一株发酵乳杆菌及其应用的利记博彩app

专利名称：一株发酵乳杆菌及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一株发酵乳杆菌及其应用，属于生物技术领域。
背景技术：
饲料中添加抗生素能够抵抗疾病，促进动物的生长，加快集约化畜牧业的发展。但是随着人们生活水平的提高和对健康程度的不断重视，抗生素添加剂在给人们带来巨大的经济利益的同时其负面效应逐渐显现，最典型的特征就是抗生素引起的耐药性，内源性感染、二重感染以及食品中残留，这些将对养殖业、饲料工业和动物带来严重威胁，进而通过食物链危机人类健康。因此，禁止抗生素添加剂在畜牧业中使用的呼声越来越高，研究和开发新的抗生素替代品的工作迫在眉睫。近年来，益生菌因其安全、绿色无污染且对动物生长具有显著作用而被作为抗生素替代品的首要选择。乳酸杆菌是益生菌中的主要菌种，它是动物消化道栖生微生物，在防治胃肠道感染、调节免疫功能和调节肠道的微生物菌群平衡中具有较好作用，如能够促进仔猪增重、降低猪肠道的PH值、改善血液生化指标，增强消化道内酶活性及降低肠道大肠杆菌数等，使用乳酸杆菌益生素可以调整胃肠道微生态平衡，所以乳酸杆菌是一种很有前途的益生素生产菌种。美国FDA和AAFCO在1989年公布的安全微生物品种共43种，其中乳酸杆菌占12种，中华人民共和国农业部2011年公布允许使用的19种饲用微生物中有6 种是乳酸杆菌。在美国，益生素工业上应用的产品57%含有乳酸杆菌属。大连医学院康白等开发研制的乳酶生，是一种乳酸杆菌的干燥制剂，保存期间稳定性好，每克产品含活乳酸杆菌约IO7个，仔猪每日口服3-4克可以有效治疗腹泻。乳酸杆菌除了能提高动物的生产性能以外，还能提高动物的抗病力，赵庶吏等 (2004)研究发现生物菌对致病性大肠杆菌有很强的抵抗作用，使仔猪下痢和发病率降低 87.4%，治疗效果非常显著。Peran等Q006)研究发现发酵乳杆菌通过释放谷胱甘肽及调节细胞因子(如TNF-α)和诱导型一氧化氮合酶的表达，来防止鼠结肠炎的发生。乳酸菌类产品的开发利用已成为饲料工业一个活跃领域，但也存在一些亟待解决的问题如产品质量不稳定、活菌数量不够、消化率低和成本高等。因此，培养繁殖力强、耐受能力强、产生较高消化酶的菌种以生产出产量高、质量稳定、在体温范围内具有较高活性的乳酸杆菌类产品，以提高其利用率，同时改进工艺、降低生产成本、提高产品的市场竞争力以及对于畜牧业的发展和人类的健康都非常有意义。

发明内容
本发明的一个目的是提供一株发酵乳杆菌(LactcAaci llus fermentum) HAFI5007。本发明所提供的发酵乳杆菌(LactcAacillus fermentum) HAFI5007，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏中心登记入册编号=CGMCC No. 4648。该发酵乳杆菌具有抗逆性强、抗杂菌能力强和益生特性。
发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007具有以下生物学特性(1)在ρΗ2· 0处理6小时之后的存活率为78. 6% ；(2)在75°C水浴中加热15min后的存活率为45. 5% ；
(3)室温下放置1个月后的存活率为78. 9 % ；(4)接种在肉汤培养基于37°C，5% CO2的培养箱中培养M小时达到最高生长浓度为 IO11CfVml (图 1)。本发明的另一个目的是提供一种发酵乳杆菌菌剂。该菌剂能够替代现有的饲用抗生素，并具有抗病、促生长的作用。本发明所提供的发酵乳杆菌菌剂，其活性成分为发酵乳杆菌(LactcAacillus fermentum)HAFI5007。所述菌剂具有下述至少一种用途1)清除动物自由基的产品；2)缓解动物氧化应激的产品；3)增强动物机体抗氧化能力的产品；4)制备调解动物肠内微生态平衡的产品；5)增强动物肠道黏膜屏障的产品；6)调节动物粘膜免疫功能的产品；7)促进动物生长的产品。上述发酵乳杆菌(LactcAacillus fermentum) HAFI5007或菌剂可用于制备大肠杆菌抑制剂。所述大肠杆菌抑制剂中的大肠杆菌具体可为大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、大肠杆菌 K987P。所述自由基为下述三种自由基中的至少一种轻基自由基、超氧阴离子自由基、1，
