含14型肺炎球菌糖的组合的利记博彩app

专利名称：含14型肺炎球菌糖的组合的利记博彩app
技术领域：
本发明处于联合疫苗领域，特别是含14型肺炎球菌荚膜糖和脂寡糖成分(例如来自脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis))的联合疫苗。背景领域肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)也称为肺炎球菌，是革兰氏阳性球菌。 目前的肺炎球菌疫苗基于荚膜糖。获批的儿童疫苗是(a)PREVNAR ，一种来自4、6B、9V、14、 18C、19F和23F型的的糖结合物的7价混合物，(b) SYNFL0RIX , 一种还包括1、5和7F型的 10价结合混合物，和(c)PREVNAR 13 ，还包括3、6A和19A型的13价结合混合物。还已知其它9、10、11和13价结合组合。脑膜炎奈瑟菌也称为脑膜炎球菌，是革兰氏阴性球菌。目前的脑膜炎疫苗也基于荚膜糖。这些疫苗包括单价C群结合疫苗(MENJUGATE 、MENINGITEC 和NEISVAC-C )和A、 C、W-135及Y群的4价结合混合物(MENACTRA )。目前没有批准抗B群(IenB’)的通用有效疫苗。当前对于制备MenB疫苗的研究工作集中于外膜囊泡(例如MENZB 、HEXAMEN 、 Ν0ΝΑΜΕΝ )或纯化的外膜成分，如脂寡糖和外膜蛋白。近年来，基于外膜囊泡(OMV)的MenB 疫苗受到更多关注。例如，诺华疫苗(Novartis Vaccines)、葛兰素史克(GlaxoSmithKline) 和RIVM/NVI各有基于囊泡的产品。参考文献1公开了用于对肺炎球菌和MenB免疫的组合物，通过联合13价肺炎球菌结合疫苗(‘13评11(，；惠氏(Wyeth)的PREVNAR 13 )与9价MenB外膜囊泡疫苗 (NONAMEN , NVI公司)而形成。仍需要其它和改善的联合疫苗以提供保护抵抗B群脑膜炎球菌和肺炎球菌。发明描述本发明人指出参考文献1所述联合疫苗的问题。13vPnC组分包括14型肺炎球菌荚膜糖(CS14)，MenB组分中的囊泡包括细菌外膜脂寡糖(L0S ；也称为LPQ成分。本发明人认识到LOS (至少L2、L3、L4和L7免疫型脑膜炎球菌)和CS14都具有四糖结构 Gal β l-4GlcNAc β l_3Gal β l_4Glc。此四糖称为乳糖-N-新四糖(LNnT)，也存在于人体特别是乳汁中，且作为乳糖-N-新四糖神经酰胺(也称为副红细胞糖苷脂)的末端部分，后者是ABH和P1血型鞘糖脂及一些神经节苷脂的生物合成前体。尽管LNnT表位通常在人组织体内通过末端唾液酸化作用被掩蔽(也见于MenB，但未见于CS14)，在一些环境下(例如温度降低)该表位成为免疫可达且抗体与表位的结合引起溶血。此可达性导致的自身免疫反应称为冷凝集素病或AIHA (自身免疫性溶血性贫血)。本发明人认识到在MenB LOS和CS14中都存在LNnT结构意味着给予病人这些抗原中的任一个可能导致抗LNnT抗体水平提高。如果共同给予这2种抗原，特别是当所述抗原与疫苗佐剂一起给予，存在激发高水平抗LNnT抗体的风险。因此，含MenB LOS和CS14的组合疫苗，特别是当所述疫苗在冬季给予时，可能存在引起病人AIHA的更高风险。本发明旨在通过限制这些疫苗中LNnT表位的免疫原性效果来降低风险，并提供多种方法使共同给予MenB和肺炎球菌抗原时产生自身反应性抗体的风险最小。第一方面，LOS或CS14之一或两者的LNnT表位被破坏。因此，本发明提供含脑膜炎球菌脂寡糖(L0Q和14型肺炎球菌荚膜糖(CS14)的免疫原性组合物，其中所述LOS和 /或CS14不包括Gal β l-4GlcNAc β l-3Gal β l_4Glc四糖。所述免疫原性组合物通常还包括佐剂。所述表位仅存在于LOS和CS14其中之一时，优选LOS没有该表位。第二方面，LOS和CS14中都保留LNnT表位，但疫苗没有佐剂。因此，本发明提供含脑膜炎球菌脂寡糖(LOS)和14型肺炎球菌荚膜糖(CS14)的无佐剂免疫原性组合物，其中所述LOS和CS14都包括Gal β 1_4G1cNAc0 l_3Gal β l_4Glc四糖。例如，所述LOS可来自L2或L3免疫型脑膜炎球菌(或可包括两者的混合物)。第三方面，LOS和CS14中都保留LNnT表位，但剂量降到较低水平。因此，本发明提供含脑膜炎球菌脂寡糖(L0Q和14型肺炎球菌荚膜糖(CS14)的免疫原性组合物，其中 ⑴所述 LOS 和 CS14 都包括 Gal β l_4GlcNAc β l_3Gal β l_4Glc 四糖，(ii)所述 LOS 浓度低于Syg/ml，且(iii)所述CS14浓度低于Syg/ml。第四方面，通过用含LNnT的LOS抗MenB但用蛋白抗原抗肺炎球菌来制备抗MenB 和14型肺炎球菌的疫苗。因此，本发明提供含脑膜炎球菌脂寡糖(L0Q和肺炎球菌多肽抗原的免疫原性组合物，其中⑴所述LOS包括Gali3 l-4GlcNAci3 l-3Gali3 l-4Glc四糖， ( )所述肺炎球菌多肽可引发抗14型肺炎球菌的有效免疫应答，和(iii)所述组合物不包括14型肺炎球菌荚膜糖。第五方面，通过使用含LNnT的CS14荚膜糖和抗MenB的非LOS抗原来制备抗MenB 和14型肺炎球菌的疫苗。因此，本发明提供含脑膜炎球菌多肽和14型肺炎球菌荚膜糖的免疫原性组合物，其中(i)所述14型肺炎球菌荚膜糖包括Gal β l-4GlcNAc^ l-3Gal β l_4Glc 四糖，(ii)所述脑膜炎球菌多肽可引发抗B群脑膜炎球菌的有效免疫应答，和(iii)所述组合物不包括脑膜炎球菌脂寡糖。在本发明的一些实施方式中，免疫原性组合物包括不超过一种的脑膜炎球菌PorA 亚型，例如它们可不包括PorA外膜蛋白。脑膜炎球菌脂寡糖脑膜炎球菌LOS是在细菌外膜外部单层中发现的基于葡糖胺的磷脂。它包括脂质 A部分和核心寡糖区，脂质A部分作为膜中的疏水锚。寡糖核心内的异质性产生不同脑膜炎球菌菌株间的结构和抗原多样性，其可用于将菌株细分成12种免疫型(Li到L12)。

图1 显示L3免疫型的核心糖。连接Ifep1(庚糖)的α链包含带有唾液酸帽的LNnT四糖。所述相同结构也见于L7和L9免疫型。L2和L4免疫型包括与L3相同的α链，但附于Hepn的 β和/或Y链不同。KDO1残基(2-酮-3-脱氧-辛酮糖酸)附于LOS的脂质A部分且通常也连接于第二个KDO残基(图1中显示为KDO11)。L2和L3 α链包括LNnT四糖。当本发明使用不含LNnT四糖的LOS时，则采用来自不同免疫型(例如，来自L1、L4、L5、L6或L8)的L0S。然而，在一些实施方式中，可能需要保留L2和/或L3表位(除了其LNnT表位)。这可通过使用突变菌株方便地完成，所述菌株经过改造破坏其合成α链内LNnT四糖的能力。已知通过敲除用于相关生物合成加成的酶可实现此目标(例如参见参考文献2-7)。例如，敲除LgtB酶防止LNnT末端半乳糖的加成，以及防止下游α链末端唾液酸的加成。敲除LgtA酶防止LNnT的N-乙酰基-葡糖胺的加成，还防止下游加成。如果讨论的菌株具有IgtC基因(例如，B群脑膜炎球菌MC58菌株，具有L3免疫型，由IgtAUgtB和IgtE组成，无IgtC和IgtD)，LgtA敲除可伴以LgtC敲除。类似地，敲除LgtE和/或(ialE酶防止内部半乳糖的加成，敲除LgtF防止葡萄糖加成到H印1残基。可单独或联合使用任何这些敲除以破坏L2、L3、L4、L7或L9免疫型菌株中的 LNnT四糖。优选敲除至少LgtB，因为这提供了保留有效免疫原性而去除LNnT表位的L0S。除了突变破坏LNnT表位，敲除galE基因还提供有用的经修饰L0S，可类似地敲除脂质A脂肪转移酶基因[8]。可从LOS中移除至少一种主要0连接脂肪酸[9]。也可使用每LOS分子二级酰基链数量减少的LOS [10]。所述LOS通常包括至少GlcNAc-Ifep2磷酸乙醇胺-KDO2-脂质A结构[11]。缺失LNnT四糖时，所述LOS可包括GlcNAc β l_3Gal β l_4Glc 三糖。本发明组合物可包括不同形式的LOS。LOS可使用其自身纯化形式。其可与载体蛋白结合。其可存在于脑膜炎球菌外膜囊泡内。其可结合脑膜炎球菌外膜囊泡。当结合LOS时，可以经LOS的脂质A部分或通过任何其它适当部分例如其KDO残基结合。如果LOS的脂质A部分缺失，则需要这类替代连接。LOS的结合技术可参见例如参考文献9、11、12、13等。这些结合物的优选载体蛋白是细菌毒素，如白喉或破伤风毒素或者其类毒素或突变体。这些常用于结合疫苗。CRM197白喉毒素突变体是有用的[14]。