生产脑膜炎奈瑟氏菌的人工荚膜多糖的方式和方法

专利名称：生产脑膜炎奈瑟氏菌的人工荚膜多糖的方式和方法
技术领域：
本发明涉及生产脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria mentingitidis)的合成和人工荚膜多糖的方式(装置，means)和方法。本发明也涉及可通过本发明方法获得的荚膜多糖。还提供了用作药物，特别用作疫苗和/或诊断剂(diagnostics)的脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖。
背景技术：
细菌性脑膜炎仍然是对全球健康的严重威胁，估计全世界每年有17万人因此而死亡(WHO，http://www.who.int/nuvi/meningitidis/en/)。尽管可利用强有力的抗微生物药剂，但病死率仍然很高(10-40% )，而且幸存者经常遭受后遗症，如神经残疾或肢体缺失和耳聋(Van Deuren 等人，Clin Micriobiol Rev 2000 ； 13 (1) 144-166 ;Kaper 等人，Nat Rev Microbiol 2004,2(2) :123-140)。脑膜炎奈瑟氏菌(Nm)是细菌性脑膜炎的最重要致病物之一，因为它具有在流行波中传播的潜力(Kaper等人，Nat Rev Microbiol 2004，2(2) :123-140 ;Rosenstein 等人，N Eng J Med 2001,344(18) :1378-1388) 产生 Nm 物种的疾病的关键毒力决定因素是它们的细胞外多糖荚膜，该多糖荚膜对人血清中脑膜炎球菌的生成是至关重要的(Vogel等人，hfect Immun 1997,65(10) =4022-4029) 基于这些多糖的抗原变异，已鉴定出Nm的至少十二种不同的血清组(血清群，serogroup) (A、B、C、E29、H、I、K、L、W-135、X、Y和Z)，但仅六种(A、B、C、W-135、Y和X)导致几乎所有的病例；还可参见 Handbook of Meningococcal Disease. Frosch, Μ. , Maiden, Μ. C. J. (eds).Weinheim =Wiley-VCH ψ^ Frosch,M. ,V0GEL,U. (2006) "Structure and genetics of themeningococcal capsule.，，。血清组A(NmA)和C(NmC)是撒哈拉沙漠以南的非洲脑膜炎球菌性脑膜炎(meningococcal meningitidis)的主要原因，而血清组B (NmB)和C是工业化国家主要的致病菌株。然而，血清组W-135(NmW-135)和Y(NmY)正变得越来越流行。对于NmW_135，最明确的证明就是2002年布基纳法索的流行病，此流行病感染病例超过13，000例，死亡人数超过 1，400 人(Connolly 等人，Lancet 2004,364(9449) :1974-1983 ；WHO，Epidemicand Pandemic Alert and Response (EPR) 2008)。相比之下，NmY 在美国得到重视，它在美国的流行程度已从1989-1991期间的2%增加到1997-2002期间的37% (Pollard等人，JPaediatr Child Health 2001,37(5) :S20_S27)。最近，以前只是零星发现的血清组X(NmX)在尼日尔出现高发病率，并暴发于肯尼亚和乌干达(Biosier等人，Clin Infect Dis 2007，44(5) :657-663 ；Lewis, WHO Health Action in Crisis 1,62006)。血清组A、B、C.29E, H、I、K、L、W-135、X、Y和Z是本领域众所周知的，并描述在Frosch, M.，V0GEL, U. (2006)，同前文献中。所有血清组的荚膜多糖(CPS)都是带负电的线性聚合物。血清组B和C包裹在由通过血清组B中α-2 —8糖苷键或血清组C中的α -2 — 9键连接的唾液酸(Neu5Ac)部分组成的均聚CPS中(Bhattacharjee等人，J BiolChem 1975,250(5) =1926-1932) 血清组W-135和Y都是杂聚物。它们由血清组W-135中半乳糖 /Neu5Ac 重复单元[—6) - α -D-Glcp-(1 — 4) _ α -Neu5Ac_ (2 — ]n，或血清组 Y 中葡萄糖 /Neu5Ac 重复单元[—6) - α -D-Galp-(1 — 4) - α -Neu5Ac_ (2 — ]n 组成(Bhattachar jee等人，Can J Biochem 1976,54(1) :1_8)。NmA 和 NmX 的 CPS 不包含 Neu5Ac 部分，而是分别由N-乙酰基-甘露糖胺1-磷酸[—6)-a-D-ManpNAc-(1 — OPO3 — ]η或N-乙酰基-葡糖胺I-磷酸[—6)-a-D-GlcpNAc-(l — OPO3 — ]n重复单元构造而成的(Bundle等人，Carbohydr Res 1973，26(1) :268-270 ;Bundle 等人，J Biol Chem 1974,249(15)4797-4801) ；Bundle 等人，J Biol Chem 1974，249 (7) :2275_2沘1 Jennings 等人，J InfectDis 1977,136 Suppl:S78_S83)。产生Nm的疾病的CPS是吸引人的候选疫苗，且对于血清组A、C、Y、W-135，可用多糖或多糖结合物(conjugate)疫苗(Broker 等人，Minerva Med 2007,98 (5) :575-589)。对于血清组B和X，当前无疫苗可用。仅血清组B的荚膜多糖具有不良免疫原性，因为它在结构和化学上与在人中发现的多糖(多碳水化合物)(PolySia)相同。然而，NmX的大暴发仅发生在2006年，因此还未研制出任何疫苗。CPS生物合成中的关键酶是膜相关性荚膜聚合酶(capsule polymerase)。已为所有六种致病血清组鉴定出候选基因(Frosch等人，Proc Natl Acad Sci USA 1989，86 (5)1669-1673 ;Claus 等人，Mol Gen Genet 1997，257(1) J8-34 ;Tzeng 等人，Infect Immun2003,71 (2) :6712-6720)。然而，我们对那些重要酶的酶学或结构功能关系的了解仍然非常有限。虽然已为使用粗膜(crude membrane)组分作为酶源的NmB和NmC酶报道了一些数据 Gteenbergen 等人，J Biol Chem 2003,278(17) :15349-15359)，但最近才可以纯化出活跃NmB聚合酶，且只进行了初步结构功能分析(Freiberger等人，Mol Microbiol 2007，65(5) :1258-1275)。在最新的研究中，还对从血清组NmW_135和NmY克隆的荚膜聚合酶进行纯化和初步表征(Claus等人，Mol Microbiol 2009,71(4) :960-971)。这些蛋白质是双官能(bifunctional)糖基转移酶，其可以单独地合成NmW_135和NmY的各个杂聚CPS。然而，直到现在，用于奈瑟氏菌属疫苗的多糖生产仍需要脑膜炎奈瑟氏菌的发酵，以及随后针对培养基中多糖的多步纯化。这些生产工艺既是成本密集型的(costintensive)，也总是存在被奈瑟氏菌属毒素、培养基组分或随后纯化操作过程所需的化学物污染的风险。而且，所得多糖批次通常是异质的(heterogeneous)，很难表征。将在下面描述的体外生产脑膜炎奈瑟氏菌的合成和人工荚膜多糖的本发明方法已克服这些技术问题。

发明内容
本发明提供了生产脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖(capsular polysaccharides, CPS)的体外方法，所述方法包括以下步骤(a)使至少一种供体(donor)碳水化合物与至少一种纯化的荚膜聚合酶(CP)接触；(b)将所述碳水化合物与所述荚膜聚合酶温育；和(c)分离产生的荚膜多糖，其中所得荚膜多糖是脑膜炎奈瑟氏菌血清组W_135、Y、A或X特异性荚膜多糖的合成或人工荚膜多糖，或者其中所得荚膜多糖是人工嵌合荚膜多糖，该人工嵌合荚膜多糖包含脑膜炎奈瑟氏菌血清组 Y/W-135、W-135/Y、B/Y、C/Y、B/W-135、C/W-i;35、B/Y/W-i;35、C/Y/W-135、B/W-135/Y、C/W-135/Y、X/A 或 A/X 的荚膜多糖或荚膜多糖亚基(subunit)。根据本发明，惊人地发现脑膜炎奈瑟氏菌血清组W_135、Y、A和X的荚膜多糖(CPS)可以通过合成生产，即体外生产。因此，可以避免以前使用的成本和时间密集型生产工艺。此外，发现包含不同脑膜炎奈瑟氏菌血清组的CPS或其亚基的人工嵌合CPS可以通过本文描述和列举的体外方法生产。可通过本文描述的体外方法获得的嵌合CPS可以包括脑膜炎奈瑟氏菌血清组A、B、C、W-135、X和/或Y的两个或更多个CPS亚基或者含有脑膜炎奈瑟氏菌血清组A、B、C、W-135、X和/或Y的不同CPS的一个或多个衍生化(derivatized)结构单元(building blocks)的CPS，或者由它们组成。此种衍生化结构单元的实例在图1 5中示出。可通过本文描述的方法获得的嵌合CPS可以包含脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y/W-135、W-135/Y、B/Y、C/Y、B/W-135、C/W-135、B/Y/W-135、C/Y/W-135、B/W-135/Y、C/W-135/Y、X/A或A/X的CPS或CPS亚基，或者由它们组成。在所述嵌合CPS内，CPS亚基的一个或多个结构单元可以衍生化，如图1 5中示例性示出的。可通过上文陈述的本发明方法获得的嵌合CPS可以包含一种或多种各包含CPS亚基的碳水化合物。可通过本文所述的方法获得的嵌合CPS的CPS亚基，或包含在这些嵌合CPS中的衍生化结构单元的序列可以是任何顺序的。可通过上文陈述的体外方法获得的嵌合CPS实例在图6中示出。可通过上文描述的体外方法获得的嵌合CPS也可以用作药物，例如用作疫苗。特别地，本文描述的嵌合CPS作为由脑膜炎奈瑟氏菌引起的疾病预防和治疗疫苗，如脑膜炎奈瑟氏菌疫苗是有利的。通过本文描述的体外方法获得的嵌合CPS可以用作对抗不同脑膜炎奈瑟氏菌血清组的疫苗。这些含有不同CPS亚基的嵌合CPS可以用来对抗其CPS亚基包含在所述嵌合CPS中的脑膜炎奈瑟氏菌血清组。例如，根据本发明，含有脑膜炎奈瑟氏菌血清组A的CPS亚基和脑膜炎奈瑟氏菌血清组X的CPS亚基的嵌合CPS可以用作对抗脑膜炎奈瑟氏菌血清组A和脑膜炎奈瑟氏菌血清组X的疫苗。本发明体外方法也可以获得多聚嵌合CPS。此种嵌合CPS可以包含不同脑膜炎奈瑟氏菌血清组的两个、三个或更多个不同CPS亚基，或者由它们组成。例如，可通过本文陈述的体外方法获得的嵌合CPS可以包含脑膜炎奈瑟氏菌血清组w-135、Y和C的CPS亚基或者由它们组成。而且，此种嵌合CPS以及针对它的抗体可用于诊断目的。在本文描述和列举的体外方法的一个实施方式中，人工嵌合CPS包含脑膜炎奈瑟氏菌血清组w-135和Y的CPS。在本文陈述的方法的进一步实施方式中，使该至少一种供体碳水化合物和至少一种荚膜聚合酶(CP)进一步与受体碳水化合物接触。根据本发明体外方法，可以在步骤(b)期间进一步活化与至少一种纯化的荚膜聚合酶(CP)接触的供体碳水化合物。优选地，该活化通过活化核苷酸如CMP、UDP、TDP或AMP的键连(连键、连接，linkage)介导。更优选地，该活化核苷酸是CMP或UDP。核苷酸键连对碳水化合物的活化可以通过本领域已知的数种活化酶催化。可以在本文提供的体外方法的步骤(a)期间使此种活化酶与该至少一种供体碳水化合物和至少一种CP接触。例如，在本文陈述的体外方法的步骤(a)期间，使硕大利什曼原虫(Leishmania major)的UDP-糖焦磷酸化酶(USP)(USP-LM)与至少一种供体碳水化合物和至少一种CP接触。USP-LM催化feil-Ι-磷酸和Glc-I-磷酸分别活化成核苷酸糖UDP-Gal和UDP-Glc。USP-LM的核苷酸序列在SEQ ID NO :9中示出。USP-LM的多肽序列在SEQ ID N0:10中示出。为了活化Neu5Ac，优选使用 CMP-NeuNAc 合成酶(CSS) (Ganguli 等人，J Bacteriol (1994)，176(15)4583-4589)。UDP-ManNAc 优选从 UDP-GlcNAc 使用酶 UDP-GlcNAc-差向异构酶合成。在 SEQID NO=Il中，示出从脑膜炎奈瑟氏菌血清组A克隆的UDP-GlcNAc-差向异构酶的核苷酸序列，UDP-GlcNAc-差向异构酶的相应多肽序列在SEQ ID NO 12中示出。根据本文陈述的方法，可以使该至少一种供体碳水化合物和荚膜聚合酶(CP)进一步与受体碳水化合物接触。在本文陈述的体外方法的一个实施方式中，与至少一种供体碳水化合物接触的荚膜聚合酶(CP)专用于(specific for)合成脑膜炎奈瑟氏菌血清组W-135的CPS。具体地，与至少一种供体碳水化合物接触的CP是CP-W-135或其功能衍生物。编码CP-W-135的核苷酸序列在SEQ ID NO 1中示出。CP-W-135的氨基酸序列在SEQ ID NO 2中示出。CP-ff-135功能衍生物是能够合成血清组W-135和血清组Y CPS的荚膜多糖(CPS)的酶(Claus等人，Mol Microbiol 2009,71(4) :960-971)。优选地，CP-W-135功能衍生物的核苷酸序列与SEQID NO 1具有至少80 %，更优选至少85 %，更优选至少90 %，最优选至少95 %的序列同一性，且CP-W-135功能衍生物的氨基酸序列与SEQ ID NO :2具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少95%，最优选至少99%的序列同一性。功能衍生物也可以包含维持生物活性的功能片段。所以，如本文结合核苷酸序列或多肽使用的术语“其功能衍生物”是指，与本文定义的核苷酸序列或可被本发明核酸序列(例如SEQ ID NO 1)编码的多肽(例如，SEQ ID NO 2所示的)具有基本相同的(生物)活性的功能片段。该(生物)功能尤其可以通过Claus等人，Mol Microbiol 2009,71(4) :960-971中描述的方法以及本文提供的本发明中(的方法)评估。根据本发明，核苷酸或氨基酸序列的同一性水平分别指的是SEQ ID NO 1所示核苷酸序列或SEQ ID NO :2所述多肽序列的整个长度(全长)，并且成对地(pair-wise)评估，其中每个空位(空隙，gap)都被记为一个不匹配。如本文使用的术语“同一性”与术语“同源性”等效。例如，术语同一性和同源性在本文结合分别与SEQ ID NO :1或2，优选在整个长度内具有至少80%的同一性或同源性的核酸或多肽/氨基酸序列使用。因此，本发明涉及多肽(为CP-W-135或其片段)在本发明方法中的应用，其中该多肽与SEQ ID NO 2中所示的多肽具有至少80%的同一性/同源性。如果例如通过例如序列比较进行比较的两个核酸序列同一性不同，则术语“同一性”或“同源性”指的是较短序列和与所述较短序列匹配的较长序列的部分。因此，当所比较的序列长度不相同时，同一性程度是指与较长序列中核苷酸残基相同的较短序列中核苷酸残基的百分比，或者与较短序列中核苷酸序列相同的较长序列中核苷酸的百分比。在这种情况下，技术人员能够容易地确定与较短序列“匹配”的较长序列的部分。而且，针对序列比较(例如，“同一性”或“同源性”值的确定)的这些定义将应用于本文描述和公开的所有序列。此外，同一性意味着相应核苷酸序列或多肽(例如，由此编码的多肽)之间存在功能和/或结构等效性(等同性，equivalence) 0与本文描述的特定核酸/氨基酸序列具有给定水平的同一性的核酸/氨基酸序列可以代表这些序列的衍生物/变体，所述衍生物/变体优选具有相同的生物功能。