1-二苯基苦基苯胼自由基。所述缓解动物氧化应激体现为下述1)-3)中至少一种1)提高动物肌肉、肝脏和 /或血浆中抗氧化酶的活性；2)降低动物丙二醛的含量；幻增强动物抑制自由基产生的能力。所述增强动物肠道黏膜屏障体现为改善动物肠道菌群组成和/或促进动物肠道粘液蛋白的表达。所述调节动物粘膜免疫功能体现为下述1)-3)中至少一种1)增加动物外周血 T淋巴细胞⑶4+淋巴细胞亚群的比例；2)促进回肠中TNF-α基因的表达；3)促进回肠中 IFN-Y基因的表达。所述肠道粘液蛋白为MUC2。所述菌剂具体可由发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007和保护剂混合后，冷冻干燥，制成发酵乳杆菌干燥制剂，所述的保护剂为脱脂奶粉、麦芽糊精、稻壳粉、 麦麸中的一种或多种。本发明所述发酵乳杆菌(LactcAacillus fermentum) HAFI5007或所述菌可以作为添加剂用于动物饲料，其中的动物包括但不限于猪、羊、牛、鸡等各种动物。该饲料具有与抗生素饲料类似的功能，但无抗生素饲料的副作用。
本发明的发酵乳杆菌及其发酵乳杆菌菌剂主要作为动物的饲料添加剂，其可以替代现有动物日粮中的抗生素，调节动物肠内微生态平衡，清除体内的自由基，提高抗氧化能力，从而具有增强非特异性免疫功能来预防疾病的作用，同时还可以提供营养因子、促进营养物的消化吸收、促进动物生长和提高饲料转化率、提高断奶仔猪的生产性能。本发明的发酵乳杆菌及其发酵乳杆菌菌剂对防治动物消化系统疾病起到保健作用，同时对幼年动物可刺激其胃肠道发育，所以将之作为饲料添加剂应用在饲料中能起到抗病促生长的作用。同时，本发明的发酵乳杆菌及其发酵乳杆菌菌剂无耐药性和药物在动物产品中残留从而对人类的健康产生潜在的危害的可能，是一种有前途的绿色饲料添加剂。下面结合具体实施例详细描述本发明，所述实施例用于理解而不是限制本发明。保藏说明菌种名称发酵乳杆菌拉丁名Lactobacillus fermentum菌株编号HAFI5007保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称CGMCC地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期2011年3月11日保藏中心登记入册编号CGMCC No. 4648


图1为发酵乳杆菌生长曲线。图2为平皿挖沟法测定乳酸杆菌培养物对大肠杆菌的抑制。图3为发酵乳杆菌在过氧化氢存在时的存活能力。图4为发酵乳杆菌对羟自由基的清除能力。图5为发酵乳杆菌对超氧阴离子的清除能力。图6为发酵乳杆菌对DPPH的清除能力。图7为发酵乳杆菌对断奶仔猪肠道粘液蛋白的影响(标尺200 μ m) (10X20)。ACE分别是对照组的十二指肠、空肠和回肠，BDF分别是发酵乳杆菌组的十二指肠、空肠和回肠，粘液蛋白(如深棕色颗粒或团块)。图8为发酵乳杆菌对断奶仔猪肠道组织形态的影响(标尺200 μ m) (10X20)。ACE分别是对照组的十二指肠、空肠和回肠，BDF分别是发酵乳杆菌组的十二指肠、空肠和回肠。
具体实施例方式本发明的发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum) HAFI5007，可先接种于 Rogosa SL琼脂的Himgates滚管培养基中进行培养，得到的种子培养物再接种于Rogosa SL肉汤厌氧培养基里进行培养。其中所述的琼脂培养基为适合发酵乳杆菌培养的任何培养基，本领域技术人员都
