专利名称：鸡传染性法氏囊病病毒ibdv vp2蛋白配体结合表位多肽及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于分子病理学与免疫学技术领域，具体涉及鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白配体的结合表位多肽及其应用。
背景技术：
IBD是由IBDV引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病，病毒在法氏囊的B淋巴细胞中迅速繁殖，损伤法氏囊的B淋巴细胞，引起严重的免疫抑制，往往给养鸡业带来较大的经济损失。近年来，IBDV超强毒株的不断产生，增加了对该病的防控难度。在病毒感染细胞的过程中，病毒吸附细胞是第一步也是关键步骤，这涉及病毒结合细胞的受体与细胞上的配体与病毒之间的相互作用问题，病毒必须首先结合到靶细胞表面，经受体的介导进入细胞，然后才能复制，引起相关的病理变化；因此如果找到病毒配体或者病毒受体，以其中任何一个为药靶都可以阻断病毒与受体的结合。初步研究结果获得了一些IBDV受体和配体的信息，如受体是糖蛋白，与SIgM阳性B细胞的表面分子有关，也可能是鸡热休克蛋白 90 ；结合IBDV受体的配体蛋白是IBDV VP2，但是IBDV配体蛋白VP2与受体结合多肽表位未见报道。应用生物技术和蛋白质技术来研究病毒受体和病毒配体，对于探明IBD发生的分子机制，阻断病毒对细胞的吸附和侵染过程，防止传染病的发生有重大意义。可以预见，发现病毒配体是最有竞争力和挑战性的课题之一。而与此相关的基础及应用研究必将极大丰富我们对病毒与宿主关系的认识，并对抗病毒疫苗及抗病毒药物的设计产生重大影响。 IBDV作为无囊膜的RNA病毒，研究IBDV配体线性多肽表位，揭示该病毒的侵染机制，具有重要的理论价值和实践意义，从分子水平上探索IBDV感染细胞的机制，将为研究开发IBDV感染阻断剂药物，控制传染病的发生提供理论依据，同时也为其它传染病致病机制的研究提供借鉴和参考。本实验室已经成功制备了 30多株IBDV单抗，为IBDV VP2配体结合表位的研究奠定了坚实的基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明提供了 IBDV结合靶细胞的一条线性配体表位多肽P22的氨基酸序列，该配体表位多肽P22能够抑制IBDV感染CEF，随多肽浓度的增加感染率降低，并且得到能够完全抑制病毒感染靶细胞的多肽浓度。还提供了细胞免疫化学染色鉴定多肽P22与CEF的结合效率及多肽抑制IBDV感染CEF靶细胞的方法。本发明的技术方案
本发明利用生物信息学技术，分析了 IBDV的VP2蛋白氨基酸序列的一级结构，设计并合成了 IBDV VP2蛋白上的1条多肽，P22命名为。以CEF为靶细胞，通过IBDV的感染、收获，测定了 IBDV的毒力、半数组织培养感染剂量(TCID50)和感染比(Μ0Ι )，进行合成多肽与靶细胞的结合试验、病毒阻断试验和多肽阻断IBDV感染靶细胞的试验，筛选的特异性结合靶细胞能够抑制病毒感染配体表位多肽，并对IBDV的配体表位进行了精确定位。鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白配体的结合表位多肽的氨基酸序列为Iqs ngnykfdqmlgtaqnlpasynycrlvsrsltvrsstIpggο所述的结合表位多肽位于VP2三维结构S区域的D-E环。所述的结合表位多肽为线性配体结合表位。所述的结合表位多肽用Sulfo-NHS-Biotin标记多肽时，多肽与 Sulfo-NHS-Biotin 的摩尔比为 1:1 1 :4。所述多肽能够抑制IBDV感染CEF的多肽浓度为0. 00625 0. 2mmol/L。所述多肽能够完全抑制IBDV感染CEF时的多肽浓度为0. 2mmol/L。利用所述的结合表位多肽鉴定该多肽与CEF结合效率的方法包括以下步骤 ⑴制备CEF，37°C培养Mh，直至细胞铺满96孔细胞培养板；