其它适当载体蛋白包括脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白复合体[15]，合成肽[16，17]，热激蛋白[18，19]， 百日咳蛋白[20，21]，细胞因子[22]，淋巴因子[22]，激素[22]，生长因子[22]，含来自不同病原衍生抗原的多种人CD4+T细胞表位的人造蛋白[23]如m9[M]，来自流感嗜血杆菌 (H. influenzae)的蛋白D [25-27]，肺炎球菌溶血素[28]或其无毒衍生物[四]，肺炎球菌表面蛋白PspA [30]，摄铁蛋白[31]，来自艰难梭菌(C. difficile)的毒素A或B [32]，重组铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外蛋白 A(rEPA) [33]等。LOS可存在于囊泡内。这类囊泡包括通过破坏脑膜炎球菌外膜或从中起泡以形成含来自外膜的蛋白成分和LOS的囊泡而获得的任何蛋白脂质体泡。因此，该术语包括 OMV(有时也称为‘疱’)、微泡(MV[34])和‘天然 OMV’ ( iNOMV' [35])。MV和NOMV是天然产生的膜泡，其在细菌生长期间自发形成并释放到培养基中。 可通过在肉汤培养基中培养奈瑟菌(Neisseria)，分离肉汤培养基中的全细胞与更小的 MV(例如，通过过滤或低速离心以仅沉淀细胞而不沉淀更小的囊泡)，然后从消除细胞的培养基中收集MV(例如，通过过滤、通过差速沉淀或MV聚集、通过高速离心以沉淀MV)获得 MV。通常可根据培养中产生的MV量来选择用于生产MV的菌株，例如参考文献36和37描述了高MV产量的奈瑟菌。从细菌中人工制备0MV，可用去污剂处理(例如用脱氧胆酸盐)或通过非去污剂方法(例如参见参考文献38)进行制备。形成OMV的技术包括用胆酸盐去污剂(例如，石胆酸、鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、脱氧胆酸、胆酸、熊胆酸等的盐，优选用脱氧胆酸钠[39和40] 处理奈瑟菌)在高至足以不沉淀去污剂的PH下处理细菌Wl]。其它技术基本可在没有洗涤剂的情况下使用如超声、均化、微流化、空化、渗压震扰、碾磨、弗氏压碎、混合等技术进行 [38]。采用无去污剂或低洗涤剂的方法能保留有用的抗原如NspA[38]。因此，一种方法可使用含约0. 5 %或更低，例如约0. 2 %、约0. 1 %、< 0. 05 %或0浓度脱氧胆酸盐的OMV提取缓冲液。参考文献42描述了一种制备OMV的有用方法，涉及粗OMV的超滤而不是高速离心。所述方法可包括超滤进行后的超离心步骤。本发明所用的囊泡可从任何脑膜炎球菌菌株中制备。所述囊泡通常来自B群菌株，但可从B之外的血清群制备(例如，参考文献41公开了用A群的方法)，如A、C、W135 或Y。所述菌株可以是任何血清型(例如1、加、213、4、14、15、16等)、任何血清亚型和任何免疫型(例如Ll山2山3山3，3，7山10等)。脑膜炎球菌可来自任何适当谱系，包括高侵入性和高毒性谱系，例如以下7种高毒性谱系的任意一种亚组I ；亚组III ；亚组IV-I ；ET-5 复合体；ET-37复合体；A4簇；谱系3。通过多位点酶电泳(MLEE)确定这些谱系，但也用多位点序列分型(MLST)进行脑膜炎球菌分类[参考文献43]，例如，通过MLST，ET-37复合体是ST-ll，ET-5复合体是ST-32 (ET-5)，谱系3是ST-41/44等。可从具有以下亚型之一的菌株中制备囊泡:P1. 2 ；Pl. 2,5 ；Pl. 4 ；Pl. 5 ；Pl. 5,2 ；Pl. 5，c ；PL 5c, 10 ；Pl. 7，16 ；Pl. 7，16b ； PL 7h，4 ；Pl. 9 ；Pl. 15 ；Pl. 9，15 ；Pl. 12，13 ；Pl. 13 ；Pl. 14 ；Pl. 21，16 ；Pl. 22，14。本发明使用的囊泡可从野生型脑膜炎球菌菌株或突变脑膜炎球菌菌株中制备。例如，参考文献44公开了从具有经修饰fur基因的脑膜炎奈瑟菌所得囊泡的制备。参考文献 51教导同时敲除porA和cps会上调nspA表达。参考文献3、51和52公开了用于OMV生产的更多脑膜炎球菌敲除突变体。参考文献45公开了其内fHBP上调的囊泡。参考文献46 公开了从修饰成表达6种不同PorA亚型的菌株中构建囊泡。这些或其它突变体都可用于本发明。因此，在一些实施方式中，本发明使用的菌株可表达超过一种PorA亚型。先前已构建6价和9价PorA菌株。所述菌株可表达2、3、4、5、6、7、8或9种PorA亚型=Pl. 7，16 ； Pl. 5-1,2-2 ；Pl. 19，15-1 ；Pl. 5-2,10 ；Pl. 12-1,13 ；Pl. 7-2,4 ；Pl. 22，14 ；Pl. 7-1,1 和 / 或 Pl. 18-1，3，6。然而，在其它实施方式中，菌株的PorA表达可下调，例如其中PorA的量比野生型水平(例如，相较如参考文献51公开的菌株H44/76)降低至少20% (例如>30%、 彡40%、彡50%、彡60%、彡70%、彡80%、彡90%、彡95%等)，或甚至敲除PorA。有利地，制备自脑膜炎球菌LgtB_ve菌株的囊泡显示改善组合制品中的抗CS14反应。LOS可以来自如参考文献47所述含固定(即无相变量)L0S免疫型的菌株(例如， 遗传改造的脑膜炎球菌菌株)。例如，可固定L2和L3 LOS免疫型。这些菌株的免疫型间转换率比原始野生型菌株减少超过2倍(甚至> 50倍)。参考文献47公开了如何通过IgtA 和/或IgtG基因产物修饰实现此结果。在一些实施方式中，菌株可高表达(与对应野生型菌株相比)某些蛋白。例如，菌株可高表达NspA、蛋白287 W8]、fHBP [45]、TbpA和/或Tbp ^φ 9]、铜、锌超氧化物歧化酶[49]等。在一些实施方式中，菌株可包括参考文献3和50-52所公开的一种或多种敲除和 /或高表达突变。用于下调和/或敲除的有用基因包括(a) Cps、CtrA, CtrB, CtrC、CtrD, FrpB> GalE> HtrB/MsbB、LbpA> LbpB> LpxK> Opa> Opc> PilC、PorB> SiaA> SiaB> SiaC> SiaD>TbpA 和 / 或 TbpB [50] ； (b)CtrA、CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB、LbpA, LbpB, LpxK、Opa、Opc、PhoP、PilC、PmrE、PmrF、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA 和 / 或 TbpB[51] ； (c) ExbB> ExbD> rmpM、CtrA> CtrB> CtrD> GalE> LbpA> LpbB> Opa> Opc> PilC、PorB> SiaA> SiaB> SiaC、SiaD, TbpA 禾Π / 或 TbpB[52]；禾口 (d)CtrA、CtrB, CtrD, FrpB, OpA、OpC, PilC、PorB, SiaD, SynA, SynB 和 / 或 SynC[3]。当使用突变菌株时，在一些实施方式中所述菌株可任选除了 LNnT破坏突变之外具有一种或多种或所有以下特征⑴上调TbpA ； (ii)上调NhhA ； (iii)上调0mp85 ； (iv) 上调LbpA ； (ν)上调NspA ； (vi)敲除PorA ； (vii)下调或敲除FrpB ； (viii)下调或敲除Opa ； (ix)下调或敲除Opc ； (χ)缺失cps基因复合体。有利地，可处理囊泡中的LOS以连接囊泡中的LOS和蛋白成分(“泡内”结合[3])。LOS可以在结合其庚糖II残基的GlcNac残基上0_乙酰化，例如用于L3[53]。免疫原性组合物可包括超过一种L0S，例如来自脑膜炎球菌免疫型L2和L3的 LOS0例如，可使用参考文献M所述的LOS组合。在一些实施方式中，LOS以低于5μ g/ml存在于组合物中，例如彡4μ g/ml、 彡3μ g/ml、彡2 μ g/ml、彡1 μ g/ml。当CS14保留LNnT表位时，可用此低浓度。LOS抗原优选在给予对象后引发细菌抗脑膜炎球菌抗体。14型肺炎球菌荚膜糖本发明的组合物包括14型肺炎球菌荚膜糖(CS14)。参考文献55报道CS14包括图2所示的重复结构。本发明使用的CS14糖通常包括野生型重复单元，但在一些实施方式中可修饰成不含Gal β l-4GlcNAc β l-3Gal β l_4Glc四糖。通过敲除一种或多种相关生物合成酶或通过化学和/或酶处理糖以修饰四糖内四个残基中的一个或多个，可完成此修饰。例如，纯化自溶角质噬纤维菌(Cytophaga keratolytica)培养上清液的内切β _半乳糖苷酶催化水解敏感多糖的半乳糖β (1 — 4)葡萄糖键，所述敏感多糖包括CS14 [55]。CS14可N-乙酰化。例如，如参考文献56所述，CS14可以超过50%、60%、70%、 80%或90% N-乙酰化。CS14通常作为缀合物包含在组合物中。上文描述了这类缀合物的适当载体蛋白， 例如细菌毒素，如白喉或破伤风毒素或者其类毒素或变体例如CRM197，脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白复合体，合成肽，热激蛋白，百日咳蛋白，细胞因子，淋巴因子，激素，生长因子，含多种来自不同病原衍生抗原的人CD4+T细胞表位的人造蛋白如W9、来自流感嗜血杆菌的蛋白D、 肺炎球菌溶血素或其无毒衍生物，肺炎球菌表面蛋白PspA、摄铁蛋白、来自艰难梭菌的毒素 A或B、rEPA等。