专利名称：一种肽改性链段及其在肽分子影像探针改性中的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种肽改性链段及其应用，特别涉及一种肽改性链段及其在肽分子影像探针改性中的应用。
背景技术：
正电子发射断层扫描(PET)作为21世纪生物医学研究和临床诊断的尖端技术，被称为“活体生化显像”技术，可以从体外无创、定量、动态地观察人体内的生理、生化变化，洞察标记药物在正常人或病人体内的活动，在分子影像研究领域中地位显著。相比于常规B 超、CT、MR等解剖影像手段，它可以早期提供功能、代谢信息；与SPECT相比，PET分辨率高， 可定量分析，具有明显优势。PET采用的分子影像探针绝大多数是人体内源性代谢物或类似物。PET显像核素常为体内必需元素，如18F可以替换代谢物的H原子，所得类似物的生物活性与原代谢物很相似；且18F的物理半衰期短(tl/2= 109. 7分钟)，对人辐照剂量小。以肿瘤细胞中过度表达的受体为靶向的肽分子影像探针具有快速清除、优良的组织渗透性和低免疫原性等特性，是目前分子影像研究的热点。尽管PET和18F标记的分子成像探针具有很多优势，但目前只有少数几种18F标记的肽分子影像探针被应用于临床实验， 还没有一种肽分子影像探针通过美国食品与药品监督管理局(FDA)的审批正式用于临床。 究其原因主要是肽分子影像探针在体内的药代动力学性能差。尽管体外实验表明许多肽分子影像探针具有很好的受体结合能力及细胞摄取，但是PET显像结果却很差，肿瘤摄取和肿瘤与背景的对比度难以达到要求。通常必须对靶向肽进行修饰以改进其药代动力学性能，才能用于PET显像，常用方法包括聚乙二醇(PEG)修饰和引入糖结构。这两项技术已经成功应用于RGD多肽分子影像探针的修饰改性。但是对于亲水性很差的肽分子影像探针， 这两项技术改性的效果并不理想，且不易进行工业化生产。因此，开发一种新的肽分子影像探针改性技术是十分必要的。
发明内容
本发明的目的就是针对上述缺陷，提供了一种肽改性链段，结构式如下 (L) m- (A) n- (S) ο,
其中L为连接链段，m为0-10 ；A为PN或NP氨基酸对，η为1_10 ；S为间隔链段，ο为 0-10。所述连接链段L为甘氨酸或乙二醇组成；所述m为1-10，ο为1_10 ；所述m为3，n 为1, ο为1。所述PN或NP氨基酸对中，氨基酸P和氨基酸N具有相反电荷。所述P为精氨酸或赖氨酸，N为天冬氨酸或谷氨酸，具体选自如下8种组合，PN 精氨酸-天冬氨酸，精氨酸-谷氨酸，赖氨酸-天冬氨酸，赖氨酸-谷氨酸；NP 天冬氨酸-精氨酸，天冬氨酸-赖氨酸，谷氨酸-精氨酸，谷氨酸-赖氨酸。所述间隔链段S由氨基酸或乙二醇组成。
本发明的另一个目的是提供一种上述肽改性链段在肽分子影像探针改性中的应用，是将肽改性链段插入到分子探针结构中靶向肽部分和显像核素部分之间制备得到改性后的肽分子影像探针。所述分子探针结构靶向肽部分为具有肿瘤靶向作用的多肽。所述分子探针结构靶向肽部分为胃泌素受体肽。所述显像核素部分为用于PET/SPECT的显像核素、含PET/SPECT显像核素的标记前体或近红外线荧光显像核素中的任意一种。所述用于PET/SPECT 的显像核素为 18F, "C，，64Cu, 99mTc，188Re ；所述用于 PET/ SPECT的显像核素为18F或68^1 ；所述含PET/SPECT显像核素的标记前体为18F-FP, 18F-SFB, 18F-FBA, 68Ga-DOTA,68Ga-NOTA,64Cu-DOTA,99mTc_hynic ；所述含 PET/SPECT 显像核素的标记前体为18F-FP或68^1-DOTA ；所述近红外线荧光显像核素为Cy5. 5。本发明的有益效果为本发明所提供的肽改性链段及其在肽分子影像探针改性中的应用，可以显著改善靶向肽的药代动力学性能，增加肿瘤摄取值和肿瘤与背景的对比度， 优化显像质量。应用自动肽合成仪通过Fmoc保护化学可以方便制得目标肽产物，适合大规模生产。
