专利名称：新型副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种副猪嗜血杆菌多价疫苗，特别是指一种副猪嗜血杆菌4型JS株、5型ZJ株、12型HeB株的三价灭活疫苗及制备方法。
背景技术：
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, Hps)引起猪的多发性衆膜炎和关节炎，该病又称为猪革拉泽氏病(Glsser’s Disease)，曾一度被认为是由应激所引起的散发性疾病，后来被证实是由副猪嗜血杆菌所引起。副猪嗜血杆菌可以影响从2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶后和保育阶段发病，通常见于5 8周龄的猪，发病率一般在10% 15%，严重时死亡率可达50%。主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱；主要剖检病变表现为纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。此外，副猪嗜血杆菌还可引起败血症，并且在急性感染后可能留下后遗症，即母猪流产、公猪慢性跛行。 早在1910年，德国科学家Glsser就发现了副猪嗜血杆菌与猪的多发性浆膜炎和关节炎之间的联系。随着世界养猪业的发展，该病已成为全球范围内影响养猪业的典型细菌性疾病。西方发达国家在大量分离副猪嗜血杆菌的基础上，发现该菌的血清型复杂多样，按Kieletein-Rapp-Gabriedson(KRG)琼脂扩散血清分型方法,至少可将副猪嗜血杆菌分为15个血清型，另有20%以上的分离株血清型不可定；根据德国、美国、加拿大、日本和西班牙等国家的血清流行病学调查，以血清型4、5、13型最为流行；根据我国血清流行病学调查和分离菌株的鉴定，以4、5型最为流行，其次是12型、13型。近年来，各副猪嗜血杆菌血清群之间交互免疫力不强，接种的疫苗菌株血清群与当时当地流行的副猪嗜血杆菌病的病原血清群不相符，给该病的预防和治疗带来了一定的难度。目前国内用于副猪嗜血杆菌病免疫预防的疫苗有勃林格殷格翰动物保健(美国)有限公司生产的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(Z-1517株)；西班牙海博莱生物大药厂生产的猪副猪嗜血杆菌病I型和6型灭活疫苗和华中农业大学、武汉科前动物生物制品有限责任公司、中牧实业股份有限公司生产的副猪嗜血杆菌病4型和5型灭活疫苗；这些疫苗的应用起到了一定的预防作用，而该病的病原流行株和多种血清型感染已经使现有疫苗很难达到预期的免疫效果，尤其是还没有副猪嗜血杆菌病12型，由于没有合适的毒株制备，加上各个抗原之间存在干扰，一针能够防治副猪嗜血杆菌新病原弓I起的副猪嗜血杆菌病为养殖业迫切需要解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种解决目前技术缺陷的副猪嗜血杆菌病，由三种抗原和兽医学可接受的佐剂组成，其中，所述的三种抗原为已灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株、已灭活的副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株、已灭活的副猪嗜血杆菌血清12型HeB株抗原。本发明使用的抗原来自副猪嗜血杆菌血清4型JS株，保藏号为CCTCC NO M2011172 ;副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株，保藏号为CCTCC NO M 2011173 ;副猪嗜血杆菌血清12 型 HeB 株，保藏号为 CCTCC NO M 2011174。优选地，本发明所述三种抗原的比例相等，副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型抗原含量各为 2. OX 109CFU/mL。优选地，本发明所述的兽医学可接受的佐剂为白油佐剂、氢氧化铝胶佐剂和Montanide IMS1313 VG,Montanide IMS 251C VG,Montanide ISA15A VG及Montanide GELPR聚合物佐剂的一种或几种组成。优选的，本发明所述的兽医学可接受的佐剂为水性佐剂Montanide GEL PR。更优地，本发明所述的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗中还含有疫苗总量O. 01% V的硫柳萊。本发明还提供了一种如上所述的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗的制备方法，包括 以下步骤 a.分别将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株、副猪嗜血杆菌血清12型HeB株菌种繁殖培养，得到4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液；b.分别将步骤a培养得到的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液进行灭活，并浓缩菌液；c.将上述已灭活、浓缩的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液等体积比例混合，并加入疫苗总量O. 01 % V的硫柳萊，然后和兽药学上可接受的佐剂进行乳化，其中，副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗抗原含量为灭活前副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型活菌数各为 2. OX 109CFU/mL。d.对步骤c得到的副猪嗜血杆菌病三联灭活疫苗进行分装。