针对人蛋白酶激活受体-2的高亲和力人抗体的利记博彩app

专利名称：针对人蛋白酶激活受体-2的高亲和力人抗体的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及特异于蛋白酶激活受体-2 (PAR-2)的抗体及其抗原结合片段。
背景技术：
蛋白酶激活受体(“PAR”)为一个七次跨膜G-蛋白偶联受体家族。在七次跨膜 G-蛋白偶联受体中，PAR具有独特的激活形式；即，PAR是通过氨基末端发生蛋白水解性裂解产生新的N端结构域(起“栓系配体(tethered ligand) ”作用)而被激活的。所述栓系配体与受体的细胞外环-2相互作用并由此导致受体激活。目前，PAR家族有四个已知的成员，称为 PAR-I、PAR-2、PAR-3 及 PAR-4。PAR-2也称为“C140”(US 5，874，400)。人类和小鼠的PAR-2共有蛋白酶裂解结构域 SKGRSLIG(SEQ ID NO :852 的残基 6-13，以及 SEQ ID NO :856 的残基 8-15)。数种蛋白酶如胰蛋白酶，以及肥大细胞类胰蛋白酶(tryptase)，组织因子/VIIa因子复合物和fe因子、嗜中性粒细胞蛋白酶3 (PR-3)、人白细胞弹性蛋白酶以及源于病原器官的蛋白酶将此段序列在R和S残基之间裂解。数种疾病和病况涉及到或相关于PAR-2活性，包括炎症疾病、疼痛、胃肠病况、 神经疾病以及心血管障碍(见例如，Linder等人，2000，J. Immunol. 165 :6504-6510 ； Vergnolle 等人，2001，Nature Medicine 7 :821-826 ;Cenac 等人，2007，J. Clin. Investigation 117 :636-647 ；Vergnolle,2004, British J. Pharmacol. 141 :1264-1274 ； Knight 等人，2001，J. Allergy Clin. Immunol. 108 :797-803 ；Schmidlin ^ 人，2002， J. Immunol. 169 :5315-5321)。结合PAR-2的抗体具有拮抗体内PAR-2活性的效力。因此抗 PAR-2抗体对于治疗及/或减轻多种疾病病况具有潜在的用途。US 5, 874, 400,US 2007/0237759,WO 2009/005726 以及 US 2010/0119506 中提到了结合PAR-2的抗体，以及其特定的治疗用途。然而，本领域仍然需要新型的PAR-2调制试剂，包括-PAR-2抗体，其可用于治疗PAR-2介导的疾病和病况。发明概述本发明提供了结合人PAR-2的人抗体。本发明的抗体尤其可用于抑制PAR-2介导的信号传到以及治疗PAR-2激活引起或相关的疾病或障碍。本发明包括抗体，其与PAR-2的N端区域相互作用并阻断在激活PAR-2的蛋白酶裂解位点(如本文定义的)的蛋白水解性裂解而不阻断在一个或多个非激活蛋白酶裂解位点的蛋白水解性裂解。根据特定的实施方式，展示有这种蛋白水解性裂解阻断特性的抗PAR-2抗体与激活性PAR-2蛋白酶裂解位点附近的特定氨基酸相互作用。例如，本发明提供具有蛋白酶裂解阻断活性的抗PAR-2抗体，其与人PAR-2(SEQ ID NO :851)的Val_42 和Asp-43相互作用，并可能进一步与一个或多个人PAR-2残基(选自Ser_37、Leu_38、 Ile-39、Gly-40和Gly-44构成的一组)相互作用。根据其他实施方式，本发明的抗-PAR-2抗体特异性结合人PAR-2及猴PAR-2，但是不结合选自小鼠、大鼠、兔、狗和猪PAR-2中的至少一种。本发明还包括能够抑制或减弱 PAR-2的蛋白水解性激活但不阻断PAR-2的蛋白水解性裂解的抗体。本文描述了用于测量/评估抗体阻断PAR-2裂解或蛋白水解性激活的能力的示例性方法。本发明的抗体可以为全长的(例如，IgGl或IgG4抗体)或可只包含抗原结合部分(例如，Fab, F(ab' )2或scFv片段)，并且可以对其修饰以影响其功能性，例如，消除残余的效应子功能(Reddy 等人，2000，J. Immunol. 164 :1925-1933)。本发明提供了抗体或抗体的结合片段，所述抗体包含重链可变区(HCVI )，其具有选自如下的氨基酸序列:SEQ ID NO :2、18、22、26、42、46、50、66、70、74、90、94、98、114、118、 122、138、142、146、162、166、170、186、190、194、210、214、218、234、238、242、258、262、266、 282、286、290、306、310、314、330、334、338、354、358、362、378、382、386、402、406、410、426、 430、434、450、454、458、474、478、482、498、502、506、522、526、530、546、550、554、570、574、 578、594、598、602、618、622、626、642、646、650、666、670、674、690、694、698、714、718、722、 738、742、746、762、766、770、786、790、794、810、814、818、834 和 838，或具有至少 90%、至少 95%、至少98%或至少99%的序列同一性的与其基本上类似的序列。根据特定的实施方式，所述抗体或抗体的抗原结合部分包含具有选自SEQ ID N0:98、146、338和714的氨基酸序列的HCVR。本发明还提供了抗体或抗体的抗原结合片段，其包含轻链可变区(LCVI )，所述轻链可变区具有选自如下的氨基酸序列:SEQ ID NO :10、20、M、34、44、48、58、68、72、82、92、 96、106、116、120、130、140、144、154、164、168、178、188、192、202、212、216、226、236、240、 250、260、264、274、284、288、298、308、312、322、332、336、346、356、360、370、380、384、394、 404、408、418、428、432、442、452、456、466、476、480、490、500、504、514、524、528、538、548、 552、562、572、576、586、596、600、610、620、624、634、644、648、658、668、672、682、692、696、 706、716、720、730、740、744、754、764、768、778、788、792、802、812、816、826、836 和 840，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性的与其基本上类似的序列。 根据特定实施方式，所述抗体或抗体的抗原结合部分包含具有选自SEQ ID NO :106,154, 346和692的氨基酸序列的LCVR。本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，其包含HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)序列对，所述 HCVR 和 LCVR 序列对选自=SEQ ID NO :2/10、18/20、22/24、26/34、42/44、46/48、
50/58,66,/68、70/72,74//82,90/92>94/'96,98/106,114/116、118/120>122,/130、.138；/140、142/'144、146/,154、162/'164,166/'168>170/,178、186/'188,190/'192、194/'202、210/'212、214/'216,218/,226、234/'236,238/'240>242/'250、258/'260、262/'264、266/'274、282/'284、286/'288、290；/298、306/'308,310/'312>314//322,330/'332、334/'336、338/'346、354/,356、358/々60、362,/370、378/,380、382/'384,386/,394、402/,404、406/'408、410/'418,426/,428、430/,432、434,/442、450//452,454/'456>458,/466、474//476,478/'480、482/,490、498；/500、502,/504、506,/514、522；/524,526/'528,530,/538、546；/548、550/,552、554//562,,570,/572、574,/576、,578,/586、,594,/596,598/,600,602/'610、618/'620、622/'624、626/'634、642/'644、646/'648,650/,658、666/'668,670/'672>674/,682、690/'692,694/'696、698/'706、714/,716、714/,692、718,/720、722/'730,738/'740>742/々44、746/'754,762/'764、766/'768、770//778,
786/788,790/792,794/802,810/812,814/816,818/826,834/836 和 838/840。根据特定实施方式，所述抗体或其片段包含选自氨基酸序列对SEQ ID NO :98/106、146/154、338/346和 714/692 的 HCVR 禾口 LCVR0
本发明还提供了抗体或抗体的抗原结合片段，其包含的重链⑶R3(HCDR3)结构域和轻链⑶R30XDR3)结构域，所述重链⑶R3结构域具有选自如下的氨基酸序列SEQ ID NO :8、32、56、80、104、128、152、176、200、224、248、272、296、320、344、368、392、416、440、 464、488、512、536、560、584、608、632、656、680、704、728、752、776、800 和 824，或具有至少 90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性的与其基本上类似的序列；所述轻链 CDR3结构域具有选自如下的氨基酸序列=SEQ ID NO :16、40、64、88、112、136、160、184、208、 232、256、280、304、328、352、376、400、424、448、472、496、520、544、568、592、616、640、664、 688、712、736、760、784、808和832，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性的与其基本上类似的序列。在特定实施方式中，所述抗体或抗体的抗原结合部分包含选自如下的HCDR3/ LCDR3 氨基酸序列对:SEQ ID NO :8/16、32/40、56/64、80/88、104/112、1沘/136、152/160、 176/184,200/208,224/232,248/256,272/280,296/304,320/328,344/352,368/376, 392/400,416/424,440/448,464/472,488/496,512/520,536/544,560/568,584/592, 608/616、632/640、656/664、680/688、704/712、728/736、752/760、776/784、800/808 和 824/832。根据特定实施方式，所述抗体或抗体的抗原结合部分包含选自如下的HCDR3/ LCDR3 氨基酸序列对SEQ ID NO :104/112、152/160、344/352 和 704/712 构成的一组。具有这些HCDR3/LCDR3对的抗PAR-2抗体的非限制性实例为分别标记为H4H588N、H4H591N、 H4H618N、和 H4H581P。