专利名称：一种口服肿瘤纳米疫苗及其构建方法
技术领域：
本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种口服肿瘤纳米疫苗及其构建方 法。
背景技术：
肿瘤疫苗的研制已有100多年的历史，多种疫苗进行了临床试验，取得了令人鼓 舞的效果。但是，我们也应该注意到，一些在动物实验中很有效的疫苗在人体试验的结果却 令人失望，一个重要的原因是运用常规途径(肌肉注射、皮内接种)接种后，淋巴组织摄取 的抗原量有限，使得疫苗的免疫效能未能充分发挥。相比之下，2倍于体表面积的肠粘膜下 含有极其丰富的淋巴组织，且疫苗经口服后可同时激活黏膜和全身免疫，具有效率高、维持 时间长、使用方便、用药量小等特点，能更有效激发特异性CTL反应，堪称理想的免疫途径。然而，肿瘤疫苗的有效成分多为抗原蛋白分子或编码抗原的基因，这些生物大分 子口服后极易被体液稀释及酶系降解破坏、难于通过生物屏障(免疫系统，组织，细胞膜 等)，或由于半衰期短、清除率高，降低了肿瘤疫苗的生物利用度，大大限制了蛋白/肽疫苗 的口服应用。虽然有实验证实了 口服纳米药物后可被胃肠道吸收，然而，从黏膜途径投入的微 粒抗原物质的吸收率仍很低，使得疫苗经口服后很难到达M细胞，通常并不会诱导出所期 待的黏膜免疫反应，这种缺陷严重制约了黏膜疫苗的发展。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种使用安 全、方便，主动靶向于肠道M细胞的高效广谱口服肿瘤纳米疫苗。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种口服肿瘤纳米疫苗，其特征 在于，该疫苗由油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗，和通过交联剂磷脂酰乙醇胺修饰于油包水型 纳米乳剂肿瘤疫苗表面的西红柿凝集素组成。本发明还提供了一种口服肿瘤纳米疫苗的构建方法，其特征在于，该方法包括以 下步骤(1)油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的制备；(2)西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的合成；(3)油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的表面修饰。上述步骤(1)中所述的油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的制备方法为将0.5mg 1. 5mg复合抗原与Span-20、Pluronicl88和0. 6mL大豆油混合，用双蒸水调整总体积为 ImL 4mL，混合均勻得到油相；然后在3000rpm磁力搅拌下，将油相逐滴加入3mL 12mL 双蒸水水相中，再移至真空高速剪切乳化机上，在0. 510 ΙΙΦει真空下，20000转/分钟 25000转/分钟条件下高速剪切30min 50min，温度控制在80°C以下；接着移至冰浴下 30KHz 50KHz超声^iin 8min，反复超声三次，透析去除游离蛋白，并用0. 22 μ m的滤膜过滤除菌后，得到油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗；所述复合抗原为MAGE1/HSP70/MAGE3融合 蛋白与SEA超抗原按50 150 1的摩尔比混合而成；所述油相中Span-20的质量百分比 浓度为5% 10%，Pluronicl88的质量百分比浓度为15% 20%。上述步骤(3)中所述的油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的表面修饰方法为将油包水 型纳米乳剂肿瘤疫苗加入西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的PBS溶液中，在温度为0°C 4°C 的条件下反应Ih 3h，然后将反应物透析去除游离的西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺，得到 西红柿凝集素修饰的纳米乳剂肿瘤疫苗，即口服肿瘤纳米疫苗。上述的一种口服肿瘤纳米疫苗的构建方法，所述油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗与西 红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的PBS溶液的质量比为5 10 1。上述的一种口服肿瘤纳米疫苗的构建方法，所述西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的 PBS溶液中西红柿凝集素的浓度为ang/mL 6mg/mL。本发明与现有技术相比，具有以下优点1、本发明以黏膜免疫系统为切入点，选择口服免疫途径，发挥黏膜免疫系统数量 和功能上的优势，提高疫苗导入效率，放大肿瘤疫苗抗肿瘤免疫效应。并具有使用安全、方 便、用药剂量少，效率高的特点。