优选地，本发明的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗的制备方法中，所述兽医学可接受的佐剂为白油佐剂、氢氧化铝胶佐剂和Montanide IMS1313 VG、Montanide IMS 251C VG、Montanide ISA15A VG及Montanide GEL PR聚合物佐剂的一种或几种组成。优选地，本发明所述的副猪嗜血杆菌病细菌为副猪嗜血杆菌血清4型JS株，保藏号为CCTCC NO M 2011172 ;副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株，保藏号为CCTCC NO M 2011173 ；副猪嗜血杆菌血清12型HeB株，保藏号为CCTCC NO M 2011174。本发明的另一目的在于提供如上述的副猪嗜血杆菌病三联灭活疫苗在预防和治疗副猪嗜血杆菌相关病的应用。技术效果发明人意外地分离获得三株副猪嗜血杆菌血清4型、5型和12型的菌株，通过试验发现这三株副猪嗜血杆菌4型JS株菌、5型ZJ株菌、12型HeB株菌制备获得三联灭活疫苗可以对我国目前流行的多种副猪嗜血杆菌血清型引起的副猪嗜血杆菌病有较好的预防和治疗效果，特别是可以解决目前由于副猪嗜血杆菌新发病原而导致的现有疫苗治疗效果不佳的问题。其次，多价疫苗常常由于抗原的相互影响而导致免疫失败，特别是对于多血清型的副猪嗜血杆菌引起的疾病，由于血清型众多，选择抗原的种类和比例更加困难，而且对于大动物(猪)的免疫学实验往往时间漫长、费用昂贵，这也是一直以来市场上未出现有效的副猪嗜血杆菌多价疫苗的原因。而本发明在获得了三株新的副猪嗜血杆菌基础上，通过对这三种毒株制备的抗原的浓度含量及其相互比例进行了大量工作和实践，得到了一种抗原间配比及浓度适宜的三价疫苗，疫苗的免疫效果良好，可以有效治疗和预防副猪嗜血杆菌相关疾病，解决了长期以来的多血清型副猪嗜血杆菌相关疾病的多价疫苗制备困难的问题。最后，本发明的三价灭活疫苗使用了氧化铝胶或水型佐剂，特别发现了水性佐剂制备获得三价灭活疫苗)安全性和免疫效果最佳，而且配苗工艺简单，疫苗易注射，安全可靠，克服了以往常用的油性佐剂的缺点。菌株保藏说明本发明所用的菌株为副猪嗜血杆菌病血清4型JS株分类命名副猪嗜血杆菌病JS(Haemophilus parasuis JS),保藏号为CCTCCNO M 2011172 ；·副猪嗜血杆菌病血清5型ZJ株分类命名副猪嗜血杆菌病ZJ(Haemophilus parasuis ZJ),保藏号为CCTCCNO M 2011173 ；副猪嗜血杆菌病血清12型HeB株分类命名副猪嗜血杆菌病HeB(Haemophilus parasuis HeB),保藏号为:CCTCCNO Μ 2011174 ；以上三个菌株的保藏日期均为2011年5月18日，保藏地址均为中国武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏单位均为中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)。
图I为副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗工艺流程图。
具体实施例方式本发明提供的新型副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗，所述副猪嗜血杆菌病灭活疫苗包含抗原和佐剂；其中抗原包含已灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、12型HeB株抗原；所述佐剂为兽医学可接受的佐剂；作为本发明副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗的优选实施方案，所述三种抗原的比例相等(即I : I : 1)，副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型抗原含量均为2. 0X109CFU/mL。其中，本发明的抗原含量是指在灭活前的活菌数的含量。作为本发明副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗的优选实施方案，所述佐剂为白油佐齐U、氢氧化铝胶佐剂和以卡波姆(Carbomer)为基础的Montanide IMS1313 VG(包括同系列佐剂)、Montanide IMS 251C VG (包括同系列佐剂)、Montanide ISA15A VG (包括同系列佐齐[J)及Montanide GEL PR(包括同系列佐剂)聚合物佐剂。作为本发明副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗的优选实施方案，所述疫苗中还含有疫苗总量O. 01% V的硫柳汞。新型副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的制备方法，包含如下步骤a.分别将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、12型HeB株菌种繁殖培养，得到4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液；