它们可以是天然存在的变异形式(variations)，例如来自其它种类(varieties)、物种等的序列，或者突变形式(mutations)，且所述突变形式可以天然形成或者可以通过预订(deliberate)诱变产生。此外，该变异形式可以是合成产生的序列。该等位基因变体可以是天然存在的变体或合成产生的变体或通过重组DNA技术产生的变体。与上述核酸序列的偏离(deviation)可以通过，例如删除、替换、添加、插入和/或重组产生。术语“添加”是指在给定序列末端添加至少一个核酸残基/氨基酸，而“插入”是指在给定序列内插入至少一个核酸残基/氨基酸。术语“删除”是指在给定序列内删除或除去至少一个核酸残基/氨基酸残基。术语“替换”是指替换给定序列内至少一个核酸残基/氨基酸残基。再次，如本文使用的这些定义，加上适当的变更，可以适用于本文提供和描述的所有序列。变体多肽，特别是根据本文描述的本发明体外方法使用的核酸序列的不同变体编码的多肽优选表现出它们共同具有的特定特性。这些包括，例如，生物活性、分子量、免疫反应性、构象等，以及物理性质，如凝胶电泳迁移行为、色谱行为、沉降系数、溶解度、光谱特性、稳定性、最适pH、最适温度等。在上面描述的体外方法的进一步实施方式中，该荚膜聚合酶(CP)是CP-W-135或其功能衍生物，且与CP接触的至少一种供体碳水化合物是CMP-NeU5Ac或其衍生物，且至少一种供体碳水化合物是UDP-Gal或其衍生物。CMP-Neu5Ac和UDP-Gal衍生物的实例分别在图ID和IB中示出。在本文陈述的体外方法的另一个实施方式中，CP是CP-W-135或其功能衍生物，且至少一种供体碳水化合物是fel-1-磷酸或其衍生物，且至少一种供体碳水化合物是唾液酸或其衍生物。feil-l-磷酸和唾液酸衍生物的实例分别在图4B和4D中示出。优选地，根据本文描述的体外方法，该唾液酸是Neu5Ac。在上文描述的体外方法中，当与CP接触时，Gal-I-磷酸和唾液酸可以进一步与至少一种核苷酸和/或磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP)及辅助酶(辅酶)接触。此种核苷酸可以是CMP、CDP、CTP、UMP、UDP和UTP。在本文陈述的体外方法中，供体碳水化合物feil-Ι-磷酸和唾液酸中的至少一种可以在与CP —起温育期间进行活化，从而产生活化的糖核苷酸UDP-Gal和/或CMP-Neu5Ac。根据上文描述和列举的体外方法中，CP-W-135或其功能衍生物以及至少一种供体碳水化合物可以进一步与受体碳水化合物在接触步骤期间接触。所述受体碳水化合物可以是脑膜炎奈瑟氏菌血清组W-135的寡聚或多聚的CPS(W-135CPS)、脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y的寡聚或多聚的CPS (Y CPS)、脑膜炎奈瑟氏菌血清组B的寡聚或多聚的CPS (B CPS, α 2，8-连接的唾液酸)，和/或脑膜炎奈瑟氏菌血清组C的寡聚或多聚的CPS(C CPS，α 2，9-连接的唾液酸)。所述受体碳水化合物也可以在它的还原端带有一个或多个另外的官能团，如图5图例中列举的。因此，可以合成可通过本文描述的体外方法获得的，包含脑膜炎奈瑟氏菌血清组 Y/W-135、W-135/Y、B/Y、C/Y、B/W-135、C/W-135、B/Y/W-135、C/Y/W-135、B/W-135/Y或C/W-135/Y的CPS或CPS亚基，或者由它们组成的人工嵌合CPS。例如，在本发明体外方法中，使CP-W-135与作为供体碳水化合物的CMP-Neu5Ac和UDP-Gal，以及作为受体碳水化合物的α 2，8-连接的唾液酸三聚体(B CPS三聚体)接触，从而合成包含脑膜炎奈瑟氏菌血清组B/W-135的CPS亚基或者由它们组成的人工嵌合CPS。在可通过上文描述的本发明方法获得的嵌合CPS当中，CPS亚基的一种或多种碳水化合物可以衍生化，并且可以包含例如，另外的官能团如氨基、烷基、羟基、羧酸、叠氮化物(azides)、酰胺、乙酰基或卤素原子；也可参见“Carbohydrate chemistry”卷1_34 monosaccharides, disaccharides, and specific oligosaccharides, 1967-2000 年出版的文献的综述，Cambridge (England)，Royal Society of Chemistry。可通过本文陈述的体外方法获得的嵌合CPS可以包含一种或多种各包含CPS亚基的碳水化合物。所述嵌合CPS的CPS亚基的序列可以是任何顺序的。作为实例，生产脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖(CPS)的体外方法包括以下步骤(a)使 CMP_Neu5Ac、UDP-Gal 和水解的 Y CPS 与 CP-W_i;35 接触；(b)将 CMP_Neu5Ac、UDP-Gal 和水解的 Y CPS 与 CP-W_i;35 —起温育；禾口(c)分离出由脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y/W-135荚膜多糖亚基组成的人工嵌合CPS。技术人员容易理解，还可以应用如本文描述的活化或未活化供体碳水化合物、受体碳水化合物和荚膜聚合酶(CP)的其它组合。此种其它组合和其它修改并没有违背本发明的主旨。例如，本发明的另一个示例体外方法涉及包含以下步骤的生产脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖(CPS)的方法(a)使 Neu5Ac、Gal-I-P, CTP、UTP 和水解的 Y CPS 与 CP-W-135、USP-LM 和 CSS 接触；(b)将 Neu5Ac、Gal-I-P, CTP、UTP 和水解的 Y CPS 与 CP-W-135、USP-LM 和 CSS —起温育，其中将Neu5Ac活化成CMP-Neu5Ac且将Glc-I-P活化成UDP-Glc ；和(c)分离出由脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y/W-135荚膜多糖亚基组成的人工嵌合CPS。技术人员容易理解，还可以应用如本文描述的活化或未活化供体碳水化合物、受体碳水化合物和荚膜聚合酶(CP)的其它组合。此种其它组合和其它修改并没有违背本发明的主旨。在本文陈述的体外方法的另一个实施方式中，与至少一种供体碳水化合物接触的荚膜多糖(CP)专用于合成脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y的CPS。具体地，与至少一种供体碳水化合物接触的CP是CP-Y或其功能衍生物。编码CP-Y的核苷酸序列在SEQ ID NO :3中示出。CP-Y的氨基酸序列在SEQ ID NO :4中示出。CP-Y功能衍生物是能够合成血清组W-135和血清组 Y CPS 的荚膜多糖的酶(Claus 等人，Mol Microbiol 2009,71(4) :960-971)。优选地，CP-Y功能衍生物的核苷酸序列与SEQ ID NO 3具有至少40%，至少80%，更优选至少85 %，更优选至少90 %，最优选至少95 %的序列同一性，且CP-Y功能衍生物的氨基酸序列与SEQ ID NO :4具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少95%，最优选至少99%的序列同一性。功能衍生物也可以包含维持生物活性的功能片段。因此，如本文结合核苷酸序列或多肽使用的术语“其功能衍生物”是指，与可被本发明核酸序列(例如SEQ ID NO 3)编码的本文定义的核苷酸序列或多肽(例如，如SEQ ID NO :4中所示的)具有基本相同的(生物)活性的功能片段。该(生物)功能尤其可以通过Claus等人，MolMicrobiol 2009,71(4) :960-971中描述的方法以及本文提供的方法评估。根据本发明，核苷酸或氨基酸序列的同一性水平分别指的是SEQ ID N0:3所示核苷酸序列或SEQ ID NO :4所示多肽序列的整个长度，并且成对地评估，其中每个空位都被记为一个不匹配。如本文使用的术语“同一性”与术语“同源性”等效。例如，术语同一性和同源性在本文结合分别与SEQ ID NO :3或4，优选在整个长度内具有至少80%的同一性或同源性的核酸或多肽/氨基酸序列使用。因此，本发明涉及多肽(为CP-Y或其片段)在本发明方法中的应用，其中该多肽与SEQ ID NO 4中所示的多肽具有至少80%的同一性/同源性。如果例如通过例如序列比较进行比较的两个核酸序列同一性不同，则术语“同一性”或“同源性”指的是较短序列和与所述较短序列匹配的较长序列的部分。因此，当所比较的序列长度不相同时，同一性程度优选指与较长序列中核苷酸残基相同的较短序列中核苷酸残基的百分比，或者与较短序列中核苷酸序列相同的较长序列中核苷酸的百分比。在这种情况下，技术人员能够容易地确定与较短序列“匹配”的较长序列的部分。而且，针对序列比较(例如，“同一性”或“同源性”值的确定)的这些定义将应用于本文描述和公开的所有序列。术语“同一性”和“同源性”在上文中有进一步描述，该定义和解释尤其适用于CP-Y及其功能片段。在本发明体外方法的具体实施方式
中，CP是CP-Y或其功能衍生物，且至少一种供体碳水化合物是CMP-Neu5Ac或其衍生物，且至少一种供体碳水化合物是UDP-Glc或其衍生物。CMP-Neu5Ac和UDP-Glc衍生物的实例分别在图ID和2B中示出。再次，根据本发明的术语衍生物或功能片段涉及具有生物活性的衍生物或片段。此种“生物”功能可以在如后附实例中提供的或如Claus (2009)，同前文献中描述的试验中进行测试。在本文陈述的体外方法的进一步实施方式中，荚膜聚合酶(CP)是CP-Y或其功能衍生物，且至少一种供体碳水化合物是Glc-I-磷酸或其衍生物，且至少一种供体碳水化合物是唾液酸或其衍生物。唾液酸衍生物的实例在图4D中示出，Glc-I-磷酸衍生物的实例在图15中示出。在优选实施方式中，所述唾液酸是Neu5Ac。根据本文描述的体外方法，当与CP接触时，Gal-I-磷酸和唾液酸可以进一步与至少一种核苷酸和/或磷酸烯醇丙酮酸(PEP)及辅助酶接触。此种核苷酸可以是01^、^ 、0 』1^、皿？和^ 。在本文陈述的体外方法中，供体碳水化合物feii-i-磷酸和唾液酸中的至少一种可以在与CP —起温育期间进行活化，从而产生活化的糖核苷酸UDP-Glc和/或CMP-Neu5Ac。CP-Y或其功能衍生物以及至少一种供体碳水化合物可以进一步与受体碳水化合物在本文所述的体外方法的接触步骤期间接触。所述受体碳水化合物可以是寡聚或多聚的W-135CPS、寡聚或多聚的Y CPS、寡聚或多聚的B CPS，和/或寡聚或多聚的C CPS。所述受体碳水化合物也可以在它的还原端带有一个或多个另外的官能团(见图例5)。因此，可以合成可通过本发明体外方法获得的，包含脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y Y/W-135、W-135/Y、B/Y、C/Y,B/ff-135X/ff-135,B/Y/ff-135X/Y/ff-135,B/ff-135/Y 或 C/W-135/Y 的 CPS 或 CPS 亚基或者由它们组成的嵌合CPS。例如，使CP-Y与供体碳水化合物CMP-Neu5Ac和UDP-Gal，以及与作为受体的寡聚W-135CPS接触，从而合成包含脑膜炎奈瑟氏菌血清组W-135/Y的CPS亚基或者由它们组成的人工嵌合CPS。在这种情况下，术语“功能衍生物”也可以包含“功能片段”。在可通过本文陈述的体外方法获得的嵌合CPS当中，CPS亚基的一种或多种碳水化合物可以衍生化，并且可以包含例如，另外的官能团如氨基、烷基、羟基、羧酸、叠氮化物、酰胺、乙酰基或卤素原子；也可参见例如“Carbohydrate chemistry ‘‘卷l-34Cambridge [England], Royal Society of Chemistry，同前文献。所述嵌合 CPS 可以包含一种或多种各包含CPS亚基的碳水化合物。可通过本文面描述的体外方法获得的嵌合CPS的CPS亚基的序列可以是任何顺序的。作为本发明的实例，生产脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖(CPS)的体外方法包括以下步骤(a)使 CMP_Neu5Ac、UDP-Glc 和水解的 W_i;35CPS 与 CP-Y 接触；(b)将 CMP_Neu5Ac、UDP-Glc 和水解的 W_i;35CPS 与 CP-Y —起温育；禾口(c)分离出由脑膜炎奈瑟氏菌血清组W-135/Y的荚膜多糖亚基组成的人工嵌合CPS。如上所述，技术人员容易理解，还可以应用如本文描述的活化或未活化供体碳水化合物、受体碳水化合物和荚膜聚合酶(CP)的其它组合。此种其它组合和其它修改并没有违背本发明的主旨。本发明的另一个示例体外方法涉及包含以下步骤的生产脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖(CPS)的方法(a)使 Neu5Ac、Glc-I-P, CTP、UTP 和水解的 W_i;35CPS 与 CP-Y、USP-LM 和 CSS 接触；(b)将 Neu5Ac、Glc-l-P、CDP、UDP、PEP 和水解的 W_i;35CPS 与 CP_Y、USP_LM 和 CSS与一起温育，其中将Neu5Ac活化成CMP-Neu5Ac，且将Glc-I-P活化成UDP-Glc ；和(c)分离出由脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y/W-135的荚膜多糖亚基组成的人工嵌合CPS。再次，还可以应用如本文描述的活化或未活化供体碳水化合物、受体碳水化合物和荚膜聚合酶(CP)的其它组合。此种其它组合和其它修改并没有违背本发明的主旨。本发明也涉及这样的体外方法，其中与至少一种供体碳水化合物接触的荚膜聚合酶(CP)专用于合成脑膜炎奈瑟氏菌血清组X的CPS。具体地，与至少一种供体碳水化合物接触的CP是CP-X或其功能衍生物。编码CP-X的核苷酸序列在SEQ ID NO :5中示出。CP-X的氨基酸序列在SEQ ID NO :6中示出。CP-X功能衍生物是能够合成血清组X的荚膜多糖的酶(Tzeng 等人，Infect Immun 2003,71 (2) :6712-6720)。优选地，CP-X 功能衍生物的核苷酸序列与SEQ ID NO: 5具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，最优选至少95%的序列同一性，且CP-X功能衍生物的氨基酸序列与SEQ ID NO 6具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少95%，最优选至少99的序列同一性。功能衍生物也可以包含维持生物活性的功能片段。所以，如本文结合核苷酸序列或多肽使用的术语“其功能衍生物”是指，与本文定义的核苷酸序列或可被本发明核酸序列(例如SEQ ID NO5)编码的多肽(例如，如SEQ ID NO :6中所示的)具有基本相同的(生物)活性的功能片段。再次，功能片段包括在术语“功能衍生物”中。该(生物)功能尤其可以通过Tzeng等人，Infect Immun 2003,71 (2) :6712-6720中描述的方法以及本文提供的方法评估。根据本发明，核苷酸或氨基酸序列的同一性水平分别指的是SEQ ID NO :5所示核苷酸序列或SEQ ID NO :6所示多肽序列的整个长度，并且成对地评估，其中每个空位都被记为一个不匹配。如本文使用的术语“同一性”与术语“同源性”等效。例如，术语同一性和同源性在本文结合分别与SEQ ID NO 5或6，优选在整个长度内具有至少80%的同一性或同源性的核酸或多肽/氨基酸序列使用。因此，本发明涉及多肽(为CP-X或其片段)在本发明方法中的应用，其中该多肽与SEQ ID NO 6中所示的多肽具有至少80%的同一性/同源性。如果例如通过例如序列比较进行比较的两个核酸序列同一性不同，则术语“同一性”或“同源性”指的是较短序列和与所述较短序列匹配的较长序列的部分。因此，当所比较的序列长度不相同时，同一性程度优选指与较长序列中核苷酸残基相同的较短序列中核苷酸残基的百分比，或者与较短序列中核苷酸序列相同的较长序列中核苷酸的百分比。