特别有用于CS 14的载体蛋白是CRM197、破伤风类毒素、白喉类毒素和流感嗜血杆菌蛋白D。如PREVNAR 中所见，CRM197很有用。载体分子可直接或经接头与CS14共价结合。已知多种接头如己二酸接头，其形成可通过偶联游离NH2基(例如通过胺化引入糖)与己二酸(例如，利用二酰亚胺活化)，然后偶联蛋白与所得糖-己二酸中间体[57，58]。另一种优选连接是羰基接头，其形成可通过修饰糖的游离羟基与CDI [59，60]反应，然后与蛋白反应以形成氨基甲酸盐连接。其它接头包括β-丙酰胺基[61]、硝基苯乙胺[62]、卤代酰基卤化物[63]、糖苷键[64]、6_氨基己酸[65]、Ν-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP) [66]、己二酸二酰胼ADH [67]、C4-C12部分W8]等。也可使用碳二亚胺缩合W9]。可经还原性胺化结合CS14。首先用过碘酸盐氧化糖以引入醛基，其随后能通过还原性胺化反应与载体蛋白如赖氨酸的ε_氨基形成直接共价连接。如果每分子糖包括多个醛基，则此连接技术可产生交联产物，其中多种醛与多个载体氨基反应。CS14糖可包括制备自肺炎球菌的全长完整糖，和/或可包括全长糖的片段，即所述糖可比细菌中所见天然荚膜糖短。因此，可解聚所述糖，解聚在糖纯化期间或在糖纯化后但在结合前进行。使用解聚以提供免疫原性的最优链长度和/或为糖的物理可控性缩短链长度。如I^revnar 中所见，优选完整CS14。在一些实施方式中，CS14以低于5yg/ml存在于组合物中，例如彡4 μ g/ml， 彡3 μ g/ml，彡2 μ g/ml，彡1 μ g/ml。当LOS保留LNnT表位时，此低浓度有用。浓度约4 μ g/ ml较为方便。CS14抗原优选引发结合CS14的抗荚膜抗体，例如引起彡0. 20 μ g/mL的抗CS14抗体水平[70]。可通过酶免疫测定(EIA)和/或调理吞噬活性(OPA)测量来评估抗体。EIA 方法已充分确认且抗体浓度与疫苗功效间存在关联。替代的脑膜炎球菌抗原在本发明的一些实施方式中，组合物包括含LNnT的CS14荚膜糖和抗MenB的非 LOS 抗原。LOS 替代物包括多肽抗原，如 fHBPJ87、NadA、NspA、HmbR、NhhA、App 和 / 或 0mp85。 这些抗原以纯化多肽如重组多肽有效存在。脑膜炎球菌抗原优选在给予对象后引起细菌抗脑膜炎球菌抗体。fHBP(H因子结合蛋白)本发明的组合物可包括fHBP抗原。已详细鉴定fHBP抗原。该抗原也称为 ‘741，[参考文献 81 中的 SEQ ID 25；35 与 2536]、‘NMB1870，、‘GNA1870，[参考文献 71-73]、 ‘P2086，、‘LP2086，或‘0RF2086，[74-76]。该抗原是天然的脂蛋白且在所有脑膜炎球菌血清组中表达。fHbp的C末端免疫显性结构域(‘fHbpC’)的结构已由NMR[77]确定。该蛋白部分形成八链β桶，其链通过可变长度环连接。所述桶之前是短的α螺旋和挠性N末端尾。fHBP抗原分成3种不同变体[78]且发现抗给定家族的血清在同一家族内具有杀菌性，但对表达另外两个家族之一的菌株没有活性，即有族内交叉保护，但无族间交叉保护。本发明可使用单一 fHBP变体，但优选包括来自2种或3种变体的fHBP。本发明使用单一 fHBP变体时，组合物可包括多肽，所述多肽含有(a)与SEQ ID NO 1有至少序列同一性的氨基酸序列和/或包含的氨基酸序列由SEQ ID NO=I的至少χ个连续氨基酸的片段组成；或(b)与SEQ ID NO :2有至少序列同一性的氨基酸序列和/或包含的氨基酸序列由SEQ ID NO 2的至少y个连续氨基酸的片段组成；或(c)与 SEQ ID NO 3有至少c%序列同一性的氨基酸序列和/或包含的氨基酸序列由SEQ ID NO 3的至少ζ个连续氨基酸的片段组成。本发明使用来自2种或3种变体的fHBP时，组合物可包括2种或3种不同fHBP 的组合，所述fHBP选自(a)第一多肽，所含氨基酸序列与SEQ ID NO 1有至少序列同一性和/或所含氨基酸序列由SEQ ID NO 1的至少χ个连续氨基酸的片段组成；(b)第二多肽，所含氨基酸序列与SEQ ID NO :2有至少序列同一性和/或所含氨基酸序列由SEQID NO 2的至少y个连续氨基酸的片段组成；和/或(c)第三多肽，所含氨基酸序列与SEQ ID NO 3有至少c%序列同一性和/或包含的氨基酸序列由SEQ ID NO 3的至少ζ个连续氨基酸的片段组成。所述第一、第二和第三多肽具有不同的氨基酸序列。本发明使用来自2种变体的fHBP时，组合物可同时包括(a)第一多肽，所含氨基酸序列与SEQ ID NO :1有至少序列同一性和/或所含氨基酸序列由SEQ ID NO 1的至少χ个连续氨基酸的片段组成；和(b)第二多肽，所含氨基酸序列与SEQ ID N0:2有至少
序列同一性和/或所含氨基酸序列由SEQ ID NO :2的至少y个连续氨基酸的片段组成。 所述第一和第二种多肽具有不同的氨基酸序列。本发明使用来自2种变体的fHBP时，组合物可同时包括(a)第一多肽，所含氨基酸序列与SEQ ID NO :1有至少序列同一性和/或所含氨基酸序列由SEQ ID NO 1的至少χ个连续氨基酸的片段组成；和(b)第二多肽，所含氨基酸序列与SEQ ID N0:3有至少
序列同一性和/或所含氨基酸序列由SEQ ID NO :3的至少ζ个连续氨基酸的片段组成。 所述第一和第二种多肽具有不同的氨基酸序列。a 值为至少 85，例如 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99. 5 或更高。b 值为至少 85，例如 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99. 5 或更高。c 值为至少 85，例如 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99. 5 或更高。a、b 和 c
的值彼此不内在相关。χ 值为至少 7，例如 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。 y 值为至少 7，例如 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。ζ 值为至少 7，8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、 60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。x、y 和 ζ 的值彼此不内在相关。SEQ ID NO :1、2或3的片段优选包括相关SEQ ID的表位。有用的组合物可包括所含氨基酸序列与SEQ ID NO :3有至少90% (如至少93%) 序列同一性和/或所含氨基酸序列由SEQ ID NO 3的至少40个连续氨基酸的片段组成。在一些实施方式中，fHBP多肽在例如N末端半胱氨酸脂化，通常形成三棕榈酰-S-甘油酰-半胱氨酸。在其它实施方式中，fHBP未脂化。给予fHBP优选引发能结合由氨基酸序列SEQ ID NO :1、2或3组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。本发明使用的优选fHBP抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。存在一种或多种fHBP多肽时，fHBP总剂量可以在60 μ g/剂量-200 μ g/剂量之间。287本发明的组合物可包括287抗原。所述287抗原作为基因NMB2132 (GenBank登录号GI =7227388 ；本文的SEQ ID NO 9)包含在B群脑膜炎球菌菌株MC58的公开基因组序列中[79]。此后已公开许多菌株的287抗原序列。例如，287的等位基因形式可参见参考文献80的图5和15、参考文献81的实施例13和图21 (其中的SEQ ID 3179到3184)。还报道了 287抗原的不同免疫原性片段。本发明使用的优选287抗原包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 9的同一性为50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和/或(b)含有SEQ ID NO :9的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是 7 或更高(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、 70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包含SEQ ID NO :9的表位。