2、本发明采用纳米乳剂作为口服疫苗的载体，在保护抗原成分不被破坏的同时， 保证疫苗有效通过膜障、酶障，提高口服肿瘤疫苗的生物利用度；并使疫苗被动靶向于 APCs、促进抗原成分提呈；利用其缓释所载抗原特性，持续、有效激活机体免疫。3、本发明以西红柿凝集素修饰于纳米乳剂疫苗NE(MHMS)表面，利用凝集素能特 异性靶向结合于肠道M细胞的特性，有效提高纳米疫苗吸收率，激活黏膜和全身双重免疫 的同时，能进一步保护微粒抗原免于酶解，具有创新性。4、本发明联合使用MAGE-I和MAGE-3，发挥两种肿瘤特异性抗原优势互补作用，进 一步增强疫苗的广谱性；并以一定比例混合入SEA超抗原，在激活CD8+T细胞同时有效活化 CD4+T细胞，二者协同起效，高效杀伤癌细胞。下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
图1为本发明口服肿瘤纳米疫苗的模式图。图2为本发明口服肿瘤纳米疫苗的电镜图。图3为各组肿瘤疫苗免疫后小鼠脾淋巴细胞对B16-MAGE1-MAGE3细胞的杀伤率。图4为各组肿瘤疫苗免疫后小鼠脾淋巴细胞对B16细胞的杀伤率。图5为经各组肿瘤疫苗治疗后荷瘤小鼠的肿瘤体积变化。图6为各组肿瘤疫苗对肿瘤切除后复发的预防作用。
具体实施例方式如图1所示的一种口服肿瘤纳米疫苗，该疫苗由油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗，和 通过交联剂磷脂酰乙醇胺修饰于油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗表面的西红柿凝集素组成；所 述油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗由纳米乳剂NE，和包裹在纳米乳剂NE内的复合抗原(MAGE1/ HSP70/MAGE3融合蛋白与SEA超抗原按100 1的摩尔比混合而成)组成。
一、口服肿瘤纳米疫苗的构建该口服肿瘤纳米疫苗的构建方法包括油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的制备；西红 柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的合成；纳米乳剂肿瘤疫苗的表面修饰。实施例1(1)油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的制备将1. Omg复合抗原(MAGE1/HSP70/MAGE3与SEA按100 1的摩尔比混合)、 Span-20、Pluronicl88和0. 6mL大豆油混合，用双蒸水调整总体积为2. 5mL,混合均勻得 到油相；然后在3000rpm磁力搅拌下，将油相逐滴加入7. 5mL双蒸水水相中，再移至真空 高速剪切乳化机上，在0. 7KPa真空下，23000转/分钟条件下高速剪切40min，温度控制 在80°C以下；接着移至冰浴下40KHz超声5min，反复超声三次，透析去除游离蛋白，并用 0. 22 μ m的滤膜过滤除菌后，于4°C保存备用，得到油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗；所述油相 中Span-20的质量百分比浓度为8%，PluroniC188的质量百分比浓度为18% ；(2)西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的合成将60mg的磷脂酰乙醇胺(PE)溶于60mL氯仿中，加入过量戊二酸酐室温反 应证，反应液过硅胶柱，氯仿-甲醇(体积比为9 1)洗脱，收集戊二酰磷脂酰乙醇胺 (N-glut-PE)，称取IOmg的戊二酰磷脂酰乙醇胺(N-glut-PE)，并向其中加入250 μ L DMSO 和ImL浓度为0. 15mol · Γ1的氯化钠，超声15s，调节ρΗ值至3. 5，然后加入15mg EDC，ImL 含SOmg · mL-1西红柿凝集素(TL)的Tris-HCl溶液，冰浴搅拌反应Mh，薄层色谱监测反应 进程，薄层色谱的展开剂为丁醇-乙酸-水(体积比为4 1 1)，碘蒸气显色，反应液过 硅胶柱，丁醇-乙酸-水(体积比为4 1 1)洗脱，收集产物，用流动的去离子水透析过 夜，然后用PBS缓冲液透析48h，收集透析内液，冻干即得纯化的西红柿凝集素-磷脂酰乙醇 胺(TL-PE)；(3)油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的表面修饰将油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗按8 1的质量比加入西红柿凝集素-磷脂酰乙醇 胺(TL-PE)的PBS溶液中，在温度为2°C的条件下反应池，然后将反应物透析去除游离西红 柿凝集素-磷脂酰乙醇胺，得到西红柿凝集素修饰的纳米乳剂肿瘤疫苗，即口服肿瘤纳米 疫苗TL-NE(MmK)；所述西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的PBS溶液中西红柿凝集素的浓度 为 4mg/mL。