专利名称：一种肠道病毒71型与甲型肝炎联合疫苗的利记博彩app
技术领域：
本发明属于医学生物技术领域，涉及一种联合疫苗及其制备方法，特别是涉及肠道病毒71型与甲型肝炎联合疫苗及其制备方法。
背景技术：
近年来手足口病发病日益频繁，患病病例及病死人数逐年上升，严重威胁着我国儿童与婴幼儿的健康，给社会造成巨大的经济负担。2008年5月我国将手足口病纳入丙类传染病管理。肠道病毒71型作为手足口病最主要的病原体，常常与手足口病大规模爆发流行、重症和死亡病例相关。甲型肝炎是一种主要的强传染性的肠道传染病，发病率高，流行面广，是我国法定管理的乙类传染病。为有效控制疾病的流行，研究开发用于预防上述两种类肠道病毒引起的疾病的疫苗具有重大意义。肠道病毒71型(EV71)和甲型肝炎病毒(HAV)均是通过粪-口途径传播的小RNA 病毒科病毒，分别属于肠道病毒属和嗜肝病毒属，人类是它们唯一的自然宿主。肠道病毒71型手足口病(HFMD)是由多种肠道病毒引起的全球性常见传染病。 1958年首次报道了发生于新西兰的病例，同年分离出主要病原CA16，1969年首次确认另一个重要病原体EV71，之后EV71与CA16交替出现，成为HFMD的主要病原体。HFMD的病原还包括其他多种肠道病毒。近年来EV71感染在我国大陆呈现上升趋势，分离的EV71毒株皆属C4基因亚型。疾病感染手足口病、中枢神经系统感染及疱疹性咽峡炎是EV71感染引起的常见临床症状，但在EV71流行过程中的表现差异很大。20世纪70年代欧洲爆发的EV71中患者症状主要表现为脑炎和脊髓灰质炎样麻痹，HFMD症状很少见；而同期日本流行的EV71主要表现为HFMD症状。在1998年台湾地区EV71流行中，中枢神经系统感染者中有80%同时患HFMD，而同期澳大利亚的这个比例只有7%。急性咽峡炎在中国香港地区、日本和中国台湾地区的EV71流行中都曾有报道。EV71引起的神经源性肺水肿主要分布于亚太地区EV71 流行的大量病例中。发热和急性呼吸道疾病是幼儿EV71感染的又一常见临床症状，在澳大利亚、加拿大和1998年中国台湾的EV71流行中都有报道。流行病学(1)全球概况1975年，保加利亚发生EV71大流行，共有705名患儿受到感染，死亡44例，93 %的重症病例和83. 8 %的死亡病例发生在5岁以下人群。1978年匈牙利发生EV71疫情，出现拟6例无菌性脑膜炎和7M例脑炎病例，死亡45例。1972-1999 年日本、澳大利亚与马来西亚均发生多次EV71大流行。2003-2007年越南爆发三次大规模 EV71疫情。近30多年间世界发生的HFMD大流行都是由EV71感染引起的，EV71已成为全球范围内最重要的中枢神经毒性病毒病原。(2)中国大陆概况我国常见的HFMD发病形式有流行和散发两种。1987年在湖北省HFMD流行期间首次发现EV71感染。1995年武汉病毒研究所从HFMD病人中分离出EV71。1998与2000年台湾地区和山东省招远市先后暴发 EV71感染引起的HFMD。2002年4_6月上海市发生HFMD。2004年3_7月深圳市发生HFMD 聚集性病例10起。2006年我国报告HFMD病例13，637例，死亡6例。2007年报告83，344
3例，死亡17例；2008年HFMD居全国报告的丙类传染病发病数第二位，死亡数的首位，报告病例489，073例，重症1，165例，死亡1 例，重症与死亡病例中EV71感染率分别为81. 59% 与96. 43%。截至2009年9月底，全国累计报告HFMD例970，477例，重症12,861例，死亡 317 例。甲型肝炎甲型肝炎是由HAV引起的肝脏急性，发病率与社会经济发展水平密切相关，不同地区人群抗HAV抗体阳性率不同(15%-100%)。估计每年有150万甲型肝炎临床病例发生。HAV感染后可诱导产生终生免疫。在低度流行区甲型肝炎通常会在高危人群中以单个病例形式出现或呈小规模爆发，在高度流行区多数人在儿童期已获得隐性感染而临床病例较少见。