图1为18F标记的改性前的肽分子影像探针1和应用本发明肽改性链段修饰后的 18F标记的肽分子影像探针2的结构式。其中，1为18F标记的改性前的肽分子影像探针1 ；2为应用本发明肽改性链段修饰后的18F标记的肽分子影像探针2。图2为标记的改性前的肽分子影像探针3和应用本发明肽改性链段修饰后的 68Ga标记的肽分子影像探针4的结构式。其中，3为标记的改性前的肽分子影像探针3 ；4为应用本发明肽改性链段修饰后的68Ga标记的肽分子影像探针4。图3为Cy5. 5标记的改性前的肽分子影像探针5和应用本发明肽改性链段修饰后的Cy5. 5标记的肽分子影像探针6的结构式。其中，5为Cy5. 5标记的改性前的肽分子影像探针5 ；6为应用本发明肽改性链段修饰后的Cy5. 5标记的肽分子影像探针6。图4为荷PC-3瘤裸鼠尾静脉分别注射3. 7 MBq (100 μ Ci) 18F标记的肽分子影像探针1和2后0. 5、1小时冠状microPET显像图。图5为荷PC-3瘤裸鼠尾静脉分别注射3. 7 MBq (100 μ Ci) 标记的肽分子影像探针3和4后0. 5、1小时冠状microPET显像图。图6为荷PC-3瘤裸鼠尾静脉分别注射IOOnM Cy5. 5标记的肽分子影像探针5和 6后分别于0. 5、2、4、24小时的光学成像图。其中，探针1、3、5为改性前的探针，探针2、4、6为改性后的探针。
具体实施例方式以下结合附图详细说明本实用新型的具体实施方式
。
实施例1
实验原理
以靶点为胃泌素释放肽受体的蛙皮素多肽衍生物为例。序列为D-Phe-Gln-Trp-Ala-V Bl-Gly-His-Leu-NHCH2CH3的多肽具有胃泌素释放肽受体靶向性，可以通过与正电子核素 (比如18F, 68Ga)标记前体18F-2-氟苯丙酸，螯合剂DOTA反应制得18F, 标记的肽分子影像探针1和3用于PET显像，或者与近红外线荧光显像核素cy5. 5反应制得cy5. 5标记的肽分子影像探5用于光学显像.肽分子影像探针1，3，5显像效果不好，其改性可通过将肽改性链段 Gly-Gly-Gly-Arg-Asp-Asn 插入到 D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu -NHCH2CH3和显像部分18F-2-氟苯丙酸，螯合剂DOTA或cy5. 5之间制备得到改性后的肽分子影像探针2，4，6_改性前肽分子影像探针1、3、5和改性后肽分子影像探针2、4、6的结构见图1、2和3所示。材料与方法
1、蛙皮素多肽合成
所用化学试剂均为化学纯。通过固相Fmoc化学法采用CS Bio公司CS 336X多肽自动合成仪，制得肽分子影像探针1，3，5的前体肽(D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu -NHCH2CH3)，和肽分子影像探针 2，4，6 的前体肽(Gly-Gly-Gly-Arg-Asp-Asn-D-Phe-Gln -Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-NHCH2CH3)。具体方法为采用[Ethyl-Fmoc-amino)methyl] AM F树脂，氨基酸采用Fmoc保护的前体(Cs Bio公司，美国)，将上述试剂加入合成仪对应的试剂瓶中，按序列置于合成仪样品盘，采用合成仪自带的通用程序于室温自动合成。 待合成结束，取树脂，干燥，加IOml三氟乙酸，室温裂解池，裂解液加乙醚(30ml*2)离心 (4000rpm*5min)，所得白色沉淀物加水溶解，经制备型HPLC纯化，冻干，即得上述多肽。纯化条件为Proto 300 C18 柱(156843 ;5um, 25(^20mm, Higgins Analytical, Inc.