专利名称：改进的脂质制剂的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及利用脂质颗粒递送治疗剂的领域。具体地，本发明提供了有利于核酸的体内递送的阳离子脂质和含有此类脂质的脂质颗粒，以及适合用于体内治疗用途的核酸-脂质颗粒组合物。此外，本发明提供了制备此类组合物的方法以及利用此类组合物将核酸引入细胞的方法，例如用于多种疾病症状的治疗。
背景技术：
治疗性核酸包括例如小干扰RNA(SiRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸、核酶、质粒和免疫刺激性核酸。此类核酸通过多种机制起作用。对于siRNA或miRNA，此类核酸可通过称为RNA干扰(RNAi)的过程下调特定蛋白质的细胞内水平。在将siRNA或miRNA引入细胞质后，此类双链RNA构建体可结合称为RISC的蛋白质。siRNA或miRNA的有义链在RISC复合物中被取代，从而在RISC内提供了可识别和结合具有与所结合的siRNA或miRNA的序列互补的序列的mRNA的模板。在结合互补mRNA后，RISC复合物切割mRNA并且释放切割的链。RNAi可通过编码蛋白质合成的相应mRNA的靶向特异性破坏来提供特定蛋白质的下调。RNAi的治疗性应用极其广泛，因为siRNA和miRNA构建体可用针对靶蛋白质的任何核酸序列合成。迄今为止，siRNA构建体在体外和体内模型中都已显示出特异性下调靶蛋白质的能力。此外，目前正在临床研究中评估siRNA构建体。然而，目前siRNA或miRNA构建体面临的两个问题是首先，它们在血浆中对核酸酶消解的易感性，其次，它们有限的进入细胞内区室(当以游离siRNA或miRNA形式全身性施用时它们可在所述区室中结合RISC)的能力。这些双链构建体可通过将化学修饰的核苷酸连接子例如硫代磷酸酯基团掺入分子内来进行稳定。然而，这些化学修饰只提供有限的免受核酸酶消解的保护作用并且可降低构建体的活性。siRNA或miRNA的细胞内递送可通过使用载体系统(例如聚合物、阳离子脂质)或通过化学修饰构建体(例如通过胆固醇分子的共价结合)来进行促进。然而，需要改进的递送系统来增加siRNA和miRNA分子的效能并且减少或消除对化学修饰的需要。反义寡核苷酸和核酶也可抑制mRNA翻译成蛋白质。对于反义构建体，这些单链脱氧核酸具有与靶蛋白质mRNA的序列互补的序列并且可按照沃森-克里克碱基配对结合mRNA。该结合阻止靶mRNA的翻译和/或触发mRNA转录体的RNA酶H降解。结果，反义寡核苷酸具有作用特异性(即，特定疾病相关蛋白的下调)的巨大潜力。迄今为止，此类化合物已表明在几种体外和体内模型(包括炎性疾病、癌症和HIV的模型)中具有希望(于Agrawal, Trends in Biotech. 14 :376-387 (1996)中介绍)。反义链也可通过与染色体 DNA的特异性杂交影响细胞活性。目前正在进行几种反义药物的人晚期临床评估。此类药物的靶点包括bcl2和载脂蛋白B基因以及mRNA产物。 免疫刺激性核酸包括脱氧核糖核酸和核糖核酸。对于脱氧核糖核酸，已显示某些序列或基序引发哺乳动物的免疫刺激。此类序列或基序包括CpG基序、富含嘧啶的序列和回文序列。脱氧核糖核酸中的CpG基序相信可被内体受体、S卩toll-样受体9 (TLR-9)特异性识别，所述受体随后触发先天性和获得性免疫刺激途径。还报导了某些免疫刺激核糖核酸序列。此类RNA序列据认为通过结合toll-样受体6和7 (TLR-6和TLR-7)触发免疫活化。此外，还报导了双链RNA具有免疫刺激性并且据认为通过结合TLR-3而活化。关于治疗性核酸的用途的一个公知的问题涉及磷酸二酯核苷酸间键合的稳定性和该连接子对核酸酶的易感性。