5知晓何种培养基适合发酵乳杆菌培养。然而可以优选为Rogosa SL琼脂的Himgates滚管培养基，这里所述的Rogosa SL琼脂的Hungates滚管培养基理解为以在Rogosa SL完全选择性培养基的基础上，适当修改的适合发酵乳杆菌培养的培养基。所述适合发酵乳杆菌培养的培养基可以为现有技术任何适合发酵乳杆菌培养的培养基，这为本领域技术人员所知晓，但是仍可进一步优选培养基的配方为胰蛋白胨1 20g，牛肉膏1 20g，酵母浸粉1 15g，葡萄糖1 20g，阿拉伯糖1 15g，蔗糖1 15g，醋酸钠5 25g，枸橼酸钠 1 10g，磷酸二氢钾1 15g，七水硫酸镁0. 1 1. 5g，四水硫酸锰0. 1 1. 5g，硫酸亚铁 0. 01 0. IOg,吐温-800. 1 2. OmL,琼脂5 20g，蒸馏水100 2500mL ；优选为胰蛋白胨5 15g，牛肉膏5-15g，酵母浸粉3 10g，葡萄糖5 15g，阿拉伯糖3 10g，蔗糖3 10g，醋酸钠10 20g，枸橼酸钠1 5g，磷酸二氢钾1 10g，七水硫酸镁0. 1 lg，四水硫酸锰0. 1 lg，硫酸亚铁0. 01 0. 05g,吐温-80 0. 5 1. 5mL,琼脂10 15g，蒸馏水 500 2000mL ；更优选为胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，阿拉伯糖5g， 蔗糖5g，醋酸钠15g，枸橼酸钠2g，磷酸二氢钾6g，七水硫酸镁0. 58g，四水硫酸锰0. 25g，硫酸亚铁0. 03g,吐温-80 ImL,琼脂13g，蒸馏水IOOOmL0其中的液体培养基为适合发酵乳杆菌培养的任何培养基，本领域技术人员也知晓这种液体培养基，其中可优选肉汤厌氧培养基，这里所述的肉汤厌氧培养基理解为在普通肉汤厌氧培养基的基础上，适当修改的培养基，所述适当修改的培养基可以为现有技术任何适合发酵乳杆菌培养的培养基，这为本领域技术人员所知晓，优选Rogosa SL肉汤厌氧培养基，其中培养基的配方为胰蛋白胨5 15g，牛肉膏1 20g，酵母浸粉3 10g，葡萄糖5 15g，阿拉伯糖3 10g，蔗糖3 10g，醋酸钠10 20g，枸橼酸钠1 5g，磷酸二氢钾1 10g，七水硫酸镁0. 1 lg，四水硫酸锰0. 1 lg，硫酸亚铁0. 01 0. 05g,吐温-800. 5 1. 5mL，蒸馏水500 2000mL ；更优选为胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉 5g，葡萄糖10g，阿拉伯糖5g，蔗糖5g，醋酸钠15g，枸橼酸钠2g，磷酸二氢钾6g，七水硫酸镁 0. 58g，四水硫酸锰0. 25g，硫酸亚铁0. 03g,吐温-80 ImL,蒸馏水IOOOmL0应用上述培养基，本领域技术人员一般都知晓具体培养过程，这里优选为上述 Rogosa SL琼脂培养基的Hungates滚管中培养，优选在培养箱中，37°C下，培养15 72小时；其中的发酵乳杆菌扩大培养优选在Rogosa SL肉汤厌氧培养基中，37°C下培养15 80 小时。前面所述的保护剂为本领域技术人员通常使用的能够作为发酵乳杆菌菌剂的保护剂，本发明优选所述载体为为脱脂奶粉、麦芽糊精、稻壳粉、麸皮的一种或多种，优选为脱脂奶粉，其发酵乳杆菌菌液与脱脂奶粉按照重量体积比1 8 0.1 2体积比混合，优选为3 5 0. 5 1。本发明含有发酵乳杆菌的动物饲料，其特征在于，该发酵乳杆菌饲料在提高动物抗氧化和免疫力中的作用。所述动物为家禽和家畜。本发明的动物饲料包括常用动物饲料和本发明的发酵乳杆菌菌剂。其中发酵乳杆菌菌剂的含量至少为0. 001%，优选为0. 001 3%，更优选0.01% 2%，最优选 0.05% 0.2%。主要研究该配合饲料在提高动物抗氧化和免疫力中的作用。所述动物为家禽和家畜。本发明的发酵乳杆菌菌剂可以同目前市面上任何常用动物饲料进行配合，即本发明所述动物饲料保护范围不为配合的常用动物饲料种类所限制。。