本发明还提供了抗体或其片段，其进一步包含重链⑶Rl (HCDRl)结构域、重链 ⑶R2(HCDR2)结构域、轻链⑶Rl (IXDRl)结构域和轻链⑶R2 (IXDR2)结构域，所述重链⑶Rl 结构域具有选自如下的氨基酸序列:SEQ ID NO :4、28、52、76、100、124、148、172、196、220、 244、268、292、316、340、364、388、412、436、460、484、508、532、556、580、604、628、652、676、 700、724、748、772、796和820，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性的与其基本上类似的序列；所述重链CDR2结构域具有选自如下的氨基酸序列SEQ ID NO :6、30、54、78、102、126、150、174、198、222、246、270、294、318、342、366、390、414、438、 462、486、510、534、558、582、606、630、654、678、702、726、750、774、798 和 822，或具有至少 90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性的与其基本上类似的序列；所述轻链 CDRl结构域具有选自如下的氨基酸序列=SEQ ID NO 12、36、60、84、108、132、156、180、204、 228、252、276、300、324、348、372、396、420、444、468、492、516、540、564、588、612、636、660、 684、708、732、756、780、804和828，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性的与其基本上类似的序列；所述轻链CDR2结构域，其具有选自如下的氨基酸序列=SEQ ID NO :14、38、62、86、110、134、158、182、206、230、254、278、302、326、350、374、398、 422、446、470、494、518、542、566、590、614、638、662、686、710、734、758、782、806 和 830，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性的与其基本上类似的序列。本发明的特定的非限制性示例抗体及抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、 LCDRl、LCDR2 和 LCDR3 结构域，其分别选自(i)SEQ ID NO 100、102、104、108、110 和 112(例如 H4H588N) ； (ii)SEQ ID NO :148、150、152、156、158 和 160 (例如 H4H591N) ； (iii) SEQ ID NO :340、342、344、348、350 和 352(例如 H4H618N)及(iv)SEQ ID NO :700、702、704、 708,710和712(例如H4H581P)。这些示例性CDR的氨基酸序列描述于图2和3中。
在一个相关的实施方式中，本发明包括抗体或抗体的抗原结合片段，其特异地结合PAR-2，其中所述抗体或片段包含在重链和轻链序列之内的重链和轻链CDR结构域， 所述重链和轻链序列选自:SEQ ID NO :2/10、18/20、22Λ4、26/;34、42/44、46/48、50/58、
66/68,70/"2:74/82>90/'92,94/96,.98/106、114/116、118/120、122/130、138/140,142；/144、146/'154,162；/164、166//168,170/'178,186/'188、190/'192,194/'202,210/212、214/'216、218/'226、234,/236、238；/240,242/'250,258/'260、262/'264,266/,274、282/'284、286/'288,290/,298、306,/308、310,/312,314/'322,330/'332,334/'336,338/'346、354/356、358/'360、362/,370、378,/380、382,/384,386/'394,402/'404、406/,408、410/,418、426/'428、430/'432、434/,442、450,/452、454,/456,458/'466,474//476,478//480,482/,490、498/'500、502/,504、506/,514、522,/524、526,/528,530/,538、546,,548、550；/552,554；/562、570/'572、574/,576、578,/586、594/596、598,/600,602//610,618//620、622,/624,626,/634、642/'644、,646；/648、
650/658,666/668,670/672,674/682,690/692,694/696,698/706,714/716,714/692, 718/720,722/730,738/740,742/744,746/754,762/764,766/768,770/778,786/788, 790/792、794/802、810/812、814/816、818/拟6、8；34/836 和 838/840。根据特定实施方式，所述抗体或其片段包含HCVR和LCVR之内的CDR序列，所述HCVR和LCVR选自SEQ ID NO 98/106,146/154,338/346和714/692的。用于鉴别HCVR和LCVR氨基酸序列之内的CDR的方法和技术在本领域熟知，并可用于鉴别本文公开的特定HCVR和/或LCVR氨基酸序列之内的⑶R。可用于鉴别⑶R边界的示例性常规技术包括例如，Kabat定义、Chothia定义及 AbM定义。概述之，Kabat定义基于序列可变性，Chothia定义基于结构环区域的位置，AbM 定义是 Kabat 和 Chothia 方法的折中。参见例如，Kabat，“ Sequences of Proteins of Immunological Interest, " National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)； Al-Lazikani 等人，J. Mol. Biol. 273 :927-948 (1997)；和 Martin 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:拟68-9272(1989)。用于鉴定抗体内CDR序列的公共数据库也是可用的。在另一方面，本发明提供了编码抗PAR-2抗体或其片段的核酸分子。本发明还包括携带有本发明核酸的重组表达载体，以及引入这些载体的宿主细胞，以及通过在允许抗体生产的条件下培养细胞的抗体生产方法和所生产抗体的回收方法。在一个实施方式中，本发明提供了抗体或其片段，其包含由选自如下的核酸序列编码的 HCVR =SEQ ID NO :1、17、21、25、41、45、49、65、69、73、89、93、97、113、117、121、137、 141、145、161、165、169、185、189、193、209、213、217、233、237、241、257、261、265、281、285、 289、305、309、313、329、333、337、353、357、361、377、381、385、401、405、409、425、429、433、 449、453、457、473、477、481、497、501、505、521、525、529、545、549、553、569、573、577、593、 597、601、617、621、625、641、645、649、665、669、673、689、693、697、713、717、721、737、741、 745、761、765、769、785、789、793、809、813、817、833 和 837，或与其具有至少 90 %、至少 95%、至少98%或至少99%同源性的基本上相同的序列。根据特定实施方式，所述抗体或其片段包含由选自SEQ ID NO :97、145、337和713的核酸序列编码的HCVR0本发明还提供了抗体或其片段，其包含由选自如下的核酸序列编码的LCVR=SEQ ID NO :9、19、23、33、43、47、57、67、71、81、91、95、105、115、119、129、139、143、153、163、167、 177、187、191、201、211、215、225、235、239、249、259、263、273、283、287、297、307、311、321、 331、335、345、355、359、369、379、383、393、403、407、417、427、431、441、451、455、465、475、479、489、499、503、513、523、527、537、547、551、561、571、575、585、595、599、609、619、623、 633、643、647、657、667、671、681、691、695、705、715、719、729、739、743、753、763、767、777、 787、791、801、811、815、825、835和839，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少 99%同源性的基本上相同的序列。根据特定实施方式，所述抗体或其片段包含由选自SEQ ID NO :105、153、345和715的核酸序列编码的LCVR0本发明还提供了抗体或抗体的抗原结合片段，其包含HCDR3结构域和LCDR3结构域，所述HCDR3结构域由选自如下的核苷酸序列编码SEQ ID NO :7、31、55、79、103、 127、151、175、199、223、247、271、295、319、343、367、391、415、439、463、487、511、535、559、 583、607、631、655、679、703、727、751、775、799 和 823，或与其具有至少 90%、至少 95%、至少98%或至少99%同源性的基本上相同的序列；所述LCDR3结构域由选自如下的核苷酸序列编码:SEQ ID NO :15、39、63、87、111、135、159、183、207、231、255、279、303、327、351、 375、399、423、447、471、495、519、543、567、591、615、639、663、687、711、735、759、783、807 和 831，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本上相同的序列。 根据特定实施方式，所述抗体或其片段包含由选自SEQ ID NO :103/111,151/159,343/351 和703/711的核酸序列对编码的HCDR3和IXDR3序列。本发明还提供了抗体或其片段，其进一步包含HCDRl结构域、HCDR2结构域、IXDRl 结构域和IXDR2结构域，所述HCDRl结构域由选自如下的核苷酸序列编码SEQ ID NO :3、 27、51、75、99、123、147、171、195、219、243、267、291、315、339、363、387、411、435、459、483、 507、531、555、579、603、627、651、675、699、723、747、771、795 和 819，或与其具有至少 90%, 至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本上相同的序列；所述HCDR2结构域由选自如下的核苷酸序列编码:SEQ ID NO :5J9、53、77、101、125、149、173、197、221、245、269、 293、317、341、365、389、413、437、461、485、509、533、557、581、605、629、653、677、701、725、 749、773、797和821，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本上相同的序列；所述IXDRl结构域由选自如下的核苷酸序列编码SEQ ID NO :11、35、59、 83、107、131、155、179、203、227、251、275、299、323、347、371、395、419、443、467、491、515、 539、563、587、611、635、659、683、707、731、755、779、803 和 827，或与其具有至少 90%, M 少95 %、至少98 %或至少99 %同源性的基本上相同的序列；所述IXDR2结构域由选自如下的核酸序列编码:SEQ ID NO :13、37、61、85、109、133、157、181、205、229、253、277、301、325、 349、373、397、421、445、469、493、517、541、565、589、613、637、661、685、709、733、757、781、 805,829，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本上相同的序列。