血清中外切核酸酶和内切核酸酶的存在导致具有磷酸二酯连接子的核酸的快速降解，从而，治疗性核酸在血清存在的情况下或在细胞内具有极短的半衰期。(Zelphati，0.等人，Antisense. Res. Dev. 3 :323-338 (1993)；和 Thierry, A. R.等人，第 147-161 页，Gene Regulation Biology of Antisense RNA and DNA (编辑 Erickson, RP 和 Izant, JG ;Raven Press，NY(1992))。由于这些和其他已知的问题，目前正在开发的治疗性核酸不使用在天然核酸中发现的基本磷酸二酯化学物质。该问题已通过减少血清或细胞内降解的化学修饰得到部分克服。已测试核苷酸间磷酸二酯桥上(例如，使用硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或氨基磷酸酯键合)、核苷酸碱基上(例如，5-丙炔基-卩密卩定)或糖上(例如,2'-修饰的糖)的修饰(Uhlmann E.等人Antisense Chemical Modifications. Encyclopedia of Cancer,第 X 卷，pp 64-81 Academic PressInc. (1997))。其他研究人员已试图利用2' -5'糖键合提高稳定性(参见，例如美国专利No. 5，532，130)。已尝试其他改变。然而，这些解决方法中没有一个已证明完全令人满意，并且体内游离治疗性核酸仍然只具有有限的功效。此外，如上文中关于SiRNA和miRNA所指出的，问题仍然在于有治疗性核酸穿过细胞膜的有限能力(参见，Vlassov 等人,Biochim. Biophys. Acta 1197 :95-1082 (1994))和在于与全身性毒性例如补体介导的过敏反应、改变的凝血性质和血细胞减少(Galbraith等人，Antisense Nucl. Acid Drug Des. 4 :201-206 (1994))相关的问题。为了尝试提高功效，研究者也已利用基于脂质的载体系统递送化学修饰的或未修饰的治疗性核酸。在 Zelphati，0 和 Szoka, F. C.，J. Contr. Rel. 41 :99-119(1996)中，作者提及阴离子(常规的)脂质体、PH敏感性脂质体、免疫脂质体、膜融合脂质体(fusogenicliposome)和阳离子脂质/反义聚集体的用途。类似地已以阳离子脂质体形式全身性地施用siRNA，并且已报导此类核酸-脂质颗粒在哺乳动物(包括非人灵长类动物)体内提供了改进的祀蛋白质的下调(Zimmermann等人，Nature 441:111-114(2006))。尽管取得最新的进展，但本领域内仍然存在对适合于常规治疗用途的改进的脂质-治疗性核酸组合物的需要。优选地，此类组合物可以以较高效率封装核酸，具有高药物脂质比率，保护封装的核酸在血清中免受降解和清除，适合于全身性递送，并且提供封装的核酸的细胞内递送。此夕卜，此类脂质-核酸颗粒应当是耐受良好的并且提供足够的治疗指数，以便以有效剂量的核酸进行的患者治疗与对患者的显著毒性和/或风险无关。本发明提供了此类组合物、制备所述组合物的方法以及使用所述组合物将核酸引入细胞的方法，包括用于疾病的治疗。
发明内容
本发明提供了新型阳离子脂质以及包含所述脂质的脂质颗粒。此类脂质颗粒还可包含活性剂并且按照本发明的相关方法用于递送活性剂至细胞。本发明的脂质可包含一种或多种异构形式。此类化合物的所有此类异构形式明确地包括在本发明中。本发明的化合物还可包含可限制键旋转(例如因双键的存在而引起的限制)的键(例如，碳-碳键)或取代基。因此，所有顺式/反式和E/Z异构体明确地包括本发明中。
