专利名称：一种猪细小病毒灭活疫苗的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种猪细小病毒灭活疫苗的生产方法，属于兽用生物制品领域。
背景技术：
猪细小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一。该病的主要特征是怀孕母猪发生流产、死产、胚胎死亡和胎儿木乃伊化，而母猪本身不表现临床症状，其他猪感染后也无明显的临床症状。本病一般呈地方性流行或散发，有时也呈现流行性或称为“暴发”，这种“暴发”多见于猪群初次感染，特别是初产母猪症状明显。目前该病已普遍存在于世界各地的猪群中，给养猪业造成了巨大经济损失。为了减少猪细小病毒病对养猪业造成的损失，国内外许多学者进行了广泛的研究，在疫苗研制上也取得了一定的进展。国外Paul (Paul PS, Mengeling WL，Evaluation of a modified live-virus vaccine for the prevention of porcine parvovirus induced reproductive disease in swine. Am. J. Vet. Res,1980, 41 (2) :2007-2011), Fujisaki(Fujisaki, et.al, Establishment of the attenuated strain of porcine parvovirus parvovirus by serial at low temperature. Natl. Inat, Anim. Health, 1982, (22),1-7), Akhiro(Akhiro, et. al, Establishment of the attenuated strain of porcine parvovirus for the live vaccine and its bioIogical-immunological characteristics)培育出了猪细小病毒弱毒活疫苗。
发明内容
本发明的目的是采用免疫原性良好的猪细小病毒(TOF01株)毒株接种于ST细胞 (原始ST细胞购自中国兽医药品监察所，基础细胞库和生产用细胞库由本发明人鉴定、建立、保管和供应。该细胞无致瘤性或无致癌性，无细胞毒性，无细菌、霉菌、支原体、外源病毒污染。从现有代次(56代)可连续使用50代。)培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活，加入矿物油佐剂混合乳化制成。用于预防由猪细小病毒引起的猪细小病毒病。一、生产用毒株1.毒种的来源制造用猪细小病毒YBF01株，由本发明人2000年在山东省某猪场患病猪流产物分离的一株自然弱毒株(PPV-01株病毒)，用蚀斑克隆技术对该病毒分离株进行克隆，筛选到一株高增殖力毒株，命名为猪细小病毒(Porcine ParvovirusHBFOl株(简称PPV-YBF01 株)该病毒毒株已于2011年5月5日送北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 4809。在对该毒株的理化特性及生物学特性进行系列研究、鉴定的基础上，制备了猪细小病毒灭活疫苗。2. YBF01株病毒毒株的特点(1)致细胞病变作用将TOF01株病毒含量不低于106_°TCID5(1/0. Iml的种毒按
的量接种于长势良好的ST细胞，置37°C培养72 96h，出现细胞圆缩、脱落，继而出现空洞、拉网等特异性病变。
(2)病毒含量将YBFOl株毒种用细胞维持液O %新生牛血清的MEM液，购自 GIBC0)进行10倍系列稀释，取10_4、10_5、10_6、10、个稀释度，分别接种于长势良好的ST细胞(96孔细胞板)，每个稀释度接种4孔，每孔0.1ml。同时设病毒阳性对照孔和细胞阴性对照孔，37°C培养和观察7日，出现CPE者判为感染，计算TCID5tlt5每0. Iml病毒含量不低于 106°TCID5Q。C3)红细胞凝集价种毒液对0.5%豚鼠红细胞血凝效价应不低于1 256。(4)毒力取怀孕30 50日猪细小病毒抗体阴性(HI抗体效价不高于1 8)健康初产母猪4头，分别滴鼻和注射YBFOl株种毒液各2. 0ml，连续观察母猪至分娩，无流产、早产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍出现。该毒株毒力较弱，对妊娠母猪安全。(5)免疫原性对豚鼠的免疫原性用病毒含量不低于106_°TCID5(1/0. Iml的TOFOl株病毒液按常规方法制备油乳剂灭活疫苗，接种体重300 450g猪细小病毒抗体阴性(HI抗体效价不高于 1 8)豚鼠4只，各肌肉注射疫苗0.5ml。观日后，采血测定HI抗体效价，免疫豚鼠HI抗体效价均不低于1 64。对猪的免疫原性用病毒含量不低于106_°TCID5(1/0. Iml的TOFOl株病毒液按常规方法制备油乳剂灭活疫苗，接种猪细小病毒抗体阴性(HI抗体效价不高于1 8)健康猪4 头，各肌肉注射疫苗2. 0ml。28日后，采血测定HI抗体效价，免疫猪HI抗体效价均不低于