根据特定实施方式，所述抗体或其片段包含由SEQ ID NO 97和105 ；SEQ ID NO 145和153 ；SEQ ID NO :337和345 ；或SEQ ID NO :713和715的核酸序列编码的重链和轻链⑶R序列。本发明还提供分离的抗体或抗体的抗原结合片段，其特异性结合PAR-2并包含 HCDR3 和 LCDR3,其中 HCDR3 包含式为 Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12 (SEQ ID NO 843)的氨基酸序列，其中X1是Ala或Val，X2是Lys, X3是Gly或Glu, X4是Asp或Gly, X5是 Phe 或 Asp, X6 为 Trp 或 Ser, X7 为 Ser 或 Gly, X8 是 Gly 或 Tyr, X9 是 Tyr 或 Asp, X10 是 Phe 或 Leu，X11 是 Asp 或 Ala，且 X12 是 Tyr ；并且 LCDR3 包含式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQID NO 846)的氨基酸序列，其中X1是Met或Gln，X2是Gln，X3是Ala或Tyr，X4是Thr或 Lys, X5 是 Gln、Ser 或 lie，X6 是 Phe 或 kr，X7 是 Pro，X8 是 Thr 或 Leu，且 X9 是 Thr 或不存在。在一个更具体的实施方式中，本发明特征在于一种分离的抗体或其片段，其特异性结合PAR-2 并包含如下序列式 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO :841)的 HCDRl 序列， 其中 X1 是 Gly, X2 是 Phe, X3 是 Thr，X4 是 Phe, X5 是 Ser 或 Arg, X6 是 Ser 或 Arg, X7 是 Tyr, 且 X8 是 Gly,Ala 或 Thr ；式 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO :842)的 HCDR2 序列，其中 X1 是 lie, X2 是 Ser、Gly 或 Thr, X3 是 Tyr、Gly 或 Asp, X4 是 Asp、Gly 或 Ser, X5 是 Gly 或 Arg，X6 是 lie、Gly 或 Ala，X7 是 Asn、kr、Arg 或 Gly，且 X8 是 Lys、Ala 或 Thr;式 X1-X2 -X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12 (SEQ ID NO :843)的 HCDR3 序列，其中 X1 是 Ala 或 Val，X2 是 Lys, X3 是 Gly 或 Glu, X4 是 Asp 或 Gly, X5 是 Phe 或 Asp, X6 是 Trp 或 Ser, X7 是 Ser 或 Gly, X8 是 Gly 或 Tyr, X9 是 Tyr 或 Asp, X10 是 Phe 或 Leu, X11 是 Asp 或 Ala,且 X12 是 Tyr ； 式 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xici-X11 (SEQ ID NO :844)的 LCDRl 序列，其中 X1 是 Gln，X2 是 Ser 或 Gly，X3 是 Leu 或 lie，X4 是 Val 或 kr，X5 是 His、Asn 或 Thr，X6 是 kr、Asn 或 Tyr， X7是Asp或不存在，X8是Gly或不存在，X9是Asn或不存在，X10是Thr或不存在，且X11是 Tyr 或不存在；式 X1-X2-X3 (SEQ ID NO :845)的 LCDR2 序列，其中 X1 是 Lys 或 Ala，X2 是 lie、 Ala 或 Thr，且 X3 是 Ser ；以及包含具有式 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO :846)的氨基酸序列的LCDR3，其中X1是Met或Gln, X2是Gln, X3是Ala或Tyr5X4是Thr或Lys, X5是 Gln、Ser 或 lie，X6 是 Phe 或 kr，X7 是 Pro，X8 是 Thr 或 Leu，且 X9 是 Thr 或不存在。本发明包含具有修饰的糖基化模式的抗-PAR-2抗体。在一些应用中，移除不需要的糖基化位点的修饰，或抗体不含存在于寡糖链上的果糖部分可能对于例如增加抗体依赖的细胞毒性(ADCC)功能有用(见Siield等人(2002) JBC 277 :26733)。在另一些应用中， 可进行半乳糖基化修饰以修饰补体依赖的细胞毒性(CDC)。在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含特异性结合PAR-2的重组人抗体或其片段以及药物可接受载体。在一个相关的方面，本发明的特征在于PAR-2抑制剂与第二种治疗试剂组合的组合物。在一个实施方式中，PAR-2抑制剂为所述抗体或其片段。在一个实施方式中，第二种治疗试剂为任何能与PAR-2抑制剂有利组合的试剂。能与PAR-2抑制剂有利组合的示例性试剂包括但不限于抑制PAR-2活性的其他试剂(包括其他抗体或其抗原结合片段、肽抑制剂、小分子拮抗物等等)和/或干扰PAR-2上游或下游信号传导的试剂。在另一方面，本发明提供是用本发明的抗PAR-2抗体或抗体的抗原结合部分抑制PAR-2活性的方法，其中治疗性方法包括施用治疗有效量的包含本发明的抗体或抗体的抗原结合片段的药物组合物。所治疗的障碍为通过移除、抑制或减少PAR-2活性而改善、减轻、抑制或预防的任何疾病或病况。本发明的抗PAR-2抗体或抗体片段可起阻断 PAR-2和蛋白酶(例如，胰蛋白酶或胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶)之间相互作用的功能，或另外地抑制蛋白酶介导的PAR-2活性。备选地，或另外地，本发明的抗-PAR-2抗体可干扰 PAR-2栓系配体与一种或多种PAR-2细胞外环之间的相互作用(见，例如MacFarlane等人，2001, Pharmacological Reviews 53:245-282 for a general discussion of PAR-2 proteolytic cleavage and activation)。所述抗体或抗体片段可单独或与一种或多种另外的治疗试剂联合使用。本发明还包括本发明的抗PAR-2抗体或抗体的抗原结合部分在制备药物中的用途，所述药物用于在患者中治疗与PAR-2活性相关或由其引起的疾病或障碍。通过下文详述的总结，其他实施方式也将显而易见。附图简述

图1.抗体H4H581P、H4H588N、H4H591N及H4H618N的重链可变区及CDR的序列对比列表。图2.抗体H4H581P、H4H588N、H4H591N及H4H618N的轻链可变区及CDR的序列对比列表。图3.上图㈧显示了对应于激活性PAR-2蛋白酶裂解位点周围的序列的C-及 N-端生物素标记的肽(GTNRSSKGRSLIGKVDGT ;SEQ ID NO :852)。蛋白酶裂解位点标注为1 号(上游非激活性蛋白酶裂解位点)及2号(激活性PAR-2蛋白酶裂解位点)。无裂解及裂解片段的预期大小列于上表中。下图(B)显示了抗PAR-2抗体或阴性对照存在下经胰蛋白酶处理后0、5及15分钟后观察到的片段大小。图4.上图㈧显示了小鼠、大鼠及人对应于激活性PAR-2蛋白酶裂解位点周围的序列的肽(分别为SEQ ID NO =883,858及852)。这些蛋白酶裂解位点标注为1号和2号 (上游非激活性蛋白酶裂解位点)及3号(激活性PAR-2蛋白酶裂解位点)。无裂解及裂解片段的预期大小列于上部表中。下图(B)显示了抗PAR-2抗体或阴性对照存在下经胰蛋白酶处理后0和5分钟后观察到的片段大小。图5.描述了对结合PAR-2的激活性蛋白酶裂解位点周围序列(SEQ ID NO :852) 的抗体进行丙氨酸扫描表位作图的结果。空心三角代表位于PAR-2蛋白酶裂解位点上游的蛋白酶裂解位点。激活性PAR-2蛋白酶裂解位点由实心三角表示。括号中数字表示全长人 PAR-2序列(SEQ ID NO :851)中氨基酸数目。氨基酸残基下圆圈内数字表示抗体结合丙氨酸扫描突变肽的T1/2相对于抗体结合野生型肽的T1/2的百分比，如表M46和观中显示。若进行了两次重复试验，圆圈中显示的是平均T1/2百分比。有白色数字的黑色圆圈表示氨基酸，当其转变为丙氨酸时减少抗体结合的T1/2为抗体结合野生型肽T1/2的30%或更少。这些氨基酸在本文定义为所述抗体相互作用的残基。发明详述在描述本发明前，要理解的是本发明不限于所描述的具体方法和实验条件，这些方法和条件可以变化。还要理解的是本发明使用的术语只是出于描述具体实施方式
的目的，不意欲为限制性的，因为本发明的范围只受到所附的权利要求的限制。除非定有规定，本文所使用的所有技术和科学术语都与本发明所述技术领域普通技术人员通常所理解的意义相同。如本文所使用的，当用于指代具体提到的数值时，术语 “大约”的意思是该值可与所提到的值有不超过1 %的变动。例如，如本文所使用的，词语“大约100”包括99和101及之间的所有值(例如，99. 1、99· 2、99· 3、99· 4等等)。尽管任何与本文描述的方法和材料类似或等价的那些可用于实践或测试本发明， 然而当前描述的为优选的方法和材料。定义如本文所使用的，术语“蛋白质酶激活受体-2 ”、“蛋白酶激活受体-2 ”及“PAR-2 ”指的是全长PAR-2蛋白质。人PAR-2是由SEQ ID NO :850中所示的核酸序列编码的，并具有SEQ ID NO :851的氨基酸序列。来自非人物种(例如，小鼠、猴、兔、狗、猪等等)的PAR-2 分子的氨基酸序列可得自公共资源。如本文所使用的，术语“PAR-2片段”指的是肽或多肽，其包含位于激活性PAR-2蛋白酶裂解位点(如本文下面要定义的)上游(即，N端)的4、5、6、7、8、9、10个或更多的连续氨基酸及/或位于激活性PAR-2蛋白酶裂解位点下游(即，C端)4、5、6、7、8、9、10个或更多的连续氨基酸。示例性PAR-2片段在实施例2的表2中有说明(标记为肽“A”到“J”; 即，分别为 SEQ ID NO :852-861)。除非特别指出来自非人物种(例如，“小鼠PAR-2”、“小鼠PAR-2片段”、“猴PAR-2”、 “猴PAR-2片段”等等)，如本文所使用的，词语“PAR-2”和“PAR-2片段”指的是人PAR-2蛋白质或片段。如本公开上下文中使用的，词语“激活性PAR-2蛋白酶裂解位点，，指的是人PAR-2 的残基Arg-36*kr-37之间的连接(SEQ ID NO :851)。激活性PAR-2蛋白酶裂解位点是当裂解时导致天然发生蛋白质中形成PAR-2栓系配体的位点。如本文所使用的，术语“PAR-2蛋白酶”指的是能够在激活性PAR-2蛋白酶裂解位点裂解PAR-2或PAR-2片段的酶。示例性PAR-2蛋白酶包括胰蛋白酶、组织蛋白酶G、顶体蛋白、组织因子Vila、组织因子叙、人气道胰蛋白酶样蛋白酶、类胰蛋白酶、膜型丝氨酸蛋白酶-1 (MT-SPl)、TMPRSS2、蛋白酶_3、弹性蛋白酶、激肽释放酶_5、激肽释放酶_6，激肽释放酶-14、活化的蛋白C、十二指肠酶(duodenase)、牙龈蛋白酶(gingipain)-R、Der pUDer p3、Der p9、嗜热菌蛋白酶、粘质沙雷氏菌(serralysin)和齿密螺旋体(T. denticla)蛋白酶。如本文所使用的，术语“抗体”意指包含由二硫键相互连接的四条多肽链——两条重链(H)和两条轻(L)链及其多聚体的免疫球蛋白分子(例如，IgM)。每条重链包含重链可变区(本文简写为HCVR或Vh)及重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域——Ch1、Ch2 &Ch3。每条轻链包含轻链可变区(本文简写为LCVR或^及轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(Ql)。