美国)， 流速为lOml/min。采用梯度洗脱，洗脱剂组成从0_2分钟时的95%溶剂A (0. 1%TFA水溶液)和5%溶剂B (0. 1%TFA的乙腈溶液)变化到32分钟时的35%溶剂A (0. 1%TFA水溶液) 和65%溶剂B (0. 1%TFA的乙腈溶液)。上述多肽冻干品经MALDI-TOF-MS (Waters 公司，美国)鉴定，D-Phe-Gln-Trp-A 1 a-VaI-Gly-Hi S-Leu-NHCH2CH3 (m/z 984.61，理论值[MW] 984.15); Gly-Gly-Gly-Ar g-Asp-Asn-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HiS-Leu-NHCH2CH3 (m/z 1540.92，理论值[MW] 1540. 68)。2、多肽标记
18F标记18F-来源于GE公司的PETtracer回旋加速器。采用文献报道的方法方法 (Haubner R, Kuhnast B, Mang C, Weber WA, Kessler H, Wester HJ, etal (2004) [18F] Galacto-RGD synthesis, radiolabeling, metabolic stability, and radiation dose estimates. Bioconjug Chem 15:61-69)制得18F_2氟丙酸对硝基苯酯。干燥后加入前体肽(500ug)的二甲基亚砜溶液(DMS0，200μL)和N，N-二异丙基乙胺溶液(DIPEA，20 μ L)。 40°C反应30分钟，然后加入SOOuL质量百分浓度5%乙酸中止反应。采用HPLC对分子探针1 或2的粗产物进行纯化，纯化条件为CW Vydac蛋白质和肽柱(218TP510 ;5 μ m, 250 X 10 mm)，流速为5ml/min。采用梯度洗脱，洗脱剂组成从0_2分钟时的95%溶剂A (0. 1%TFA 水溶液)和5%溶剂B (0. 1%TFA的乙腈溶液)变化到32分钟时的35%溶剂A (0. 1%TFA水溶液)和65%溶剂B (0. 1%TFA的乙腈溶液)。收集纯化产物并用15mL水稀释。溶液流经C18 萃取柱(S印-Pak C18萃取柱(Waters公司)，使用前用无水乙醇5ml和水IOml处理)，并用5mL水冲洗。纯化后的18F标记的分子探针1或2用ImL乙醇洗脱。洗脱液在40°C下用氮气吹干。残余物溶于生理盐水中并用0.22 μ m滤膜过滤至无菌瓶中备用。过滤器和聚醚砜膜(孔径，0.22毫米，直径13毫米)均购自Nalge Nunc International0未修饰的前体肽的标记产率为30%左右，修饰过的前体肽标记产率> 90%。所有标记产物的放化纯由HPLC 测得均大于95%，条件为C18 Vydac蛋白质和肽分析柱(5 μ m, 250 X 4. 6mm)，流速为lml/ min0合成结束时根据放射剂量除以示踪剂摩尔数得到比活度约为50TBq/mmol。68Ga标记以二甲基甲酰胺200 μ L为溶剂，加入等摩尔的D0TA-NHS — Ester (1，4，7，10-
Tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-Tetraacetic Acid Mono-N-Hydroxysuccinimide Ester, Macrocyclics公司，美国)和前体肽，再加入N，N-二异丙基乙胺溶液(DIPEA) 20μ L，混勻，40°C反应30分钟，加入2ml质量百分浓度5%的乙酸中止反应。上述粗产品经 HPLC纯化。纯化条件为高效液相色谱为Waters600 HPLC系统(Waters公司)。Cw Vydac 蛋白质和肽柱(Dionex公司，美国，218TP510 ;5 μ m，250 X 10 mm)，流速为5ml/min。