本发明最有用的287抗原可在给予对象后引发能结合由氨基酸序列SEQ ID NO 9 组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。本发明使用的优选287抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。NadA (奈瑟菌粘附素A)本发明的组合物可包括NadA抗原。所述NadA抗原作为基因NMB 1994 (GenBank 登录号GI =7227256 ；本文的SEQ ID NO 10)包含在B群脑膜炎球菌菌株MC58的公开基因组序列中[79]。此后已公开许多菌株的NadA抗原序列，已充分证明该蛋白作为奈瑟菌粘附素的活性。还报道了 NadA的不同免疫原性片段。本发明使用的优选NadA抗原包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 10的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID NO :10 的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、 60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。(b)的优选片段包含 SEQ ID NO 10 的表位。本发明最有用的NadA抗原可在给予对象后引发能结合由氨基酸序列SEQ ID NO 10组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。本发明使用的优选NadA抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。SEQ ID NO 6就是一个这类片段。NspA (奈瑟菌表面蛋白A)本发明的组合物可包括NspA抗原。所述NspA抗原作为基因NMB 0663 (GenBank 登录号GI =7225888 ；本文的SEQ ID NO 11)包含在B群脑膜炎球菌菌株MC58的公开基因组序列中[79]。先前已从参考文献82与83中了解该抗原。此后已公开许多菌株的NspA 抗原序列。还报道了 NspA的不同免疫原性片段。本发明使用的优选NspA抗原包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 11的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID NO :11 的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、 60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。(b)的优选片段包含 SEQ ID NO :11 的表位。本发明最有用的NspA抗原可在给予对象后引发能结合由氨基酸序列SEQ ID NO 11组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。本发明使用的优选NspA抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。HmbR本发明的组合物可包括脑膜炎球菌HmbR抗原。全长HmbR序列作为基因NMB 1668(本文中SEQ ID NO 7)包含在B群脑膜炎球菌菌株MC58的公开基因组序列中[79]。 参考文献84报道了来自另一菌株的HmbR抗原(本文的SEQ ID NO :8)。SEQ ID NO :7和8 长度差1个氨基酸且具有94. 2%同一性。本发明可使用含全长HmbR序列的多肽，但常用含部分HmbR序列的多肽。因此，在一些实施方式中，根据本发明使用的HmbR序列可包括与SEQ ID NO :7有至少i %序列同一性的氨基酸序列，其中i值是50、60、70、80、90、95、99或更高。在其它实施方式中，根据本发明使用的HmbR序列可包括SEQ ID NO :7的至少j个连续氨基酸的片段，其中j值是7、8、 10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高。在其它实施方式中，根据本发明使用的HmbR序列可包括的氨基酸序列(i)与SEQ ID N0:7有至少序列同一性和/或(ii)含有SEQ ID NO 7的至少j个连续氨基酸的片段。j个氨基酸的优选片段包括SEQ ID NO 7的表位。这些表位通常包含位于HmbR表面的氨基酸。有用的表位包括具有参与HmbR与血红蛋白结合的氨基酸的表位，因为结合这些表位的抗体能阻断细菌结合宿主血红蛋白的能力。参考文献85研究了 HmbR的拓扑结构和其关键功能残基。本发明最有用的HmbR抗原可在给予对象后引发能结合由氨基酸序列SEQ ID NO 7组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。本发明使用的优选HmbR抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。与参考文献31不同，本发明的HmbR抗原通常不结合荚膜糖抗原。NhhA(开口奈瑟菌(Neisseria hia)同源物)本发明的组合物可包括NhhA抗原。所述NhhA抗原作为基因NMB0992 (GenBank登录号GI =7226232 ；本文的SEQ ID NO :12)包含在B群脑膜炎球菌菌株MC58的公开基因组序列中[79]。此后已公开许多菌株的NspA抗原序列，例如参考文献后80与86，已报道NspA 的不同免疫原性片段。NhhA也称为Hsf。本发明使用的优选NhhA抗原包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 12的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID NO :12 的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、 60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。(b)的优选片段包含 SEQ ID NO 12 的表位。本发明最有用的NhhA抗原可在给予对象后引发能结合由氨基酸序列SEQ ID NO 12组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。本发明使用的优选NhhA抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。App (粘着和穿透蛋白)本发明的组合物可包括App抗原。所述App抗原作为基因NMB1985 (GenBank登录号GI =7227246 ；本文的SEQ ID NO 13)包含在B群脑膜炎球菌菌株MC58的公开基因组序列中[79]。此后已公开许多菌株的App抗原序列。还报道了 App的不同免疫原性片段。本发明使用的优选App抗原包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 13的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%、99·5%或更高)；和/或(b)含有SEQIDN0:13的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、 60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。(b)的优选片段包含 SEQ ID NO: 13 的表位。本发明最有用的App抗原可在给予对象后引发能结合由氨基酸序列SEQ ID NO 13组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。本发明使用的优选App抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