然而其中的常用动物饲料可优选为日粮，进一步优选为猪用日粮、鸡用日粮、反刍动物用日粮和水产动物用日粮。对于不同的动物，其日粮的配方各不相同，但是，现有技术中公开的任何日粮都可以作为本发明的动物饲料，其配方都是该领域的公知常识。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例2 6中的发酵乳杆菌如无特殊说明，均指发酵乳杆菌 (Lactobacillus fermentum)HAFI5007 CGMCC No. 4648实施例1、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007 的分离鉴定本发明的发酵乳杆菌是从猪胃肠道粘膜中提取、分离、筛选、纯化得到的。(一 )发酵乳杆菌的分离与纯化1. 1试验材料取健康仔猪胃肠道粘膜5cm2(胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠)，在灭菌杯中，用无菌生理盐水冲洗粘膜上的食糜，将粘膜浸入装有15mL HEPES缓冲液的烧杯中，用镊子来回摇动粘膜5min后，得到上清液。1. 2培养基1.2.1 Rogosa SL 琼脂的培养基胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，阿拉伯糖5g，蔗糖5g，醋酸钠 15g，枸橼酸钠2g，磷酸二氢钾6g，七水硫酸镁0. 58g，四水硫酸锰0. 25g，硫酸亚铁0. 03g,吐温-80 lmL，琼脂13g，蒸馏水lOOOmL，用醋酸调节pH至5. 0。1. 2. 2Rogosa SL肉汤厌氧培养基配方同1.2. 1，不添加琼脂，蒸馏水IOOOmL,用醋酸调节pH至5.0。用新配制的 0. 忍天青溶液作氧指示剂，趁热分装入Himgates管，冲CO2至无色，迅速封口。121°C高压蒸汽灭菌5min。1. 3菌株的分离培养用无菌注射器吸取0.2mL上清液注入装有Rogosa SL琼脂的Hungates滚管中，用手轻轻滚动使上清液均勻分布在管中琼脂表面。放入5% CO2培养箱，37°C培养7 之后， 在生物安全柜里无菌操作将白色针尖大小的菌落用针头挑取转移到厌氧无菌Rogosa肉汤里进行培养，观察肉汤是否变浑浊，有浑浊的放置4°C冰箱贮藏备用。1.4革兰氏染色用无菌注射器吸取少量Rogosa SL肉汤培养物，滴在载玻片上，在酒精灯火焰上轻轻烘干固定。滴加结晶紫染色液，染lmin，水洗；滴加革兰氏碘液媒染，作用lmin，水洗；滴加丙酮乙醇混合液(丙酮95%乙醇=3 7)脱色30s，水洗；滴加沙黄染色液复染lmin， 水洗，待干，在普通光学显微镜上观察，菌体成红色为阴性，紫色的为阳性。呈革兰氏阳性形态一致的杆菌，进一步进行接触酶试验。1. 5接触酶试验作Rogosa SL斜面培养基，取培养物约0.2mL注入装有Rogosa SL培养基斜面，5% 0)2培养箱，37°C培养Mh，长出菌落后，将3%过氧化氢溶液滴加到菌落上，若没有气泡产生说明是阴性，若有气泡产生说明是阳性。通过Rogosa SL厌氧培养的培养物经革兰氏染色阳性和接触酶试验阴性可初步认为是乳酸杆菌属(Lactobacillus)。
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2结果与讨论本试验从健康仔猪胃肠道粘膜中利用经过盐酸校正后Rogosa SL完全选择性培养基筛选出5907株乳酸杆菌株。将仔猪胃肠道粘膜在HEPES缓冲液中摇动5min，用无菌注射器吸取0. 2mL上清液装入含Rogosa SL琼脂的滚管中培养Mh，再挑去白色菌落在厌氧无菌 RogosaSL肉汤里进行培养。经过革兰氏染色和接触酶试验，证明乳酸杆菌是健康仔猪胃肠道的优势菌群，说明经盐酸校正的Rogosa SL培养基适合分离胃肠道粘膜乳酸杆菌。