V1^Pt区域可进一步划分为超可变区域(称为互补决定区(CDR))及分散于其中的更保守的区域，称为框架区(FR)。每种V1^Pt都由三个CDR和四个FR构成， 以下列顺序依次从氨基端排列到羧基端FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同实施方式中，抗Ang-2抗体的FR(或其抗原结合部分)可与人的种系序列(germline sequence)相同，或可以为天然或人工修饰的。可基于对两种或多种CDR进行逐个对比分析而定义氨基酸保守序列。如本文所使用的，术语“抗体”还包括全长抗体分子的抗原结合片段。如本文所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”，诸如此类，包括特异性结合抗原而形成复合物的任何天然发生的、酶反应获得的、合成的或遗传改造的多肽或糖蛋白。 抗体的抗原结合片段可使用任何合适的标准技术如蛋白质水解消化或重组遗传工程技术 (涉及对编码抗体可变和人选的恒定结构域的DNA进行操作和表达)衍生自例如，全长抗体分子。所述DNA是已知的和/或就是很容易得自例如商业来源、DNA文库(包括，例如噬菌体抗体文库)或可以合成获得。可对DNA进行测序并进行化学操作，或通过使用例如分子生物学技术进行操作，例如将一个或多个可变和/或恒定结构域排入合适的构象，或引入密码子，制造半胱氨酸残基，修饰、添加或删除氨基酸等等。抗原结合片段的非限制性实例包括(i)Fab片段；(ii)F(ab' )2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(ν)单链Fv(ScFv)分子；(vi)dAb片段；及(vii)由模拟抗体超可变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如，分离的互补决定区(CDR))。其他工程改造分子，如双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)和微抗体(minibody)， 也包含在如本文所使用的词语“抗原结合片段”的意义之内。抗体的抗原结合片段一般包含至少一个可变结构域。可变结构域可以为任何大小或氨基酸组成，一般会包含临近一个或多个框架序列的框架或在其之内的至少一个CDR。在具有与\结构域相连的Vh结构域的抗原结合片段内，所述Vh和\结构域可以以任何合适的排列各自相应排列。例如，可变区可为二聚体并含有VH-VH、或V^t 二聚体。备选地，抗体的抗原结合片段可含有单体的Vh或\结构域。在特定实施方式中，抗体的抗原结合片段可包含至少一个可变结构域，其共价连接于至少一个恒定结构域。本发明的抗体的抗原结合片段的可变及恒定结构域的非限制性、示例性的构象包括⑴ VChI ； (ii)VH-CH2 ； (iii)VH-CH3 ； (iv) VH-CH1-CH2 ； (ν) Vh-Ch 1-Ch2-Ch3 ； (vi)VH-CH2-CH3 ； (vii) Vh-Cl ； (viii) Vl-ChI ； (ix)VL-CH2 ； (χ) VL-CH3 ； (xi) Vl-Ch 1-Ch2 ； (xii)VL-CHl-CH2-CH3 ； (xiii) VL-CH2-CH3 R (xiv)VfQ。在可变及恒定结构域的任何构象中(包括上文列出的示例性构象)，所述可变及恒定结构域可直接互相连接或可通过完全的或部分的铰链或连接子区域相连。铰链区可由至少2个(例如，5、10、15、20、40、 60或更多)氨基酸构成，其在单个多肽分子中相邻的可变及/或恒定结构域之间形成柔性的或半柔性连接。此外，本发明抗体的抗原结合片段可包含上文列出的任何可变及恒定结构域构象中的同源二聚体或异源二聚体(或其他多聚体)，其相互之间和/或与一种或多种单体VH或VL结构域(例如，通过二硫键)非共价相连。如全长抗体分子，抗原结合片段可为单一特异性或多特异性(例如，双特异性)。 抗体的多特异性抗原结合片段一般会包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能特异性结合个别的抗原或结合同一抗原上不同表位。任何多特异性抗体形式，包括本文公开的示例性双特异性抗体形式，可使用本领域既有的常规技术用于本发明抗体的抗原结合片段的情况。抗体的恒定区对抗体固定补体及调节细胞依赖的细胞毒性的能力是重要的。因此，抗体的同种型可基于其对于抗体调节细胞毒性是否需要而进行选择。如本文使用的，术语“人抗体”意欲包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变及恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸序列 (例如，通过体外随机或点特异诱变或体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR——尤其在CDR3中。然而，如本文所使用的，术语“人抗体”不意欲包括其中的CDR序列衍生自其他哺乳动物物种(如，小鼠)的种系而移植入人框架序列的抗体。如本文所使用的，术语“重组人抗体，，意欲包括通过重组方式制备、表达或分离的所有人抗体，如使用转染入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体(下文有进一步描述)，分离自重组、联合的人抗体文库的抗体(下文有进一步描述)，分离就人免疫球蛋白基因进行转基因的动物(例如，小鼠)的抗体(见，例如Taylor等人(1992)Nucl. Acids Res. 20 6287-6295)或通过涉及剪接人免疫球蛋白基因序列剪接成其他DNA序列的任何方式制备、表达、创造或分离的抗体。这些重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变及恒定区域。然而，在特定实施方式中，对这些重组人抗体进行体外诱变(或，当使用就人Ig序列进行转基因的动物时，使用的是体内体细胞诱变)，因此重组抗体的Vh和\区域的氨基酸序列为这样的序列，当衍生自人种系Vh及\序列并与其相关时，其可能不是天然存在于体内的人抗体种系库中。人抗体可以以两种形式存在，这与铰链异质性相关。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含大约150-160kDa的稳定四链构建体，其中二聚体是通过链间重链二硫键维持在一起的。在第二种形式中，二聚体不是通过链间二硫键相连，并且形成一个大约75-80kDa的由共价偶联的轻重链(半抗体)组成的分子。这些形式即使在亲和纯化后都极难分离。第二种形式在多种完整IgG同种型中出现的频率是由于(但不限于)与所述抗体铰链区同种型相关的结构差异。人IgG4铰链的铰链区中的单一氨基酸置换可显著减少二种形式的出现至使用人IgGl铰链一般观察到的水平(Angal等人(199 Molecular Immunology 30 105)。本发明包括在铰链、CH2或CH3区域中具有一个或多个突变的抗体， 所述突变在例如生产中对改善所需抗体形式的产量是需要的。如本文所使用的，“分离的抗体”指的是已经从其天然环境的至少一种组分中鉴定及分离和/或回收的抗体。例如，已经从抗体天然存在或天然产生的生物体、组织或细胞的至少一种组分分离或移出的抗体是用于本发明的目的“分离的抗体”。分离的抗体还包括重组细胞中原位的抗体，以及已经进行至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据特定实施方式， 分离的抗体几乎不含其他细胞物质及/或化学物质。术语“特异性结合”等等指的是抗体或其抗原结合片段与抗原形成生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合的特点在于解离常数为IxlO-fiM或更少。用于确定两个分子是否特异性结合的方法在本领域已熟知，并且包括例如，平衡透析、表面等离子共振等等。 例如，如本文所使用的，本发明上下文中“特异性结合”人PAR-2的抗体包括以如下Kd结合人PAR-2或其部分(例如，包含激活性蛋白酶裂解位点的PAR-2片段)的抗体，所述Kd为小于大约ΙΟΟΟηΜ、小于大约500nM、小于大约300nM、小于大约200nM、小于大约ΙΟΟηΜ、小于大约90nM、小于大约80nM、小于大约70nM、小于大约60nM、小于大约50nM、小于大约40nM、 小于大约30nM、小于大约20nM、小于大约10nM、小于大约5nM、小于大约4nM、小于大约3nM、 小于大约2nM、小于大约InM或小于大约0. 5nM,如表面等离子共振测定中所测量的。(见例如本文实施例4)。然而，特异性结合人PAR-2的分离的抗体可以具有对其他抗原的交叉反应性，例如来自其他物种的PAR-2分子。如本文所使用的，“中和性”或“阻断性”抗体意指结合PAR-2的抗体(i)干扰 PAR-2或PAR-2片段与一种或多种蛋白酶的相互作用，(ii)阻止PAR-2蛋白酶对PAR-2或 PAR-2片段的裂解，(iii)抑制PAR-2栓系配体和PAR-2细胞外环之间的相互作用，及/或 (iv)导致对PAR-2的至少一种生物学功能的抑制。由PAR-2中和性或阻断性抗体引起的抑制不需要很完全，只要可使用恰当的测定法检测到就行。用于检测PAR-2抑制的示例性测定法在本文有所描述。本文公开的全长人源抗PAR-2抗体相对于对应的种系序列，在重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区域可包含一个或多个氨基酸置换、插入及/或缺失。这些突变可通过将本文公开的氨基酸序列与得自例如公共抗体序列数据库的种系序列相比较而容易地获得。本发明包括抗体，及其抗原结合片段，其衍生自本文公开的任何氨基酸序列，其中一个或多个框架和/或CDR区域内的一个或多个氨基酸回复突变至相应的种系残基或至种系残基的保守性氨基酸置换(天然或非天然的)(这些序列变化在本文称为“种系回复突变”)。本领域普通技术人员以本文公开的重链和轻链可变区序列开始，可容易地生产包含一个多个单独的种系回复突变或其组合的大量的抗体和抗原结合片段。在特定实施方式中，Vh和/或\结构域内的所有框架和/或CDR残基都突变回到种系序列。在其他实施方式中，只有特定的残基突变回到种系序列，例如，只有在FRl的前8个氨基酸中或FR4的后8 个氨基酸中的突变残基，或者只有CDR1、CDR2或CDR3内的突变残基进行了回复突变。进一步地，本发明的抗体可包含框架和/或⑶R区域内的两个或多个种系回复突变的任何组合， 即，其中特定的个体残基突变回种系序列，而不同于种系序列的特定其他残基得到保留。一旦获得，可容易地对包含一个或多个种系回复突变的抗体和抗原结合片段就一种或多种所需要的特性进行测试，如，改善的结合特异性、增加的结合亲和力、改善或增强的拮抗或对抗性生物学特性(随情况而定)、减少的免疫原性等等。以此种一般方式获得的抗体及抗原结合片段在本发明范围之内。本发明还包括抗PAR-2抗体，其包含具有一个或多个保守性置换的本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的变体。例如，本发明包括抗PAR-2抗体，其具有的 HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列相对于本文公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等等的保守性氨基酸置换。在一个实施方式中，所述抗体包含HCVR，其具有SEQ ID NO :698的氨基酸序列，其中有8个或更少的保守性氨基酸置换。在另一个实施方式中，所述抗体包含HCVR，其具有SEQ ID NO :698 的氨基酸序列，其中有6个或更少的保守性氨基酸置换。在另一个实施方式中，所述抗体包含HCVR，其具有SEQ ID NO :698的氨基酸序列，其中有4个或更少的保守性氨基酸置换。在另一个实施方式中，所述抗体包含HCVR，其具有SEQ ID NO :698的氨基酸序列，其中有2个或更少的保守性氨基酸置换。在一个实施方式中，所述抗体包含LCVR，其具有SEQ ID NO 706的氨基酸序列，其中有8个或更少的保守性氨基酸置换。在另一个实施方式中，所述抗体包含LCVR，其具有SEQ ID NO :706的氨基酸序列，其中有6个或更少的保守性氨基酸置换。在另一个实施方式中，所述抗体包含LCVR，其具有SEQ ID NO :706的氨基酸序列，其中有4个或更少的保守性氨基酸置换。