0mp85 (85kDa 外膜蛋白)本发明的组合物可包括0mp85抗原。所述0mp85抗原作为基因NMB0182 (GenBank 登录号GI =7225401 ；本文中的SEQ ID NO 14)包含在B群脑膜炎球菌菌株MC58的公开基因组序列中[79]。此后已公开许多菌株的0mp85抗原序列。关于0mp85的进一步信息见参考文献87和88。还报道了 0mp85的不同免疫原性片段。本发明使用的优选0mp85抗原包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 14的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ IDN0:14 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。(b)的优选片段包含 SEQ ID NO 14 的表位。本发明最有用的0mp85抗原可在给予对象后引发能结合由氨基酸序列SEQ ID NO 14组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。本发明使用的优选0mp85抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。替代的肺炎球菌抗原在一些实施方式中，组合物不包括CS14，但疫苗包括含LNnT的LOS提供针对MenB 的保护，包括抗肺炎球菌的蛋白抗原。肺炎球菌多肽可引发抗14型肺炎球菌的有效免疫应答。组合物可包括以下一种或多种(1) spr0057抗原；(2) spr0286抗原；(3) spr0565 抗原；(4) sprl098 抗原；(5) sprl345 抗原；(6) sprl416 抗原；(7) sprl418 抗原；(8) spr0867 抗原；(9) sprl431 抗原；(10) sprl739 抗原；(ll)spr2021 抗原；(12) spr0096 抗原；(13) sprl433 抗原；和 / 或(14) sprl707 抗原。组合物可包括以下一种或多种⑴I^spA多肽；(2)I^saA多肽；(3)I^pC多肽；(4) LytA 多肽；(5) PhtA 多肽；(6) PhtA 多肽；(7) PhtA 多肽；和 / 或(8) PhtD 多肽。组合物可包括肺炎球菌菌毛亚基，如RrgA、RrgB和/或RrgC。所述肺炎球菌多肽在给予对象后可优选弓I发保护抗体。spr0057原始的'spr0057 ‘序列在参考文献89中标注为'β _N_乙酰-己糖胺酶前体'(见GI :15902101)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO 18给出R6菌株中发现的全长 spr0057的氨基酸序列。本发明使用的优选spr0057多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 18的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ IDN0:18 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 spr0057 蛋白包括 SEQ ID NO 18 的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:18的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:18C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO :18的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。SEQ ID NO :32是一个合适片段，其缺少天然前导肽和分选酶识别序列。
spr0286原始的'spr0286'序列在参考文献89中标注为'透明质酸裂解酶前体'(见 GI :15902330)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO 19给出R6菌株中发现的全长spr(^86
的氨基酸序列。本发明使用的优选spr0286多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 19的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ IDN0:19 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 spr0286 蛋白包括 SEQ ID NO 19 的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:19的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:19C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 19的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。SEQ ID NO 33是一个合适片段，其缺少天然前导肽和分选酶识别序列。其它合适片段是SEQ ID N0:34和35。spr0565原始的'spr0565'序列在参考文献89中标注为'β-半乳糖苷酶前体'(见 GI :15902609)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO :20给出R6菌株中发现的全长spr0565
的氨基酸序列。本发明使用的优选spr0565多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO :20的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID N0:20 的至少'η' 个连续氨基酸片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、 60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 spr0565 蛋白包括 SEQ ID NO 20 的变体。 (b)的优选片段包含SEQ ID N0:20的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:20C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO: 20的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。SEQ ID N0:36是一个合适片段，其缺少天然前导肽和分选酶识别序列。其它合适片段是SEQ ID N0:37和38。spr0565的一个变体形式是本文的SEQ ID NO :39。参考文献90报道了使用此变体形式用于免疫(其中的SEQ ID而178)。有用的印1~0565多肽可包含的氨基酸序列(￡1) 与 SEQ ID NO :39 的同一性为 50%或更高(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID N0:39的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、 16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些多肽包括 SEQ ID N0:39的变体。(b)的优选片段包括SEQ ID NO 39的表位。其它优选片段缺失SEQ ID NO :39C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和 /或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO :39的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。参考文献90的表1鉴定了 SEQ ID NO 39的免疫原性片段。
由于spr0565天然是长多肽(> 2000个氨基酸)，表达片段更为容易。因此，本发明使用的spr0565适当形式可以长度小于1500个氨基酸(例如< 1400，< 1300，< 1200， < 1100 等)。这种 spr0565 短形式包括 ‘SprO565A' (SEQID NO 37)和 ‘SprO565B' (SEQ ID NO 38)。spr!098原始的'sprl098'序列在参考文献89中标注为‘分选酶'(见GI 15903141)。 出于参比目的，本文以SEQ ID NO 21给出R6菌株中发现的全长sprl098的氨基酸序列。本发明使用的优选sprl098多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 21的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ IDN0:21 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 sprl098 蛋白包括 SEQ ID NO :21 的变体。(b)的优选片段包括来自SEQ ID N0:21的表位。其它优选片段缺失SEQ ID NO :21C 末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N 末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 21的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。SEQ ID NO 40是一个合适片段，其缺少天然前导肽序列。spr!345原始的'sprl345 ‘序列在参考文献89中标注为'假拟蛋白'(见GI 15903388)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO 22给出R6菌株中发现的全长spr 1345的氨