⑵加多肽，倾去上清液，将培养好的单层细胞用预冷的PBS洗涤3次，在培养板上依次加入浓度为 0. 2mmol/L、0. Immol/L、0. 05mmol/L、0. 025mmol/L 的用 Biotin 标记的多月太 Biotin-P22,100 μ 1/孔，每个浓度重复做3次，在4°C结合lh，使细胞与Biotin-P22多肽充分结合，设6孔不加Biotin标记的多肽P22的正常细胞做对照实验，设6孔加Biotin-BSA 的细胞做无关多肽对照实验；
(3)用预冷的PBS洗涤细胞3次，洗去未结合的多肽，中止多肽结合试验；
(4)固定，加入含0.3%H2O2的甲醇溶液，50μ 1/孔，4°C固定lOmin，倾去上清液，用 PBST洗涤3次；
(5)封闭，加入含5%血清的PBST缓冲液，100μ 1/孔，37°C封闭Ih ；倾去上清液，用 PBST洗涤3次；
(6)加Avidin-HRP，加入辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白，50μ 1/孔，1:500稀释，稀释液为含5%血清的PBST缓冲液，37°C作用Ih ；倾去上清液，用PBST洗涤3次；
(7)用AEC显色试剂盒显色，根据试剂盒的说明进行操作，在显微镜下观察试验结果， 并记录染色细胞数目。利用所述的结合表位多肽鉴定该多肽抑制IBDV感染CEF靶细胞的方法包括以下步骤⑴制备CEF，37°C培养Mh，直至细胞铺满96孔细胞培养板；
⑵加多肽，倾去细胞上清液，用预冷PBS洗涤细胞一次，在培养板上依次加入浓度为 0. 00625mmol/L、0. 0125mmol/L、0. 025mmol/L、0. 05mmol/L 0. Immol/L、0. 2mmol/L 的 P22 多肽和BSA，100 μ 1/孔，每个浓度重复做3次，稀释液为10%的DMEM，其中BSA作为无关多肽， 4°C作用Ih ；
(3)加病毒倾去含有多肽的上清液，每孔加入10倍TCID50量的IBDV感染细胞，其中一组不加病毒只加完全培养基作为阴性对照，4°C作用Ih ；
(4)用新鲜10%的DMEM培养基洗涤细胞3次，加新培养基于感染的细胞孔中，100μ 1/ 孔，在含5%ω2的培养箱中，37°C培养48h ；
(5)在倒置显微镜下观察细胞病变，同时进行细胞免疫化学染色，统计感染细胞数量， 具体步骤如下
5所述细胞免疫化学染色步骤为
①固定，加入含0.3%H2A的甲醇溶液，50μ 1/孔，4°C固定lOmin，倾去上清液，用 PBST洗涤3次；
②封闭，加入5%血清PBST，100y1/孔，37°C封闭Ih ；倾去上清液，用PBST洗涤3次；
③加Avidin-HRP，加入辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白，50μ 1/孔，1:500稀释，稀释液为含5%血清的PBST缓冲液，37°C作用Ih ；倾去上清液，用PBST洗涤3次；
④用AEC显色试剂盒显色，根据试剂盒的说明操作，在显微镜下观察试验结果，并记录染色细胞数目。所述的结合表位多肽在抑制IBDV感染CEF中的应用。本发明的积极有益效果
1、本发明提供了 IBDV结合靶细胞的一条线性配体表位多肽P22，该表位多肽位于VP2 蛋白上。2、本发明的配体表位多肽P22能够抑制IBDV感染CEF，并随多肽浓度的增加，CEF 的感染率降低，具有剂量依赖性，并得出多肽浓度为0. 2mmol/L时能够完全抑制IBDV感染 CEF靶细胞的结论。3、本发明采用的细胞免疫化学染色鉴定多肽P22与CEF细胞的结合效率及多肽抑制IBDV感染CEF靶细胞的方法，该方法特异、敏感、经济易操作。4、本发明为进一步从病毒配体和病毒受体相互作用方面进行病毒配体表位的研究，为进一步揭示IBDV的感染机制，以及抗病毒药物筛选和新型疫苗的研制提供了理论依据。
图1
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图12图。
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图16
实施例2中0. 2mmol/L的Biotin_P22结合CEF的结果(100X)。
实施例2中0. lmmol/L的Biotin_P22结合CEF的结果(100X)。
实施例 2 中 0. 05mmol/L 的 Biotin_P22 结合 CEF 的结果(100X)。