在这种情况下，技术人员能够容易地确定与较短序列“匹配”的较长序列的部分。而且，针对序列比较(例如，“同一性”或“同源性”值的确定)的这些定义将应用于本文描述和公开的所有序列。再次，术语“同一性”和“同源性”在上文中有进一步描述，该定义和解释尤其适用于CP-X及其功能片段。应用于本文描述的方式和方法中的CP可以是CP-X或其功能衍生物，且至少一种供体碳水化合物可以是UDP-GlcNAc或其功能衍生物。UDP-GlcNAc衍生物的实例可以是烷基化或羟基化或者包含另外官能团如羧酸、叠氮化物、酰胺、乙酰基或卤素原子的化合物，如还在图3B中示出的；还可参见“Carbohydrate chemistry”卷1_34，Cambridge [England], Royal Society of Chemistry,同前文献。在本发明体外方法的另一个实施方式中，荚膜聚合酶(CP)可以是CP-X或其功能衍生物，且至少一种供体碳水化合物可以是GlcNAc-1-磷酸或其功能衍生物。GlcNAc-1-磷酸衍生物的实例在图16中示出。当与CP接触时，所述供体碳水化合物GlcNAc-1-磷酸可以进一步与至少一种核苷酸和/或磷酸烯醇丙酮酸(PEP)及辅助酶接触。所述核苷酸可以是UMP、UDP和UTP。所述供体碳水化合物GlcNAc-1-磷酸可以在与CP —起温育期间进行活化。根据本文陈述的体外方法，这种活化可以产生活化的糖核苷酸UDP-GlcNAc。一般地，在本发明的背景下，本文描述的糖衍生物也可以是这些糖的标记形式。例如，对于本文描述的糖衍生物，该糖可以是放射性标记的，如[14C]或[3H]。此种标记尤其对本文描述的糖的诊断应用和使用有用。此种诊断应用和使用将在下面进一步描述。根据本发明方法，CP-X(或其功能衍生物)以及至少一种供体碳水化合物可以进一步与受体碳水化合物在本文描述的体外方法的接触步骤期间进行接触。所述受体碳水化合物可以是脑膜炎奈瑟氏菌血清组X的寡聚或多聚的CPS(X CPS)、脑膜炎奈瑟氏菌血清组A的寡聚或多聚的CPS (CPS A)，和/或含有末端GIcNAC残基的碳水化合物结构，如透明质酸、肝素、硫酸肝素或蛋白质连接的低聚糖。例如，可以合成可通过本发明体外方法获得的，包含脑膜炎奈瑟氏菌血清组A/X或X/A的CPS或CPS亚基或者由它们组成的嵌合CPS。所述包含脑膜炎奈瑟氏菌血清组的CPS或CPS亚基或者由它们组成的嵌合CPS，如果用作受体，可以包含含有末端GIcNAC残基的碳水化合物结构，如透明质酸、肝素、硫酸肝素或蛋白质连接的低聚糖。在可通过本发明体外方法获得的嵌合CPS当中，CPS亚基的一种或多种碳水化合物可以衍生化，并且可以包含，例如，另外的官能团如氨基、烷基、羟基、羧酸、叠氮化物、酰胺、乙酰基或卤素原子；还可以参见“Carbohydrate chemistry"卷1_；34Cambridge (England), Royal Society of Chemistry，同前文献。嵌合 CPS 可以包含一种或多种各包含CPS亚基的碳水化合物。嵌合CPS的CPS亚基的序列可以是任何顺序的。作为本发明的实例，生产脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖(CPS)的体外方法包括以下步骤
(a)使 UDP-GlcNAc 和水解的 A CPS 与 CP-X 接触；(b)将UDP-GlcNAc和水解的A CPS与CP-X —起温育；和(c)分离出由脑膜炎奈瑟氏菌血清组A/X的荚膜多糖亚基组成的人工嵌合CPS。如上所述，还可以应用如本文描述的活化或未活化供体碳水化合物、受体碳水化合物和荚膜聚合酶(CP)的其它组合。此种其它组合和其它修改并没有违背本发明的主旨。在本文陈述的体外方法的另一个实施方式中，与至少一种供体碳水化合物接触的荚膜聚合酶(CP)专用于合成脑膜炎奈瑟氏菌血清组A的CPS。具体地，与至少一种供体碳水化合物接触的CP是CP-A或其功能衍生物。编码CP-A的核苷酸序列在SEQ ID NO 7中示出。CP-A的氨基酸序列在SEQ ID NO :8中示出。CP-A功能衍生物是能够合成血清组A的荚膜多糖的酶(Swartley 等人，J Bacteriol (1998)，180 (6) :1533-1539)。优选地，根据本发明，CP-A功能衍生物的核苷酸序列与SEQ ID NO: 7具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90 %，最优选至少95 %的序列同一性，且CP-A功能衍生物的氨基酸序列与SEQID NO 8具有至少80 %，更优选至少85 %，更优选至少90 %，更优选至少95 %，最优选至少99%的序列同一性。功能衍生物也可以包含维持生物活性的功能片段。所以，如本文结合核苷酸序列或多肽使用的术语“其功能衍生物”是指，与本文定义的核苷酸序列或可被本发明核酸序列(例如SEQ ID NO 7)编码的多肽(例如，如SEQ ID NO 8中所示的)具有基本相同的(生物)活性的功能片段。该(生物)功能尤其可以通过Swartley等人，JBacteriol (1998)，180 (6) :1533-1539中描述的方法以及本文提供的方法评估。如本文结合核苷酸序列或多肽使用的术语“其功能衍生物”是指，与本文定义的核苷酸序列或可被本发明核酸序列(例如SEQ ID NO 7)编码的多肽(例如，如SEQ ID NO 8中所示的)具有基本相同的(生物)活性的功能片段。生物活性可以通过本文提供的和本领域中已知的方法评估；参见，例如，Swartley (1998)，同前文献。此种功能衍生物也包含功能片段。根据本发明，核苷酸或氨基酸序列的同一性水平分别指的是SEQ ID NO :7所示核苷酸序列或SEQ ID NO :8所示多肽序列的整个长度，并且成对地评估，其中每个空位都被记为一个不匹配。如本文使用的术语“同一性”与术语“同源性”等效。例如，术语同一性和同源性在本文结合分别与SEQ ID NO 7或8，优选在整个长度内具有至少80%的同一性或同源性的核酸或多肽/氨基酸序列使用。因此，本发明涉及多肽(为CP-A或其片段)在本发明方法中的应用，其中该多肽与SEQ ID NO 8中所示的多肽具有至少80%的同一性/同源性。如果例如通过例如序列比较进行比较的两个核酸序列同一性不同，则术语“同一性”或“同源性”指的是较短序列和与所述较短序列匹配的较长序列的部分。因此，当所比较的序列长度不相同时，同一性程度是指与较长序列中核苷酸残基相同的较短序列中核苷酸残基的百分比，或者与较短序列中核苷酸序列相同的较长序列中核苷酸的百分比。在这种情况下，技术人员能够容易地确定与较短序列“匹配”的较长序列的部分。而且，针对序列比较(例如，“同一性”或“同源性”值的确定)的这些定义将应用于本文描述和公开的所有序列。术语“同一性”和“同源性”在上文中有进一步描述，该定义和解释尤其适用于CP-A及其功能片段。在本发明体外方法的一个实施方式中，所使用的CP是CP-A或其功能衍生物，且至少一种供体碳水化合物可以是UDP-ManNAc或其衍生物。UDP-ManNAc衍生物的实例可以是烷基化或羟基化或者包含另外官能团如羧酸、叠氮化合物、酰胺、乙酰基或卤素原子的化合物，如还在图17B中示出的；还可参见“Carbohydrate chemistry”卷1-34 monosaccharides, disaccharides, and specific oligosaccharides, 1967-2000 年出版的文献的综述，Cambridge (England), Royal Society of Chemistry。在本文描述的体外方法的另一个实施方式中，荚膜聚合酶(CP)是CP-A或其功能衍生物，且至少一种供体碳水合物是ManNAc-I-磷酸或其衍生物。ManNAc-I-磷酸和唾液酸衍生物的实例在图18中示出。当与CP接触时，所述供体碳水合物ManNAc-I-磷酸可以与至少一种核苷酸和/或磷酸烯醇丙酮酸(PEP)及辅助酶接触。所述核苷酸可以是UMP、UDP和UTP。所述供体碳水化合物ManNAc-I-磷酸可以在与CP—起温育期间进行活化。根据本文陈述的体外方法中，这种活化可以产生活化的糖核苷酸UDP-ManNAc，或其衍生物。CP-A或其功能衍生物以及至少一种供体碳水化合物可以进一步与受体碳水化合物在本发明体外方法的接触步骤期间接触。根据本文陈述的本发明体外方法，受体碳水化合物可以是脑膜炎奈瑟氏菌血清组X的寡聚或多聚的CPS(X CPQ、脑膜炎奈瑟氏菌血清组A的寡聚或多聚的CPS(CPSA)，和/或包含末端GIcNAC或ManNAc残基的碳水化合物结构，如透明质酸、肝素、硫酸肝素或蛋白质连接的低聚糖。例如，可以通过本文陈述的体外方法合成包含脑膜炎奈瑟氏菌血清组A/X或X/A的CPS或CPS亚基或者由它们组成的嵌合CPS。可通过陈述的体外方法获得的，包含脑膜炎奈瑟氏菌血清组的CPS或CPS亚基或者由它们组成的嵌合CPS，如果用作受体，可以包含含有末端GIcNAC残基的碳水化合物结构，如透明质酸、肝素、硫酸肝素或蛋白质连接的低聚糖。在可通过本发明体外方法获得的嵌合CPS当中，CPS亚基的一种或多种碳水合物可以衍生化，并且可以包含，例如，另外的官能团，如氨基、烷基、羟基、羧酸、叠氮化物、酰胺、乙酰基或卤素原子；也可参见”Carbohydrate chemistry” Volumes 1-34Cambridge(England), Royal Society of Chemistry，同前文献。这些嵌合 CPS 可以包含一种或多种各包含CPS亚基的碳水化合物。可通过本文描述的体外方法获得的嵌合CPS的CPS亚基的序列可以是任何顺序的。作为本发明的实例，生产脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖(CPS)的体外方法包括以下步骤(a)使 UDP-ManNAc 和水解的 X CPS 与 CP-A 接触；(b)将UDP-ManNAc和水解的X CPS与CP-A —起温育；禾口(c)分离出由脑膜炎奈瑟氏菌血清组X/A的荚膜多糖亚基组成的人工嵌合CPS。再次，技术人员容易理解，还可以应用如本文描述的活化或未活化供体碳水化合物、受体碳水化合物和荚膜聚合酶(CP)的其它组合。此种其它组合和其它修改并没有违背本发明的主旨。与供体碳水化合物和CP接触的受体碳水化合物可以根据本文描述的体外方法进行纯化。如果所述受体碳水化合物是脑膜炎奈瑟氏菌的寡聚或多聚的CPS，则可以对它进行水解。与至少一种供体碳水化合物接触的荚膜聚合酶(CP)可以在陈述的体外方法中进行纯化。所述CP可以是从脑膜炎奈瑟氏菌裂解液中分离的或通过重组产生的。
本发明也涉及可通过本文描述的体外方法获得的人工嵌合CPS。此种CPS可以是脑膜炎奈瑟氏菌血清组W-135、Y、A或X的合成或人工嵌合CPS，或者包含脑膜炎奈瑟氏菌血清组 Y/W-135、W-135/Y、B/Y、C/Y、B/W-i;35、C/W-i;35、B/Y/W-i;35、C/Y/W-i;35、B/W-135/Y、C/W-135/Y、Χ/Α或Α/Χ的CPS或CPS亚基或由它们组成的人工嵌合CPS。可通过本发明体外方法获得的人工嵌合CPS可以用作疫苗。在本发明优选实施方式中，它们用于人主体的疫苗接种(vaccination)。还公开了可通过本发明体外方法获得的嵌合CPS在制备疫苗中的应用。在本发明具体实施方式
中，可通过本文描述的体外方法获得的嵌合CPS用作对抗由脑膜炎奈瑟氏菌血清组A、B、C、W-135、X或Y引起的脑膜炎球菌性脑膜炎的疫苗。可通过该体外方法获得的嵌合CPS也可以用于诊断由脑膜炎奈瑟氏菌血清组A、B、C、W-135、X或Y引起的脑膜炎球菌性脑膜炎或与其相关的疾病。可通过该体外方法获得的嵌合CPS也可以用于分析操作程序中。例如，此种嵌合CPS可以用作规定的标准碳水化合物从而使得与样本碳水化合物的比较能被分析。本发明进一步涉及结合到可通过本文描述的体外方法获得的人工嵌合CPS上的抗体。优选地，这些抗体特异性地结合到人工嵌合CPS上。本文中的术语“抗体”在广义上使用且具体包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整的抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们表现出期望的生物活性即可。也包括人和人化(humanized)抗体以及 CDR 移植抗体(CDR-grafted antibodies)。如本文使用的术语“单克隆抗体”是指从基本均质性(homogeneous)抗体的群体中获得的抗体，即，包含除了少量存在的可能的天然发生的突变之外相同的群体的各种抗体。单克隆抗体具有高度的特异性，针对单一抗原表位(抗原位点，antigenic site)。此外，与包括针对不同决定簇(决定子，determinant)(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每种单克隆抗体均针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体还具有可在不被其它抗体污染的情况下合成的优点。修饰词“单克隆”是指该抗体的特征为它是从基本均质性的抗体群体获得的，而不应解读为该抗体需要通过任何特定方法生产。例如，根据本发明方法使用的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法生产，这种方法首次由Kohler，G.等人，Nature 256 (1975) 495描述，或者可以通过重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利No. 4，816，567)。“抗体片段”包含完整抗体的一部分。在本发明背景下，抗体特异性地识别可通过本文描述的体外方法获得的CPS或人工嵌合CPS。如本文描述的抗体或其片段也可以用于药物和医疗环境，如疫苗接种/免疫，特别是被动(passive)疫苗接种/免疫。本发明抗体也可以用于治疗和/或诊断由脑膜炎奈瑟氏菌血清组A、B、C、W-135、X或Y引起的脑膜炎球菌性脑膜炎。本发明进一步涉及焦磷酸化酶，特别是硕大利什曼原虫(Leishmania major)的 UDP-糖磷酸化酶(USP-LM) (Damerow 等人，J Biol Chem (2010)，285 (2) :878-887)。USP-LM的核苷酸序列在SEQ ID NO :9中示出。USP-LM的多肽序列在SEQ ID N0:10中示出。所述USP-LM可以将己糖-1-磷酸(hexose-1-phosphate)和/或戊糖磷酸(pentose-1-phosphate)活化为核苷酸糖。例如，USP-LM将半乳糖磷酸(Gal-1-P)活化为UDP-半乳糖(UDP-Gal)并将葡萄糖磷酸(Glc-I-P)活化为UDP-葡萄糖(UDP-Glc)。该活化可以是可逆的。USP-LM进一步可以作用于并活化多种己糖-1-磷酸以及戊糖-1-磷酸，且因此呈现出宽广的体外特异性。戊糖-ι-磷酸的实例有木糖-ι-磷酸、阿拉伯糖-1-磷酸、葡萄糖醛酸-1-磷酸，而且对GlcNAc-lP具有非常弱的活性。本文也描述了编码焦磷酸化酶或其片段的核酸分子。此种核酸分子可以是DNA分子、RNA分子、硫代磷酸寡核苷酸(oligonucleotide thiophosphates)、取代(substituted)的核糖寡核苷酸或PNA分子。此外，术语“核酸分子”可以指DNA或RNA或其杂合体(hybrids)或其在本领域中已知的任何修饰(参见，例如关于修饰的US 5525711、US 4711955、US 57拟608或EP 302175)。该多核苷酸序列可以是单链或多链的、线性或环形的、天然或合成的，且没有任何尺寸限制。例如，该多核苷酸序列可以是基因组DNA、cDNA、mRNA、反义RNA、核酶(ribozymal)或编码此种RNA或嵌合修复体(chimeroplasts)的DNA(Gamper,Nucleic Acids Research，2000，28，4332-4339)。所述多核苷酸序列可以是质粒形式或者病毒DNA或RNA形式。特别地，本发明涉及具有SEQ ID NO :9所示核苷酸序列的核酸分子。本发明也包括包含SEQ ID NO :9所示核酸分子的核酸分子，其中添加、删除或替换一个、两个、三个或更多个核苷酸。此种核酸分子可以编码具有焦磷酸化酶活性的多肽。如本文使用的术语“活性”特别指多肽或其片段将糖-ι-磷酸活化为核苷酸糖的能力。在本发明具体实施方式