在一个方面中，本发明提供了包含式I的阳离子脂质的改进的脂质制剂，其中式I为式I 还可被称为 DLin-M-C3-DMA、MC3 或 M-C3。式 I 的每一个，DLin-M-C3_DMA、MC3和M-C3具有上文直接提供的式。脂质制剂通常还包含中性脂质、固醇和PEG或PEG修饰的脂质。在一个方面，改进的脂质制剂还包含靶向脂质(例如，含有GalNAc和/或叶酸的脂质)。在一个方面,本发明提供了通过挤出法或在线混合法(in-line mixing method)进行的改进的脂质制剂的制备。在一个方面，本发明还提供了给动物施用包含基于RNA的构建体的改进的脂质制剂和评估靶基因的表达的方法。在一个方面，本发明中表征的脂质制剂，例如与寡核苷酸例如双链RNA(dsRNA)结合的脂质制剂，可用于在体内或体外改变(例如，减少)肿瘤细胞中靶基因的表达。在某些实施方案中，本发明中表征的脂质制剂可用于改变肿瘤细胞系(包括但不限于HeLa、HCT116、A375、MCF7、B16F10、H印3b、HUH7、IfepG2、Skov3、U87 和 PC3 细胞系)中靶基因的表达。在另一个方面，本发明提供包含本发明的脂质的脂质颗粒。在某些实施方案中，月旨质颗粒还包含中性脂质和能够减少颗粒聚集的脂质。在一个实施方案中，脂质颗粒基本上由⑴至少一种本发明的脂质；(ii)选自DSPC、DPPC、P0PC、D0PE和SM的中性脂质；(iii)固醇，例如胆固醇；和(iv)聚乙二醇-脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，以约20-60%阳离子脂质5-25%中性脂质25-55%固醇0. 5-15% PEG-脂质的摩尔比组成。在一个实施方案中，本发明的脂质是光学纯的。在其它相关实施方案中，本发明包括还包含治疗剂的本发明的脂质颗粒。在一个实施方案中，治疗剂是核酸。在一个实施方案中，该核酸是质粒、免疫刺激性寡核苷酸、单链寡核苷酸例如反义寡核苷酸、antagomir ;双链寡核苷酸例如siRNA、适体或核酶。在另一个实施方案中，本发明包括一种包含本发明的脂质颗粒和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂的药物组合物。
在其他相关实施方案中，本发明还包括调节靶基因在细胞中的表达的方法，所述方法包括给细胞提供本发明的脂质颗粒或药物组合物。靶基因可以是野生型基因。在另一个实施方案中，靶基因包含一个或多个突变。在具体的实施方案中，该方法包括特异性调节含有一个或多个突变的靶基因的表达。在具体的实施方案中，脂质颗粒包含选自免疫刺激性寡核苷酸、单链寡核苷酸例如反义寡核苷酸，antagomir ;双链寡核苷酸例如siRNA、适体、核酶的治疗剂。在一个实施方案中，核酸是编码siRNA、反义寡核苷酸、适体或核酶的质粒。 在本发明的一个方面，靶基因选自因子VII、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA、TTR、RSV、PDGF^基因、Erb-B基因、Src基因、CRK基因、GRB2基因、RAS基因、MEKK基因、JNK基因、RAF基因、Erkl/2基因、PCNA(p21)基因、MYB基因、JUN基因、FOS基因、BCL-2基因、细胞周期蛋白D基因、VEGF基因、EGFR基因、细胞周期蛋白A基因、细胞周期蛋白E基因、WNT-I基因、3 -连环蛋白基因、c-MET基因、PKC基因、NFKB基因、STAT3基因、存活素基因、Her2/Neu基因、拓扑异构酶I基因、拓扑异构酶II a基因、p73基因、p21(WAFl/CIPl)基因、p27 (KIPl)基因、PPMlD基因、RAS基因、小窝蛋白I基因、MIB I基因、MTAI基因、M68基因、SORTl基因、XBPl基因、肿瘤抑制基因的突变、p53肿瘤抑制基因及其组合。