实施例2中Biotin-BSA结合CEF的结果(100X)。
实施例2中正常的CEF (100X)。
实施例3中P22-moIgG与CEF结合的散点图。
实施例3中P22-moIgG与CEF结合的集合图。
实施例3中的Xin-I株IBDV阻断P22-moIgG与CEF结合抑制的散点图。 实施例3中的Xin-I株IBDV阻断P22-moIgG与CEF结合抑制的集合图。 实施例3中的moIgG与CEF结合的散点图。 实施例3中的moIgG与CEF结合的集合图。
实施例3的结合试验和阻断结合试验的流式细胞仪叠加分析的平面叠加
实施例3中的结合试验和阻断结合试验的流式细胞仪叠加分析的三维图。 实施例4中0. 2mmol/L P22抑制IBDV感染CEF的结果Q00X)。 实施例4中0. 15mmol/L P22抑制IBDV感染CEF的结果(200X)。 实施例4中0. 05mmol/LP22抑制IBDV感染CEF的结果(200X)。
图 17图 18图 19图 20图 21图 22图 2具体实施例方式下面结合附图和具体实施例来进一步详细说明本发明。本发明中若没有特别说明外，其中的百分比均指重量百分比。实施例1 IBDV VP2多肽的设计、合成、Sulfo-NHS-Biotin标记多肽及多肽与小鼠 IgG CmoIgG)偶联
1. 1多肽的设计
利用DNASIS (Ver. 2. 5，Hitachi)软件将IBDV (P15480)的氨基酸序列进行分析， 并参照IBDV VP2的晶体结构(Fass6li Coulibaly等，2005年)，设计1条IBDV VP2多肽 P22，位于S区的D-E环，且多肽N端均添加Cys，用于载体蛋白偶联。多肽的合成
利用Symphony 12通道多肽合成仪在Fmoc-氨基酸-王树脂(Fmoc-Amino Acids attached to Wang Resin,RrZK ) ± ISIffi^lin-) ' (solid-phase peptide
synthesis)合成多肽，多肽合成按标准操作规程进行。基本合成过程为执行^(1_1程序进行C末端氨基酸王树脂溶涨一执行Std程序(或Md_db程序)*加20%的piperidine 脱Fmoc保护一用DMF洗树脂一*加下一位Fmoc保护氨基酸和活化剂HBTU进行酰化反应一*用Kaiser法或TNBS法检测酰化反应的完成情况一*DMF洗树脂一重复执行 Std程序(或Md_db程序)，在树脂上连接下一位氨基酸(重复带*步骤)，直到该多肽序列合成完成。根据组成肽链氨基酸不同选取适当的裂解试剂，执行乂(1_(31￥程序，用TFA法裂解肽链与树脂的连接一冷乙醚离心沉淀法回收TFA裂解多肽一Sephadex G_25脱盐纯化一MS和HPLC分析鉴定和纯化多肽。其中，多肽裂解反应完成后，应用冷乙醚离心沉淀法从TFA裂解多肽收集液中回收合成肽产物。将收集管中的收集液蒸发30 60min，过滤除掉杂质。向收集液中加入3倍收集液体积的冷乙醚(4°C )，盖好收集管盖，颠倒混勻，冰浴 10分钟，3000r/m，离心lOmin，弃上清，留沉淀。重新用新鲜的冷乙醚重悬沉淀(旋涡震荡)， 重复以上操作3次。收集沉淀物，即为粗品合成肽。粗品合成肽经过G25脱盐纯化，再经制备型HPLC纯化后，冷冻干燥，-20°C保存备用。合成IBDV VP2的多肽P22其氨基酸序列如 SEQ ID N0:1，其分子量为 4. 80kDa。标记多肽
(1)将Sulfo-NHS-Biotin和多肽从_20°C取出，放置室内使之恢复至室温；
(2)称量2.2mg的Sulfo-NHS-Biotin，溶于0. 5mL的双蒸水中，充分混勻，配制成 IOmmol/L 的 Sulfo-NHS-Biotin 溶液；
实施例4中0. 025mmol/L P22抑制IBDV感染CEF的结果(200X)。 实施例4中0. 0125mmol/L P22抑制IBDV感染CEF的结果(200X)。 实施例4中0. 00625mmol/L P22抑制IBDV感染CEF的结果Q00X)。 实施例4中未加P22直接用10TCID50的IBDV感染CEF的结果Q00X)。 实施例4中BSA抑制IBDV感染CEF的结果Q00X)。 实施例4中正常的CEF (200 X).