中，本文描述的核酸分子编码可将己糖-1-磷酸和/或戊糖-1-磷酸活化为核苷酸糖，特别将半乳糖-1-磷酸(Gal-I-P)活化为UDP-半乳糖(UDP-Gal)和将葡萄糖-1-磷酸(Glc-I-P)活化为UDP-葡萄糖(UDP-Glc)的多肽。该活化可以是可逆的。本领域技术人员可以容易地测定多肽将糖-ι-磷酸活化为核苷酸糖的活性。由相应的糖-1-磷酸和UTP合成UDP-Glc、UDP-Gal或其它UDP-糖的反应(正反应)产生副产物焦磷酸盐，其可以利用例如Enz-Chek Pyrophosphate Kit(Invitrogen)监测。替换地，按照形成的UTP分析从核苷酸糖和焦磷酸盐合成的糖-1-磷酸(逆反应)。在这个试验中，可利用大肠杆菌CTP合成酶(31)从UTP产生游离的无机磷酸盐，其可以再次利用Enz-ChekPyrophosphate Kit(Invitrogen) 5 Enz-Chek Phosphate Kit (Invitrogen)监测。细节在实施例11中示意性地给出。优选地，本发明描述的核酸分子与SEQ ID NO :9具有至少45 %，更优选至少50 %，更优选至少55 %，更优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，更优选至少90 %，更优选至少95 %，更优选至少96 %，更优选至少97 %，更优选至少98 %，且最优选至少99 %的同一性。这种核酸分子优选编码可将己糖-ι-磷酸和/或戊糖-ι-磷酸活化为核苷酸糖，特别将半乳糖-1-磷酸(Gal-l-p)活化为UDP-半乳糖(UDP-Gal)和将葡萄糖-1-磷酸(Glc-I-P)活化为UDP-葡萄糖(UDP-Glc)的多肽。该活化可以是可逆的。本发明进一步涉及与上述核酸分子互补的核酸分子。还包括可以与本文描述的核酸分子杂交的核酸分子。本发明核酸分子也可以是本文描述的核酸分子的片段。特别地，此种片段是功能片段。此种功能片段的实例是用作引物的核酸分子。如本文结合核酸分子/DNA序列使用的术语“杂交(hybridization)”或“杂交(hybridize)”可以涉及在严格条件或非严格条件下的杂交。如果没有进一步说明，该条件优选为非严格条件。所述杂交条件可以根据例如下面文献中描述的常规方案确立Sambrook， Russell" Molecular Cloning，A Laboratory Manual" ，Cold Spring HarborLaboratory, N. Y. (2001) ；Ausubel, “ Current Protocols in Molecular Biology “，Green Publishing Associates andWiley Interscience, N. Y. (1989)，或 Higgins andHames(Eds.) “ Nucleic acid hybridization, a practical approach “ IRL PressOxford, Washington DC, (1985)。条件的设置完全在技术人员的技术范围内且可以根据本领域中描述的方案确定。因而，对仅特异性杂交的序列的检测通常要求严格的杂交和洗涤条件，如 65°C下 0. Ix SSC,0. 1% SDS0 检测同源或不完全互补(exactly complementary)的序列的非严格杂交条件可以设置为65°C下6xSSC，l% SDS0众所周知，探针的长度和待确定核酸的组成构成杂交条件的进一步参数。上述条件的改变可以通过添加和/或替换用于抑制杂交实验中背景的替换封闭剂(blocking reagent)完成。典型的封闭剂包括Denhardt ‘ s试剂(Denhardt ‘ s reagent)、BL0TT0、肝素、变性鲑鱼精子DNA，和市售的专利配方(proprietary formulations)。由于相容性问题，特定封闭剂的添加可能要求修改上述杂交条件。根据本文描述的本发明，可以将检测同源性或不完全互补的序列的低度严格杂交条件设置为，例如65°C下6x SSC，1%SDS。众所周知，探针的长度和待确定核酸的组成构成杂交条件的进一步参数。杂交核酸分子也包含上述分子的片段。此种片段可以代表可用作引物、为如上所述的功能焦磷酸化酶或其功能片段编码的核酸分子。此外，与前述核酸分子中任一种杂交的核酸分子也包括这些分子的互补片段、衍生物和等位基因变体。另外，杂交复合体是指依靠互补的G和C碱基以及互补的A和T碱基之间形成氢键(连接)的两个核酸序列的复合体；这些氢键可以由碱基堆积相互作用(base stacking interactions)加以进一步稳定。这两个互补的核酸序列氢键处于反平行构型中。杂交复合体可以在溶液中形成(例如，Cot或Rot分析)，或者可以在存在于溶液中的一个核酸序列和固定在固体载体(例如，细胞已固定在其上的膜、过滤器、芯片、销钉(Pin)或玻片)上的另一个核酸序列之间形成。术语互补的或互补是指多肽在许可的盐和温度条件下通过碱基配对自然结合(的特性)。例如，序列“A-G-T”结合到互补序列“T-C-A”上。两个单链分子之间的互补可以是其中仅一些核酸结合的“部分”(互补)，或者当单链分子之间存在总体互补时，它可以是完全(互补)。核酸链之间的互补度对核酸链之间的杂交效率和强度具有重要的影响。这在扩增反应中特别重要，扩增反应取决于核酸链之间的结合。术语“杂交序列”优选指，与如上面所述的编码焦磷酸化酶的核酸序列具有至少45 %，更优选至少50 %，更优选至少55 %，更优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，更优选至少90 %，更优选至少95 %，更优选至少96 %，更优选至少97 %，更优选至少98 %，且最优选至少99 %的序列同一性的序列。而且，术语“杂交序列”优选指，编码如本文所述的焦磷酸化酶，与SEQ ID NO=IO具有至少45 %，更优选至少50 %，更优选至少55 %，更优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，更优选至少90 %，更优选至少95 %，更优选至少96 %，更优选至少97 %，更优选至少98 %，最优选至少99 %的序列同一性的序列。本发明进一步涉及包含编码焦磷酸化酶的本发明核酸分子的载体。本发明也涉及包含编码本文所述的焦磷酸化酶的核酸构建体的载体。如本文使用的术语“载体”特别是指质粒、粘粒、病毒、噬菌体以及基因工程中常用的其它载体。在优选实施方式中，本发明载体适合于转化细胞，如真菌细胞、微生物细胞如酵母或原核细胞。在特别优选的实施方式中，此种载体适合于稳定转化细菌细胞，例如从而表达本发明的焦磷酸化酶。因此，在本发明一个方面，所提供的载体是表达载体。一般地，表达载体在文献中有详尽的描述。一般说来，它们可以不但包含选择标记基因和确保所选宿主中的复制的复制起点，而且还包含启动子，且在大多数情况下包含转录终止信号。启动子和终止信号之间优选存在至少一个限制位点，或使得期望被表达的核酸序列/分子能被插入的多接头(polylinker)。应理解，当通过利用现有技术中已知的、已包含适用于本发明背景的启动子，例如表达如本文上面描述的焦磷酸化酶的表达载体制取本文提供的载体时，以使得到的载体仅包含一种适用于本发明背景的启动子的方式将核酸构建体插入到那个载体中。技术人员知道此种插入如何进行。例如，在连接之前从该核酸构建体或从该表达载体中切除启动子。本发明载体的非限制性实例为包含本发明核酸构建体的质粒载体pET22b。适合于包含本发明核酸构建体从而形成本发明载体的载体的进一步实例在本领域中是已知的且为，例如细菌表达系统用的其它载体，如PET系列(Novagen)的载体或者pQE载体(Qiagen)0在另外的实施方式中，本发明涉及包含本发明核酸构建体和/或载体的宿主细胞。优选地，本发明宿主细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞。作为非限制性实例，本发明宿主细胞可以是大肠杆菌。本文提供的宿主细胞对产生本发明焦磷酸化酶特别有用。一般地，本发明宿主细胞可以是包含本发明核酸构建体或载体的原核细胞或真核细胞，或者源自此种细胞并包含本发明核酸构建体或载体的细胞。在优选实施方式中，该宿主细胞包含本发明核酸构建体或载体，即，以使得它包含整合到基因组中的本发明核酸构建体的方式利用本发明核酸构建体或载体进行基因修饰。例如，本发明的此种宿主细胞，以及本发明的一般宿主细胞可以是细菌、酵母或真菌细胞。在一个特定方面，本发明宿主细胞能够表达或表达如本文定义的和如SEQID NO :10中示例性地描述的焦磷酸化酶。用于产生本发明宿主细胞，例如这种特别的宿主细胞的不同相应表达系统的实例综述，例如包含在下面文献中=Methods inEnzymology 153(1987)，385-516 ;Bitter 等人(Methods in Enzymology 153(1987)，516-544) ；Sawers 等人(Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996),1-9)；BilIman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7(1996),500-4) ；Hockney(Trendsin Biotechnology 12 (1994)，456-463)；和 Griffiths 等人(Methods in MolecularBiology 75(1997),427-440)。利用根据本发明的核酸构建体或载体对宿主细胞进行的转化或基因工程可以通过标准方法进行，如下面文献中描述的Sambrook and Russell (2001), MolecularCloning :A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA ；Methods inYeast Genetics,A Laboratory Course Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1990。本文进一步描述了包含SEQ ID NO :10所示氨基酸序列的多肽，其中添加、删除或替换了一个、两个、三个或更多个氨基酸残基。该多肽可以具有焦磷酸化酶功能。优选地，该多肽可以将己糖-1-磷酸和/或戊糖-1-磷酸活化为核苷酸糖，特别将半乳糖-1-磷酸(Gal-I-P)活化为UDP-半乳糖(UDP-Gal)和将葡萄糖-1-磷酸(Glc-1-P)活化为UDP-葡萄糖(UDP-Glc)。该活化可以是可逆的。该多肽的氨基酸序列可以与SEQ ID N0:10具有至少45 %，更优选至少50 %，更优选至少55 %，更优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，更优选至少90 %，更优选至少95 %，更优选至少96 %，更优选至少97 %，更优选至少98 %，且最优选至少99 %的同一性。优选地，该多肽可以将己糖-ι-磷酸和/或戊糖-ι-磷酸活化为核苷酸糖，特别将半乳糖-1-磷酸(Gal-I-P)活化为UDP-半乳糖(UDP-Gal)和将葡萄糖磷酸(Glc-I-P)活化为UDP-葡萄糖(UDP-Glc)。该活化可以是可逆的。还包括本文描述的多肽的功能片段。这些多肽的功能片段表现出焦磷酸化酶功能。优选地，这些功能片段可以将己糖-ι-磷酸和/或戊糖-1-磷酸活化为核苷酸糖，特别将半乳糖-1-磷酸(Gal-I-P)活化为UDP-半乳糖(UDP-Gal)和将葡萄糖-1-磷酸(Glc-I-P)活化为UDP-葡萄糖(UDP-Glc)。该活化可以是可逆的。本文描述的核酸分子或其片段以及载体、宿主细胞和多肽或其片段可以进一步用于活化己糖-I-P和/或戊糖-1-P。根据本发明，此种应用可以是体外应用。己糖-I-P的实例为GlC-I-P或Gal-l-p。戊糖-I-P的实例为木糖_1_P或阿拉伯糖_1_P。核苷酸或氨基酸序列的同一性水平是指SEQ ID NO :9所示核苷酸序列或SEQ IDNO :10所示多肽序列的整个长度，并且成对地评估，其中每个空位都被记为一个不匹配。如本文使用的术语“同一性”与术语“同源性”等效。例如，这个术语结合与另一个，优选整个核酸序列具有至少45 %，更优选至少50 %，更优选至少55 %，更优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，更优选至少90 %，更优选至少95 %，更优选至少96 %，更优选至少97 %，更优选至少98 %，且最优选至少99%的同源性，即序列同一性的核酸序列使用。关于氨基酸/多肽序列或其片段，这个术语在本文结合与另一个，优选整个氨基酸/多肽序列具有至少45 %，更优选至少50 %，更优选至少55 %，更优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，更优选至少90 %，更优选至少95 %，更优选至少96 %，更优选至少97 %，更优选至少98 %，且最优选至少99%的同源性，即，序列同一性的氨基酸/多肽序列或其片段使用。因此，本发明涉及与SEQ ID NO: 10所示的多肽具有至少45%，更优选至少50%，更优选至少阳%，更优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，更优选至少90 %，更优选至少95 %，更优选至少96 %，更优选至少97%，更优选至少98%，且最优选至少99%的同一性/同源性的焦磷酸化酶或其片段。同样，在涉及本文公开的焦磷酸化酶(或其功能片段)的这个实施方式的背景下，如果例如通过例如序列比较进行比较的两个核酸序列同一性不同，则术语“同一性”或“同源性”指的是较短序列和与所述较短序列匹配的较长序列的部分。因此，当所比较的序列长度不相同时，同一性程度是指与较长序列中核苷酸残基相同的较短序列中核苷酸残基的百分比，或者与较短序列中核苷酸序列相同的较长序列中核苷酸的百分比。在这种情况下，技术人员能够容易地确定与较短序列“匹配”的较长序列的部分。而且，针对序列比较(例如，“同一性”或“同源性”值的确定)的这些定义将应用于本文描述和公开的所有序列。同样，在本文陈述的新焦磷酸化酶背景下，同一性意味着相应核苷酸序列或多肽(例如，由此编码的多肽)之间存在功能和/或结构等效性。与本文描述的特定核酸/氨基酸序列具有给定水平的同一性的核酸/氨基酸序列可以代表这些序列的衍生物/变体，所述衍生物/变体优选具有相同的生物功能。它们可以是天然存在的变异形式，例如来自其它种类、物种等的序列，或者突变形式，且所述突变形式可以天然形成或者可以通过预订诱变产生。此外，该变异形式可以是合成产生的序列。本文公开的焦磷酸化酶的等位基因变体可以是天然存在的变体或合成产生的变体或通过重组DNA技术产生的变体。与上述核酸序列的偏离可以通过，例如删除、替换、添加、插入和/或重组产生。术语“添加”是指在给定序列末端添加至少一个核酸残基/氨基酸，而“插入”是指在给定序列内插入至少一个核酸残基/氨基酸。术语“删除”是指在给定序列内删除或除去至少一个核酸残基/氨基酸残基。术语“替换”是指替换给定序列内至少一个核酸残基/氨基酸残基。本文公开的焦磷酸化酶的变体多肽，特别是本发明核酸序列的不同变体编码的多肽优选表现出它们共同具有的特性。这些包括，例如，生物活性、分子量、免疫反应性、构象等，以及物理性质，如凝胶电泳迁移行为、色谱行为、沉降系数、溶解度、光谱特性、稳定性、最适pH、最适温度等。如本文使用的术语“合成的”描述了体外合成的CPS结构，且其中该CPS的结构与在脑膜炎奈瑟氏菌的天然CPS中发现的结构相同。如本文使用的术语“人工的”描述了体外合成的且与在脑膜炎奈瑟氏菌的天然CPS中发现的结构不同的CPS结构。例如，人工CPS是这样的嵌合CPS，其包含脑膜炎奈瑟氏菌血清组A、B、C、W-135、X和/或Y的两个或更多个CPS亚基或者含有脑膜炎奈瑟氏菌血清组A、B、C、W-135、X和/或Y的不同CPS的一个或多个衍生化结构单元的CPS，或者由它们组成。