在另一个实施方案中，核酸是编码多肽或其功能变体或片段的质粒，这样，多肽或其功能变体或片段的表达得以增加。在另一个相关实施方案中，本发明包括治疗以受治疗者体内多肽的过表达为特征的疾病或失调的方法，包括给受治疗者提供本发明的脂质颗粒或药物组合物，其中治疗剂选自siRNA、微RNA、反义寡核苷酸和能够表达siRNA、微RNA或反义寡核苷酸的质粒，并且其中siRNA、微RNA或反义RNA包含特异性结合编码多肽的多核苷酸或其补体的多核苷酸。在另一个相关实施方案中，本发明包括治疗以受治疗者体内多肽的表达不足为特征的疾病或失调的方法，包括给受治疗者提供本发明的药物组合物，其中所述治疗剂是编码多肽或其功能变体或片段的质粒。在其他实施方案中，本发明提供了诱导受治疗者体内免疫应答的方法，包括给受治疗者提供本发明的药物组合物，其中治疗剂为免疫刺激性寡核苷酸。在具体的实施方案中，将药物组合物与疫苗或抗原组合在一起提供给患者。在相关实施方案中，本发明包括疫苗，该疫苗包含本发明的脂质颗粒和与疾病或病原体相关的抗原。在一个实施方案中，脂质颗粒包含免疫刺激性核酸或寡核苷酸。在具体的实施方案中，抗原是肿瘤抗原。在另一个实施方案中，抗原是病毒抗原、细菌抗原或寄生虫抗原。本发明还包括制备本发明的脂质颗粒和药物组合物的方法及用于制备此类脂质颗粒和药物组合物的试剂盒。在另一个方面，本发明提供了评估包含试剂(例如治疗剂或诊断剂)和本发明的脂质的组合物的方法。
图I为描绘小鼠模型中包含DLin-M-C3_DMA的脂质制剂对FVII的沉默的影响的条形图。
图2为描绘对于多种脂质组合物，MC3在大鼠体内的剂量反应的条形图。图3为显示包含MC3的制剂的功效的ApoE依赖性的条形图。野生型但非ApoE基因敲除小鼠显示出FVII蛋白水平的剂量依赖性降低。图2也描绘了证明MC3脂质体制剂的ApoE依赖性的图和使用MC3的ApoE KO小鼠的沉默的缺乏可通过与ApoE预混合而被有效拯救。图4为显示脂质制剂中MC3的摩尔百分比的变化的效应以及还有中性脂质的变化(例如，利用DSPC、DMPC和DLPC的改变中性脂质)的效应的条形图。图5为显示增加PEG遮蔽减少小鼠中非-GalNAc-介导的沉默的条形图。图6为显示增加PEG遮蔽减少大鼠中非-GalNAc-介导的沉默的条形图。图7为显示具有不同摩尔百分比的MC3并具有和不具有GalNAc的脂质体制剂的功效的条形图。图8为显示GalNAc-靶向脂质体的活性在无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)敲除小鼠中被消除的条形图。图9为百分比残留FVII与实施例17中制备的制剂的剂量(mg/kg)的剂量反应曲线。图10为如实施例18中测定的式I的阳离子脂质的pKa滴定曲线。
具体实施例方式本文中提供了改进的脂质制剂，其可用作例如将试剂例如基于核酸的试剂，例如基于RNA的构建体递送至细胞或受治疗者。本文中还描述了给动物施用包含基于RNA的构建体的改进的脂质制剂，并且在某些实施方案中，评估靶基因的表达的方法。在某些实施方案中，改进的脂质制剂包括靶向脂质(例如，本文中描述的靶向脂质例如含有GalNAc或叶酸的脂质)。MM本发明提供了包含式I的阳离子、中性脂质、固醇和PEG或PEG修饰的脂质的改进的脂质制剂，其中式I为
权利要求
1.式I的阳离子脂质
2.包含如权利要求I所述的阳离子脂质的脂质制剂。
3.如权利要求2所述的脂质制剂，其包含40-65%的式I的阳离子脂质、5-10%的中性脂质、25-40%的固醇和0. 5-10%的PEG或PEG修饰的脂质。