采用梯度洗脱，洗脱剂组成从0-2分钟时的95%溶剂A (0. P/oTFA水溶液)和5%溶剂B (0. 1%TFA 的乙腈溶液)变化到32分钟时的35%溶剂A (0. P/oTFA水溶液)和65%溶剂B (0. 1%TFA的乙腈溶液)，冻干，产率> 80%。将纯化后产物配成浓度为10ug/10uL的水溶液，取10uL， 加入HEPES缓冲液(1M)450uL，再加入68fei的盐酸(0. 6M)洗脱液(5mCi/500uL)，混勻，80°C 反应10分钟得到68Ga标记的分子探针3或4。标记产率(>95%)，HPLC测定放化纯>95%， 测定条件为C18 Vydac蛋白质和肽分析柱(5 μ m, 250 X 4. 6mm)，流速为lml/min)。68Ga 标记的分子探针3或4用0. 22 μ m滤膜过滤至无菌瓶中备用。过滤器和聚醚砜膜(孔径， 0. 22 毫米，直径 13 毫米)均购自 Nalge Nunc hternational。Cy5. 5标记以二甲基甲酰胺200 μ L为溶剂，加入等摩尔的Cy5. 5-NHS Ester (Lumiprobe公司，美国)和前体肽，再加入N, N- 二异丙基乙胺(DIPEA) 20 μ L，混勻，
40°C反应30分钟，加入2ml质量百分浓度5%的乙酸中止反应。上述粗产品经HPLC纯化。 纯化条件为高效液相色谱为Waters600 HPLC系统(Waters公司)。C18 Vydac蛋白质和肽柱(Dionex公司，美国，218TP510 ;5 μ m, 250 X 10 mm)，流速为5ml/min。采用梯度洗脱，洗脱剂组成从0-2分钟时的95%溶剂A (0. P/oTFA水溶液)和5%溶剂B (0. 1%TFA的乙腈溶液)变化到32分钟时的35%溶剂A (0. P/oTFA水溶液)和65%溶剂B (0. 1%TFA的乙腈溶液)，冻干，即得Cy5. 5标记的分子探针5或6。产率均> 80%。3、建立细胞和动物模型
PC-3人前列腺癌细胞株用于动物模型的制备，在37°C和5% CO2条件下，PC-3细胞在 F-II培养基(10%FBS) (GIBC0,美国)中生长。在无胸腺裸鼠前侧皮下注入5X IO6个肿瘤细胞，得PC-3肿瘤模型。当肿瘤长至100 - 300 mm3 (接种后3-4星期)时，该模型鼠可用于 microPET或光学显像。4、MicroPET 显像
使用西门子INVEON microPET进行microPET显像。在异氟烷麻醉后，荷瘤鼠(每组 5只)尾静脉注入3. 7 MBq (100 μ Ci) 18F标记的肽分子影像探针1或2或标记的肽分子影像探针3或4。注射后分别于30分钟和1小时，进行5分钟静态扫描。使用 2维有序子集最大期望值迭代方法(0SEM 2D)进行图象重建。ASI Pro 5. 2. 4. 01软件分析。由图4和图5 microPET影像中的颜色变化(由黑到白摄取值逐渐增高)，可见18F、68Ga 标记的肽分子影像探针1和3性能不佳，探针1未见肿瘤摄取，1和3均见肝、肾、肠摄取高。而经过Gly-Gly-Gly-Arg-Asp-Asn修饰后的肽分子影像探针2和4则显像效果良好。 探针2在注射后0. 5，Ih肿瘤吸收分别为2. 8 士0. 7，1. 8 士0. 3 ID%/g，注射后0. 5h肿瘤与肝、肾、肌肉的吸收比值分别为3. 52，0. 71，6. 19。探针4在注射后0. 5，Ih肿瘤吸收分别为 5. 6士 1. 2，3. 7士0. 6 ID%/g ；注射后0. 5h肿瘤与肝、肾、肌肉的吸收比值分别为7. 33，0. 48， 11. 52。连接链段修饰前后，示踪剂的显著差异性清楚地表明Gly-Gly-Gly-Arg-Asp-Asn肽改性链段可以显著改善示踪剂的药代动力学性能。
5.光学显像