此种衍生化结构单元的实例在图1 5中示出。嵌合CPS可以包含脑膜炎奈瑟氏菌血清组 Y/W-135、W-135/Y、B/Y、C/Y、B/W-135、C/W-135、B/Y/W-135、C/Y/W-135、B/ff-135/Y、C/W-135/Y、X/A或Α/Χ的CPS或CPS亚基，或者由它们组成。在嵌合CPS内，CPS亚基的一个或多个结构单元可以衍生化，如图1 5中示例性示出的。嵌合CPS可以包含一种或多种各包含CPS亚基的碳水化合物。嵌合CPS的CPS亚基的序列可以是任何顺序的。嵌合CPS实例在图6中示出。如本文使用的术语“碳水化合物”包含结构单元如任何形式的糖(saccharides)和糖(sugars)以及添加有数个羟基的醛和酮。碳水化合物可以包含经由共价键如糖苷连键连接的一个或多个所述结构单元。碳水化合物可以具有任何长度，即，它可以是单体、二聚体、三聚体或多聚体。碳水化合物也可以包含一个或多个结构单元作为经由共价键连接到主链上的侧链。碳水化合物还可以包含一个或多个活化糖，如核苷酸糖。核苷酸糖的实例为 UDP-Glc、UDP-Gal, UDP-GlcNAc, UDP-GlcUA、UDP-Xyl、GDP-Man、GDP-Fuc, CMP_Neu5Ac和 CMP-NeuNAc。如本文使用的术语“CPS亚基”描述了对脑膜炎奈瑟氏菌血清组各种CPS有特异性的一种或多种碳水化合物。在CPS亚基内，一种或多种碳水化合物可以衍生化。如果一个特定CPS亚基中存在两种或更多种碳水化合物，则它们通过对各种脑膜炎奈瑟氏菌血清组的CPS有特异性的连键连接。从上面明显可以看出，本发明提供了生产合成荚膜多糖，特别是人工嵌合荚膜多糖的方式和方法。因此，本发明还涉及通过或可通过本文提供的方法获得的嵌合荚膜多糖，特别是脑膜炎奈瑟氏菌的嵌合荚膜多糖。此种嵌合荚膜多糖尤其是，包含脑膜炎奈瑟氏菌血清组 Y/W-135、W-135/Y、B/Y、C/Y、B/W-i;35、C/W-i;35、B/Y/W-i;35、C/Y/W-i;35、B/W-135/Y、C/W-135/Y、X/A或A/X的荚膜多糖或荚膜多糖亚基的嵌合荚膜多糖。如本文提供的此种荚膜多糖不仅作为科学工具有用处，而且在医学环境中非常有价值，例如作为药物组合物。此种药物组合物可以包含疫苗。因此，本发明也涉及包含本文描述的嵌合荚膜多糖的药物组合物。所述荚膜多糖可以是分离的，但也设想了这些嵌合荚膜多糖结合其它结构例如多肽等使用。此种多肽，尤其可以用作本文描述的本发明嵌合荚膜多糖的载体或骨架。已开发将低聚糖共价连接到蛋白质上的许多方法(文献(Lit) :(a)Vince Pozsgay,Oligosaccharide-protein conjugates as vaccine candidates againstbacteria, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Academic Press,2000，卷 56，153-199 页，(b) Jennings, H. J.，R. K. Sood (1994) Synthetic glycoconjugatesas human vaccines ；Lee, Y.C. R. T. Lee(eds) Neoglycoconjugates. Preparation andApplications. San Diego, Academic Press, pp 325-371, (c)Pozsgay, V. ；Kubler-Kielb,J. , Conjugation Methods toward Synthetic Vaccines, Carbohydrate-Based Vaccines,American Chemical Society, July 2,2008,36-70) ； (D) Carl E. Frasch, Preparationof bacterial polysaccharide-protein conjugates Analytical and manufacturingchallenges, Vaccine, In Press, Corrected Proof，网上公布于 2009 年 6 月 24 日，ISSN0264-410X, DOI :10. 1016/j. vaccine. 2009. 06. 013.)。一个实例是本文描述的合成或人工CPS分子与蛋白质氨基通过还原胺化共价偶联。因此，本发明也包括包含如本文描述的嵌合荚膜多糖的复合物(化合物，compound) 0此种复合物具有特定的科学应用和医学应用。其中的一个此种应用是作为疫苗的应用，即，本文提供的复合物可以用于主体的疫苗接种。此种主体可以是哺乳动物，且在特定实施方式中，可以是人。本文提供的疫苗对于奈瑟氏菌的疫苗接种特别有用。根据上面，本发明也提供了包含本文公开的嵌合荚膜多糖的复合物在制备待给予主体，优选给予哺乳动物，最优选给予人的疫苗中的应用。此种医学应用特别涉及关于疾病的医学应用或干预，如脑膜炎疫苗接种，特别是对抗由脑膜炎奈瑟氏菌血清组A、B、C、W-135、X或Y引起的脑膜炎球菌性脑膜炎的疫苗接种。然而，如上面提到的和如后附实例中说明的，本发明也涉及新焦磷酸化酶(Damerow等人，Biol Chem(2010), 285 (2) :878-887)。因此，本发明也提供了本文定义的焦磷酸化酶在科学研究、工业环境以及医学环境中的应用。因此，本发明也涉及为本文定义的焦磷酸化酶(或其功能片段)编码的核酸分子、包含此种核酸分子的载体、包含此种核酸分子或此种载体的宿主细胞，或本文定义的焦磷酸化酶(或其功能片段)自身在将己糖-ι-磷酸和/或戊糖-ι-磷酸活化为核苷酸糖中的应用。所述己糖-ι-磷酸尤其可以选自Glc-IP和(ial-1-P构成的组，且所述戊糖-1-磷酸尤其可以选自木糖-I-P和阿拉伯糖-I-P构成的组。本文公开的焦磷酸化酶的此种应用可以是体外应用。特别设想在如本文公开的，例如用于生产合成多糖，如嵌合荚膜多糖的(生物)化学过程和方法中应用如本文描述的焦磷酸化酶。本文描述的焦磷酸化酶也可以用于生产活化的核苷酸糖如UDP-Gal、UDP-Glc、UDP-Xyl、UDP-GalA 或 UDP-Ara。本文提供的组合物可以包含如本文描述的合成和/或嵌合多糖(CPQ。此种组合物，尤其对医学和诊断目的有用，特别对药物和疫苗接种目的有用，即，对于奈瑟氏菌诱导的疾病治疗或诊断检测或对抗这些病原体的疫苗接种有用。因此，本发明也涉及如本文定义的组合物，该组合物是进一步包含可选的药物可接受载体的药物组合物。本发明药物组合物可以包含本发明CPS。该药物组合物可以进一步包含特异性针对本发明这些CPS的抗体，例如针对本文公开的这些合成CPS或者针对这些CPS产生的本发明抗体(或其片段或衍生物)。此种CPS以及针对此种CPS的抗体可以单独或结合用于尤其是疫苗接种方案。因此，包含本发明CPS或针对本发明CPS的抗体的本发明药物组合物可以用于制药目的，如受感染人和动物的有效治疗和/或用于疫苗接种目的。因此，本发明涉及包含如本文描述的CPS和/或针对如本文描述的CPS的抗体或抗体片段，和可选的药物可接受载体的药物组合物。在本发明背景下，本文描述的药物组合物尤其可以用于治疗、预防和/或诊断奈瑟氏菌诱导的疾病和/或感染。优选地，该药物组合物用作疫苗，如本文在下面将进一步描述的。本发明药物组合物可以进一步包含药物可接受载体、赋形剂和/或稀释剂。合适的药物载体的实例在本领域中是众所周知的，且包括磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳液，如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。包含此种载体的组合物可以通过众所周知的常规方法调配。这些药物组合物可以以合适的剂量给予主体。合适的组合物的给予可以通过不同方式实施，如通过静脉内、腹膜内、皮下、肌内、外用、真皮内、鼻内或支气管内给予。给药方案将由主治医师和临床因素决定。如医学领域众所周知的，针对任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者体型(Size)、体表面积、年龄、待给予的特定化合物(复合物)、性别、给予时间和途径、一般健康状况，和并行给予的其它药物。本发明药物组合物，特别在用于疫苗接种目的时，可按每剂(剂量，dose)约0. Olyg Ig CPS，或每剂约0. 5 μ g 500 μ g，或每剂约1 μ g 300 μ g CPS使用。然而，设想了低于或高于这个示例范围的剂量，尤其在考虑到前述因素时。合适的组合物的给予可以通过不同方式实施，如通过静脉内、腹膜内、皮下、肌内、外用或真皮内给予。然而，特别在本发明的药物干预中，奈瑟氏菌感染可能要求给予在感染侧，如脑。可以通过定期评估监测进展。本发明组合物可以局部或全身给予。给予一般是肠胃外，例如静脉内给予。本发明组合物也可以直接给予到靶位，例如通过基因枪(biolistic)递送到内部或外部靶位或者通过导管递送至动脉内的部位。用于肠胃外给予的制剂包括无菌水溶液或无菌非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例为，丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和注射用有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇溶液/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒剂(vehicle)包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液，或固定油。静脉内媒剂包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)等。还可以存在防腐剂和其它添加剂，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，本发明药物组合物可以包含此外的物质如白细胞介素和/或干扰素，这取决于该药物组合物的预期用途。在本发明的优选实施方式中，如本文定义的药物组合物是疫苗。疫苗尤其可以由如本文描述的一种或多种CPS，或由一种或多种抗体、所述抗体的片段或本发明抗体，即，针对如本文公开的CPS的抗体的衍生物制备。因此，在本发明背景下，疫苗可以包含如本文描述的一种或多种CPS和/或一种或多种抗体、所述抗体的片段或本发明抗体，即，针对如本文公开的CPS的抗体的衍生物。用在作为疫苗的药物组合物中的本发明CPS或抗体、所述抗体的片段或衍生物可以调配为，例如中性或盐形式。药物可接受盐，如酸加成盐，和其它盐在本领域中是已知的。疫苗尤其可用于治疗和/或预防病原体如奈瑟氏菌的感染，并以与调配方法相容的剂量，和以此种对预防或治疗性处理药理学有效的量给予。疫苗接种方案可以包含主动或被动免疫，其中主动免疫需要向宿主/患者给予一种抗原或多种抗原(如本发明嵌合多糖或抗体、所述抗体的片段或针对这些CPS的抗体的衍生物)，试图引出保护性免疫反应。被动免疫需要将预先形成的免疫球蛋白或其衍生物或片段(例如，本发明抗体，其衍生物或片段，即，针对本发明嵌合CPS和如通过本文提供的方式和方法获得的特异性抗体)转移到宿主/患者中。疫苗接种的原理和实践以及疫苗是技术人员已知的，参见，例如，Paul，“ Fundamental Immunology“ RavenPress, New York(1989)or Morein, " Concepts in Vaccine Development " , ed S. H. E. Kaufmann, Walter de Gruyter, Berlin, New York(1996), 243-264 ；Dimitriu S,editor. "Polysaccharides in medicinal application" ；New York :Marcel Dekker,PP 575-602。典型地，疫苗被制备成注射型液体溶液或悬浮液，也可以制备适合于在注射之前溶解或悬浮在液体中的固体剂型。该制剂可以乳化或者该蛋白质可以包裹在脂质体中。通常将活性免疫原性成分与可与该活性成分相容的药物学可接受赋形剂混合。合适的赋形剂包括，但不局限于水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等；也可以使用各种量的这些赋形剂的组合。该疫苗也可以包含少量辅助物质如润湿剂或乳化剂、PH缓冲剂，和/或增强该疫苗有效性的佐剂。例如，此种佐剂可以包括铝组合物(aluminum compositions)，如氢氧化铝、磷酸铝或磷酸氢氧化铝(aluminumphosphohydroxide)(如"Gen H-B-Vax或〃 DPT-Impfstoff Behring"中使用的)、N-乙酰基-胞壁酰基(muramyl)-L-苏氨酰(threonyl) -D-异谷酰胺(thr-DMP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰基(nornuramyl) -L-丙氨酰基-D-异谷酰胺(CGP 11687，也称为nor-MDP)、N_乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1 ‘ 2' - 二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP19835A,也称为 MTP-PE)、2%鲨烯 / 吐温-80 ⑧乳液中的 MF59 和 RIBI (MPL+TDM+CWS)。该疫苗通常通过静脉内或肌内注射给予。适合于其它给予模式的另外制剂包括栓剂，且在一些情况下包括口服制剂。对于栓剂，传统粘合剂和载体可以包括但不局限于，聚亚烷基二醇(polyalkylene glycol)或甘油三酯。口服制剂包括此种通常采用的赋形剂，如医药级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠(sodium saccharine)、纤维素、碳酸镁等。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末形式，且包含约10 % 约95 %的活性成分，优选约25 % 约70 %。疫苗以与剂量配方(dosage formulation)相容的方式，以预防和/或治疗有效的量给予。待给予的量一般在每剂约0. 01 μ g Ig抗原，或每剂约0. 5 μ g 500 μ g抗原，或每剂约Iyg 300μg抗原(在当前情况下，CPS是抗原)的范围内，且取决于待给药的主体、主体免疫系统合成抗体的能力，和期待的保护程度。需要给予的活性成分的精确量也取决于医生的判断，而且对于每个主体可能是独特的。该疫苗可以单剂量或多剂量给药方式给予。多剂量是这样的，即，可以在疫苗接种的初始时程使用1 10种单独的剂量，接着在维持和/或加强免疫反应所需的后续时间间隔给予其它剂量，例如，在1 4个月给予第2剂量，且如果个体需要，在几个月后给予一种(或多种)后续剂量。该给药方案也至少部分地由个体需要确定，且取决于医生的判断。考虑到，包含本发明免疫原性复合物(化合物)的疫苗可以联合其它免疫调节剂，例如，联合免疫球蛋白，联合细胞因子或联合可优化抗原处理的分子，如李斯特菌溶胞素(listeriolysin)给予。对于临床和/或科学标本中如奈瑟氏菌的病原体、病原片段、其衍生物、其(多)肽(蛋白质)、其多核苷酸等的诊断和量化，已开发出多种免疫学方法以及分子生物方法，如核酸杂交测定、PCR测定或DNA酶免疫测定(DEIA ；Mantero等人，Clinical Chemistry37(1991)，422-4四)，它们在本领域中是众所周知的。在这种情况下，应注意本发明核酸分子还可以包含PNA、含有酰胺骨架连键的修饰DNA类似物。此种PNA尤其作为DNA/RNA杂交的探针有用处。本发明蛋白质尤其对受感染个体生物测试样品中的抗病原(如，例如抗细菌或抗病毒)抗体的检测有用。还考虑了，抗体和包含本发明此种抗体的组合物对区分急性与非急性感染有用。如本文提供的CPS也可以用于诊断环境中，例如作为例如色谱方法中的“标准”。因此，本发明CPS可以用于比较分析，且可以单独或结合用于本领域已知的诊断方法。