菌种的筛选是及其烦琐的过程。大多数乳酸菌的选育过程是从消化道上皮分离益生菌，这样便可以获得具有良好定植效果的菌种。( 二)发酵乳杆菌的抗逆性选育1. 1培养基1. 1. IRogosa SL 肉汤培养基同(一)中的1.2. 2。1.1.2厌氧斜面培养基同(一)中的1.2.1。1. 2耐酸性能选育制备含pH3. O和pH2. 5的Rogosa SL肉汤培养基，分别接种已培养Mh的胃乳酸杆菌和肠乳酸杆菌，接种量1 %，于37°C培养24h后观察。如果培养基变的浑浊，说明该菌株耐酸。从接种开始和第他用无菌注射器取出ImL进行梯度稀释至10_5后，取0.3mL稀释液在MRS琼脂(pH5. 2)上均勻涂布，平皿放置在37°C，5% 0)2培养箱中，培养Mh，计算存活率。然后镜检看是否染菌。能够生长的菌株的最初分离样品保存在_80°C冰箱备用。1. 3耐胆盐性能选育制备含猪胆盐0. 3 %的厌氧斜面培养基，接种已培养Mh的菌株，接种量1 %，于培养24h后观察。如果培养基变的浑浊，说明该菌株耐胆盐。然后镜检看是否染菌。能
够生长的菌株的最初分离样品保存在_80°C冰箱备用。1. 4耐高铜性能选育制备含有250mg/kg五水硫酸铜的肉汤厌氧培养基，接种已培养Mh的菌培养物， 接种量1%，于培养12 7 后观察。如果培养基变的浑浊，说明该菌株耐高铜。然后镜检看是否染菌。能够生长的菌株的最初分离样品保存在_80°C冰箱备用。1. 5耐高锌性能选育制备含有氧化锌的肉汤厌氧培养基，接种已培养24h的菌培养物，接种量1%， 于培养12 7 后观察。如果培养基变的浑浊，说明该菌株耐高锌。然后镜检看是否染菌。能够生长的菌株的最初分离样品保存在_80°C冰箱备用。2.结果与讨论2. 1耐酸性能选育通过耐酸性能选育，有513株乳酸杆菌可以在pH2. 1的Rogosa SL培养基中生长繁殖，淘汰率为30%。这说明胃肠道的大多数乳酸杆菌耐酸性能较好，有70%可以在仔猪的胃肠道中进行繁殖。乳酸杆菌一般通过定植在消化道上皮发生益生特性。因此，如果菌种对胃酸没有耐受性很难对动物的生产性能产生良好的作用。2. 2耐胆盐性能选育
将通过耐酸性能选育的513株乳酸杆菌进行耐胆盐性能选育，有103株乳酸杆菌可以在含胆盐0.3^WR0g0sa SL培养基中生长繁殖，淘汰率为79.92%。研究表明，胆盐是肠乳酸杆菌在动物胃肠道内遇到的比胃酸更不利的因素。Chou和Weimer (1999)研究发现用胆盐选择性驯化乳酸杆菌对胆盐的耐受力是有效的，经过几代胆盐驯化之后得到的乳酸杆菌耐胆盐的能力比亲代乳酸杆菌强，乳酸杆菌容易对胆盐性能产生耐受性，且具有一定的遗传性，选育出耐胆盐的发酵乳杆菌在生产中具有重要的意义。2. 3耐高铜性能选育将通过耐胆盐性能选育的103株乳酸杆菌进行耐高铜性能选育，有87株乳酸杆菌可以在含250mg/kg五水硫酸铜的Rogosa SL培养基中生长繁殖，淘汰率为15. 53%。证明该乳酸杆菌具有较强的耐高铜特性。由于高铜日粮具有促生长的作用，是目前我国比较普遍使用的日粮，因此选择具有耐高铜的发酵乳杆菌是极其必要的。2. 4耐高锌性能选育将通过耐高铜性能选育的87株乳酸杆菌进行耐高锌性能选育，有76株乳酸杆菌可以在含氧化锌的Rogosa SL培养基中生长繁殖，淘汰率为12.64%。高锌具有防止腹泻、促进生长的作用，因此在我国利用氧化锌来配制仔猪饲料，尤其是生产断奶仔猪饲料的厂家很多。因此选育出耐高锌的发酵乳杆菌也是必要的。3 小结通过本试验获得76株来源于仔猪胃肠道粘膜，对消化道内环境有一定抵抗能力的乳酸杆菌菌株，这为以后的选种工作打下了基础。(三)发酵乳杆菌的益生特性选育1. 1发酵乳杆菌代谢产物抑制大肠杆菌能力的选育大肠杆菌(K88、K99和987P)购自中国兽药监察所。Κ88在中国医学细菌保藏管理中心的保藏号为CMCC44742，K99在中国医学细菌保藏管理中心的保藏号为CMCC44820， 987P在中国医学细菌保藏管理中心的保藏号为CMCC44317。