在中、低度流行国家成人病例更为常见。疾病感染HAV本身不导致细胞病变，肝细胞损害是由白细胞介导的免疫反应所致。急性甲型肝炎与其他类型的急性病毒性肝炎难以区分，典型症状包括发热、不适、厌食、呕吐和腹部不适，随后出现尿色加深和黄疸。约有0.01%的临床病例会出现爆发性肝炎，病死率很高。HAV引起的急性肝炎并发症较少，引起的肝外并发症较多。HAV不会引起慢性感染，目前无特异性抗病毒治疗方法。甲型肝炎的病死率为0. 015%，感染临床表现与患病年龄有关，5岁以内幼儿90%以上不出现明显症状；15岁左右的青少年约有25%有症状；成年人则90%以上症状和体征明显。大年龄组人群疾病严重程度增加、死亡率增高。流行病学(1)全球概况人体感染HAV后出现抗HAV抗体，血清抗体阳性率可作为人群的病毒传播标志。北欧血清抗体阳性率最低约15%，欧洲其他地区、澳大利亚、日本和美国，40%-70%的成人血清抗体阳性。发展中国家所有成人几乎都有既往感染的血清学证据。( 中国大陆概况中国是甲型肝炎的高发区，城市人群感染率>80%，农村人口感染率> 90%。1990 2009年全国甲型肝炎发病总体呈逐年下降趋势，发病数由584,353 例下降至43，841例；发病率由52. 58/10万下降至3. 28/10万。我国全年均有甲型肝炎发病，呈现春季高发现象，但发病流行高峰不明显。发病年龄主要集中在青壮年和儿童中，男性发病多于女性。2004年爆发沈起，2005年爆发33起，2006年爆发43起，发病数依次为 2，291 例、2，061 例和 1，808 例。甲型肝炎疫苗已经上市多年，我公司生产的肠道病毒71型灭活疫苗业已获准进行临床试验。
发明内容
本发明旨在提供一种EV71与HAV联合疫苗及其制备方法。为实现本发明的目的，本发明首先提供一种EV71与HAV联合疫苗，其包含灭活 EV71以及灭活HAV。在另一个实施方案中，还包括铝佐剂。其中所述的灭活EV71抗原含量为25 1600U/ml(EV71抗原含量检测用EV71抗原参比品可购自中国食品药品检定研究院)；灭活HAV抗原含量的半数有效量(指引起50% 实验对象出现阳性反应时的药量，ED50)为不高于125u，优选为25 2000u/ml。优选的灭活EV71抗原含量为50 800U/ml，灭活HAV抗原含量为100 1000u/ml。在本发明的一个实施方案中，所述的铝佐剂优选为氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝。联合疫苗中铝含量终浓度为0. 125 2. Omg/ml，优选的铝含量终浓度为0. 25 1. Omg/ml。本发明所用的铝佐剂，可以市售获得也可以采用已知方法进行制备，该佐剂为本领域技术人
4员所熟知，易于获得和制备。本发明中，所述灭活EV71毒株可选用本领域公知的任何适用于本发明的EV71病毒的基因型，优选为A、B、C基因型，病毒培养用细胞为Vero细胞或者2BS细胞；灭活HAV毒株可选用本领域公知的任何适用于本发明的HAV疫苗株，优选为TZ84株、YN5株、HMl75株和吕8株，培养用细胞为Vero细胞或2BS细胞。本发明的另一个目的在于提供所述联合疫苗的制备方法，其包括将灭活EV71和灭活HAV分别吸附于铝佐剂，将上述两种灭活病毒的吸附产物混合制得EV71与HAV联合疫苗；或者将灭活EV71与灭活HAV混合后再与铝佐剂进行吸附；或者先将灭活EV71与铝佐剂进行吸附以后再加入灭活HAV进行吸附；或者先将灭活HAV与铝佐剂进行吸附以后再加入灭活EV71进行吸附。与现有技术相比，本发明具有如下优点本发明的疫苗可以同时预防由EV71引起的手足口病、中枢神经系统感染及疱疹性咽峡炎、神经源性肺水肿和急性呼吸道疾病及HAV引起的甲型肝炎。动物实验表明，联合疫苗中EV71的免疫原性高于EV71灭活疫苗的免疫原性。