在另一个实施方式中，所述抗体包含LCVR，其具有SEQ ID NO 706的氨基酸序列，其中有2个或更少的保守性氨基酸置换。如本文所使用的，术语“表面等离子共振”指的是通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的变化而分析实时相互作用的光学现象，例如，使用BIAcore 系统(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare，Piscataway, NJ) 0如本文所使用的，术语“KD”，意指具体抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。术语“表位”指的是与抗体分子的可变区内特异性抗原结合位点(称为补位)相互作用的抗原决定子。单个抗体可有超过一个表位。因此，不同抗体可结合抗原上的不同区域且可具有不同生物学效应。表位可以为构象型或线形的。构象表位是通过来自线性多肽链的不同节段的氨基酸空间排列而产生的。线性表位是由多肽链上相邻的氨基酸残基产生的。在特定条件下，表位可包括抗原上的糖、磷酸基团或磺酰基的部分。术语“基本上同一”或“基本上相同的”当指的是核酸或其片段时，表示当其以合适的核苷酸插入或缺失与其他核酸(或其互补链)最佳比对时，核苷酸序列同一性为核苷酸碱基的至少大约95%、更优选地至少大约96%、97%、98%或99%，如通过任何熟知的序列同一性算法测量的，如FASTA，BLAST或Gap，这些在下文讨论。与参考核酸分子基本上同一的核酸分子可能在特定条件下编码具有与参考核酸分子编码的多肽相同或几乎相似的氨基酸序列的多肽。如对多肽用到的，术语“基本上相似”或“基本上相似的”指的是两个肽序列在最佳的比对时(如通过GAP或BESTFIT程序，使用缺省缺口权重)共有至少95%的序列同一性，更优选地为至少98%或99%的序列同一性。优选地，不相同的残基位置的区别在于有保守性氨基酸置换。“保守性氨基酸置换”是这样的置换，其中氨基酸残基被具有类似化学特性(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的其它氨基酸置换。一般地，保守性氨基酸置换基本上不改变蛋白质的功能特性。在两个或多个氨基酸序列相互之间差异为保守性置换的情况下，序列同一性百分比或相似度可向上调整以校正置换的保守性质。用于做出此种调整的方式对本领域技术人员是熟知的。见，例如，Pearson(1994)Methods Mol. Biol. 24 307-331。具有相似化学特性的侧链的氨基酸组的实例包括(1)脂肪族侧链甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族-羟基侧链丝氨酸和苏氨酸；(3)含氨侧链天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族测量苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链赖氨酸、 精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链天冬氨酸和谷氨酸，以及(7)含硫侧链半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸置换组为缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。备选地，保守性取代为在PAM250指数可能性阵列中具有正值的任何变化，如Gormet等人(1992)公开于义化！！⑶256 =1443-1445的。“中等保守性”取代为在PAM250指数可能性阵列中为非负值的任何变换。多肽的序列相似性(也称为序列同一性)通常使用序列分析软件测量。蛋白质分析软件使用为不同置换、缺失和其他修饰(包括保守性氨基酸置换)指定的相似度的测量值匹配相似序列。例如，GCG软件包含程序如Gap和Bestfit，其可使用缺省参数确定紧密相关的多肽之间的序列同源性或序列同一性，如来自生物不同种的同源多肽之间，或野生型蛋白质及其突变体之间。见，例如，GCG 6.1版。多肽序列还可使用FASTA使用缺省或推荐参数进行对比，这是GCG 6. 1版中的一个程序。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供了查询及搜索序列之间最佳重叠区域的比对及序列同一性百分比(Pearson(2000)，见上文)。将本发明的序列与包含大量来自不同生物的序列进行对比的另一个优选的算法为计算机程序BLAST，尤其是使用缺省的参数进行BLASTP或TBLASTN。见，例如，Altschul等人(1990) J. Mol. Biol. 215 :403-410 及 Altschul 等人(1997) Nucleic Acids Res. 25 :3389_402。人抗体的制备用于产生单克隆抗体(包括全长人单克隆抗体)的方法在本领域已知。任何所述的已知方法可用于本发明的情况以制造特异性结合人PAR-2的人抗体。使用VEL0CIMMUNE 技术或用于产生单克隆抗体的任何其他已知方法，PAR-2的高亲和力嵌合抗体起初分离时具有人可变区和小鼠恒定区。如下文的实验部分描述的，抗体经过鉴定并就所需要的特征进行筛选，所述特征包括亲和力、选择性、表位等等。小鼠恒定区被所需要的人恒定区所取代以产生本发明的全长人抗体，例如野生型或修饰的IgGl或IgG4。所选择的恒定区可能根据特定用途而变化，可变区具有高亲和力抗原结合性及靶标特异性特征。生物等效物本发明的抗PAR-2抗体和抗体片段包括蛋白质，其具有与所描述的抗体不同但保留结合人PAR-2能力的氨基酸序列。所述变体抗体及抗体片段与亲本序列相比较包含一个或多个氨基酸的添加、缺失，或置换，但显示出与所描述抗体几乎等价的生物学活性。类似地，本发明的编码抗PAR-2抗体的DNA序列包括这样的序列，其与所公开的序列相比较时包含一个或多个核苷酸的添加、缺失或置换，但其编码的抗PAR-2抗体或抗体片段与本发明的抗PAR-2抗体或抗体片段几乎等价。这些变体氨基酸和DNA序列的实例在上文有所讨论。两种抗原结合蛋白质或抗体，在以下情况下认为其是生物等效的若例如其为药物等效物或药物备选物，当其以相同的摩尔剂量、在类似的实验条件下，无论是单一剂量或多剂量施用时，二者的吸收速率和程度未显示显著差异。一些抗体若在其吸收程度而不是吸收速率上等效时被认为是等效物或药物备选物，其仍然被认为是生物等效的，这是是因为吸收速率上的这些差异是主观的(intentional)并能以标记情况(labeling)反映出来， 其对于例如慢性使用时保留有效的体内药物浓度并不关键，故在医学上认为其对于所研究的特定药物产品不显著。在一个实施方式中，两种抗原结合蛋白质若其安全性、纯度和效力方面没有临床有意义的差别，其是物等效的。在一个实施方式中，若患者可在参照产品及生物学产品之间转换一次或更多次， 而相比于无所述转换持续治疗没有预期的副作用风险增加，包括免疫原性的临床显著变化或降低的效用，两种抗原结合蛋白质是生物等效的。在一个实施方式中，两种抗原结合蛋白质都通过共同的一种或多种作用机制作用于所使用的一种或多种条件，达到这些机制已知的程度，那么这两种抗原结合蛋白质是生物等效的。生物等效性可通过体内和体外方法证明。生物等效性测量方法包括，例如，(a)在人或其他哺乳动物中的体内测试，其中测量血液、血浆、血清或其他生物学液体中抗体或其代谢物的浓度作为时间的函数；(b)已经与人的体内生物利用度数据相关并可合理对其产生预测的体外测试；(c)在人或其他哺乳动物中的体内测试，其中测量所述抗体(或其靶标)的合适的急性药学效应作为时间的函数；以及(d)受到良好控制的临床试验，其中确立了抗体的安全性、有效性或生物利用度或生物等效性。本发明的抗PAR-2抗体的生物等效变体可通过例如制造对生物学活性不重要的残基或序列的多种置换或者删除对生物学活性不重要的末端或内部残基或序列而构建。例如，对生物学活性不重要的半胱氨酸残基可删除或用其他氨基酸取代以避免复性时形成不必要或不正确的分子内二硫桥。在其他情况下，生物等效抗体可包括抗PAR-2抗体变体，其包含修饰抗体糖基化特征的氨基酸变化，例如，包含消除或移除糖基化的突变。抗体的生物学特征本发明的抗体可通过补体依赖的细胞毒性(CDC)或抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)发挥作用。“补体依赖的细胞毒性”(CDC)指的是在补体存在下本发明的抗体将抗原表达细胞裂解。“抗体依赖细胞介导的细胞毒性” (ADCC)指的是细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)(例如，天然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)的非特异性细胞毒性细胞识别靶标细胞上结合的抗体并由此导致靶标细胞的裂解。CDC和ADCC可使用本领域熟知并可得的测定法进行测量，(见例如，U. S. 5，500, 362和5，821，337，及Clynes等人 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95 :652-656)。备选地，或另外地，本发明的抗体可在阻断PAR-2相互作用或抑制受体组分相互作用上有治疗性作用。在本发明PAR-2抗体的情况下，所述抗体尤其可通过阻断或遮蔽激活性PAR-2蛋白酶裂解位点起作用。备选地，本发明的抗体可通过干扰栓系配体和一个或多个细胞外环(如，环1、环2和/或环3)之间的相互作用起作用。更具体地，本发明的抗PAR-2抗体可显示出一种或多种以下特征(1)结合人 PAR-2或人PAR-2片段并结合非人(例如，小鼠、猴、大鼠、兔、狗、猪等等)PAR-2或PAR-2 片段的能力；(2)结合人PAR-2或人PAR-2片段但并不结合非人(例如，小鼠、猴、大鼠、兔、 狗、猪等等)PAR-2或PAR-2片段的能力；(3)结合人PAR-2或人PAR-2片段并结合猴PAR-2 或猴PAR-2片段，但不结合小鼠、大鼠、兔、狗、猪PAR-2或PAR-2片段的能力；(4)结合人 PAR-2或人PAR-2片段并结合人PARI、PAR-3或PAR-4或其片段的能力；( 结合人PAR-2 或人PAR-2片段但不结合人PAR-I、PAR-3或PAR-4或其片段的能力；(6)结合人PAR-2或人PAR-2片段并结合非人(例如，小鼠、猴、大鼠、兔、狗、猪等等)PAR-1、PAR-3或PAR-4或其片段的能力；(7)结合人PAR-2或人PAR-2片段但不结合非人(例如，小鼠、猴、大鼠、兔、 狗、猪等等)PAR-l、PAR-3或PAR-4或其片段的能力；(8)阻断PAR-2或PAR-2片段的蛋白水解性裂解的能力；(9)阻断人PAR-2或人PAR-2片段及非人(例如，小鼠、猴、大鼠、兔、狗、猪等等)PAR-2或PAR-2片段的蛋白水解性裂解的能力；(10)阻断人PAR-2或人PAR-2片段的蛋白水解性裂解但不阻断非人(例如，小鼠、猴、大鼠、兔、狗、猪等等)PAR-2或PAR-2片段的蛋白水解性裂解的能力；(11)阻断人PAR-2或人PAR-2片段及人PAR-I、PAR-3或PAR-4 或其片段的蛋白水解性裂解的能力；(12)阻断人PAR-2或人PAR-2片段的蛋白水解性裂解但不阻断人PAR-l、PAR-3或PAR-4或其片段的蛋白水解性裂解的能力；(13)阻断人PAR-2 或人PAR-2片段及非人(例如，小鼠、猴、大鼠、兔、狗、猪等等)PAR-1、PAR-3或PAR-4或其片段的蛋白水解性裂解的能力；和/或(14)阻断人PAR-2或人PAR-2片段的蛋白水解性裂解但不阻断非人(例如，小鼠、猴、大鼠、兔、狗、猪等等)PAR-1、PAR-3或PAR-4或其片段的蛋白水解性裂解的能力。如上文项目(8)-(14)中使用的术语“蛋白水解性裂解”指的是PAR分子(PAR-1、 PAR-2、PAR-3或PAR-4)或其片段被PAR-2蛋白酶或其他能够在激活性PAR-2蛋白酶裂解位点处裂解PAR-2能力的酶裂解。人PAR-2的N端区域具有至少两个“非激活性”蛋白酶裂解位点，即，能够被胰蛋白酶裂解但不导致受体激活的位点。N端非激活性蛋白酶裂解位点位于(a)人PAR-2(SEQ ID NO 851)的 Arg-31*kr-32 残基的连接处；及(b)人 PAR_2(SEQ ID NO :851)的 Lys-34 和 Gly-35残基的连接处。PAR-2的N末端的激活性和非激活性裂解位点在图5中标出(白色三角表示非激活性蛋白酶裂解位点，黑色三角表示激活性PAR-2蛋白酶裂解位点)；又见图4。 