b.分别将步骤a培养得到的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液中按总量加入O. 3%的甲醛溶液，放置37°C灭活，期间搅拌3 5次，根据计数结果浓缩菌液；c.将上述已灭活、浓缩的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液等比例混合，并加入疫苗总量O. 01 %的硫柳汞，然后和不同佐剂进行乳化，成品副猪嗜血杆菌病灭活疫苗抗原含量为灭活前副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型活菌数各为2. OX 109CFU/mL ；d.以适量体积分装副猪嗜血杆菌病灭活疫苗，盖上瓶盖，并压铝盖。在上述新型副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗的制备过程中，从步骤a培养好的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液取样，进行纯粹性检验和活菌计数；从步骤b已灭活好的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液取样进行灭活检验和安检；对步骤c得到的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗进行无菌检验、安全检验和效力检验，以确保疫苗的安全性、可靠性。本发明的新型副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗，克服了现有商品化疫苗只能预防I·种或者2种副猪嗜血杆菌流行毒株引起的副猪嗜血杆菌感染的不足。本发明采用了不同的疫苗佐剂和适宜的配苗技术制备了副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗，可以同时预防由副猪嗜血杆菌多种血清型引起的副猪嗜血杆菌病。可以满足不同养殖户和大型养殖场的需求，并达到了一针多防的效果。为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。如未特别声明，本发明的一般实验方法可使用本领域常用的试验方法进行，或参考《中华人民共和国兽药典(二〇〇五年版)》及附录的试验方法完成。实施例I副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗的制备与效力实验副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗，由已经灭活、浓缩并且安全检验合格的副猪嗜血杆菌病血清4型、5型、12型菌株制备获得，即用副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型菌株制备抗原，分别与Montanide IMS1313 VG (包括同系列佐剂)、Montanide IMS 251C VG (包括同系列佐剂)、Montanide ISA15A VG(包括同系列佐剂)、Montanide GEL PR(包括同系列佐剂)、白油佐剂、氢氧化铝胶佐剂混合配制疫苗，其中，所述三种抗原浓度比例相等。I.菌种a.副猪嗜血杆菌血清4型JS株，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏日期2011年5月18日，保藏号为CCTCC M 2011172。b.副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏日期2011年5月18日，保藏号为CCTCC M 2011173。c.副猪嗜血杆菌血清12型HeB株，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏日期2011年5月18日，保藏号为CCTCC M2011174。2.菌种的繁殖a. 一级种子的繁殖上述冻干菌种，划线接种于TSA/NAD平板上，置37°C培养18 24小时，选取符合要求的菌落，接种于TSB/NAD液体培养基中，37°C培养12小时，作为一级种子。b. 二级种子的繁殖取一级种子的培养物，按I % V的量加入TSB/NAD液体培养基中，37°C培养12小时，经检验纯粹后作为二级种子。3.菌液的培养在副猪嗜血杆菌培养基(商售TSB)中，加入O. 01% O. 05% (V/V)的NAD、5% 10% (V/V)的血清、O. I % 5% (V/V)的葡萄糖，将副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型菌种分别按1% (V/V)的量加进培养基中分别培养，混匀后置37°C培养18小时，得到三种菌液。4.纯粹检验从上述培养好的三种菌液中取样，用TSA/NAD培养基依《中华人民共和国兽药典》附录进行纯粹检验，结果为纯粹。5.活菌计数
从上述培养好的三种菌液取样，用TSA/NAD平板培养进行活菌计数，以确定培养的菌数。6.灭活向上述三种培养好的菌液中，按总量的O. 3% (V/V)加入甲醛溶液，放置于37°C灭活24h，期间搅拌3 5次。7.灭活检验灭活后，取上述三种已经灭活的菌液5mL接种于IOOmL含O. 01% O. 05% (V/V)NAD、5% 10% (V/V)的血清、0.1% 5% (V/V)的葡萄糖的副猪嗜血杆菌TSB培养基中，37°C培养18小时，再移植于上述IOOmL培养基中37°C培养18小时。取灭活的菌液O. ImL划线接种于TSA/NAD平板培养基，37°C培养24小时。以上两种培养基培养后，均无菌生长。8.安全检测取上述三种已灭活的菌液静脉注射18 22g的Balb/C小鼠5只，每只O. 2mL,结果为三天内5/5健活,为灭活彻底。9.疫苗的配制a.油佐剂苗的配制具体成分配比如下表
主要材料组分含量(％)
兽用白油93
司本-806
硬脂酸绍I
吐温-804
水相油相(体积比) I 1.5以白油为佐剂制成的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗。具体方法如下油相的制备白油93份，加入硬脂酸铝I份，边加边搅拌，再加入6份司本-80，充分混均，121°C，30分钟。水相制备参照菌落计数结果，将各个菌液以超滤器浓缩为5.0X1010CFU/mL·将三种血清型灭活并检验合格的菌液等比例混合，加入终浓度为4%灭菌吐温-80，边加边搅拌，至完全溶解。乳化水相与油相的比例为I : 1.5，即I份水相配
I.5份油相在高速搅拌器中乳化2-5分钟，在终止搅拌前加入疫苗总量的O. 01% V的硫柳汞，使得疫苗中三种抗原的含量均为2. OX 109CFU/ml。b.铝胶佐剂苗的配制具体成分配比如下
权利要求
1.一种副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗，其特征在于，由三种副猪嗜血杆菌抗原和兽医学可接受的佐剂组成。