该诊断组合物可选地包含合适的检测方式(装置，means)。如本文公开和描述的CPS以及针对或特异性对抗这些嵌合多糖而产生的特异性抗体或其片段或衍生物，例如适用于免疫分析，其中它们可以液相利用或结合到固相载体上。固相载体在本领域中是已知的，且可以包含聚苯乙烯珠、乳胶珠、磁珠、胶体金属颗粒、玻璃和/或硅芯片和表面、硝基纤维素条(nitrocellulose strips)、膜、片、动物红细胞，或红细胞影泡(血影，ghosts)、硬膜细胞(duracytes)和反应盘的壁和孔、塑料管或其它测试管。将核酸、(多)肽、蛋白质、抗体、微生物等固定在固相上的合适的方法包括但不局限于，离子、疏水、共价相互作用等。可利用所述蛋白质、抗原片段、融合蛋白、本发明抗体或所述抗体的片段或衍生物的免疫分析实例为直接或间接方式的竞争性和非竞争性免疫分析。常用的检测分析可以包含，放射性同位素或非放射性同位素方法。此种免疫分析的实例为放射免疫分析(RIA)、三明治型(免疫测定分析(immunometric assay))和^festern印迹分析。此外，这些检测方法包括，尤其IRMA (免疫放射免疫测定分析)、EIA (酶免疫分析)、ELISA (酶联免疫分析)、FIA (荧光免疫分析)，和CLIA (化学发光免疫分析)。本领域中使用的其它检测方法是没有利用示踪分子的那些。这些方法的一种原型是基于给定分子桥接至少两种颗粒的特性的凝集反应(agglutination)分析。本发明CPS可以结合到许多不同载体上。众所周知的载体实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉(amyloses)、天然和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖，和磁铁矿。对于本发明目的，该载体的性质可以是可溶性或不可溶性的。可用于标记生物分子的多种技术是本领域技术人员众所周知的，被认为在本发明的范围之内，且包含，尤其，酶或生物素基(biotinyl group)的共价偶联、碘化、磷酸化、生物素化、随机引物法、缺口平移法(nick-translations)、碳水化合物的加尾(利用末端转移酶)或标记。此种技术，例如描述在下列文献中TijSSen，“ Practiceand theory of enzyme immuno assays“，Burden，RH and von Knippenburg (Eds)，卷15(1985)，“ Basic methods in molecular biology“ ；Davis LG, Dibmer MD ；BatteyElsevier (1990)，Mayer 等人，(Eds)" Immunochemical methods in cell and molecularbiology “ Academic Press，London (1987)，或"Methods in Enzymology “系列，AcademicPress, Inc.,或 Fotini N. Lamari, Reinhard Kuhn, Nikos K.Karamanos, "Derivatizationof carbohydrates for chromatographic, electrophoretic and mass spectrometricstructure analysis", Journal of Chromatography B,^ 793,1 Derivatization ofLarge Biomolecules, (2003),第 15-36 页。检测方法包括，但不局限于，自体放射照相术(autoradiography)、荧光显微镜术、直接和间接的酶促反应，等等。本文描述的嵌合CPS可以通过本领域中已知的以及本文描述和列举的方法检测。例如，本文描述的基于ELISA(酶联免疫吸附分析)的方法可以用于检测和量化本文描述的嵌合CPS。在这种情况下，本文描述的嵌合CPS可以通过与该嵌合CPS的一部分或结构单元接触的抗体或其它结合分子，如卵磷脂(Iectine)或类似物固定化。本文描述的嵌合CPS的第二部分或结构单元的检测可以通过，例如与标记用于进一步检测的如本文描述的抗体或其它结合分子接触，或者与标记用于进一步检测的如本文描述的第二抗体(二抗)或其它结合分子接触实现。本文在上面和下面描述和列举了适合于这个目的的标记分子。用于检测本文描述的和可通过本文提供的方法获得的嵌合CPS的实例在图19中示出或描述下面的实例，特别是实施例14和15中。本发明涉及生产对抗奈瑟氏菌属的疫苗的方法，包含以下步骤(a)合成或体外生产如上面定义的一种多糖(或多种多糖)；和(b)将所述一种多糖(或多种多糖)与药物可接受载体结合。在用于生产疫苗的这个方法的优选实施方式中，所述“一种多糖(或多种多糖)，，是如本文公开的嵌合CPS。此外，本发明涉及生产抗奈瑟氏菌属的一种菌株或多种菌株，特别是脑膜炎奈瑟氏菌的疫苗的方法，该方法通过(a)将本发明一种多糖(或多种多糖)(优选一种嵌合多糖(或多种嵌合多糖)与生物可接受载体结合(而完成)。


图1 :UDP-Gal、CMP-Neu5Ac及其可能的衍生物的示意图。A) UDP-半乳糖；B)UDP-半乳糖衍生化的潜在靶位用R1、R2> R3和R4表示。Rh的实例为=R = H, R = OH, R =N3, R = F, R = (CH2)xN3, R = C00H, R = (CH2)xCOOH, R = NH(CO) CH3, R = NH(CO) (CH2)xCH3,R = 0 (CO) CH3, R = O(CO) (CH2)xCH3 ；C) CMP-唾液酸；D) CMP-唾液酸衍生化的潜在靶位用礼、R2>R3>R4 和 R5 表示。R1-S 的实例为:R = H, R = OH, R = N3, R = F, R = (CH2)xN3, R = C00H，R = (CH2)xCOOH, R = NH(CO) CH3, R = NH(CO) (CH2)xCH3, R = O(CO) CH3, R = O(CO) (CH2) XCH3。图2 =UDP-Glc及其可能的衍生物的示意图。A)UDP-葡萄糖；B)UDP-葡萄糖衍生化的潜在靶位用R!>R2>R3和R4表示。Rh的实例为:R = H，R = 0H，R = N3, R = F，R = (CH2)xN3, R = C00H, R = (CH2)xCOOH, R = NH(CO) CH3, R = NH(CO) (CH2)xCH3, R = O(CO) CH3, R =O(CO) (CH2) xCH3。图 3 :UDP-GlcNAc 及其可能的衍生物的示意图。A)UDP_GlcNAc ；B)UDP-GlcNAc 衍生化的潜在靶位用R1^ R2> R3和R4表示。Rh的实例为=R = H, R = OH, R = N3, R = F, R =(CH2)xN3, R = C00H, R = (CH2)xCOOH, R = NH(CO) CH3, R = NH(CO) (CH2)xCH3, R = O(CO) CH3,R = O(CO) (CH2) xCH3。
图4:Gal-l-P、唾液酸及其可能的衍生物的示意图。A)半乳糖磷酸；B) Gal-I-P衍生化的潜在靶位用R” R2> R3和R4表示。R1^的实例为=R = H, R = OH, R = N3, R = F，R = (CH2) XN3，R = C00H, R = (CH2) xC00H, R = NH(CO) CH3, R = NH(CO) (CH2) XCH3, R = O(CO)CH3, R = O(CO) (CH2)xCH3 ；C) N-乙酰基神经氨酸；D)N_乙酰基神经氨酸衍生化的潜在靶位用 R1、R2> R3 和 R4 表示。Rh 的实例为=R = H, R = OH, R = N3, R = F, R = (CH2)xN3' R =C00H, R = (CH2)xCOOH, R = NH(CO) CH3, R = NH(CO) (CH2)xCH3, R = O(CO) CH3, R = O(CO) (CH2) xCH3。图5 受体衍生物的示意图。Α)在带有附接到异头碳(anomeric carbon) C2上的官能团的寡聚/多聚的血清组W-135或Y荚膜多糖还原端的末端糖(terminal sugar)。R1 = OH, R1 = [ — 2) - α-Neu5Ac_ (8 — ]χ, R1 = [—2) - α-Neu5Ac_ (9 — ]χ，R1 = [ — 1) - α -D-Glc-(6 — 2) - α -Neu5Ac (4 — ]χ，R1 = [—1) - α -D-Gal-(6 — 2) - α -Neu5Ac (4 — ] χ ；B)在带有附接到异头碳C2上的官能团的寡聚/多聚的血清组B荚膜多糖还原端的末端糖。& = 0H，R2 = [ — 2)-a-Neu5Ac-(8 —) J ；C)在带有附接到异头碳C2上的官能团的寡聚/多聚的血清组C荚膜多糖还原端的末端糖。R3 = OH, R3= [ — 2) - a-Neu5Ac-(9 — ) J。R = FITC-乳糖，R = FCHASE-乳糖，R = N3, R = F, R = (CH2) xN3 (对于图 A、B 和 C)。图6 野生型和嵌合脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖的示意图。NmW-135 :NmW-135[ —6)-a -D-Galp-(1 — 4) - α -Neu5Ac_ (2 — ]η 荚膜多糖，NmY =NmY [ — 6) - α -D-Glcp-(1 —4)-α -Neu5Ac-(2 — ]η 荚膜多糖，NmB/C :NmB[ — 8)- α -Neu5Ac-(2 — ]n 荚膜多糖或 NmC[ — 9) - α -Neu5Ac-(2 — ] 荚膜多糖，NmX :NmX[ — 4) - α -D-GlcpNAc-(1 — OPO3 — ]η 荚膜多糖，NmA :NmA[ — 4) - α-D-ManpNAc-(1 — OPO3 — ]η荚膜多糖。嵌合CPS可以包含指示的CPS结构的一个或多个结构单元。该结构单元可以具有可变的长度。图 7 =CP-Wl35 荚膜聚合酶 NmW-135。MK 肌球蛋白激酶(Sigma-Aldrich)，PK 丙酮酸激酶(Sigma-Aldrich)。CSS 来自NmB的CMP_Neu5Ac合成酶。IPP 无机焦磷酸酶 (Molecular Probes)。USP 来自硕大利什曼原虫的UDP-糖-焦磷酸化酶(Damerow等人， J Biol Chem (2010), 285 (2) :878-887)。PEP 磷酸烯醇丙酮酸。Gal-IP 半乳糖-1-磷酸。图8 在一锅(one-pot)/六酶反应中从简单原料(半乳糖-IP、磷酸烯醇丙酮酸和唾液酸)体外合成W-135CPS。双循环反应的产物形成通过以下进行分析A)使用抗-W-135CPS特异性抗体mAb MNW1-3的点印迹分析。B和C)多糖PAGE分析。B)在指示的时间步长(time step) (0h、;3h、24h和47h)之后取出反应样品，将其与2M蔗糖以1 1混合之后施加到凝胶中。为了增加单一条带Is的分辨率，还施加了稀释液(1 10)。C)稀释系列的5 50 μ g W-135CPS标准物使得人们可以评价该循环反应(反应1 10 [h])形成的，纯化(纯化反应)之后的多糖产物。对2、3和8泳道进行比较，可以粗略评价加入的多糖和由此形成的产物量，所形成的产物量接近ang/200 μ L反应体积。这相当于理论最大产率的80 90%。所有样品都通过25% PAGE分离，且在随后的阿尔辛蓝(Alcian blue)/ 银染色中检测到糖结构。图9 重组CP-W135和CP-Y的纯化。A)在大肠杆菌中进行C-端6xHis标记的酶的表达，并通过两步操作程序中的IMAC和尺寸排阻色谱纯化。整个纯化过程获得的蛋白质组分通过如所示的考马斯染色的SDS-PAGE(10% )分析；B-C)CP-W-135和CP-Y的低聚状态。纯化的CP-W-135和CP-Y的四级结构通过尺寸排阻色谱分析。标准蛋白质的洗脱体积由箭头指示(B)，主要峰组分(peak fraction)随后通过针对6xHis-表位标签的flfestern 印迹分析进行分析(C)。图10 重组CP-X的纯化。使C-端6xHis标记的酶在N端融合到MBP上，在大肠杆菌中进行表达，并通过MBP亲和色谱和尺寸排阻色谱纯化。细菌裂解液、流过液(flow through)、洗涤液、亲和层析汇集物(pool)、凝胶过滤汇集物和80°C储存的蛋白质组分(级分、流分，fractions)通过考马斯染色的SDS-Page (A)和通过针对6x His-标签(B)和 MBP-标签(C)，以抗-His mAb ( ^ -5His (anti-PentaHis), Qiagen)和抗 MBP mAb HRP 结合的(NEB)为探针的Western印迹分析进行分析。(D)使C-端6xHis标记的酶在N端融合到 MBP上，在大肠杆菌中进行表达，并通过MBP亲和色谱纯化。细菌裂解液和亲和纯化的蛋白质组分通过考马斯染色的SDS-PAGE (左侧)和以抗-His mAb (抗_5His，Qiagen)为探针的 Western印迹分析(右侧)进行分析。图11 长血清组W-135和Y聚合物链的体外合成。A)CP-W-135和CP-Y合成产物的多糖PAGE分析。为了获得低聚糖受体底物，使纯化的血清组W-135CPS (泳道2)水解 (CPS7M ,泳道；3)，随后用作体外聚合的引物材料。反应混合物包含纯化的酶催化剂、各种供体糖CMP-Neu5Ac/UDP-Gal (泳道4)和CMP-NeuSAc/UDP-Glc (泳道5)以及受体结构CPS水解 (CPSaydro)。所有样品都通过25 % PAGE分离，并在随后的阿尔辛蓝/银染色中检测到糖结构； B)A(泳道 4-5)中合成的多糖利用抗-CPS-W-135(mAb MNW1-3)和抗-CPS-Y (mAb MNY4-1) 特异性抗体进行免疫染色。在Imin和30min反应时间之后将该反应混合物的5 μ 1等分试样点到Hybond膜上。利用等量的受体结构CPS7wff (无酶)作为阴性对照。图 12 血清组 X CPS 的体外合成。A) ^t UDP-[6- ] -GlcNAc (2mCi/mmol, Perkin Elmer)的存在下利用纯化的CP-X作为催化剂以放射化学分析法分析聚合物合成。不添加受体(oA)，或添加完整的NmX-裂解液。在O、10和30min反应时间之后分析5 μ 1等分试样。通过下行纸(descending paper)色谱分离样品，并通过闪烁计数测量。B)另外，通过 PAGE(25%)分析反射性标记的反应产物。将含有和不含有CP-X酶的样品在反射性标记的供体糖UDP-W-3H]-GlcNAc (2mCi/mmol,Perkin Elmer)和完整NmX-裂解液的存在下温育。图13 以定义的低聚糖受体为原料合成血清组W-135和Y CPS。利用纯化的 CP-ff-135(A)和CP-Y (B)酶催化剂延伸人工受体。在CMP-[14C]Neu5Ac的存在下以反射化学分析法分析聚合物合成。反应混合物另外包含需要的UDP-己糖供体底物(对于CP-W-135 为UDP-Gal，对于CP-Y为UDP-Glc)和如指示的人工受体底物。通过下行纸色谱分离样品， 并通过闪烁计数分析。ok 没有添加受体，DPI 唾液酸单体，DP2 α 2，8_连接的唾液酸二聚体，DP3 α 2,8-连接的唾液酸三聚体，cps Nmff 纯化的NmW_i;35CPS，cps NmY 纯化的 Nmff-135CPS0图14 嵌合W135/Y-聚合物的体外合成。A)在W-135或Y CPS存在下，以如图13 描述的放射化学分析法分析纯化的CP-W-135和CP-Y的产物形成，与在没有任何CPS受体存在的情况下的反应相比较；B)在平行分析中，分析CPS特异性抗体对合成的多糖的识别从而证实双表位CPS分子的合成。用纯化的血清组W-135CPS长链(CPS(W-135))或水解 (CPS(ff-135)水解)组分作为体外CPS合成的引物材料。