4.如权利要求2所述的脂质制剂，其中，所述中性脂质选自DSPC、DPPC,DMPC, POPC,DOPE 和 SM。
5.如权利要求2所述的脂质制剂，其中，所述固醇是胆固醇。
6.如权利要求2所述的脂质制剂，其中，所述PEG脂质为PEG-C14至PEG-C22、PEG-Cer14至 PEG-C2tl 或 PEG-DSPE。
7.如权利要求2所述的脂质制剂，其中，所述制剂通过在线混合法来制备。
8.如权利要求2所述的脂质制剂，其包含约57.5%的式I的阳离子脂质、约7. 5%的中性脂质、约31. 5%的固醇和约3. 5%的PEG或PEG修饰的脂质。
9.如权利要求8所述的脂质制剂，其中，所述制剂通过挤出法来制备。
10.如权利要求2所述的脂质制剂，其还包含治疗剂。
11.如权利要求10所述的脂质制剂，其中，所述治疗剂包含核酸。
12.如权利要求11所述的脂质制剂，其中，所述核酸选自SiRNA、反义核酸、微RNA、反义微RNA、antagomir、微RNA抑制剂、微RNA激活剂、免疫刺激性核酸或Ul接头。
13.如权利要求12所述的脂质制剂，其中，脂质核酸的比为约3至约15。
14.如权利要求13所述的脂质制剂，其中，脂质核酸的比为约5至约13。
15.如权利要求2所述的脂质制剂，其还包含至少一种载脂蛋白。
16.如权利要求15所述的脂质制剂，其中，所述载脂蛋白是ApoE、其活性多态形式、异构体、变体和突变体以及片段或截短形式。
17.如权利要求2所述的脂质制剂，其还包含靶向脂质。
18.如权利要求17所述的制剂，其中，所述靶向脂质包含N-乙酰基半乳糖胺。
19.如权利要求18所述的制剂，其中，所述N-乙酰基半乳糖胺至少包含单-、双-或三天线型糖单位。
20.如权利要求17所述的制剂，其中，所述靶向脂质以约0.001 %至约5%的摩尔量存在于所述制剂中。
21.如权利要求17所述的制剂，其中，所述靶向脂质是选自式II、式III、式VI和式VII的化合物
22.如权利要求2所述的脂质制剂，其包含约50%的式I的阳离子脂质、约10%的中性脂质、约38. 5%的固醇和约I. 5%的PEG或PEG修饰的脂质。
23.如权利要求2所述的脂质制剂，其包含约50%的式I的阳离子脂质、约10%的中性脂质、约35 %的固醇和约5 %的PEG或PEG修饰的脂质。
24.如权利要求2所述的脂质制剂，其包含约57.2%的式I的阳离子脂质、约7. 1%的中性脂质、约34. 3%的固醇和约I. 4%的PEG或PEG修饰的脂质。
25.一种将治疗剂递送至细胞的方法，包括给受治疗者施用如权利要求10所述的脂质制剂。
26.如权利要求25所述的方法，其中，所述治疗剂是dsRNA。
27.如权利要求26所述的方法，其中，靶基因是因子VII。
28.如权利要求26所述的方法，其还包括将靶基因的表达与预选的参照值相比较。
29.如权利要求26所述的方法，其中，所述治疗剂是反义、siRNA、核酶或微RNA。
30.一种调节靶基因在细胞中的表达的方法，所述方法包括给细胞提供如权利要求10所述的脂质制剂。
全文摘要
本发明表征式(I)的阳离子脂质、包含式I的阳离子脂质的改进的脂质制剂和相应的使用方法，其中式I为还公开了靶向脂质和包含此类靶向脂质的特定脂质制剂。
文档编号A61K31/20GK102625696SQ201080026228
公开日2012年8月1日 申请日期2010年6月10日 优先权日2009年6月10日
发明者卡兰特赫塔西尔·G·拉吉夫, 史蒂芬·安塞尔, 埃金·安金科, 威廉·坎特里, 杰雅帕卡什·K·娜瑞安纳尔, 秦晓君, 穆图萨米·贾亚拉曼, 穆希亚·曼努哈兰, 约瑟夫·R·多尔金, 陈建新 申请人:阿尔尼拉姆医药品有限公司