本发明包括阻断激活性PAR-2蛋白酶裂解位点但不阻断一个或两个非激活性PAR-2蛋白酶裂解位点的抗PAR-2抗体。候选抗体是否阻断或不阻断特定的蛋白酶裂解位点可通过本领域普通技术人员使用任何合适的测定法确定，如示例性的体外阻断测定法(如本文实施例8用到的)。如实施例8中说明的，示例性抗体H4H58IP显示出在激活性PAR-2蛋白酶裂解位点及非激活性裂解位点(位于人PAR-2(SEQ ID NO :851)的残基Lys_34和Gly-35连接处) 阻断胰蛋白酶裂解，但不阻断位于人PAR-2 (SEQ ID NO :851)的残基Arg-31和kr_32连接处的非激活性蛋白酶裂解位点的裂解。相反地，实施例8中使用的对比(comparator)抗体在激活性PAR-2蛋白酶裂解位点及两个非激活性位点都阻断裂解。这些示例性抗PAR-2抗体的差异化的阻断能力最可能反映了这些抗体所结合的PAR-2分子的特定区域的差异(见例如，本文的实施例9)。如果抗体在25°C在表面等离子共振测定中就与靶标分子的结合进行测试时，显示超过500nM的KD，或在25°C在酶联免疫吸附测定(ELISA)中就与靶标分子的结合进行测试时，显示超过EC5tl的50nM，或在两种类型的测定或其等效测定中未显示任何结合时，如本文所使用的，抗体“不结合”特定的靶标分子(例如，小鼠PAR-2、大鼠PAR-2、兔PAR-2、狗 PAR-2、猪PAR-2或其片段)。在体外细胞测定中，本发明的特定抗PAR-2抗体能够抑制或减弱PAR-2的激活。 PAR-2激活的非限制性的示例性体外细胞测定在本文实施例6中描述。在此实施例中，使用了表达PAR-2并具有包含融合于报告分子(例如，荧光素酶)的NF-κ B的构建体的细胞。简言之，所述细胞与抗PAR-2抗体相组合，之后用PAR-2蛋白酶进行处理。用蛋白酶处理的细胞在抑制性抗PAR-2抗体的存在下比用蛋白酶处理的细胞在无抑制性抗PAR-2抗体，显示出的报告信号显著少，或没有信号。达到最大抑制报告信号的一半(IC5tl)所需要的抗体的浓度可通过此种测定法而计算。本发明包括抑制性抗PAR-2抗体，当如上文描述的就PAR-2激活在体外细胞测定法中测试时，其显示低于300nM的IC5(I。例如，本发明包括抗PAR-2抗体，当以如上文描述的就PAR-2激活在体外细胞测定法中测试时，其中细胞与抗体在37°C孵育lh，随后用20nM胰蛋白酶(或其他PAR-2蛋白酶)于37°C处理5h，其IC5tl 低于 300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、 120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 InM。本发明包括抗PAR-2抗体及其抗原结合片段，其结合一种或多种以下肽肽 A (GTNRSSKGRSLIGKVDGT, SEQ ID NO :852)；肽 B (SLIGKVDGTSHVTG，SEQ ID NO :853)；肽 C(SLIGKV,SEQ ID NO :854)；肽 D (人 PAR-2 的 N 端结构域-小鼠 IgG，SEQ ID NO :855)；肽 E (LAPGRNNSKGRSLIGRLETQ,SEQ ID NO :856)；肽 F (GTNRSSKGRSLIGRVDGT，SEQ ID NO :857)； 肽G(GPNSKGRSLIGRLDTP，SEQ ID NO :858)；肽H(GTNKTSKGRSLIGRNTGS，SEQ ID NO :859)；肽 I(GTNRTSKGRSLIGKTDSS,SEQ ID NO :860)；肽 J(GTSRPSKGRSLIGKADNT，SEQ ID NO :861)；肽 K(ATNATLDPRSFLLRNPND, SEQ ID NO :862)；肽 L)(DTNNLAKPTLPIKTFRGA，SEQ ID NO :863)； 或肽M(ESGSTGGGDDSTPSILPAP，SEQ ID NO :864)。关于这些肽的其他信息可见于本文实施例3。这些肽可不包含另外的标记物或部分(moiety)，或者其可包含N端或C端标记物或部分。在一个实施方式中，标记物或部分为生物素。在一个结合测定法中，标记物(如果有) 的位置可确定所述肽相对于肽所结合的表面的方向。例如，如果表面包被有亲和素，则含有 N端生物素的肽将被定向，使得肽的C端远离所述表面。关于前述的肽，本发明包括具有一种或多种以下结合特征的抗PAR-2抗体(1)结合肽A和B，但不结合肽C ；⑵结合肽A、B和D，但不结合肽C ； (3)结合肽A、B、D和F，但不结合肽C ； (4)结合肽A、B、D和F，但不结合肽C或E中任何肽；(5)结合肽A、B和D，但M中任何肽；(6)结合肽A、B和F，但不结合肽K、L或M中任何肽；(7)结合肽A、B、D和F，但不结合肽K、L或M中任何肽；和/或(8)结合肽A、B、C、D、E、F、G、I和 J中至少三种，但不结合肽H。其他本发明抗体结合形式从本文的实施例中得到了解。表位作图及相关技术为筛选结合具体表位的抗体(例如，阻断IgE与其高亲和力受体结合的那些)， 可进行常规的交叉阻断测定法，如Antibodies，Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb. , NY)中描述的。其他方法包括丙氨酸扫描突变体、肽杂交 (Reineke，2004，Methods Mol Biol 248 :443-463)、或肽裂解分析。此外，方法如表位剪切、 表位提取及抗原化学修饰也可采用(TomerdOOOJrotein Science 9:487-496)。术语“表位”指的是抗原上的B和/或T细胞应答的位点。B细胞表位可由蛋白质的相邻氨基酸或四级折叠排列的非相邻氨基酸两种方式形成。由相邻氨基酸形成的表位一般在暴露于变性溶剂时仍然保留，而由四级折叠形成的表位在以变性溶剂处理时一般会丢失。表位一般包括至少3个，更通常地，至少5个或8-10个氨基酸，其形成独特的空间构象。修饰辅助分型(Modification-Assisted Profiling，MAP)，也称为基于抗原结构的抗体分型(Antigen Structure-based Antibody Profiling, ASAP)，为将大量针对相同抗原的单克隆抗体(mAb)根据每种抗体对化学或酶修饰的抗原表面的结合形式的相似度分类的方法(US 2004/0101920)。每个分类会反应独特的表位，其与另外分类表现的表位显著不同，或有部分重叠。此技术使得能够迅速筛选遗传一致的抗体，这样鉴定可聚焦于遗传差异的抗体。当应用于杂交瘤筛选时，MAP可促进鉴定出产生具有所需特征的mAb的少量杂交瘤克隆。MAP可用于将本发明的抗PAR-2抗体分类为结合不同表位的抗体组群。本发明包括结合激活性PAR-2蛋白酶裂解位点处或其附近(例如，在5、10、15或 20个氨基酸以内)的表位的抗PAR-2抗体。在特定实施方式中，所述抗PAR-2抗体结合位于激活性PAR-2蛋白酶裂解位点上游(S卩，N端)的表位。在本发明的特定的其他实施方式中，所述抗PAR-2抗体结合位于激活性PAR-2蛋白酶裂解位点下游(即，C端)的表位。 在其他实施方式中，本发明的抗PAR-2抗体可结合包含位于激活性PAR-2蛋白酶裂解位点上游的氨基酸序列及位于激活性PAR-2蛋白酶裂解位点下游的氨基酸序列的表位。备选地。本发明的抗PAR-2抗体可在特定实施方式中结合PAR-2蛋白的细胞外环的表位(例如，细胞外环1、细胞外环2和/或细胞外环3)。本发明包括分离的人抗体或其抗原结合片段，其与位于激活性PAR-2蛋白酶裂解位点下游的特定氨基酸残基相互作用。例如，本发明包括分离的人抗体或其抗原结合片段， 其与人PAR-2(SEQ ID NO :851)的Val_42和Asp-43相互作用。除这两个残基外，所述分离的人抗体或其抗原结合片段还可与位于激活性PAR-2蛋白酶裂解位点下游的一个或多个下列残基相互作用人PAR-2(SEQ ID NO :851)的 kr-37、Leu-38、Ile_39、Gly-40 或Gly-44。 在特定实施方式中，所述分离的人抗体或其抗原结合片段不与人PAR_2(SEQ ID NO :851)的 Lys-41相互作用。例如，本发明包括分离的人抗体或其抗原结合片段，其与人PAR-2(SEQ ID NO 851)的 Ser-37、Leu-38、Ile-39、Gly-40、Val-42 和 Asp-43 相互作用，并且不与人 PAR-2 (SEQ ID NO :851)的Lys_41相互作用。实施例9中说明的实验步骤可用于确定候选抗PAR-2抗体是否与PAR-2的具体氨基酸残基“相互作用”或“不相互作用”。例如，如果19使用实施例9的步骤测试候选抗体对于具有SEQ ID NO 879 (对应PAR-2的N端区域，其中PAR-2的Val-42突变为丙氨酸，见例如，表M_28)的肽的结合，并且所述抗体的T1/2少于当测试候选抗体对于野生型肽(SEQ ID NO 871)的结合时观察到的T1/2的30%，则用于本公开的目的，此候选抗体被视为与突变为丙氨酸的氨基酸(此例中为Val-42) “相互作用于”;即，当对应于Val-42的氨基酸突变为丙氨酸(这些残基在图5中以黑色圆圈表示) 时，候选抗体的结合大大减少。在另一方面，若使用实施例9的步骤测试候选抗体对于具有 SEQ ID NO :878(对应PAR-2的N端区域，其中PAR-2的Lys-41突变为丙氨酸，见例如，表 24-28)的肽的结合，并且所述抗体的T1/2大于或等于当测试候选抗体对于野生型肽的结合 (SEQ ID NO 871)时观察到的T1/2的30%，则用于本公开的目的，此候选抗体被视为与突变为丙氨酸的氨基酸(此例中为Lys-41) “不相互作用”；即，当对应于Lys-41的氨基酸突变为丙氨酸(这些残基在图5中以黑色圆圈表示)时，候选抗体的结合未有大大减少。本发明包括结合本文描述的任何具体示例性抗体(例如，H4H58IP，H4H588N， H4H591N或H4H618N)相同的表位的抗PAR-2抗体。类似地，本发明还包括抗PAR-2抗体，其与本文描述的任何具体示例性抗体(例如H4H581P、H4H588N、H4H591N或H4H618N)交叉竞争结合PAR-2或PAR-2片段.使用本领域已知的常规方法可容易地确定抗体是否与参照抗PAR-2抗体结合相同的表位，或与其竞争结合。例如，要确定测试抗体是否结合本发明的抗PAR-2抗体的相同表位，在饱和条件下让参照抗体结合PAR-2蛋白或肽。然后，评估测试抗体结合PAR-2分子的能力。如果测试抗体能够在用参照抗PAR-2抗体的饱和结合之后结合PAR-2分子，则结论是测试抗体结合与参照抗PAR-2抗体不同的表位。另一方面，如果测试抗体在用参照抗PAR-2抗体的饱和结合之后不能结合PAR-2分子，则测试抗体可能结合与本发明的参照抗PAR-2抗体所结合的表位相同的表位。然后可进行另外的常规实验(例如，肽突变和结合分析)以验证所观察到的缺乏测试抗体的结合是否实际上是由于结合与参照抗体相同的表位，或者是否空间阻碍(或其他现象)是所观察到结合的缺乏的原因。此种实验可用 ELISA、RIA、Biacore、流式细胞术或其他本领域可得的任何定量或定性的抗体结合测定法进行。根据本发明的特定实施方式，用竞争性结合测定法测量的，如果例如一种抗体过量 1-、5-、10-、20_或100-倍抑制另一种抗体结合的至少50%但优选地为75%、90%或甚至 99%，则两个抗体结合相同(或重叠)表位(见例如，Junghans等人，Cancer Res. 1990 :50 1495-1502)。备选地，如果减少或消除一种抗体结合的抗原氨基酸突变中的几乎所有减少或消除了另一种抗体的结合，则两种抗体可视为结合相同表位。如果减少或消除一种抗体结合的氨基酸突变中仅仅有一部分减少或消除另一种抗体结合的情况下，两种抗体可视为具有“重叠表位”。为确定抗体是否与参照抗PAR-2抗体竞争结合，上文描述的结合方法以两种方向进行在第一种方向上，参照抗体在饱和条件下结合PAR-2分子，随后评估测试抗体对 PAR-2分子的结合情况。在第二种方向上，测试抗体在饱和条件下结合PAR-2分子，随后评估参照抗体对PAR-2分子的结合情况。如果在两种方向上只有第一种(饱和)抗体能能够结合PAR-2分子，则结论是测试抗体和参照抗体竞争结合PAR-2。如本领域普通技术人员会理解的，与参照抗体竞争结合的抗体不一定与参照抗体结合相同的表位，但可能通过结合重叠或邻近的表位空间上阻碍参照抗体的结合。