将该反应液的5μ1等分试样点到 Hybond 膜上，随后通过使用抗-CPS-W-135(mAbMNWl-3，(25))和抗-CPS-Y (mAb MNY4-1,(25))特异性抗体进行的免疫染色以及随后的显色反应检测结合的CPS。图15 =Glc-I-P及其可能的衍生物的示意图。A)葡萄糖磷酸；B) Glc-I-PS 生化的潜在靶位用R1^ R2> R3和R4表示。Rh的实例为=R = H, R = OH, R = N3, R = F, R = (CH2) xN3, R = C00H, R = (CH2)xCOOH, R = NH(CO) CH3, R = NH(CO) (CH2)xCH3, R = O(CO) CH3, R = O(CO) (CH2) xCH3。图16 :GlcNAc-l-P及其可能的衍生物的示意图。A)N_乙酰葡糖胺磷酸；B) GlcNAc-I-P衍生化的潜在靶位用R1、R2> R3和R4表示。R1^的实例为=R = H, R = OH, R = N3, R = F, R = (CH2)xN3, R = C00H, R = (CH2)xCOOH, R = NH(CO) CH3, R = NH(CO) (CH2)xCH3, R = O(CO) CH3, R = O(CO) (CH2) xCH3。图17 =UDP-ManNAc及其可能的衍生物的示意图。A)UDP_N_乙酰甘露糖胺；B) UDP-ManNAc衍生化的潜在靶位用R1^ R2> R3和R4表示。R1^的实例为=R = H, R = OH, R = N3, R = F, R = (CH2)xN3, R = C00H, R = (CH2)xCOOH, R = NH(CO) CH3, R = NH(CO) (CH2)xCH3, R = O(CO) CH3, R = O(CO) (CH2) xCH3。图18 =ManNAc-I-P及其可能的衍生物的示意图。A)N_乙酰甘露糖胺磷酸；B) ManNAc-I-P衍生化的潜在靶位用R1、R2> R3和R4表示。R1^的实例为=R = H, R = OH, R = N3, R = F, R = (CH2)xN3, R = C00H, R = (CH2)xCOOH, R = NH(CO) CH3, R = NH(CO) (CH2)xCH3, R = O(CO) CH3, R = O(CO) (CH2) xCH3。图19 用于证实嵌合荚膜多糖B/W-135CPS和B/Y CPS的形成的基于ELISA的分析。A)对照样品:DP50(由α-2，8连接的多聚Sia (polySia)组成的50个单元(unit) 的链长)W-135CPS(从细菌收获的NmW-135荚膜多糖)W-135CPS hyd (从细菌收获的水解的 NmW-135荚膜多糖(W-135CPS))样品在存在(+)和不存在(-)聚合酶NmW-135 (CP-W-135) 和DP50的情况下进行反应从而证明嵌合CPS的形成。样品分一式两份进行。B)对照样品 DP50(由α -2，8连接的多聚Sia组成的50个单元的链长)Y CPS (从细菌收获的NmY荚膜多糖)样品在存在(+)和不存在(_)聚合酶NmY (CP-Y)和DP50的情况下进行反应从而证明嵌合CPS的形成。样品分一式两份完成。图20 重组UDP-GlcNAc差向异构酶和CP-A的纯化。荚膜聚合酶(CP-A)以及NmA UDP-GlcNAc差向异构酶(NmA差向异构酶)的纯化。对这两种酶进行表达，并纯化带有N-末端Strep和C-末端六组氨酸标签的融合构建体。通过IMAC纯化该酶，并通过考马斯染色的SDS-PAGE(COO)和通过以抗-His mAb (抗-PentaHis，Qiagen)为探针的^festern印迹(WB)分析来分析蛋白质组分。图21 血清组A CPS的体外合成。A)在UDP-[14C]-GlcNAc的存在下利用纯化的CP-A和纯化的UDP-GlcNAc差向异构酶作为酶催化剂以放射化学分析法分析聚合物合成。不添加受体(w/o)或添加从细菌细胞收获的A CPS。在0、10和30min反应时间之后分析5 μ 1等分试样。通过下行纸色谱分离样品，并通过闪烁计数测量。B)将温育Omin和60min之后的反应样品施加到PAGE中，并通过阿辛蓝银染色显色。进行包含或不包含NmA荚膜多糖(A CPS)的反应，表明聚合酶可以在无受体的情况下运作(重新)。
具体实施例方式实施例说明本发明。实施例1 质粒分别利用寡核苷酸KS272(GC GGA TCC GCT GTT ATT ATA TTT GTT AACG)和 KS273 (CCG CTC GAG_TTT TTC TTG GCC AAA AAA CTG)，通过 PCR 从质粒 pHC4 和 pHC5 (Claus 等人，Molecular divergence of the sia locus in different serogroups of Neisseria meningitidis expressing polysialic acid capsules, Mol Gen Genet(1997),257(1) 28-34)中扩增出CP-W-135酶(荚膜聚合酶W-135)和CP-Y酶(荚膜聚合酶Y)。将 PCR产物连接在源自pET-22b (Novagen)的表达载体pET22b_Str印(Schwarzer 等人，Characterization of a novel intramolecular chaperone domain conserved in endosialidases and other bacteriophage tail spike and fiber proteins, J Biol Chem(2007) ,282(5) :2821-2831)的 BamHI 和 XhoI 位点之间。所得构建体 (pET22b-Strep-Nmffl35和pETMbltr印-NmY)带有N-端Str印-标签II (其后为凝血酶切割位点)，和C-端His-6-标签。通过测序证实所有构建体的序列同一性。利用寡核苷酸 KS422 (GC ATCT CAT ATG GCT GTT ATT ATA TTT GTT AAC G)和 KS273 (CCG CTC GAG TTT TTC TTG GCC AAA AAA CTG)，从 pHC4 和 pHC5 (Claus 等人，Molecular divergence of the sia locus in different serogroups of Neisseria meningitidis expressing polysialic acid capsules, Mol Gen Genet (1997)，257 (1) :28-34)中扩增出缺少 N-端 Strep-II-标签的表达构建体。将PCR产物连接在表达载体pET22b (Novagen)的NdeI和 XhoI 位点之间。利用引物对 KS423(GC GGA TCC ATT ATG AGC AAAATT AGC AAA TTG)和 KS424 (CCG CTC GAG TTG TCC ACT AGG CTG TGA TG)，通过 PCR 从基因组血清组 X 奈瑟氏菌 DNA中扩增出CP-X酶(荚膜聚合酶X)。将PCR产物连接到表达载体pMBPItr印-NmB-多聚(poly)ST(Freiberger 等人，Biochemical characterization of a Neisseria meningitidis polysialyltransferase reveals novel functional motifs in bacterial sialyltransferases, Mol Microbiol (2007), 65 (5) :1258-1275)的 BamHI 和 XhoI 位点之间，形成质粒pMBP-XcbA-His。另夕卜，利用引物对AB20(GCA GAT CTT TTA TAC TTA ATA ACA GAA AAT GGC)和 AB21(CCG CTC GAG TTT CTCAAATGATGATGG TAA TG)，通过 PCR 从基因组血清组 A 奈瑟氏菌 DNA中扩增出CP-A (荚膜聚合酶A)。将PCR产物连接在源自pET_22b (Novagen)的表达载体 pET22b-Str印(Schwarzer 等人，J Biol Chem(2007), 282 (5) :2821-2831)的 BamHI 和 XhoI位点之间。所得构建体(pET22b-Str印-NmA)带有N-端Mi^p-标签II (其后为凝血酶切割位点)，和C-端His-6-标签。通过测序证实序列同一性。利用引物对AB22(GCG GAT CCA AAG TCT TAA CCG TCT TTG GC)和 AB23(CCG CTC GAG TCT ATT CTT TAA TAAAGT TTC TAC A)，通过PCR从基因组血清组A奈瑟氏菌DNA中扩增出UDP-GlcNAc-UDP-ManNAc 差向异构酶(NmA-差向异构酶)。将PCR产物连接在源自pET-22b (Novagen)的表达载体 pET22b-Str印(Schwarzer 等人，J Biol Chem(2007), 282 (5) :2821-2831)的 BamHI 和 XhoI 位点之间。所得构建体(pET22b-Str印-NmA差向异构酶)带有位于N-端Mi^p-标签II (其后为凝血酶切割位点)，和C-端His-6-标签。通过测序证实序列同一性。实施例2 :CP-ff-135和CP-Y酶的表达和纯化
在15°C和225rpm下在含有100 μ g/ml羧苄青霉素的自诱导ZYM-5052培养基 (Studier,Protein production by auto-induction in high density shaking cultures, Protein Expr Purif (2005)，41 (1) :207-234)中培育新转化的大肠杆菌 BL21 (DE3)(用 pET22b-Strep-Nmffl35 或 pET22b_Str印-NmY 转化的)。78h(6000x g, 15min，4°C )后收获细胞，用PBS洗涤一次，存放在-20°C下。将来自250ml培养液的细菌颗粒重悬在添加有蛋白酶抑制剂(40mg/ml抑氨肽酶(Bestatin)、1 μ g/ml胃酶抑素(P印statin)和ImM PMSF) 的结合缓冲液(50mM Tris/HCl pH 8. 0,300mM NaCl)中，从而使最终体积为15ml。通过超声处理破碎细胞，并对样品进行离心(16000x g ;30min，4°C )。过滤(Sartorius Minisart 0. 8 μ m)裂解液，并使重组蛋白质结合到Iml His1Trap亲和柱(GE Healthcare)上。在用 10个柱体积洗涤缓冲液(50mM Tris/HCl,pH 8. 0,300mM NaCl，50mM咪唑)洗涤之后，洗脱 (50mM Tris/HCl pH 8. 0，300mMNaCl，150mM咪唑)结合的蛋白质。汇集含有重组蛋白质的组分(流分)，过滤(Millipore Ultrafree MC 0. 2 μ m)并将其施加到 Superdex 20010/300GL 柱(GE Healthcare)上以便进一步通过尺寸排阻色谱纯化。以0. 5ml/min的流速，用50mM Tris/HCl,pH 8. 0,300mM NaCl,2mM DTT洗脱蛋白质。利用 Amicon超离心设备(Millipore ； 50KDa MWC0)将获得的蛋白质样品浓缩至ang/ml，速冻于液氮中并存放在_80°C下。结果在图9中示出。从脑膜炎奈瑟氏菌血清组W-135克隆的，带有N-端Str印II和C-端6xHis-标签的荚膜聚合酶的核苷酸序列在SEQ ID NO :13中示出，相应的多肽序列在SEQ ID N0 14 中示出。从脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y克隆的，带有N-端Str印II和C-端6xHis-标签的荚膜聚合酶的核苷酸序列在SEQ ID NO :15中示出，相应的多肽序列在SEQ ID N0:16中示出。 从脑膜炎奈瑟氏菌血清组W-135克隆的，带有C-端6xHis-标签的荚膜聚合酶的核苷酸序列在SEQ ID NO 17中示出，相应的多肽序列在SEQ ID NO 18中示出。实施例3A =CP-X酶的表达和纯化在15°C和225rpm下在含有100 μ g/ml羧苄青霉素的自诱导ZYM-5052培养基 (Studier,Protein production by auto-induction in high density shaking cultures, Protein Expr Purif (2005), 41 (1) :207-234)中培育新转化的大肠杆菌 BL2I (DE3) (pMBP-XcbA-His)。78h (6000x g，15min，4°C)后收获细胞，用 PBS 洗涤一次，存放在 _20°C 下。将来自50ml培养液的细菌颗粒重悬在添加有蛋白酶抑制剂(40mg/ml抑氨肽酶、 1 μ g/ml 胃酶抑素和 ImM PMSF)的 5ml 结合缓冲液 QOmM Tris/HCl pH 7. 5,200mM NaCl, ImM DTT)中。通过超声处理破碎细胞，并对样品进行离心(16000x g ;30min，4°C )。过滤 (Sartorius Minisart 0. 8 μ m)裂解液，并在室温下使重组蛋白质结合到Iml直链淀粉树月旨(New England Biolabs)上 lh。在用 10 个柱体积结合缓冲液(20mM Tris/HCl pH 7. 5， 200mM NaCl, ImM DTT)洗涤之后，洗脱 QOmM Tris/HCl pH 7. 5,200mM NaCl, ImM DTT，IOmM 麦芽糖)结合的蛋白质。汇集含有重组蛋白质的组分，利用Amicon超离心设备(Millipore ； 50KDa MWC0)浓缩至ang/ml，速冻于液氮中并存放在_80°C下。结果在图10D中示出。从脑膜炎奈瑟氏菌血清组X克隆的，带有N-端MBP和C-端6xHis-标签的荚膜聚合酶的核苷酸序列在SEQ ID NO 19中示出，相应的多肽序列在SEQ ID NO 20中示出。实施例;3B 通过亲和色谱和尺寸排阻色谱对CP-X酶的扩展纯化(extended purification)对CP-X酶进行表达，按实施例3中描述的方式存放。将来自50ml培养液的细菌颗粒重悬在添加有蛋白酶抑制剂(40mg/ml抑氨肽酶、lyg/ml胃酶抑素和ImM PMSF)的 5ml结合缓冲液QOmM Tris/HCl pH 7. 5,200mM NaCl, ImM DTT)中。通过超声处理破碎细胞，并对样品进行离心(16000x g ;30min，4°C )。过滤(Sartorius Minisart 0. 8 μ m)裂解液，并在室温下使重组蛋白质结合到Iml直链淀粉树脂(New England Biolabs)上lh。在用10个柱体积结合缓冲液QOmM Tris/HCl pH 7. 5,200mM NaCl,lmM DTT)洗涤之后，洗脱 (20mM Tris/HCl pH 7. 5,200mM NaCl, ImM DTT，IOmM麦芽糖)结合的蛋白质。随后汇集含有重组蛋白质的组分，并将其施加到Superdex 200 10/300GL柱上以便进一步通过尺寸排阻色谱纯化。以lml/min的流速，用20mM Tris,pH 7，5完成洗脱。汇集含有重组蛋白质的组分，利用Amicon超离心设备(Millipore ;50KDa丽CO)浓缩至ang/ml，速冻于液氮中并存放在-80°C下。在整个纯化过程中取出样品，结果在图10A-10C中示出。从脑膜炎奈瑟氏菌血清组X克隆的，带有N-端MBP和C-端6xHis-标签的荚膜聚合酶的核苷酸序列在SEQ ID NO 19中示出，相应的多肽序列在SEQ ID NO 20中示出。实施例4 血清组W-135和血清组Y CPS的体外酶促合成在总体积为37. 5 μ 1的情况下，在反应缓冲液(20mM Tris/HCl pH 8.0, IOmM MgCl2, ImM DTT)中，在 ImM CMP_Neu5Ac (GERBU)、2mM UDP-Gal (CP-ff-135)或 UDP-Glc(CP-Y)，以及作为低聚糖受体结构的水解W-135 CPS(0. 