使用美国CRi Maestro 小动物活体成像系统进行光学显像，结果如图6所示。在异氟烷麻醉后，荷瘤鼠(每组5只)尾静脉注入Cy5. 5标记的肽分子影像探针5或6。注射后分别于30分钟、2小时、4小时和M小时成像。Cy5. 5标记的肽分子影像探针5性能不佳，肿瘤对探针不摄取(图6中，由黑到红摄取值逐渐增高)，主要通过肝肾排泄。而经过 Gly-Gly-Gly-Arg-Asp-Asn修饰后的肽分子影像探针6则显像效果良好，示踪剂在肿瘤中浓聚快(0.证已达高峰)，滞留时间长(24h仍可见明显肿瘤摄取)，肿瘤/肌肉吸收比值于注射后0. 5h，2h，4h，24h分别为5. 1,6. 7，11. 2,9. 5，主要通过肾排泄。
权利要求
1.一种肽改性链段，其特征在于结构式如下(L) m- (A) n- (S) ο,其中L为连接链段，m为0-10 ；A为PN或NP氨基酸对，η为1_10 ；S为间隔链段，ο为 0-10。
2.如权利要求1所述的肽改性链段，其特征在于所述连接链段L为甘氨酸或乙二醇组成；所述m为1-10，ο为1-10 ；所述m为3，η为1，ο为1。
3.如权利要求2所述的肽改性链段，其特征在于所述PN或NP氨基酸对中，氨基酸P 和氨基酸N具有相反电荷。
4.如权利要求3所述的肽改性链段，其特征在于所述P为精氨酸或赖氨酸，N为天冬氨酸或谷氨酸，具体选自如下8种组合，PN:精氨酸-天冬氨酸，精氨酸-谷氨酸，赖氨酸-天冬氨酸，赖氨酸-谷氨酸；NP 天冬氨酸-精氨酸，天冬氨酸-赖氨酸，谷氨酸-精氨酸，谷氨酸-赖氨酸。
5.如权利要求4所述的肽改性链段，其特征在于所述间隔链段S由氨基酸或乙二醇组成。
6.一种如权利要求1-5任一所述的肽改性链段在肽分子影像探针改性中的应用，其特征在于是将肽改性链段插入到分子探针结构中靶向肽部分和显像核素部分之间制备得到改性后的肽分子影像探针。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述分子探针结构靶向肽部分为具有肿瘤靶向作用的多肽。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述分子探针结构靶向肽部分为胃泌素受体肽。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述显像核素部分为用于PET/SPECT的显像核素、含PET/SPECT显像核素的标记前体或近红外线荧光显像核素中的任意一种。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述用于PET/SPECT的显像核素为18F, 11C, 68Ga, 64Cu, 99mTc, 188Re ；所述用于 PET/SPECT 的显像核素为 18F 或 68Ga ；所述含 PET/ SPECT 显像核素的标记前体为 18F-FP, 18F-SFB, 18F-FBA, 68Ga-DOTA, 68Ga-NOTA, 64Cu-DOTA, 99mTc-hynic ；所述含PET/SPECT显像核素的标记前体为18F-FP或68^1-DOTA ；所述近红外线荧光显像核素为Cy5.5。
全文摘要
本发明公开了一种肽改性链段，结构式如下(L)m-(A)n-(S)o，其中L为连接链段，m为0-10；A为PN或NP氨基酸对，n为1-10；S为间隔链段，o为0-10。本发明的有益效果为本发明所提供的肽改性链段及其在肽分子影像探针改性中的应用，可以显著改善靶向肽的药代动力学性能，增加肿瘤摄取值和肿瘤与背景的对比度，优化显像质量。应用自动肽合成仪通过Fmoc保护化学可以方便制得目标肽产物，适合大规模生产。
文档编号A61K101/00GK102276688SQ201110038979
公开日2011年12月14日 申请日期2011年5月19日 优先权日2011年5月19日
发明者严勇军, 杨敏, 陈小元 申请人:江苏省原子医学研究所