物种选择性及物种交叉反应性根据本发明特定实施方式，所述抗PAR-2抗体结合人PAR-2但不结合与来自其他物种的PAR-2。备选地，本发明的抗PAR-2抗体在特定实施方式中结合人PAR-2以及来自一种或多种非人物种的PAR-2。例如，本发明的抗PAR-2抗体可结合人PAR-2并可结合或不结合(视情况而定)小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、猕猴 (cynomologous)、绒猴、恒河猴或黑猩猩PAR-2中的一种或多种。免疫缀合物(immunoconjugate)本发明包括缀合至治疗性部分，如细胞毒素、化疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素的抗PAR-2单克隆抗体(免疫缀合物)。细胞毒性试剂包括对细胞有害的任何试剂。用于形成免疫缀合物的合适的细胞毒性试剂及化疗试剂在本领域已知，见例如，WO 05/103081。多特异性抗体本发明的抗体可以为单特异性、双特异性或多特异性的。多特异性抗体可特异于一种靶标多肽的不同表位或可包含特异于超过一种靶标多肽的抗原结合结构域。见， 例如 Tutt 等人，1991，J. Immunol. 147 :60-69 ；Kufer 等人，2004，Trends Biotechnol. 22 238-2440本发明的抗PAR-2抗体可与另一种功能性分子例如，另一种肽或蛋白质相连接或共表达。例如，抗体或其片段可与一种或多种其他分子实体功能性相连(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价相连或其他方式)，所述其他分子实体如另一种抗体或抗体片段，以产生具有第二种结合特异性的双特异性或多特异性抗体。例如，本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一条臂特异于人PAR-2或其片段，而免疫球蛋白的另一条臂特异于第二种治疗靶标或缀合至治疗性部分如胰蛋白酶抑制剂。可用于本发明情况的示例性双特异性抗体形式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3 结构域和第二 Ig CH3结构域，其中第一和第二 Ig CH3结构域相互之间有至少一个氨基酸的差异，且其中至少一个氨基酸的差异减少了所述双特异性抗体相对于不含氨基酸差异的双特异性抗体对蛋白质A的结合。在一个实施方式中，第一 Ig CH3结构域结合蛋白质A， 而第二 Ig CH3结构域包含减少或消除蛋白质A结合的突变，如H95R修饰(通过IMGT外显子编号，通过EU编号为H435R)。第二 Ch3可进一步包含Y96F修饰(通过IMGT ；通过EU 为W36F)。在IgGl抗体情况下可在第二 Ch3内找到的进一步修饰包括D16E、L18M、N44S、 K52N、V57M 及 V82I (通过 IMGT ；通过 EU 为 D356E、L358M、N384S、K392N、V397M 及 V422I)；在 IgG2 抗体情况下为 N44S、K52N 及 V82I (IMGT ；通过 EU 为 N384S、K392N 及 V422I)；在 IgG4 抗体情况下为 Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q 及 V82I (通过 IMGT ；通过 EU 为 Q355R、 N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q及V422I)。上文描述的双特异性抗体的形式上的变化在本发明范围的预期之内。治疗性制剂及施用本发明提供了治疗性组合物，其包含本发明的抗PAR-2抗体或其抗原结合片段。 根据本发明对治疗性组合物的施用将与合适的载体、赋形剂及其他并入制剂的试剂一并施用以提供改善的转移、递送、耐受等等。大量合适的制剂可见于对所有化学药剂师已知的处方集！Remington' s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company, Easton， PA。这些制剂包括例如，粉剂、膏剂、油膏齐 、胶冻剂(jelly)蜡剂、油剂、脂剂、含有微囊泡的脂剂(阳离子或阴离子)(如LIP0FECTIN )、DNA缀合物、无水吸附膏、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(不同分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶以及含有碳蜡的半固体混合物。另见 Powell 等人"Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA(1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311。抗体的剂量可根据待施用的受试者的年龄和体积、靶标疾病、病况、施用途径等等而变化。优选的剂量一般根据体重或体表面积计算。当本发明抗体用于治疗成人患者的 PAR-2活性相关病况或疾病时，静脉施用本发明的抗体是有利的，一般以大约0. 01-大约 20mg/kg体重、更优选地大约0. 02-大约7、大约0. 03-大约5或大约0. 05-大约;3mg/kg体重的单一剂量。根据病况的严重度，可对治疗的频率和疗程进行调整。可经验性地确定施用PAR-2抗体的有效剂量和时间安排；例如，可通过阶段性评估来监测患者的进展，并相应地调整剂量。此外，使用本领域熟知的方法可进行剂量的种间比例放缩(例如，Mordenti等人，1991, Pharmaceut. Res. 8 :1351)。多种递送系统是已知的并可用于施用本发明的药物组合物，例如，包装在脂质体、微颗粒、微胶囊内，能够表达突变病毒的重组细胞，受体介导的胞饮作用(见，例如mi 等人，1987，J. Biol. Chem. 262 :4429-4432)。引入组合物的方法包括但不限于，真皮内、 肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外及口服途径。所述组合物可通过任何方便的途径施用，例如通过输注或静脉团注(bolus injection)、通过经由上皮或粘膜皮肤内衬 (mucocutaneous lining)(例如，口粘膜、直肠和肠粘膜等等)的吸收，并可与其他生物学活性试剂一并施用。可以是系统性的或局部性的施用。本发明的药物组合物可用标准的针头和注射器进行皮下或静脉内递送。此外，对于皮下递送，笔式递送设备(pen delivery device)容易地应用在递送本发明的药物组合物中。所述笔式递送设备为可重复使用的或是一次性的。重复使用的笔式设备一般利用了含药物组合物的可替换药筒。一旦药筒内所有药物组合物都已施用，药筒变空，可容易地丢弃空药筒并换成含有所述药物组合物的新药筒。随后可再次使用所述笔式递送设备。在一次性的笔式递送设备中，没有可替换药筒。一次性的笔式递送设备则是起始就预装有所述药物组合物，其保存在设备内的存储库中。一旦药物组合物的存储库变空，丢弃整个设备。大量可重复使用的笔式及自动注射递送设备可应用在本发明药物组合物的皮下递送中。实例包括但不限于 AUT0PEN (0wen Mumford, Inc.，Woodstock，UK)、DISETR0NIC pen (Disetronic Medical Systems, Bergdorf， Switzerland) > HUMAL0G MIX 75/25 pen、 HUMAL0G pen、HUMALIN 70/30 pen (Eli Lilly and Co.，Indianapolis, IN)、N0V0PEN I、II 和 III (Novo Nordisk，Copenhagen，Denmark)、N0V0PEN JUNIOR (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark)、BD pen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), 0ΡΤΙΡΕΝ 、 0ΡΤΙΡΕΝ PRO 、OPTIPEN STARLET 及 0PTICLIK (sanofi-aventis，Frankfurt, Germany)， 这些仅仅是其中一部分。在本发明药物组合物的皮下递送中可应用的一次性的笔式递送设备的实例包括但不限于 S0L0STAR pen(sanofi-aventis)，the FLEXPEN (Novo Nordisk) 以及 KWIKPEN (Eli Lilly)、SURECLICK Autoinjector (Amgen, Thousand Oaks，CA)、 PENLET (Hase Ime i er, Stut t gar t, Germany)、EPIPEN(Dey，L. P.)以及 HUM IRA Pen (Abbott Labs, Abbott Park IL)，这些仅仅是列出其中一部分。在特定情况下，药物组合物可通过控制释放系统而递送。在一个实施方式中，可使用泵(见 Langer，见上文 fefton，1987，CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14 :201)。在另一个实施方式中，可使用多聚材料；见Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise (eds.)，1974，CRC Pres.，Boca Raton，Florida。在另一种其他的实施方式中，控制释放系统可置于组合物靶标附近，这样只需要系统性剂量的一部分(见，例如，Goodson, 1984, Medical Applications of Controlled Release, jAL±i, vol. 2, pp. 115—138)。胃他的控制释放系统在Langer的综述中讨论，1990，Science 249 1527-1533。可注射制备物可包括用于静脉内、皮下、皮内及肌肉内注射、滴注等的剂型。这些可注射制备物可通过公众已知的方法制备。例如，可通过将上文描述抗体或其盐溶解、重悬或乳化于常规用于注射的无菌水性基质或油性基质中而制备可注射制备物。用于注射的水性基质有例如，生理盐水、含有葡萄糖和其他辅助试剂的等渗溶液，等等，其可与合适的溶解性试剂如醇(例如乙醇)、聚醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如聚山梨酸酯80、HC0_50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50摩尔)加合物)]等等一并施用。作为油性基质，采用的有例如芝麻油、大豆油等等，其可与溶解性试剂如苯甲酸苄酯、苯甲醇等等一并使用。这样制备的注射物优选地填装于恰当的安瓿瓶中。有利地，上文描述的用于口服或非肠道用途的药物组合物制备成合适单位剂量的剂型以适合于活性成分的剂量。这些单位剂量的剂型包括例如，片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等等。所含前述抗体的量一般为大约5-大约500mg每单位剂量的剂型； 尤其是在注射剂的剂型中，优选地所含前述抗体量为大约5-100mg，对于其他剂型为大约 10-250mg。抗体的治疗性用途本发明的抗体尤其可用于治疗、预防和/或减轻与PAR-2活性相关的任何疾病或障碍，包括与PAR-2的蛋白水解性激活相关的疾病或障碍。可以用本发明的抗PAR-2抗体治疗的示例性疾病和障碍包括疼痛病况如伤害性疼痛和内脏性疼痛，以及与病况如炎症、术后切口、神经病变、骨折、烧伤、骨质疏松性骨折、骨癌、痛风、偏头痛、纤维肌痛等等相关的疼痛。本发明的抗体还可用于治疗、预防和/或减轻炎性病况如关节炎症、气道炎症(例如， 哮喘)、皮肤炎症、皮炎(例如，特应性皮炎、过敏接触性皮炎等等)、炎性肠疾病(IBD)、肾小球性肾炎、间质性膀胱炎、膀胱炎症、痛觉过敏、风湿性关节炎、骨关节炎、炎性关节炎、多发性硬化、抗磷脂综合征、α -1-抗胰蛋白酶缺陷等等。本发明的抗体可用于治疗纤维化病况， 包括例如硬皮病、胆汁性肝硬化、移植后纤维化、肾纤维化、肺纤维化、肝纤维化、胰纤维化、 睾丸纤维化、增生性伤疤及皮肤性瘢痕疙瘩。在特定实施方式中，本发明的抗体可用于治疗胃肠病况(例如，脂泻病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、原发性胃轻瘫、胰腺炎、肠道易激综合征(IBQ以及溃疡症(包括胃及十二指肠溃疡)；急性肺损伤；急性肾损伤；以及败血症。 本发明的抗PAR-2抗体还可用于治疗瘙痒症；例如，皮肤/皮肤原性(pruritoc印tive)、 神经病性、神经原性以及心因性发痒，以及与特应性皮炎、牛皮癣、烧伤伤疤(烧伤相关发痒)、增生性伤疤、瘢痕疙瘩、肾衰竭及肝衰竭相关的瘙痒。本发明的抗PAR-2抗体的其他治疗用途包括治疗、预防和/或减轻阿尔茨海默病、Netherton病、病理性血管增生、慢性荨麻疹、血管性水肿、肥大细胞增多症、子宫内膜异位、不育症(例如，与睾丸纤维化相关的男性不育症)、肥大细胞介导的疾病、艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)毒素A诱导的肠炎以及癌症(例如，血细胞癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、头颈癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌等等。