EV71与HAV病毒均为单链小RNA 病毒，结构不稳定易发生变异，一般RNA病毒变异速度比DNA病毒快一到两个数量级；由于灭活疫苗的安全性较高，因此采用EV71、HAV病毒分别培养、灭活后制备灭活疫苗优于减毒疫苗。EV71与HAV灭活病毒的病毒外壳完整，构象保持较好，可以使机体产生较高的免疫原性诱导出特异性中和抗体，EV71与HAV灭活病毒制备联合疫苗优于重组病毒。EV71病毒为肠道病毒71型，HAV为肠道病毒72型，由两种肠道病毒制备的联合疫苗具有肠道病毒类疾病更大的保护范围；同时由于两种病毒均采用接种细胞后培养纯化的方式制备，具有相似的生产工艺便于工业生产，同时由于均是灭活病毒，联合疫苗具有更高的安全性。含有两种及以上的抗原，可以同时预防两种及以上疾病的联合疫苗以其方便多效、成本低成为新一代疫苗研制的热点，与单一疫苗相比，联合疫苗可以减少疫苗的接种次数，减少生产运输储存和销售冷链运作的运输与保存成本，具有显著的优越性。本发明的联合疫苗使用了经充分证明具有良好安全性及免疫原性的HAV灭活疫苗，可大大减低疫苗的生产成本和市场价格。同时该联合疫苗吸附完全，理化性质稳定，相互干扰作用。动物实验表明，根据本发明EV71与HAV联合疫苗的优选实施方案制备的EV71与 HAV联合疫苗可有效诱导机体产生针对EV71和HAV的高滴度、特异性抗体，体外实验证实该联合疫苗所诱导的抗体具有明显的反应性与中和活性；特别的联合疫苗中EV71的与免疫效果不受另一组分的影响与干扰，吸附率大于95%，免疫原性不劣效于EV71灭活疫苗和 HAV灭活疫苗的两种单价疫苗。本发明提供的联合疫苗具有与两种单价疫苗相同的免疫原性。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1 灭活EV71原液的制备培养待接种Vero细胞至长成致密的单层后进行细胞消化，1 8稀释传代培养至长成单层后接种病毒，EV71灭活疫苗病毒种子按照1 102CCID5(l/ml接种于长好的Vero细胞，于33士 1°C培养15天，根据细胞病变情况收获培养后的细胞病毒上清得到EV71病毒收获液。收获液采用终浓度不超过250 μ g/ml的甲醛灭活不低于6天，然后通过超滤与柱层析等纯化方式进行纯化，合并层析纯化液超滤浓缩后除菌过滤，得到灭活EV71原液。实施例2 灭活HAV原液的制备采用含有新生牛血清的fegle’ s MEM培养基培养2BS细胞，细胞长好后经过细胞消化与稀释传代培养后，接种0. 05 1. OMOI的TZ84株、YN5株、HM175株和吕8株的HAV 培养，培养期间根据细胞生长情况换维持液，维持液为含有新生牛血清的fegle’ s MEM培养基。培养至病毒增殖高峰期后，采用胰蛋白酶或其他适宜方法消化含有HAV的细胞，经过离心或者过滤的方法收集病毒收获液。采用超滤法浓缩病毒，再用色谱层析法纯化病毒；除菌过滤后用终浓度不超过250 μ g/ml的甲醛于37士 1°C灭活12天，灭活后的病毒液为灭活 HAV原液。实施例3 :EV71与HAV联合疫苗制备吸附方式1 将稀释后的灭活HAV和稀释后灭活EV71分别用铝佐剂吸附后，混合两种灭活病毒的吸附产物，制成EV71与HAV联合疫苗。吸附方式2 将稀释后的灭活HAV先用铝佐剂吸附后，再加入稀释后的灭活EV71 进行吸附，制成EV71与HAV联合疫苗。吸附方式3 将稀释后灭活EV71先用铝佐剂吸附，再加入稀释后灭活HAV进行吸附，制成EV71与HAV联合疫苗。吸附方式4 将稀释后的灭活HAV与稀释后灭活EV71先混合，然后将混合液加入铝佐剂进行吸附，制成EV71与HAV联合疫苗。其中EV71抗原含量为400U/ml、200U/ml、 100U/ml, HAV抗原含量为500u/ml ；铝佐剂终浓度为0. 4mg/mL·检测四种吸附方式制备的EV71与HAV联合疫苗的吸附完全性、解离抗原以及体内效力。