1 128ο(6)特异性将YBFOl株病毒液用细胞维持液稀释至200TCID5(1/0. Iml与等量特异性猪细小病毒高免血清(本发明人采用常规方法自制)混勻，置37°C中和1小时，接种于长势良好的ST细胞(6孔细胞培养板)2孔，每孔0. 5ml，置37°C作用1. 5小时，补充维持液至 4. 0ml，设正常细胞作阴性对照，同时设未经特异性猪细小病毒高免血清中和的YBFOl株病毒液作阳性对照，置37°C培养和观察7日，判定结果，阳性对照出现细胞病变，中和组和细胞阴性对照不出现细胞病变。(7)纯净无菌生长，无支原体和外源病毒污染。二、猪细小病毒灭活疫苗的生产方法本发明所涉及的是一种猪细小病毒灭活疫苗，该疫苗含有经甲醛溶液灭活的 TOFOl株猪细小病毒(CGMMCC No. 4809)及常规的矿物油佐剂。其生产方法主要包括(1)将扩大培养的ST细胞种子细胞接种到转瓶中，37°C培养；按培养液的量将 YBFOl株猪细小病毒种子接入长势良好细胞贴壁达50% 80%弃去培养液的ST细胞，置 37°C吸附1. 5小时，加维持液继续培养；当细胞病变达80%以上时收获，冻融3次；(2)取冻融后的病毒液测定病毒含量和红细胞凝集价，每0. Iml病毒含量不低于 IO6 qTCID5q，病毒液对0.5%豚鼠红细胞血凝效价不低于1 256;(3)按常规方法收获培养物经甲醛溶液灭活，加入矿物油佐剂混合乳化制成猪细小病毒灭活疫苗。本发明的详细描述一、疫苗制备1.生产用毒种制备将毒种按的量接种于长势良好的ST细胞，37°C吸附1. 5小时，加入维持液，置37°C培养72 96小时，当细胞病变达80%以上时收获，冻融3次，分装于灭菌容器内，取样进行鉴定。注明收获日期、毒种代次等。2.细胞制备从液氮罐中取出结冻保存的ST种子细胞管置37°C水浴中融化，将细胞移入装有IOml培养液的离心管中，lOOOr/min离心5min。用含20%新生牛血清的培养液 (MEM液，购自GIBC0)悬浮细胞，置37°C培养，当长成良好单层时用胰酶-EDTA消化细胞。3.抗原制备(1)细胞单层培养将扩大培养的种子细胞接种到转瓶中，37°C培养。(2)接毒弃去培养液，按的量接种长势良好的ST细胞，置37°C吸附1. 5小时， 加维持液继续培养。(3)观察与收获接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况。当细胞病变达80%以上时收获，冻融3次。-20°C保存，应不超过30日。4.病毒灭活将检验合格的病毒液导入灭活罐内，计量加入10%甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，使甲醛的最终浓度为0.1%。经37°C搅拌灭活16小时。灭活后的病毒液置2 8°C保存，不超过30日。5.疫苗制备(1)油相制备取注射用白油94份，硬脂酸铝2份，在油相制备罐中混合均勻并加热至80°C后，再加入司本-806份，至温度达到125°C时维持30min，冷却后，导入贮油罐中(2)水相制备将检验合格的猪细小病毒抗原液96份与灭菌的吐温-804份导入水相制备罐中，开启搅拌电机搅拌20 30min，使吐温-80完全溶解。(3)乳化取油相2份导入乳化罐中，开动电机低速搅拌，同时徐徐加入水相1份后， 再以4000r/min搅拌40分钟。乳化后，取疫苗IOml加入离心管中，3000r/min离心15min， 析出后，水相不超过0. 5ml。(4)分装定量分装，加盖密封。二、疫苗的安全试验1.猪细小病毒灭活疫苗对靶动物非使用日龄的安全性试验用本发明人按本法试制的猪细小病毒灭活疫苗01、02、03批分别对4 6周龄健康仔猪16头和怀孕30 60日母猪8头进行肌肉注射，細1/头，另1组注射生理盐水作对照。观察试验猪接种疫苗后的安全性，仔猪连续观察14日，母猪观察至分娩，统计母猪产仔情况。免后14日每组剖杀2头， 观察疫苗吸收情况。结果表明，免疫组和对照组仔猪、妊娠母猪采食、精神、粪便均正常，注射部位未见肿胀、结节、发炎；免疫组母猪正常分娩，未见流产、死胎、弱仔、木乃伊胎等繁殖障碍现象发生。说明我们试制的疫苗非使用日龄接种仔猪和妊娠母猪是安全的。详见表1、 表2。表1猪细小病毒灭活疫苗(YBF01株)接种仔猪的安全性试验
权利要求
1.一种能预防由猪细小病毒引起的猪细小病毒灭活疫苗，其特征是该疫苗含有经甲醛溶液灭活的YBFOl株猪细小病毒及常规的矿物油佐剂，该病毒毒株已于2011年5月5日送北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMMCC No. 4809。
2.一种猪细小病毒灭活疫苗的生产方法，其特征在于其生产方法主要包括(1)将扩大培养的ST细胞种子细胞接种到转瓶中，37°C培养；按培养液的量将 YBFOl株猪细小病毒种子接入长势良好细胞贴壁达50% 80%弃去培养液的ST细胞，置 37°C吸附1. 5小时，加维持液继续培养；当细胞病变达80%以上时收获，冻融3次；(2)取冻融后的病毒液测定病毒含量和红细胞凝集价，每0.Iml病毒含量不低于 IO6 qTCID5q，病毒液对0.5%豚鼠红细胞血凝效价不低于1 256;(3)按常规方法收获培养物经甲醛溶液灭活，加入矿物油佐剂混合乳化制成猪细小病毒灭活疫苗。
全文摘要
本发明涉及一种细小病毒灭活疫苗(YBF01株)的生产方法。本发明所涉及的疫苗是采用免疫原性良好猪细小病毒YBF01株接种ST细胞培养，收获细胞培养物，经甲醛溶液灭活后，与油佐剂混合乳化制成。用于预防由猪细小病毒引起的猪细小病毒病。此疫苗具有安全性好、免疫效力高且免疫期长等优点。
文档编号A61K39/23GK102205120SQ20111013220
公开日2011年10月5日 申请日期2011年5月20日 优先权日2011年5月20日
发明者刘蕾, 李金积, 申洪银, 胡潇, 范根成, 邹敏, 陶晓珊 申请人:青岛易邦生物工程有限公司