基酸序列。本发明使用的优选spr 1345多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO :22的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID N0:22 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 sprl345 蛋白包括 SEQ ID NO :22 的变体。(b)的优选片段包括SEQ ID N0:22的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:22C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 22的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。SEQ ID NO 41是一个合适片段，其缺少天然前导肽和分选酶识别序列。spr!416原始的'sprl416 ‘序列在参考文献89中标注为'假拟蛋白'(见GI 15903459)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO :23给出R6菌株中发现的全长sprl416的氨
基酸序列。本发明使用的优选sprl416多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 23的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID N0:23 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 sprl416 蛋白包括 SEQ ID NO :23 的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:23的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:23C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 23的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。spr!418原始的'sprl418 ‘序列在参考文献89中标注为'假拟蛋白'(见GI 15903461)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO : 给出R6菌株中发现的全长sprl418的氨
基酸序列。本发明使用的优选sprl418多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 24的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID N0:24 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 sprl418 蛋白包括 SEQ ID NO 24 的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:24的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:24C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 24的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。spr0867原始的'spr0867 ‘序列在参考文献89中标注为'内切β_Ν_乙酰葡糖胺酶'(见GI :15902911)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO :25给出R6菌株中发现的全长 spr0867的氨基酸序列。本发明使用的优选spr0867多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO :25的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID N0:25 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 spr0867 蛋白包括 SEQ ID NO :25 的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:25的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:25C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 25的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。SEQ ID NO :42是一个合适片段，其缺少天然前导肽序列。spr!431原始的'sprl431 ‘序列在参考文献89中标注为'1，4_β _N_乙酰胞壁质酶'(见GI :15903474)。它也称为‘LytC，，其免疫用途报道于参考文献104。出于参比目的，本文以SEQ ID NO 26给出R6菌株中发现的全长sprl431的氨基酸序列。本发明使用的优选sprl431多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 26的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID N0:26 的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 sprl431 蛋白包括 SEQ ID NO 26 的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:26的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:26C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 26的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。SEQ ID NO :43是一个合适片段，其缺少天然前导肽序列。spr!739丨sprl739'多肽是肺炎球菌溶血素(例如，见GI:15903781)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO :27给出R6菌株中发现的全长sprl739的氨基酸序列。本发明使用的优选sprl739多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO :27的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID N0:27 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 sprl739 蛋白包括 SEQ ID NO :27 的变体。(b)的优选片段包括SEQ ID N0:27的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:27C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 27的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。本领域已知免疫用途的肺炎球菌溶血素突变形式[四，91-96]，本发明可使用这些突变形式。通过C末端截短(例如参见参考文献97)如缺失34个氨基酸、45个氨基酸、7 个氨基酸[98]等实现脱毒。根据SEQ ID N0:27编号，其它突变包括ftx)325 —Leu (例如 SEQ ID NO 44)和/或Trp433 — Phe (例如SEQ ID NO 45)。这些突变可与C末端截短联用，例如联用Pro325 — Leu突变与7聚体截短(例如SEQ ID NO 46)。spr2021原始的'spr2021'序列在参考文献89中标注为'通用应激蛋白GSP-781 ‘(见 GI :15904062)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO J8给出R6菌株中发现的全长spr2021