实施例4中不同浓度P22多肽抑制IBDV感染CEF的感染抑制曲线。⑶称量2mg多肽，溶于50μ DMSO溶剂中，配制成400mg/ml的储存液；
(4)取出80μ Sulfo-NHS-Biotin与50μ 的多肽溶液充分混合(连接时多肽与 Sulfo-NHS-Biotin摩尔比是1:2)，室温作用30min，4°C过夜孵育，获得Biotin_P22多肽；
(5)以10%的DMEM调整Biotin-P22多肽浓度至lmg/ml，混勻后，小剂量分装用于CEF
结合试验。小鼠IgG CmoIgG)的提纯
以饱和硫酸铵盐析法粗提纯鼠血清IgG。(1)取一定量血清，3000r/m、4°C离心30min ；取上清液加入等量PBS，对0. Olmol/ LpH 5.4 PB液透析Mh，沉淀优球蛋白，3000r/m，4°C离心30min;
(2)取上清，加SAS使终浓度达50%，室温作用2h，不断搅拌，3000r/m,室温离心30min， 弃去上清液；
⑶沉淀用双蒸水溶解，加入SAS使终浓度达35%，室温作用池，期间不断搅拌，3000r/ m，室温离心30min，弃去上清液；
⑷沉淀用双蒸水溶解，再加入SAS使终浓度达33%，室温作用lh，期间不断搅拌， 3000r/m，室温离心30min，弃去上清液；
(5)加入相当于原血清量的双蒸水溶解沉淀；于4°C对PBS搅拌透析96h，期间换液4 6次；收集蛋白液即为血清IgG。测定蛋白含量后分装，-20°C保存(或加入终浓度0. 1%叠氮钠，4°C保存)备用。. 5多肽与moIgG偶联
(1)用异型双功能试剂SMCC将多肽N端Cys的-SH与载体蛋白moIgG上的NH2相连， 形成人工结合的moIgG偶联多肽P22- moIgG。(2)在 50ml DMSO 中溶解 Img Sulfo-SMCC (MW 436.37，Spacer arm length: 11.6 A, Pierce)，加入moIgG溶液560ml，充分混勻，室温反应1 h或37°C作用30 min，并不时混勻。(3) 4°C 下对偶联缓冲液(0. lmol/L PB pH 7.2，0. 15 mol/L NaCl, Immo 1/ L EDTA)过夜透析，换液3次，去除多余偶联剂。该溶液即为SMCC活化moIgG载体蛋白 (SMCC-moIgG)，用偶联缓冲液调整蛋白浓度为5mg/ml，分装、冻存。(4)称取ang P22多肽，以50ml 二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解，加入150ml含5 mmol/L EDTA 的 0. 01 mol/L PB (pH 7. 2)，制备多肽储存液，浓度为 10 mg/ml，_20°C冻存。(5)偶联时，取IOml多肽储存液(IOOmg)，加入等体积含5 mmol/L EDTA的 0. 01mol/L PB (pH 7.2)；与 60ml SMCC-MoIgG 溶液(300mg)充分混合，室温反应 4 h，4°C 过夜孵育，获得偶联多肽P22- moIgG。(6)以 0.01 mol/L PB (pH 7. 2)调整偶联多肽P22_moIgG浓度至 0. 5 mg/ml，用于 P22的结合试验。实施例2细胞免疫化学染色方法检测Biotin-P22与CEF结合试验 (1)制备CEF，37°C培养24h后，待到细胞铺满96孔细胞培养板；
⑵倾去上清，培养好的单层细胞用预冷的PBS洗涤3次，在培养板上分别依次加入浓度从 0. 2mmol/L、0. Immol/L、0. 05mmol/L 至 0. 025mmol/L 的 Biotin 标记的多肽 Biotin-P22，100y 1/孔，每一个稀释浓度做3个重复孔，4°C结合lh，使细胞与Biotin_P22多肽充分结合，设6孔不加Biotin标记的多肽P22的正常细胞做对照，设6孔加Biotin-BSA 的细胞为对照。(3)用预冷的PBS轻柔的洗涤细胞3次，洗去未结合的多肽，中止多肽结合试验；
(4)固定，加入0.3%H2O2甲醇溶液50μ 1/孔，4°C固定lOmin，倾去上清，PBST洗涤3
次；
(5)封闭，加入5%血清PBST100 μ 1/孔，37°C封闭Ih;倾去上清，PBST洗涤3次；