EV71与HAV抗原吸附效果与解离抗原分别采用EV71与HAV抗原双抗体夹心酶联免疫法检测，检测灵敏度分别为5U/ml、15. 6u/ml ；EV71体内效力试验将联合疫苗采用0、14天两针腹腔免疫ICR小鼠，第观天采血，以细胞病变法检测血清中抗EV71中和抗体滴度。HAV 体内效力试验将联合疫苗1 8、1 32、1 1 稀释后Iml/只腹腔免疫ICR小鼠，第观天采血，用甲肝抗体测定试剂盒检测抗HAV抗体效价，根据抗体阳转率计算ED5tlt5结果见下表。抗原吸附完全性与ED5(1、EV71解离抗原回收率计算方法如下吸附完全性
(HAV I EV-1 匕:+f ？.兮 *
(HAV iz EVl)土- ^ ii理」 歹I.疫苗的吸附完全性反应疫苗中没有被铝佐剂捕获的游离的抗原含量占疫苗中总的理论抗原含量的比值，结果越高显示疫苗的吸附效果越好。ED50 :50%阳转终点对数=高于50%阳转率稀释对数+距离比例X稀释对数的因数ED50 =疫苗单位剂量/50%阳转终点疫苗稀释度(阳转终点反对数)
权利要求
1.一种肠道病毒71型与甲型肝炎联合疫苗，其特征在于，包括灭活肠道病毒71型病毒和灭活甲型肝炎病毒。
2.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，还包括铝佐剂。
3.根据权利要求2所述的联合疫苗，其特征在于，所述的铝佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝。
4.根据权利要求1 3任一项所述的联合疫苗，其特征在于，所述的肠道病毒71型灭活病毒的抗原含量为25 1600U/ml。
5.根据权利要求4所述的联合疫苗，其特征在于，所述的灭活肠道病毒71型病毒为肠道病毒71型病毒A、B或C基因型。
6.根据权利要求1 3任一项所述的联合疫苗，其特征在于，所述的灭活甲型肝炎病毒的抗原含量为25 2000u/ml。
7.根据权利要求6所述的联合疫苗，其特征在于，所述的灭活甲型肝炎病毒选自甲型肝炎病毒TZ84株、YN5株、HM175株和吕8株。
8.根据权利要求2或3所述的联合疫苗，其特征在于，所述的铝佐剂的铝含量为终浓度 0. 125 2. Omg/ml ；优选的铝含量终浓度为0. 25 1. Omg/ml。
9.权利要求1 8任一项所述的联合疫苗的制备方法，其特征在于将肠道病毒71 型灭活病毒与甲型肝炎灭活病毒分别吸附于铝佐剂，制备病毒铝吸附产物，然后将铝吸附产物混合制备联合疫苗；或者将肠道病毒71型灭活病毒与甲型肝炎灭活病毒混合后再与铝佐剂进行吸附；或者先将肠道病毒71型灭活病毒与铝佐剂进行吸附以后再加入甲型肝炎灭活病毒进行吸附；或者先将甲型肝炎灭活病毒与铝佐剂进行吸附以后再加入肠道病毒 71型灭活病毒进行吸附。
10.权利要求1 8任一项所述的联合疫苗在制备预防或治疗肠道病毒71型病毒和甲型肝炎病毒引起的疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种肠道病毒71型与甲型肝炎联合疫苗，包括肠道病毒71型灭活病毒以及甲型肝炎灭活病毒，还包括铝佐剂。本发明还提供制备所述肠道病毒71型与甲型肝炎联合疫苗的方法，该方法无需添加明胶等保护剂，无需进行pH调节，所制得的疫苗吸附效果与稳定性均较好。接种本疫苗后，甲肝病毒对肠道病毒71型有佐剂效果，肠道病毒71型的免疫原性得到增强，免疫效果达到或超过单价疫苗的免疫效果。本疫苗具有肠道病毒71型与甲型肝炎的双重免疫性与保护性能，接种本疫苗可以减少接种针次，简化免疫程序，同时有效预防人及动物由肠道病毒71型和甲型肝炎病毒引起的疾病。
文档编号A61K39/295GK102210858SQ20111012907
公开日2011年10月12日 申请日期2011年5月18日 优先权日2011年5月18日
发明者尹卫东, 蔡芳, 薛晨宝, 高强 申请人:北京科兴生物制品有限公司