实施例2(1)油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的制备将0. 5mg复合抗原(MAGE 1/HSP70/MAGE3与SEA按50 1的摩尔比混合)、 Span-20、Pluronicl88和0. 6mL大豆油混合，用双蒸水调整总体积为lmL，混合均勻得到油 相；然后在3000rpm磁力搅拌下，将油相逐滴加入3mL双蒸水水相中，再移至真空高速剪切 乳化机上，在IKI^真空下，20000转/分钟条件下高速剪切50min，温度控制在80°C以下； 接着移至冰浴下30KHz超声8min，反复超声三次，透析去除游离蛋白，并用0. 22 μ m的滤膜 过滤除菌后，于4°C保存备用，得到油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗；所述油相中Span-20的质 量百分比浓度为5%，PluroniclSS的质量百分比浓度为20% ；(2)西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的合成(同实施例1)。(3)油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的表面修饰
将油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗按5 1的质量比加入西红柿凝集素-磷脂酰乙醇 胺(TL-PE)的PBS溶液中，在温度为0°C的条件下反应池，然后将反应物透析去除游离西红 柿凝集素-磷脂酰乙醇胺，得到西红柿凝集素修饰的纳米乳剂肿瘤疫苗，即口服肿瘤纳米 疫苗TL-NE(MmK)；所述西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的PBS溶液中西红柿凝集素的浓度 为 2mg/mL。实施例3(1)油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的制备将1. 5mg复合抗原(MAGE 1/HSP70/MAGE3与SEA按150 1的摩尔比混合)、 Span-20、Pluronicl88和0. 6mL大豆油混合，用双蒸水调整总体积为4mL，混合均勻得到油 相；然后在3000rpm磁力搅拌下，将油相逐滴加入12mL双蒸水水相中，再移至真空高速剪切 乳化机上，在0. 5KPa真空下，25000转/分钟条件下高速剪切30min，温度控制在80°C以下； 接着移至冰浴下50KHz超声3min，反复超声三次，透析去除游离蛋白，并用0. 22 μ m的滤膜 过滤除菌后，于4°C保存备用，得到油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗；所述油相中Span-20的质 量百分比浓度为10%，Pluronicl88的质量百分比浓度为15% ；(2)西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的合成(同实施例1)。(3)油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的表面修饰将油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗按10 1的质量比加入西红柿凝集素-磷脂酰乙 醇胺(TL-PE)的PBS溶液中，在温度为4°C的条件下反应lh，然后将反应物透析去除游离西 红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺，得到西红柿凝集素修饰的纳米乳剂肿瘤疫苗，即口服肿瘤纳 米疫苗TL-NE(MmK)；所述西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的PBS溶液中西红柿凝集素的浓 度为 6mg/mL。二、口服肿瘤纳米疫苗的鉴定1、口服肿瘤纳米疫苗的电镜结果经表面修饰后的纳米乳剂肿瘤疫苗(口服肿瘤纳米疫苗)为乳白色的均质胶体混 悬液，如图2所示，在透射电子显微镜下观察发现纳米乳剂呈球形，大小较均勻，平均粒径、 包裹率与未经修饰前变化不大，将采集的图象经计算机图象分析得出纳米乳剂平均粒径为 (20 士 5) nm,经计算得出，包裹率为87 %，于4°C放置6个月或3000转/分钟离心IOmin后， 外观依然为均质胶体混悬液，无分层和沉淀现象。2、口服肿瘤纳米疫苗TL-NE(MHMS)的靶向性检测以胶体金标记的MAGE1/HSP70/MAGE3融合蛋白(MHM)与SEA混合后经纳米乳剂包 裹制备油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗，进一步以TL修饰于其表面构建口服肿瘤纳米疫苗，对 构建的口服肿瘤纳米疫苗进行体外、体内靶向性检测，与未经修饰的纳米乳剂肿瘤疫苗比 较，结果显示经修饰后的纳米乳剂肿瘤疫苗(口服肿瘤纳米疫苗)在体内、外实验中表现出 了明确的PP结和肠系膜淋巴结靶向性和趋向迁移特性。