的氨基酸序列。本发明使用的优选spr2021多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO :28的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID N0:28 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 spr2021 蛋白包括 SEQ ID NO 28 的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:28的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:28C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 28的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。SEQ ID NO :47是一个合适片段，其缺少天然前导肽序列。参考文献90将spr2021标注为与(ΛρΒ同源的分泌45kDa蛋白并公开其作为免疫原的用途(其中的SEQ ID NO :243 ;SP2216)。参考文献90的表1(第73页)指出了 spr2021 的免疫原性片段。spr2021的另一有用片段是参考文献99的SEQ ID N0:1(本文中SEQ ID NO 28的28-278位氨基酸)。spr0096原始的'spr0096 ‘序列在参考文献89中标注为'假拟蛋白'(见GI 15902140)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO : 给出R6菌株中发现的全长spr0096氨基
酸序列。本发明使用的优选spr0096多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO : 的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID N0:29 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 spr0096 蛋白包括 SEQ ID NO 29 的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:29的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:29C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 29的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。本文中SEQ ID NO 48是spr0096的一个变体形式，在其相对SEQ ID NO 29的C 末端附近有插入。参考文献90报道了此变体的免疫用途(其文献中的SEQ ID NO 150), 所述变体标注为LysM结构域蛋白。因此，本发明使用的spr0096包含的氨基酸序列(a) 与 SEQ ID NO :48 的同一性为 50%或更高(例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID N0:48的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、 16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些多肽包括 SEQ ID N0:48的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID NO 48的表位。其它优选片段缺失SEQ ID NO :48C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和 /或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO :48的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。参考文献90 的表1指出了 SEQ ID NO 48的免疫原性片段。spr0096多肽可以二聚体如同源二聚体的形式使用。spr!433原始的'sprl433 ‘序列在参考文献89中标注为'假拟蛋白'(见GI 15903476)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO :30给出R6菌株中发现的全长sprl433的氨
基酸序列。本发明使用的优选sprl433多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 30的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID N0:30 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 sprl433 蛋白包括 SEQ ID NO 30 的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:30的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:30C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 30的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。spr!707原始的'sprl707'序列在参考文献89中标注为'ABC转运蛋白底物结合蛋白-寡肽转运'(见GI :15903749)。出于参比目的，本文以SEQ ID NO :31给出R6菌株中发现的全长sprl707的氨基酸序列。本发明使用的优选sprl707多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO :31的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ IDN0:31 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 sprl707 蛋白包括 SEQ ID NO :31 的变体(例如SEQ ID NO 100 ；见下文)。(b)的优选片段包含SEQ ID NO 31的表位。其它优选片段缺失SEQ ID NO :31C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、 20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、 20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO :31的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。本文中SEQ ID NO :49是sprl707的一个变体形式，与SEQ ID NO :31差4个氨基酸。参考文献90报道了 SEQ ID NO 49的免疫用途(此文献中的SEQ ID NO :220)。因此，本发明使用的sprl707多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 49的同一性为50% 或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%, 97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和/或(b)含有SEQ ID N0:49的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是 7 或更高(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、 80、90、100、150、200、250或更高)。这些多肽包括SEQ ID NO :49的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:49的表位。