(6)加Avidin-HRP，加入辣根过氧化酶标记抗生物素蛋白50μ 1/孔，1 500稀释，稀释液为5%血清PBST，37°C作用Ih ；倾去上清，PBST洗涤3次；
(7)AEC显色，按照试剂盒说明，依次将试剂盒中的A溶液、B溶液和C溶液各取一滴于 Iml双蒸水中，充分混勻防止结晶出现，加以上溶液于96孔细胞板上，50 μ 1/孔，室温作用 lOmin，显微镜下观察试验结果，并将染色细胞计数，整理记录结果。参见图1 图5。图1 图5表明Biotin-P22多肽能与CEF结合，并且P22多肽主要结合到CEF的细胞膜上，结合效率随P22浓度的增加而提高，而BSA不能结合CEF。图中箭头所指为染色细胞。实施例3流式细胞术分析多肽结合试验和病毒阻断试验
用CEF分别同时进行以下试验。试验分为三组，试验A组P22- moIgG结合CEF试验； 试验B组moIgG结合CEF试验，作为阴性对照；试验C组IBDV封闭CEF结合位点后，然后进行P22- moIgG结合CEF试验，作为阳性对照。具体试验步骤如下
(1)按照常规方法制备CEF将细胞与细胞培养瓶中培养24h后，待细胞长成单层； ⑵预冷的PBS洗涤3次，用胰酶消化细胞lOmin，用IOml移液器将细胞从细胞瓶中吹下，混勻，减少细胞大团块，1500r/m离心5min，弃去细胞上清。(3)加入新的预冷的PBS，将细胞重悬，并使细胞的浓度在IO6个/ml ；
⑷加病毒(仅试验C需此步骤，试验A和试验B不进行此步骤)，加入200 μ 1 IBDV (20070630分装保存，TCID50为10 4. 5)，混勻，0°C结合Ih ；
(5)1500r/m，4°C离心离心5min，弃上清，加入Iml的洗液(10ml预冷PBS加0. 5ml胎牛血清与200 μ 1 10%NaN3)，用预冷洗液洗涤细胞，1500r/m，4°C离心5min，沉淀细胞，弃去上清；
(6)在试验A组中加入P22-moIgG50 μ 1，试验B组中加入moIgG 200μ1，与CEF 0°C结合 30min ；
(7)1500r/m，4°C离心5min，将未结合的P22-moIgG和moIgG移除，弃去上清，加入Iml 的洗液，洗涤吹勻细胞，1500r/m，4°C离心5min，沉淀细胞，弃去上清；
(8)加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG，l:10稀释后，分别向试验A、B和C组中加入 100 μ 1 ,0°C 结合 30min ；
(9)1500r/m，4°C离心5min，将未结合的FITC标记的山羊抗小鼠IgG移除，弃去上清，加入Iml洗液，洗涤吹勻细胞，1500r/m，4°C离心5min，沉淀细胞，弃去上清；
(10)用0.5ml预冷的PBS将CEF重新悬浮，混勻，400目尼龙网过滤，通过流式细胞术检测结合情况，每组试验样品计数10000个细胞。参见图6 图13。图6和图7表明P22-moIgG结合CEF的阳性细胞数为63. 7%，平均荧光强度(mean fluorescence intensity, Μ. F. I)为 113. 89。图 10 和图 11 表明moIgG 结合 CEF 的阳性细胞数为11. 5%，平均荧光强度为35. 75。图6与图7、图10与图11共同说明P22-moIgG 多肽能够结合CEF，而试验中设置的阴性对照moIgG则不能与CEF结合。图8和图9为IBDV阻断P22_moIgG结合CEF试验，结果显示经IBDV阻断后 P22-moIgG结合CEF的阳性细胞数为37. 2%，平均荧光强度为87. 23，与P22-moIgG直接结合CEF相比，阳性细胞数下降了沈.5%，平均荧光强度下降了沈.66。说明IBDV能阻断 P22-moIgG结合CEF，P22多肽为IBDV VP2的配体结合表位。图12和图13是同时利用流式细胞术将实施例3中的三个样品叠加分析，进一步表明P22与CEF的有效结合，并且IBDV成功阻断P22-moIgG结合CEF。其中，图6 图13中的A是阴性对照，P22 IBDV单抗上清与细胞作用后，加入 FITC-Iabeled goat anti-moIgG. ；B 是 P22_moIgG 与 CEF 作用后，加入 FITC 标记的羊抗体；C是IBDV先与细胞作用，然后加入P22-moIgG，最后加入FITC标记的羊抗鼠IgG.