3、分泌IFN- γ的MAGE-I和MAGE-3特异性T细胞的检测(ELISP0T)C57BL/6小鼠以每组10例随机分组为PBS阴性对照口服组PBS_po、空白乳剂口 服组NE(-)-po、MHM 口服组MHM-po、MHMS 口服组MHMS-po、油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗口服 组NE (MHMS) -po、口服肿瘤纳米疫苗口服组TL-NE (MHMS) _po、油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗 皮下组NE (MHMS) -Sc和口服肿瘤纳米疫苗皮下组TL-NE (MHMS) _sc。由于活化的T细胞能够分泌IFN- γ，因此采用ELISP0T检测小鼠脾脏淋巴细胞与B16-MAGE1-MAGE3混合培养后，以 分泌IFN- γ的T淋巴细胞频数反映活化的T细胞(包括⑶8+和⑶4+T细胞)数量。结果 显示，以 B16-MAGE1-MAGE3 为靶细胞时，NE (MHMS) -po 组、TL-NE (MHMS) -po 组、NE (MHMS) -sc 组和TL-NE(MHMS)-SC组均有特异性T淋巴细胞，与PBS-po组、NE(-)-po组、MHM-po组 和MHMS-po组相比，IFN- γ释放细胞频数有统计学差异，而后4组无组间差异；前4组中 以TL-NE(MHMS)-PO组免疫的小鼠脾淋巴细胞中针对MAGEl和MAGE3的特异性T细胞的数 量最高，与NE (MHMS) -po组、NE (MHMS) -sc组和TL-NE (MHMS) -sc组相比有统计学差异(ρ < 0. 05) ；NE (MHMS) -po 组、NE (MHMS) -sc 组和 TL-NE (MHMS)组 3 组相比，未见统计学差异。 以B16为靶细胞时，各组均可见少量非特异分泌IFN-Y的细胞。4、细胞毒性实验(LDH)C57BL/6 小鼠以每组 10 例随机分组为:PBS_po、NE (-) -po、MHM-po, MHMS-po, NE (MHMS) -po、TL-NE (MHMS) -po、NE (MHMS) -sc 和 TL-NE (MHMS) -sc,分别进行 LDH 释放实验， 结果如图 3 所示，NE (MHMS) -po 组、TL-NE (MHMS) -po 组、NE (MHMS) -sc 组和 TL-NE (MHMS) -sc 组免疫小鼠，其脾淋巴细胞能杀伤B16-MAGE1-MAGE3，而且其效果明显强于PBS-po组、 NE (-) -po 组、MHM-po 组和 MHMS-po 组小鼠(P < 0. 01) ；TL-NE (MHMS) -po 组杀伤效果明显 强于 NE (MHMS) -po 组、NE (MHMS) -sc 组和 TL-NE (MHMS) -sc 组(P < 0. 01) ；NE (MHMS) -po 组、 NE(MHMS)-sc组和TL-NE(MHMS)-Sc组杀伤效果无明显差别(P > 0. 05)；如图4所示，各组 对B16的杀伤能力均较低。5、抗MAGE-I抗体和抗MAGE-3抗体的检测采用间接ELISA法检测各组小鼠(每组6例)血清中抗MAGE-I的抗体和抗MAGE-3 抗体水平，结果如下表表1各组疫苗免疫小鼠血清的MAGE-I、MAGE-3抗体滴度(0D450nm)
组别Anti-MAGE-IAnti-MAGE-3NE(-)-po 组0.125±0.012*0.221±0.012*MHMS-po 组0.134±0.018ns，*0.190±0.018ns，*NE(MHMS)- po 组1.556±0.112 #，*1.731±0.300 #'*TL-NE(MHMS)- po 组1.995±0.436 #2.513±0.015 #NE(MHMS)-SC 组1.611±0.3311.941±0.329#'*TL-NE(MHMS)- sc 组1.697±0.120#'*1.778±0.205#'*注#p < 0. 01 ;ns与NE (-) -po组相比无显著性差异；*与TL-NE (MHMS) -po组相比 ρ < 0. 05。NE (-) -po 组和 MHMS-po 组小鼠血清抗体滴度(Anti-MAGE-l、Anti-MAGE-1)均明 显低于其余4个治疗组，其余4个治疗组中，以TL-NE (MHMS) -po组为最高，经组间比较有统 计学差异(P < 0. 05) ；NE (MHMS) -po 组、NE (MHMS) -sc 组和 TL-NE (MHMS)-sc 组组间的小鼠 血清抗体水平无显著性差异。6、肿瘤攻击实验C57BL/6小鼠分组后皮下接种B16-MAGE1-MAGE3，1周后100%成瘤，可以看见并可触及瘤结节，分别经口服或皮下注射免疫3次，观察疫苗对荷瘤小鼠的治疗作用。结果如 图5所示，NE (-) -po组和MHMS-po组肿瘤生长迅速；相对于NE (MHMS) -po组，NE (MHMS) -sc 组和TL-NE(MHMS)-sc组组间两两比较，肿瘤生长速度相近，无统计学差异；相对以上3组， TL-NE(MHMQ-po组的肿瘤生长速度明显小于其它组，能够明显抑制肿瘤生长。同时，如表2 所示，NE (MHMS) -po 组，TL-NE (MHMS) -po 组、NE (MHMS) -sc 组和 TL-NE (MHMS) -sc 组小鼠的生 存期较NE (-) -po组和MHMS-po组明显延长，且TL-NE (MHMS) -po组平均生存时间和生命延 长率分别为43. 10天和62. 6%，明显高于其它组，经组间比较均显示有显著性统计学差异。