联合疗法本发明包括治疗性施用方案，其包含将本发明的抗PAR-2抗体与至少一种另外的治疗活性组分联合施用。所述另外的治疗活性组分的非限制性实例包括其他PAR-2拮抗剂(例如，抗PAR-2抗体或PAR-2的小分子抑制剂(例如，N1-3-甲基丁酰-N4-6-氨基己酰-哌嗪；ENMD-1068))，细胞因子抑制剂(例如，白介素_1 (IL-I)抑制剂(如列洛西普 (rilonacept)或阿那白滞素，一种小分子IL-I拮抗剂，或抗IL-I抗体)；IL-18抑制剂(如小分子IL-18拮抗剂或抗IL-18抗体)；IL-4抑制剂(如小分子IL-4拮抗剂、抗IL-4抗体或抗IL-4受体抗体)；IL-6抑制剂(如小分子IL-6拮抗剂、抗IL-6抗体或抗IL-6受体抗体)；抗癫痫药物(例如加巴喷丁)；神经生长因子(NGF)抑制剂(例如，小分子NGF拮抗剂或抗NGF抗体)；低剂量秋水仙碱；阿司匹林；NSAID ；类固醇(例如，强的松、氨甲喋呤等等)；低剂量环孢霉素A ；肿瘤坏死因子(TNF)或TNF受体抑制剂(例如，小分子TNF或 TNFR拮抗剂或者抗TNF或TNFR抗体)；尿酸合成抑制剂(例如，别嘌呤醇)；尿酸分泌促进剂(例如，丙磺舒、磺吡酮、苯溴马隆等等)；其他炎性抑制剂(例如，半胱天冬酶_l、p38、 IKKl/2、CTLA-4Ig的抑制剂等等)；及/或皮质类固醇。另外的治疗活性组分可在本发明的抗PAR-2抗体施用之前、同时或之后施用。抗体的诊断性用途本发明的抗PAR-2抗体还可用于检测和/或测量样品中的PAR-2，例如，用于诊断性目的。例如，抗PAR-2抗体或其片段可用于诊断特征为PAR-2异常表达(例如，过表达、 低表达、不表达等等)的病况或疾病。对PAR-2的示例性诊断性测定可包括例如，将获自患者的样品与本发明的抗PAR-2抗体接触，其中抗PAR-2抗体用可检测标签或报告子分子进行标记。备选地，未标记的抗PAR-2抗体可与本身有可检测标记的二抗联合用于诊断性应用。所述可检测标签或报告子分子可以为放射性同位素，如咕、14(、3牛、34或125I ；荧光或化学发光部分如异硫氰酸荧光素或罗丹明红；或酶如碱性磷酸酶、β -半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶。可用于检测或测量样品中PAR-2的具体示例性测定法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)以及荧光激活细胞分选术(FACS)。可用于根据本发明的PAR-2诊断性测定法的样品包括在正常或病理条件下的获自患者的任何组织或液体样品，其含有可检测量的PAR-2蛋白质或其片段。一般地，测量获自健康患者(例如，不患有与PAR-2水平或活性异常相关的疾病或病况)的特定样品中的 PAR-2水平以在开始时建立PAR-2水平的基线，或标准。然后可将PAR-2的基线水平与获自疑似患有PAR-2相关疾病或病况的个体的样品中测量到的PAR-2水平相对比。
实施例以下实施例的提出是为本领域普通技术人员提供如何制备及使用本发明的方法和组合物的完整公开和说明，但不意欲限制发明者所认为的其发明的范围。已经尽力确保所使用的数字的精确度(例如量、温度等等)，但是一些实验误差及偏差应当考虑在内。除非另有说明，成分为重量成分，分子量为平均分子量，温度为摄氏温度而压力为大气压或近似大气压。实施例1.针对人PAR-2的人抗体的产生将包含具有氨基酸序列GTNRSSKGRSLIGKVDGT(SEQ ID NO :852)的人PAR-2肽的免疫原与刺激免疫应答的佐剂直接施用于VEL0CIMMUNE 小鼠，其包含编码人免疫球蛋白重链及κ轻链可变区的DNA。通过PAR-2特异性免疫测定法监测抗体免疫应答。当达到所需要的免疫应答时，收集脾细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合以保留其活力并形成杂交瘤细胞系。对杂交瘤细胞系进行筛选和选择以鉴定产生PAR-2特异性抗体的细胞系。使用此技术，获得了数种抗PAR-2嵌合抗体(即，具有人可变结构域和小鼠恒定结构域的抗体)；以此种方式产生的示例性抗体标记如下H2M588、H2M589、H1M590、H2M591、H1M592、H1M595、 H2M609、H2M610、H2M611、H1M612、H1M613、H2M614、H1M615、H1M616、H3M617、H2M618、H1M619 和 H3M620。抗PAR-2抗体还直接分离自未与骨髓瘤细胞融合的抗原阳性的B细胞，如 U. S. 2007/0280945A1中所描述的。使用此种方法，获得了数种全长人源抗PAR-2抗体(即， 具有人可变结构域和人恒定结构域的抗体)。以此种方式产生的示例性抗体标记如下 H1H571、H1H572、H1H573、H1H574、H1H575、H1H576、H1H577、H1H578、H1H579、H1H580、H1H581、 H1H583、H1H584、H1H585、H1H586 和 H1H587。根据此实施例的方法产生的示例性抗PAR-2抗体的生物学特性在下文提出的实施例中有详细描述。实施例2.重链和轻链可变区氨基酸序列表1列出所选出的抗PAR-2抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列对及其对应的抗体标号。N、P和G标号指的是重链和轻链有相同的⑶R序列而在⑶R序列之外的区域(即， 在框架区)有序列变化的抗体。因此具体抗体的N、P和G变体在期重链和轻链可变区内有相同的CDR序列，而在其框架区内序列有差异。表权利要求
1.分离的人抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人PAR-2(SEQ ID NO :851)并与人 PAR-2的Val-42和Asp-43相互作用。
2.权利要求1的分离的人抗体或其抗原结合片段，其中的抗体或其抗原结合片段还与一个或多个选自人PAR-2的kr-37、Leu-38、Ile-39、Gly-40和Gly-44的残基相互作用。
3.权利要求1或2的分离的人抗体或其抗原结合片段，其中的抗体或其抗原结合片段不与人PAR-2的Lys-41相互作用。
4.权利要求1-3中任何一项的分离的人抗体或其抗原结合片段，其中的抗体或其抗原结合片段与人 PAR-2 的 Ser-37、Leu-38、Ile-39、Gly-40、Val-42 和 Asp-43 相互作用，但不与人PAR-2的Lys-41相互作用。
5.权利要求1-4中任何一项的分离的人抗体或其抗原结合片段，其中的抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO :98/106和SEQ ID NO :714/692的HCVR/LCVR氨基酸序列对的互补决定区(⑶R)。
6.权利要求5的人抗体或其抗原结合片段，其中的抗体或其抗原结合片段包含选自 (a) SEQ ID NO :100-102-104/108-110-112 ；及(b) SEQ ID NO :700-702-704/708-710-712 的 HCDR1-HCDR2-HCDR3/LCDR1-LCDR2-LCDR3 氨基酸序列。
7.权利要求1-6中任何一项的分离的人抗体或其抗原结合片段，其中的抗体或其抗原结合片段阻断在位于人PAR-2的残基4印-36与％1-37连接处的激活性裂解位点对人 PAR-2的胰蛋白酶裂解。
8.权利要求7的分离的人抗体或其抗原结合片段，其中的抗体或其抗原结合片段不阻断在一个或多个非激活性裂解位点对人PAR-2的胰蛋白酶裂解，所述位点选自位于人PAR-2的残基Arg-31和连接处的非激活性裂解位点以及位于人PAR-2的残基 Lys-34和Gly-35连接处的非激活性裂解位点。
9.分离的人抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人PAR-2(SEQ ID N0:851)，其中抗体或其抗原结合片段与人 PAR-2 &kr-37、Leu-38、Ile-39、Gly-40、Val-42 和 Asp-43 相互作用，但不与人PAR-2的Lys-41相互作用，且其中抗体或抗原结合片段阻断在位于人PAR-2 的残基Arg-36和kr-37连接处的激活性裂解位点对人PAR-2的胰蛋白酶裂解，而不阻断在位于人PAR-2的残基Arg-31和kr_32连接处的非激活性裂解位点对人PAR-2的胰蛋白酶裂解。
10.分离的人抗体或其抗原结合片段，其与选自以下的参照抗体结合人PAR-2上的相同表位(a)包含具有SEQ ID NO :714的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)和具有SEQ ID NO 692的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的抗体；以及(b)包含具有SEQ ID NO 98的氨基酸序列的HCVR和具有SEQ ID NO :106的氨基酸序列的LCVR的抗体。
11.药物组合物，其包含权利要求1-10中任何一项的抗体或抗原结合片段，以及药物可接受载体或稀释剂。
12.治疗方法，其包括将权利要求11的药物组合物施用于患者，其中患者表现出由 PAR-2活性引起的疾病或障碍的一种或多种症状或指征。
13.权利要求12的治疗方法，其中由PAR-2活性引起的疾病或障碍选自疼痛、瘙痒、 哮喘、风湿性关节炎、纤维化、特应性皮炎、炎性肠疾病、溃疡性结肠炎、胰腺炎、溃疡、克罗恩氏病、癌症及Netherton病。
14.权利要求12或13的治疗方法，其进一步包括对患者施用至少一种选自以下的另外的治疗活性组分IL-1抑制剂、IL-18抑制剂、IL-4抑制剂、IL-4受体抑制剂、IL-6抑制剂、IL-6受体抑制剂、神经生长因子(NGF)抑制剂、肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂、TNF受体抑制剂、尿酸合成抑制剂以及皮质类固醇。
15.权利要求1-10中任何一项的分离的人抗体或抗原结合片段，或权利要求11的药物组合物，用于治疗表现出由PAR-2活性引起的疾病或障碍的一种或多种症状或指征的患者的用途，其中由PAR-2活性引起的疾病或障碍为选自以下的疾病或障碍疼痛、瘙痒、哮喘、风湿性关节炎、纤维化、特应性皮炎、炎性肠疾病、溃疡性结肠炎、胰腺炎、溃疡、克罗恩氏病、癌症及Netherton病。
16.权利要求1-10中任何一项的分离的人抗体或抗原结合片段，或权利要求11的药物组合物，在制备用于治疗表现出由PAR-2活性引起的疾病或障碍的一种或多种症状或指征的患者的药物中的用途，其中由PAR-2活性引起的疾病或障碍为选自以下的疾病或障碍 疼痛、瘙痒、哮喘、风湿性关节炎、纤维化、特应性皮炎、炎性肠疾病、溃疡性结肠炎、胰腺炎、 溃疡、克罗恩氏病、癌症及Netherton病。
全文摘要
本发明提供结合蛋白酶激活受体-2(PAR-2)的抗体及使用其的方法。根据本发明特定实施方式，所述抗体为结合人PAR-2的全长人抗体。本发明的抗体尤其可用于治疗与一种或多种PAR-2生物学活性相关的疾病或障碍，包括治疗疼痛病况、炎症病况及胃肠病况。
文档编号A61P29/00GK102574923SQ201080047991
公开日2012年7月11日 申请日期2010年9月8日 优先权日2009年9月9日
发明者A·J·莫菲, L·麦克唐纳, M·L·拉克罗斯-弗拉里什, M·R·莫拉, N·J·帕帕多普罗斯, R·R·萨尔泽勒 申请人:瑞泽恩制药公司