乳酸杆菌76株耐酸、耐胆盐、耐高铜、耐高锌的肠乳酸杆菌。培养基麦康凯(MacConkay)培养基(购自北京天坛生物制品般份有限公司)。在Hungates管里加MRS肉汤(蛋白胨，IOg ；牛肉浸膏，IOg ；酵母浸粉，5g ；磷酸氢二钾，2g ；枸椽酸二铵，2g ；葡萄糖，20g ；七水硫酸镁，0. 58g ；四水硫酸锰，0. 25g ；醋酸钠， 5g ；蒸馏水，IOOOmL)约15mL，充二氧化碳，制成无菌厌氧MRS肉汤。每个管中分别接种从健康仔猪胃肠道分离到的76株抗逆性强的肠乳酸杆菌，乳酸杆菌经1 培养后按接种于肉汤中，在37°C培养箱里培养24h后，置4°C冰箱保存备用。抑制大肠杆菌试验制作麦康凯培养基，加热溶解后在121°C高压灭菌15min后， 无菌倾倒平皿。用记号笔在平皿底部划线将平皿分成三个平行的区域，每个区域用接种棒划线接种大肠杆菌培养液G.0X108CFU/mL)于培养基表面，然后在距平皿中线约3cm的地方挖一宽为0. 5cm的沟，沟与接种划线垂直，用热接种棒补底，如图2所示。分别用不同的乳酸杆菌培养物将沟填满(不能溢出)，置普通培养箱37°C培养1 后，观察出现大肠杆菌菌落的位置，大肠杆菌的菌落为红色，测定离小沟最近的大肠杆菌菌落与小沟的距离。每个乳酸杆菌作两个平行样，以平均值表示结果。1. 2乳酸杆菌与大肠杆菌混合培养抑制作用选育
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大肠杆菌(K88、K99和987Ρ)来源与1. 1节同。乳酸杆菌16株肠代谢产物对大肠杆菌具有较强抑制作用的乳酸杆菌。大肠杆菌的检测培养基麦康凯(MacConkay)培养基与1. 1节同。乳酸杆菌接种于厌氧无菌MRS肉汤中，37°C培养24h后，置4°C冰箱保存备用。1. 2. 1不同浓度乳酸杆菌对大肠杆菌的抑制随机选择一株乳酸杆菌，取5mL培养物(8. 2X109CFU/mL)分别与5、10、15mL营养肉汤混合，制成3个含不同乳酸杆菌培养物浓度的营养肉汤，接种大肠杆菌，接种量为培养液的5%，置37°C，5% CO2培养箱培养4、8和1 后，分别用无菌注射器取出培养液，培养液经梯度稀释成10_2 10_5后，每个稀释度作4个平行样，取0. 3mL稀释液，用“L”棒均勻涂布于麦康凯琼脂平板上，置于37°C，普通培养箱培养18h，取菌落数在50 150个的平皿计数，以平均值表示结果，计算每毫升培养液中大肠杆菌的数量。1. 2. 2含1/4乳酸杆菌的营养肉汤中乳酸杆菌与大肠杆菌的数量关系取5mL乳酸杆菌培养物(108CFU/mL)与15mL营养肉汤混合，接种24h大肠杆菌培养物，接种量为培养液的10% (107CFU/mL)，起始混合液中乳酸杆菌的数量为大肠杆菌的10 倍，用0. IN NaOH溶液调节培养液的pH为7.0，置37°C培养箱培养24h后，分别用无菌注射器取出培养液，培养液经梯度稀释至10_5，ΙΟ"6,10_7后，取0. 3mL稀释液用“L”棒均勻涂布于 MRS琼脂培养基上，每个梯度的培养液作3个平行样，MRS琼脂培养基(pH5.4)置37°C、5% CO2培养箱培养18h，取菌落数在50 150个的平皿计数，以平均值表示乳酸杆菌的数量，计算每毫升培养液中乳酸杆菌的数量。培养24h后直接用无菌注射器取ImL培养液经梯度稀释至10_2后，取0. :3mL稀释液置于麦康凯琼脂上，用“L”棒均勻涂布，每个管做3个平行样， 将平板置于37°C，普通培养箱培养18h，计算每个平板的大肠杆菌菌落数，以平均值表示结^ ο2结果与讨论2. 1乳酸杆菌代谢产物抑制大肠杆菌的选育乳酸杆菌代谢产物抑制大肠杆菌的效果以离小沟最近的大肠杆菌菌落与小沟的距离为指标，距离越大，说明抑菌效果越好。本试验所采用的平皿挖沟法是对经典的平皿挖孔法的改进，基本原理是放置在沟中的抗菌物质能渗透过琼脂来抑制大肠杆菌，随着离沟距离的增大，能渗透过去的抗菌物质的浓度就越小。