表2各组疫苗对荷瘤小鼠生命延长率的影响
权利要求
1.一种口服肿瘤纳米疫苗，其特征在于，该疫苗由油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗，和通过 交联剂磷脂酰乙醇胺修饰于油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗表面的西红柿凝集素组成。
2.—种构建如权利要求1所述口服肿瘤纳米疫苗的方法，其特征在于，该方法包括以 下步骤(1)油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的制备；(2)西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的合成；(3)油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的表面修饰。
3.根据权利要求2所述的一种口服肿瘤纳米疫苗的构建方法，其特征在于，步骤(1)中 所述的油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的制备方法为将0. 5mg 1. 5mg复合抗原与Span-20、 Pluronicl88和0. 6mL大豆油混合，用双蒸水调整总体积为ImL 4mL，混合均勻得到油相； 然后在3000rpm磁力搅拌下，将油相逐滴加入3mL 12mL双蒸水水相中，再移至真空高速 剪切乳化机上，在0. 5KPa IKPa真空下，20000转/分钟 25000转/分钟条件下高速剪切 30min 50min，温度控制在80°C以下；接着移至冰浴下30KHz 50KHz超声3min 8min， 反复超声三次，透析去除游离蛋白，并用0. 22 μ m的滤膜过滤除菌后，得到油包水型纳米乳 剂肿瘤疫苗；所述复合抗原为MAGE1/HSP70/MAGE3融合蛋白与SEA超抗原按50 150 1 的摩尔比混合而成；所述油相中Span-20的质量百分比浓度为5% 10%，PluroniC188的 质量百分比浓度为15% 20%。
4.根据权利要求2所述的一种口服肿瘤纳米疫苗的构建方法，其特征在于，步骤(3)中 所述的油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的表面修饰方法为将油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗加入 西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的PBS溶液中，在温度为0°C 4°C的条件下反应Ih 池，然 后将反应物透析去除游离的西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺，得到西红柿凝集素修饰的纳米 乳剂肿瘤疫苗，即口服肿瘤纳米疫苗。
5.根据权利要求4所述的一种口服肿瘤纳米疫苗的构建方法，其特征在于，所述油包 水型纳米乳剂肿瘤疫苗与西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的PBS溶液的质量比为5 10 1。
6.根据权利要求4或5所述的一种口服肿瘤纳米疫苗的构建方法，其特征在于，所述西 红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的PBS溶液中西红柿凝集素的浓度为ang/mL 6mg/mL。
全文摘要
本发明提供了一种口服肿瘤纳米疫苗及其构建方法，该疫苗由油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗，和通过交联剂磷脂酰乙醇胺修饰于油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗表面的西红柿凝集素组成。其构建方法包括一、油包水型纳米乳剂肿瘤疫苗的制备；二、西红柿凝集素-磷脂酰乙醇胺的合成；三、纳米乳剂肿瘤疫苗的表面修饰。本发明的口服肿瘤纳米疫苗以西红柿凝集素特异性靶向结合于肠道M细胞，有效提高疫苗吸收率，激活黏膜和全身双重免疫；以纳米乳剂为疫苗载体，保证疫苗有效通过酶障和膜障，提高口服疫苗的生物利用度；在肿瘤抗原中加入超抗原SEA成分，激活CD8+T细胞同时有效活化CD4+T细胞，二者协同起效，加强肿瘤抗原的免疫效果。
文档编号A61K47/48GK102058879SQ20111000612
公开日2011年5月18日 申请日期2011年1月12日 优先权日2011年1月12日
发明者张秀敏, 王晓明, 胡沛臻, 葛伟, 隋延仿 申请人:中国人民解放军第四军医大学