2.根据权利要求I所述的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗其中所述抗原为已灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株、已灭活的副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株、已灭活的副猪嗜血杆菌血清12型HeB株抗原。
3.根据权利要求I所述的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗，其特征在于，所述的副猪嗜血杆菌血清4型JS株，保藏号为CCTCC NO M 2011172 ;副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株，保藏号为CCTCC NO :M2011173 ;副猪嗜血杆菌血清12型HeB株，保藏号为CCTCC NO M 2011174。
4.根据权利要求I所述的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗，其特征在于，所述三种抗原的比例相等，副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型抗原的含量各为2. OX 109CFU/mL。
5.根据权利要求I所述的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗，其特征在于，所述兽医学可接受的佐剂为白油佐剂、氢氧化铝胶佐剂和Montanide IMS1313 VG、Montanide IMS 251CVG、Montanide ISA15A VG、Montanide GEL PR 佐剂的一种或几种组成。
6.根据权利要求I所述的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗，其特征在于，所述的兽医学可接受的佐剂为水性佐剂Montanide GEL PR。
7.根据权利要求I所述的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗，其特征在于，所述的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗中还含有疫苗总量O. 01% V/V的硫柳汞。
8.—种权利要求I所述的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 a.分别将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株、副猪嗜血杆菌血清12型HeB株菌种繁殖培养，得到4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液； b.分别将步骤a培养得到的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液进行灭活，并浓缩囷液； c.将上述已灭活、浓缩的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液等体积比例混合，并加入疫苗总量O. 01 % (V/V)的硫柳汞，然后和兽药学上可接受的不同佐剂进行乳化，其中，副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗抗原含量为灭活前副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型活菌数各为2. OX 109CFU/mL。
9.根据权利要求6所述的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述兽医学可接受的佐剂为白油佐剂、氢氧化铝胶佐剂和Montanide IMS1313 VG,MontanideIMS 251C VG,Montanide ISA15A VG 及 Montanide GEL PR 聚合物佐剂的一种或几种组成。
10.一种副猪嗜血杆菌，其特征在于，所述的副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌血清4型JS株，保藏号为CCTCC NO M 2011172 ;副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株，保藏号为CCTCC NO M2011173 ;副猪嗜血杆菌血清12型HeB株，保藏号为CCTCC NO M 2011174。
11.根据权利要求1-7任意一项所述的三联灭活疫苗在制备预防和治疗副猪嗜血杆菌相关病的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗，含抗原的比例相等的已灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株、已灭活的副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株、已灭活的副猪嗜血杆菌血清12型HeB株抗原与制备方法。本发明人分离获得三株副猪嗜血杆菌血清4型、5型和12型的菌株，这三种毒株制备的抗原的浓度含量及其相互比例进行了大量工作和实践，得到了一种抗原间配比及浓度适宜的三价疫苗，可以对我国目前流行的多种副猪嗜血杆菌血清型引起的副猪嗜血杆菌病有较好的预防和治疗效果，特别是可以解决目前由于副猪嗜血杆菌新发病原而导致的现有疫苗治疗效果不佳的问题。
文档编号A61K39/39GK102908615SQ20111021883
公开日2013年2月6日 申请日期2011年8月1日 优先权日2011年8月1日
发明者张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司