大肠杆菌菌落与小沟的距离越大，说明乳酸杆菌代谢产物所含抗菌物质的抑菌能力越强。用平皿挖沟法在同一平皿可以同时测定乳酸杆菌代谢产物对3株大肠杆菌的抑制作用，而用平皿挖孔法在同一平皿只能测定对一株大肠杆菌的抑制作用。16株肠乳酸杆菌的抑菌距离在0. 7 3. Icm之间，进一步研究它们与大肠杆菌混合培养的数量关系。2. 2乳酸杆菌与大肠杆菌体外培养的数量关系2. 2. 1不同比例乳酸杆菌培养物与大肠杆菌在混合培养条件下的数量关系结果见表1。表1营养肉汤中含不同比例乳酸杆菌培养液对大肠杆菌的抑制作用(单位CFU/ mL)
权利要求
1.发酵乳杆菌(LactcAacillusfermentum) HAFI5007，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 4648。
2.一种发酵乳杆菌菌剂，其特征在于所述菌剂的活性成分为权利要求1所述的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007。
3.权利要求1所述的发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)HAFI5007或权利要求2 所述的菌剂在制备下述任一产品中的应用1)清除动物自由基的产品；2)缓解动物氧化应激的产品；3)增强动物机体抗氧化能力的产品；4)制备调解动物肠内微生态平衡的产品；5)增强动物肠道黏膜屏障的产品；6)调节动物粘膜免疫功能的产品；7)促进动物生长的产品。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述自由基为下述三种自由基中的至少一种轻基自由基、超氧阴离子自由基和1，I" 二苯基苦基苯胼自由基；所述缓解动物氧化应激体现为下述1)-3)中至少一种1)提高动物肌肉、肝脏和/或血浆中抗氧化酶的活性；2)降低动物丙二醛的含量；幻增强动物抑制自由基产生的能力；所述增强动物肠道黏膜屏障体现为改善动物肠道菌群组成和/或促进动物肠道粘液蛋白的表达；所述调节动物粘膜免疫功能体现为下述1)-3)中至少一种1)增加动物外周血T淋巴细胞⑶4+淋巴细胞亚群的比例；2)促进回肠中TNF-α基因的表达；3)促进回肠中IFN-γ 基因的表达。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述肠道粘液蛋白为MUC2。
6.根据权利要求3-5中任一所述的应用，其特征在于所述动物为猪。
7.含有权利要求1所述发酵乳杆菌(LactcAacillusfermentum) HAFI5007或权利要求 2所述菌剂的动物饲料。
8.权利要求1所述发酵乳杆菌(LactcAacillusfermentum) HAFI5007或权利要求2所述菌剂在制备大肠杆菌抑制剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述大肠杆菌抑制剂中的大肠杆菌为大肠杆菌K88、大肠杆菌K99或大肠杆菌987P。
全文摘要
本发明公开了一株发酵乳杆菌及其应用。该发酵乳杆菌为Lactobacillus fermentumHAFI5007，2011年3月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏中心登记入册编号CGMCC No.4648。本发明的发酵乳杆菌主要作为动物的饲料添加剂，提高猪营养物质消化率，改善胃肠道微生物菌系组成、肠道粘液蛋白表达以及肠道粘膜免疫功能，改善机体的抗氧化防御系统，缓解氧化应激造成的氧化损伤，改善提高猪的生产性能。
文档编号A61P31/04GK102226157SQ20111011657
公开日2011年10月26日 申请日期2011年5月6日 优先权日2011年5月6日
发明者丁修良, 宋青龙, 张海燕, 谯仕彦 申请人:北京龙科方舟生物工程技术中心