16 μ g/μ 1)存在下分析纯化的酶催化剂(5-15yg)。在室温下温育样品，按适当的时间间隔加入IM蔗糖终止反应。通过PAGE(25% )分离合成的产品，利用联合阿尔辛蓝/银染色操作程序进行染色以便证明长CPS链的体外合成，如(Bergfeld等人，The polysialic acid-specific 0-acetyltransferase OatC from Neisseria meningitidis serogroup C evolved apart from other bacterial sialate 0-acetyltransferases, J Biol Chem(2009),284(1) 6-16)中描述的。简言之，用1体积加样缓冲液(1M蔗糖)稀释样品，之后将其加到25%聚丙烯酰胺凝胶(89mM Tris、89mM硼酸、2mM EDTA、25%聚丙烯酰胺)上。另外，施加规定分子大小的标准染料混合物(0，05%锥虫蓝(trypan blue)、0，02%二甲苯蓝(Xylene cyanol)、 溴酚蓝、溴甲酚紫、酚红)，对该样品进行电泳G°C，23V/cm)直至酚红带到达凝胶终点。随后固定凝胶Ih (40% K0H，5%乙酸)，并用0，5%阿尔新蓝染色30min。用水除去背景染色， 之后开始5min的氧化步骤(0，7%高碘酸、40%乙醇、5%乙酸)。氧化之后，凝胶用水洗涤 3次，在银染色(0，6%硝酸银、201111 NaOH,0. 4% NH4OH)中温育lOmin，然后再次用水洗涤三次。最后将凝胶温育在显色剂(0，05%甲醛、240 μ M柠檬酸)中，直至多糖带清晰可见为止。 通过在5%乙酸溶液中温育中止显色反应。在平行分析中，分析CPS特异性抗体对合成的多糖的识别。在添加蔗糖之前，将反应液的5μ1等分试样点到Hybond XL-膜上。干燥膜，并用干奶粉(dry-milk)封闭0%， PBS 配制)。通过利用抗-CPS-W-I35 (mAbMNWl-3, (Longworth 等人，0-Acetylation status of the capsular polysaccharides of serogroup Y and W135 meningococci isolated in the UK，FEMS Immunol Med Microbiol (2002), 32 (2) :119-123)禾Π 抗-CPS_Y(mAb MNY4-1, (Longworth ^ Α 0-Acetylation status of the capsular polysaccharides of serogroup Y and W135meningococci isolated in the UK, FEMS Immunol Med Microbiol (2002), 32 (2) :119-123)特异性抗体进行的免疫染色，以及随后的显色反应，检测结合的CPS。为了通过红外荧光检测量化，用Odyssey封闭缓冲液(LI-COR)封闭膜，并用山羊抗小鼠IR680 (LI-COR)作为第二抗体(50ng/ml，封闭缓冲液中)。然后根据Odyssey 红外成像系统(LI-COR)的指导，对结合的CPS进行量化。结果在图11中示出。实施例5 血清组X CPS体外酶促合成在含有4mM 氚标记的 UDP-R-3H]-GlcNAc QmCi/mmol，Perkin Elmer)，和 2μ 1 完整NmX细菌裂解液或无进一步受体的，总体积为Μμ 1的反应缓冲液QOmM Tris/HCl pH 8. 0，20mM MgCl2, 2mM DTT)中，分析纯化的CP-X酶(5 μ g)。在37°C下温育样品，按适当的时间间隔混合反应溶液的5μ 1等分试样与5μ 1冷冻乙醇(96% )来终止反应。将样品点到Whatman 3MM CHR纸上，并在用96%乙醇/IM乙酸铵，pH 7，5 (7 3，ν/ν)进行下行纸色谱之后通过闪烁计数量化色谱固定氚标记的反应产物。结果在图12Α中示出。另外，发现CP-X启动聚合物的从头合成。而且，在将10μ 1反应液与10μ 1 2Μ蔗糖混合之后，还对样品应用PAGE (25%)分析，并在400V下电泳汕。为了显现[14C]-标记的反应产物，电泳之后立即真空干燥凝胶，并将其暴露到显像胶片(成像膜，imaging film) (BioMax, Kodak)中。结果在图12B中示出。实施例6 以定义的低聚糖受体为原料体外酶促合成血清组W-135和血清组Y多糖为了研究CP-W-135和CP-Y的最小受体底物要求，测试了一小组定义的低聚糖 α 2，8_连接的唾液酸单体(DPI)、二聚体(DP》和三聚体(DP!3)得自Nacalai Tesque, W-135CPS和Y CPS由U. Vogel, Wurzburg赠送。这两种酶CP-W_i;35和CP-Y都可以高效地启动以CPS受体和定义的DP3受体底物为原料的聚合物合成。而且，还发现CP-W-135启动聚合物的从头合成。按所描述(Vogel 等人’ Complement factor C3 deposition and serum resistance in isogenic capsule and lipooligosaccharide sialic acid mutants of serogroup B Neisseria meningitidis, Infect Immun 1997,65(10) :4022-4029) ^Mf 酶分析。在 ImM 放射性碳标记的 CMP-[14C]Neu5Ac(0. 13mCi/mmol, GE Healthcare)，和 2mM UDP-Gal (对于CP-W-135而言)或UDP-Glc (对于CP-Y而言)(这两种碳水化合物都得自 Sigma)的存在下，在反应缓冲液(20mM Tris/HCl pH 8. O, IOmM MgCl2，ImM DTT)中分析纯化的重组蛋白质(5-15yg)。另外，在25μ1总体积中加入2mM(低聚)糖受体或0，^ig/ ml W-135CPS或Y CPS。在室温下温育样品，并按适当的时间间隔混合反应溶液的5 μ 1等分试样与5μ 1冷冻乙醇(96% )来测定酶活性。将样品点到Whatman 3匪CHR纸上，并在用96%乙醇/IM乙酸铵，pH 7,5(7 3, ν/ν)进行下行纸色谱之后通过闪烁计数量化色谱固定(相中)mC标记的反应产物。结果在图13中示出。实施例7 嵌合奈瑟氏菌荚膜多糖的体外酶促合成为了合成嵌合多糖，在总体积为37.5μ 1的反应缓冲液QOmM Tris/HCl pH 8. O, IOmM MgCl2, ImM DTT)中，在 ImM CMP_Neu5Ac (GERBU)、2mM UDP-Gal (CP-ff-135) 或UDP-Glc(CP-Y)，以及CPS受体分子(Oj-lyg/yl)的存在下温育纯化的酶催化剂 (5-15 μ g)。利用下面的酶/受体对合成表1中指示的嵌合体。表 权利要求
1.生产脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriamentingitidis)的荚膜多糖(CPS)的体外方法，所述方法包括以下步骤(a)使至少一种供体碳水化合物与至少一种荚膜聚合酶(CP)接触；(b)将所述碳水化合物与所述荚膜聚合酶温育；和(c)分离得到的荚膜多糖，其中，所得荚膜多糖是脑膜炎奈瑟氏菌血清组W-135、Y、A或X特异性荚膜多糖的合成或人工荚膜多糖，或者其中，所得荚膜多糖是人工嵌合荚膜多糖，所述人工嵌合荚膜多糖包含脑膜炎奈瑟氏菌血清组 Y/W-135、W-135/Y、B/Y、C/Y、B/W-135、C/W-i;35、B/Y/W-135、C/Y/W-135、B/W-135/Y、C/W-135/Y、Χ/Α或Α/Χ的荚膜多糖或荚膜多糖亚基。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述嵌合荚膜多糖包含脑膜炎奈瑟氏菌血清组W-135和Y的荚膜多糖或荚膜多糖亚基。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(a)中使所述至少一种供体碳水化合物和所述至少一种荚膜聚合酶进一步与受体碳水化合物接触。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，活化所述至少一种供体碳水化合物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述至少一种供体碳水化合物通过活化核苷酸的键连而活化。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述活化核苷酸选自CMP、UDP、TDP和AMP组成的组。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述荚膜聚合酶是CP-W-135。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，至少一种供体碳水化合物是CMP-NeU5Ac，且至少一种供体碳水化合物是UDP-Gal。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述荚膜聚合酶是CP-Y。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，至少一种供体碳水化合物是CMP-NeU5Ac，且至少一种供体碳水化合物是UDP-Glc。
11.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述荚膜聚合酶是CP-X。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，至少一种供体碳水化合物是UDP-GlcNAc。
13.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述荚膜聚合酶是CP-A。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，至少一种供体碳水化合物是UDP-ManNAc。
15.根据权利要求7所述的方法，其中，至少一种供体碳水化合物选自Gal-I-P和唾液酸组成的组。
16.根据权利要求9所述的方法，其中，至少一种供体碳水化合物选自Glc-I-P和唾液酸组成的组。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中，所述唾液酸是Neu5Ac。
18.根据权利要求11所述的方法，其中，至少一种供体碳水化合物是GlcNAc-1-P。
19.根据权利要求13所述的方法，其中，至少一种供体碳水化合物是ManNAc-1-P。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中，至少一种供体碳水化合物在权利要求1的步骤(a)期间与活化酶接触并在权利要求1的步骤(b)期间进行活化。
21.编码焦磷酸化酶或其片段的核酸分子，所述核酸分子包含选自以下组成的组中的核酸分子(a)具有SEQID NO 9的核苷酸序列的核酸分子；(b)编码包含SEQID NO 10的氨基酸序列的多肽的核酸分子；(c)具有SEQID NO :9的核苷酸序列的核酸分子，其中，添加、删除或替换一个或多个核苷酸；(d)编码包含SEQID NO :10的氨基酸序列的多肽的核酸分子，其中，添加、删除或替换一个或多个氨基酸残基；(e)与SEQID NO 9的核苷酸序列具有至少45%的同一性的核酸分子；(f)编码包含与SEQID NO 10的氨基酸序列具有至少45%同一性的氨基酸序列的多肽的核酸分子；(g)与(a) (f)中任一项的核酸分子互补的核酸分子；(h)在严格条件下与(a) (g)的核酸分子中任一种杂交的核酸分子；(i)由于遗传密码简并性而与(a) (h)中任一项的核酸分子序列不同的核酸分子；以及(j) (a) (i)核酸分子的功能片段。
22.包含权利要求21所述的核酸分子的载体。
23.包含权利要求22所述的载体的宿主细胞。
24.由权利要求21所述的核酸分子或其功能片段编码的多肽。
25.根据权利要求15或16所述的方法，其中，Gal-I-P或Glc-I-P在权利要求1的步骤(a)期间与根据权利要求21所述的核酸分子或其功能片段或根据权利要求M所述的多肽或其功能片段接触，并在权利要求1的步骤(b)期间进行活化。
26.根据权利要求20或25所述的方法，其中，在步骤(a)中，至少一种供体碳水化合物进一步与PEP和/或至少一种核苷酸接触。
27.根据权利要求沈所述的方法，其中，所述至少一种核苷酸选自CMP、⑶P、CTP、UMP、UDP和UTP组成的组。
28.根据权利要求7 10、15 17、20和25 27中任一项所述的方法，其中，所述受体是寡聚或多聚的W-135荚膜多糖、寡聚或多聚的Y荚膜多糖、寡聚或多聚的α 2,8-连接的唾液酸和/或寡聚或多聚的α 2，9-连接的唾液酸。
29.根据权利要求观所述的方法，其中，所述受体在其还原端带有一个或多个另外的官能团。
30.根据权利要求11 14、18 20J6或27中任一项所述的方法，其中，所述受体是脑膜炎奈瑟氏菌血清组A或X的荚膜多糖或者含有末端GIcNAC残基的碳水化合物结构。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述包含末端GIcNAC残基的碳水化合物结构选自透明质酸、硫酸肝素、硫酸乙酰肝素或蛋白质连接的低聚糖组成的组。
32.根据权利要求观至31中任一项所述的方法，其中，对所述受体荚膜多糖进行纯化。
33.根据权利要求观至32中任一项所述的方法，其中，使所述受体荚膜多糖水解。
34.一种可通过根据权利要求1至20和25至33中任一项所述的方法获得的脑膜炎奈瑟氏菌的嵌合荚膜多糖。
35.一种包含权利要求34所述的嵌合荚膜多糖的药物组合物，其可选地进一步包含可接受的药物载体。
36.一种包含权利要求34所述的嵌合荚膜多糖或权利要求35所述的药物组合物的复合物，其用于主体的疫苗接种。
37.包含根据权利要求34所述的嵌合荚膜多糖或根据权利要求35所述的药物组合物的复合物在制备待给予主体的疫苗中的应用。
38.根据权利要求36所述的复合物或根据权利要求37所述的应用，其中，所述主体是人。
39.根据权利要求36或38所述的复合物或者根据权利要求37或38所述的应用，其中，所述疫苗接种用于抵抗由脑膜炎奈瑟氏菌血清组A、B、C、W-135、X或Y引起的脑膜炎球菌性脑膜炎。
40.权利要求21所述的核酸分子或其功能片段、权利要求22所述的载体、权利要求23所述的宿主细胞，或权利要求M所述的多肽或其功能片段在将己糖-1-磷酸和/或戊糖-ι-磷酸活化成核苷酸糖中的体外应用。
41.根据权利要求40所述的应用，其中，所述己糖-1-磷酸选自Glc-IP和(ial-1-P组成的组，且所述戊糖-ι-磷酸选自木糖-I-P和阿拉伯糖-I-P组成的组。
全文摘要
本发明提供了生产脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜多糖的体外方法。本发明也提供了可通过本文描述的方法获得的荚膜多糖。该荚膜多糖包含对脑膜炎奈瑟氏菌血清组W-135、Y、X和A有异特性的荚膜多糖。也包括这样的嵌合荚膜多糖，其包含脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y/W-135、W-135/Y、B/Y、C/Y、B/W-135、C/W-135、B/Y/W-135、C/Y/W-135、B/W-135/Y、C/W-135/Y、X/A或A/X的CPS，或者由它们组成。本发明也提供了这些荚膜多糖作为药物，特别是作为疫苗和/或诊断剂的应用。
文档编号A61K39/095GK102596241SQ201080048304
公开日2012年7月18日 申请日期2010年8月26日 优先权日2009年8月26日
发明者丽塔·热拉尔迪沙恩, 卡塔琳娜·斯图梅尔, 塞巴斯蒂安·达梅罗, 安德烈亚·贝特, 弗里德里希·弗赖贝格尔, 马丁纳·米伦霍夫 申请人:汉诺威医学院