实施例4细胞免疫化学染色方法鉴定多肽P22抑制IBDV感染CEF试验 (1)制备CEF，37°C培养24h后，待到细胞铺满96孔细胞培养板； ⑵加多肽倾去细胞上清，用预冷PBS洗涤细胞一次，在培养板上依次加入浓度从 0. 00625mmol/L、0. 0125mmol/L、0. 025mmol/L、0. 05mmol/L 0. lmmol/L、至 0. 2mmol/L 的 P22 多肽和BSA，100 μ 1/孔，每一个稀释浓度做3个重复孔，稀释液为10%DMEM，其中BSA作为无关多肽，4°C作用Ih;
(3)加病毒倾去含有多肽的上清，在每孔中加入10TCID50鸡传染性法氏囊病毒感染细胞，其中一组不加病毒，只加完全培养基作为阴性对照组，4°C作用Ih ；
(4)用新鲜10%DMEM培养基洗涤细胞3次，加新培养基于感染的细胞孔中，100 μ 1/ 孔，在5%ω2培养箱中、37°C培养48h。(5)在倒置显微镜下观察细胞病变，同时进行细胞免疫组化学染色，统计感染细胞数量，具体步骤如下
①固定，加入含0.3%H2O2的甲醇溶液50 μ 1/孔，4°C固定lOmin，倾去上清，PBST洗涤3次；
②封闭，加入5%血清PBST100 μ 1/孔，37°C封闭Ih;倾去上清，PBST洗涤3次；
③加Avidin-HRP，加入辣根过氧化酶标记抗生物素蛋白50μ 1/孔，1:500稀释，稀释液为5%血清PBST，37°C作用Ih ；倾去上清，PBST洗涤3次；
④AEC显色，按照试剂盒说明，依次将试剂盒中的A溶液、B溶液和C溶液各取一滴于 Iml双蒸水中，充分混勻防止结晶出现，加以上溶液于96孔细胞板上，50 μ 1/孔，室温作用 IOmin,显微镜下观察试验结果，并将染色细胞计数整理、记录结果。参见表1、图14 图22。图14表明，Ρ22多肽在0. 2mmol/L时可以完全抑制IBDV病毒感染CEF，培养板上 CEF全部不感染。图15 图19说明随着P22多肽浓度的降低，CEF的感染数量呈增多趋势，当多肽的浓度降低到一定范围的时候，对抑制病毒感染细胞基本不起作用。图20作为阳性对照，只加10TCID50的IBDV的CEF全部感染；图21作为无关多肽对照，BSA在任何浓度都不能抑制IBDV感染CEF，细胞未染色；图22为抑制试验中细胞的感染情况作为阴性对照，正常CEF未染色。图中箭头所指颜色较深细胞为染色细胞。图14 图22共同表明IBDV VP2蛋白配体结合表位多肽P22具有抑制IBDV感染CEF的功能，且P22多肽在抑制病毒感染中具有剂量依赖性，P22浓度为0. 2 mmol/L时可以完全抑制病毒对细胞的感染。 表1 不同浓度P22抑制IBDV感染CEF
权利要求
1.鸡传染性法氏囊病病毒IBDVVP2蛋白配体的结合表位多肽，其特征是所述结合表位多月太的氛基酸序歹0为 lqsngnykfdqmlgtaqnlpasynycrlvsrsltvrsstIpggο
2.权利要求1所述的结合表位多肽位于VP2三维结构S区域的D-E环。
3.权利要求1所述的结合表位多肽为线性配体结合表位。
4.权利要求1所述的结合表位多肽，其特征是所述多肽能够抑制IBDV感染鸡胚成纤维细胞CEF的多肽浓度为0. 00625 0. 2mmol/L。
5.权利要求4所述的结合表位多肽，其特征是所述多肽能够完全抑制IBDV感染CEF 时的多肽浓度为0. 2mmol/L。
