血清的RPMI (Gibco)中培养。LCMV是放置在10. 11. 1998的欧洲细胞培育中心(ECACC)，斯堡，威尔特郡，SP40JG，英国。根据布达佩斯条约获取号码为V98111005. MESV类型的逆转录病毒载体，携带有新霉素磷酸转移酶基因(MPLN)已经被报道(H.-G. Eckert，Blood 88(1996)3407-3415).转染辅助因子是重组的莫罗尼氏MLV，它能够复制一部分的pol基因和大部分的env基因，这种莫罗尼氏 MLV 已经被 MLV strain 4070A 取代[Mo-Ampho-MP，R320 (C. Munk, Proc.Natl. Acad. Sci, USA 94 (1997) 5837-5842)]，作为一个 SailI 至 ClaI 的片段。这种病毒在Sc-1中增殖。纯化的WE序列的LCM病毒在L-929细胞中增殖。(Τ. M. Rivers, Virology26 (1965) 270-282).连续的流式细胞技术分析LCMV-GP表达。为了分析LCMV糖蛋白的表达，3xl05到IO6细胞获取后压缩再悬浮于50μ I I 40稀释的小鼠腹水中，腹水中包含一种小鼠的单克隆抗体对抗LCMV GP-1 (Μ. Bruns et al.，Virology 130 (1983) 247-251).在冰上孵育20分钟后，细胞用PBS磷酸盐缓冲液洗3遍，接着在1: 80稀释的FITC的羊抗鼠抗体(Dako, Glostrup, Denmark)中孵育20分钟。最后再PBS中洗三遍，细胞用FACScalibur装置进行分析。病毒滴定法为了确定载体的滴度，5x104Sc-1细胞被5倍稀释后，其上清接种在24孔培养板上。对于逆转录neo载体的选择是加入400 μ g G418/ml (dry weight GIBCO)开始后24小时。培养液每4天更换一次。10天后评估克隆量。滴度是用每毫升中G418抑制转移的单位数来表示。对于逆转录病毒MFGnlsLacZ载体,按照先前文献的方法(G. R. McGregor,Methods Mol. Biol. 7 (1989) 1-19)在接种后 2 天用 X-ral (5-bromo-4-chloro-3-1ndolyl-β -D-galactopyranoside)进行染色。滴度用每ml LacZ转移单位(LTU)进行表示。LCMV的板形单位按照以前文献的方法在L-929细胞上进行分析(F. Lehmann-Grube, J. Gen.Virol. 37(1997)85-92)。MLV(LCMV)假型病毒通过等量病毒阳性上清的预孵化被中和，这种病毒阳性上清米用一个 ant1-LCMV gp44_ 中和1: 100 滴度的单克隆抗体。(M. Bruns et al. ,Virology130 (1983) 247-251).滴度采用前述的LTU/ml来确定。DNA 分析采用早期文献(C.Stocking et al. , Cell 53 (1988) 869-879)的 DNA 定量和Southern blot分析的方法。基因组DNA可以用HINDIII进行消化，HINDIII可以把MPlN载体的neo基因的3’端进行单一切除。一个包含完整neo基因的片段被用作探针。病毒的制造和提纯病毒体采用文献中用到的梯 度加速离心法进行提纯(L. Martinez-Peralta etal.，J.Gen. Virol. 55(1981)475-479).总之，就是感染细胞培育的上清采取低速和高速离心法进行纯化。采用超速离心法病毒被压缩，进而采用0-40%的二乙酰氨基三碘苯甲酸甲基葡胺梯度纯化(Schering AG, Berlin, Germany)。实施例1感染含有LCMV-LacZ基因的TeLCeb向靶细胞转移，通过Ant1-GP Mab和载体的浓度梯度来中和载体用LCMV来营救包膜蛋白阴性的鼠白血病病毒载体为了证明LCMV是否能营救包膜蛋白阴性的鼠白血病病毒载体，env阴性的包装细胞系TELCeB被感染多样性(m. ο.1.:表明细胞被感染后病毒体的数量)为O. 01的LCMV WE系感染。TELCeB来自于人成纤维细胞系Te671,并且包含gag, pol和逆转录病毒载体MFGnlsLacZ (G. M. Crooks etal.，Blood 82(1993)3290-3297).在LCMV感染后，LTU的滴度和LCMV多类型病毒被鼠的成纤维靶细胞X-gal染色和培养板测定(在板形单位，PFU)。除此之外，在感染TELCeB中LCMV糖蛋白的表达可以用流式细胞技术进行测定。结果在。LTU在6天当中，第3天最大，为5x104LTU/ml.第2天为LCMV野生型病毒的最高滴度3xl08.在第3天时PFU的产生已经下降，而此时LTU的产生量最大，LCMV糖蛋白的表达量也达到最高。这种矛盾产生的原因可能是产生的缺陷干扰LCMV颗粒抑制了 LCMV野生型病毒的复制，所有的可能性都不会是感染的逆转录病毒载体的释放。在包装细胞系中LCMV的复制没有观察到明显的细胞病变效应，尽管高水平的LCMV糖蛋白表达。接下来，用一项实验来证实是否LCMV感染TELCe产生的病毒通过LCMV糖蛋白特异性的介导LacZ基因导入。用中性的·ant1-LCMV gp44单克隆抗体孵育上清I个小时。这将引起LTU滴度下降超过3倍。转染的相同逆转录病毒的假性模型没有被ant1-LCMV抗体中和(表I)。这些数据表明，MLV/LCMV病毒体在它们的表面实际上携带有LCMV糖蛋白这些糖蛋白在缺少逆转录病毒包膜蛋白的情况下通过LCMV受体来介导基因转入。表1. LCMV感染的包装细胞系产生的感染逆转录病毒载体颗粒能够被ant1-LCMV糖蛋白单克隆抗体所中和。表I
权利要求
1.一种假型淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒糖蛋白的慢病毒载体，它含有逆转录病毒gag基因，pol基因，env基因，逆转录病毒调节基因，编码LCMV病毒糖蛋白GP-1和GP-2的gp基因。
2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述pol基因核苷酸序列如SEQID N0:5所
3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
4.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述载体中的逆转录病毒包装细胞是选自如下病毒的包装细胞系之一 MLV，HIV, SIV和FIV。
5.权利要求1所述载体在制备基因药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种假型淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒糖蛋白的慢病毒载体，属于分子生物技术领域。它含有逆转录病毒gag基因，pol基因，env基因，逆转录病毒调节基因，编码LCMV病毒糖蛋白GP-1和GP-2的gp基因。本发明第一次提出可以在高滴定度和高浓度条件下制造载体系统。载体颗粒可以在没有任何传染性物质损失的情况下被纯化。本发明的细胞系具有宽且跨种系的宿主细胞谱。
文档编号A61P31/14GK103060377SQ20111031685
公开日2013年4月24日 申请日期2011年10月18日 优先权日2011年10月18日
发明者王剑 申请人:王剑