6.利用权利要求1所述的结合表位多肽鉴定该多肽与CEF结合效率的方法，其特征是 该方法包括以下步骤⑴制备CEF，37°C培养Mh，直至细胞铺满96孔细胞培养板；⑵加多肽，倾去上清液，将培养好的单层细胞用预冷的PBS洗涤3次，在培养板上依次加入浓度为 0. 2mmol/L、0. Immol/L、0. 05mmol/L、0. 025mmol/L 的用 Biotin 标记的多月太 Biotin-P22,100 μ 1/孔，每个浓度重复做3次，在4°C结合lh，使细胞与Biotin-P22多肽充分结合，设6孔不加Biotin标记的多肽P22的正常细胞做对照实验，设6孔加Biotin-BSA 的细胞做无关多肽对照实验；(3)用预冷的PBS洗涤细胞3次，洗去未结合的多肽，中止多肽结合试验；(4)固定，加入含0.3%H2A的甲醇溶液，50μ 1/孔，4°C固定lOmin，倾去上清液，用 PBST洗涤3次；(5)封闭，加入含5%血清的PBST缓冲液，100μ 1/孔，37°C封闭Ih ；倾去上清液，用 PBST洗涤3次；(6)加Avidin-HRP，加入辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白，50μ 1/孔，1:500稀释，稀释液为含5%血清的PBST缓冲液，37°C作用Ih ；倾去上清液，用PBST洗涤3次；(7)用AEC显色试剂盒显色，根据试剂盒的说明进行操作，在显微镜下观察试验结果， 并记录染色细胞数目。
7.利用权利要求1所述的结合表位多肽鉴定该多肽抑制IBDV感染CEF靶细胞的方法， 其特征是该方法包括以下步骤⑴制备CEF，37°C培养Mh，直至细胞铺满96孔细胞培养板；⑵加多肽，倾去细胞上清液，用预冷PBS洗涤细胞一次，在培养板上依次加入浓度为 0. 00625mmol/L、0. 0125mmol/L、0. 025mmol/L、0. 05mmol/L 0. Immol/L、0. 2mmol/L 的 P22 多肽和BSA，100 μ 1/孔，每个浓度重复做3次，稀释液为10%的DMEM，其中BSA作为无关多肽， 4°C作用Ih ；(3)加病毒倾去含有多肽的上清液，每孔加入10倍TCID50量的IBDV感染细胞，其中一组不加病毒只加完全培养基作为阴性对照，4°C作用Ih ；(4)用新鲜10%的DMEM培养基洗涤细胞3次，加新培养基于感染的细胞孔中，ΙΟΟμ1/ 孔，在含5%ω2的培养箱中，37°C培养48h ；(5)在倒置显微镜下观察细胞病变，同时进行细胞免疫化学染色，统计感染细胞数量。
8.权利要求7所述的方法，其特征是所述细胞免疫化学染色步骤为①固定，加入含0.3% H2A的甲醇溶液，50μ 1/孔，4°C固定lOmin，倾去上清液，用PBST洗涤3次；②封闭，加入5%血清PBST，100y1/孔，37°C封闭Ih ；倾去上清液，用PBST洗涤3次；③加Avidin-HRP，加入辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白，50μ 1/孔，1:500稀释，稀释液为含5%血清的PBST缓冲液，37°C作用Ih ；倾去上清液，用PBST洗涤3次；④用AEC显色试剂盒显色，根据试剂盒的说明操作，在显微镜下观察试验结果，并记录染色细胞数目。
9.权利要求1所述的结合表位多肽在抑制IBDV感染CEF中的应用。
全文摘要
本发明涉及法氏囊病毒的线性配体表位及具体应用，合成了IBDVVP2蛋白上的多肽P22，并以CEF为靶细胞，通过IBDV的感染、收获，测定了IBDV的毒力、半数组织培养感染剂量和感染比，进行合成多肽与靶细胞的结合试验、病毒阻断试验和多肽阻断IBDV感染靶细胞的试验，筛选的特异性结合靶细胞能够抑制病毒感染配体表位多肽，并对IBDV的配体表位进行了精确定位。本发明的多肽P22能够抑制IBDV感染CEF，并随多肽浓度增加，CEF的感染率降低，具有剂量依赖性，当多肽浓度为0.2mmol/L时能够完全抑制IBDV感染CEF靶细胞。本发明为进一步从病毒配体和病毒受体相互作用方面进行病毒配体表位的研究提供了理论依据。
文档编号A61P31/14GK102268077SQ20111011265
公开日2011年12月7日 申请日期2011年5月3日 优先权日2011年5月3日
发明者孙国鹏, 宁红梅, 岳锋, 张艳芳, 朱彦彩, 朱艳平, 李鹏, 王选年, 贾文科, 银梅 申请人:新乡学院