其它优选片段缺失SEQ ID NO :49C末端的一个或多个氨基酸 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸 (例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25 个或更多)，而保留 SEQ ID NO :49 的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。参考文献90的表1指出了 SEQ ID NO 49的免疫原性片段。PspAI^spA是肺炎球菌表面蛋白A。出于参比目的，本文的SEQ ID NO :50是全长I^spA 的氨基酸序列。在R6基因组中，PspA是spr0121[89]。本发明使用的优选I^spA多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 50的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID NO :50 的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、 60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 I3SpA 蛋白包括 SEQ ID NO 50 的变体。(b) 的优选片段包含SEQ ID N0:50的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:50C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 50的
至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。参考文献100报道了 I^spA的免疫用途。它可有利地与I3SpC联合给予。PsaAI^saA是肺炎球菌表面粘附素。出于参比目的，本文的SEQ ID NO :51是全长I^saA 的氨基酸序列。本发明使用的优选I^saA多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 51有50% 或更高的同一性(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ IDN0:51 的至少'η' 个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 I3SaA 蛋白包括 SEQ ID NO :51 的变体。 (b)的优选片段包含SEQ ID N0:51的表位。其它优选片段缺失SEQID N0:51C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 51 的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。一个有用的I3SaA片段是参考文献99中的SEQ ID NO :3(与本文SEQ ID NO :51的21-519位氨基酸对应)。参考文献101报道了 I^saA的免疫用途。I^saA可与I^spA和/或I^spC联用。PspCI^spC是肺炎球菌表面蛋白C [102]且也称为胆碱结合蛋白A(CbpA)。参考文献103 和104报道了 I^spC的免疫用途。其在R6菌株中是sprl995，且作为参比，本文的SEQ ID NO 52是全长sprl995的氨基酸序列。本发明使用的优选I^spC多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 52的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和/或(b)含有SEQ ID N0:52 的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是 7 或更高(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、 70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 sprl995 蛋白包括 SEQ ID N0:52 的变体(例如SEQ ID而27;见下)。(b)的优选片段包含SEQ ID NO 52的表位。其它优选片段缺失 SEQ ID NO :52C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO :52的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。I^spC的一个变体称为‘Hie’。它类似于I^spC，如参考文献105的图1所示，该文献报道I3SpC结合H因子(fH)。出于参比目的，本文的SEQ ID NO :53是全长Hic的氨基酸序列。Hic蛋白可与I^spC多肽一起使用或替代I^spC多肽用于本发明。本发明使用的优选HiC多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO :53的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%、99·5%或更高)；和/或(b)含有SEQIDN0:53的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、 60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 Hic 蛋白包括 SEQ ID NO :53 的变体。(b) 的优选片段包含SEQ ID NO :53的表位。其它优选片段缺失SEQID NO :53C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 53的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。PspC和/或Hic可有利地与I3SpA和/或I3SaA联用。LytALytA是N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(自溶素)。出于参比目的，本文的SEQ ID NO 54是全长LytA的氨基酸序列。在R6基因组中，LytA是sprl7M[89]。本发明使用的优选LytA多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 54的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID NO :54 的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、 60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 LytA 蛋白包括 SEQ ID NO :54 的变体(例如GI :18568354)。(b)的优选片段包含SEQ ID NO :54的表位。其它优选片段缺失SEQ ID NO :54C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和 /或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO :54的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。参考文献106报道了 LytA的免疫用途，特别是含与异源混杂T辅助细胞表位融合的LytA胆碱结合域的形式的应用。PhtAWitA是肺炎球菌组氨酸三联体蛋白A。出于参比目的，本文的SEQ ID NO: 55是全长WitA前体的氨基酸序列。在R6基因组中，PhtA是sprl061 [89]。本发明使用的优选WitA多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 55的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID NO :55 的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、 60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 PhtA 蛋白包括 SEQ ID NO :55 的变体。(b) 的优选片段包含SEQ ID N0:55的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:55C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 55的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。参考文献107和108报道了 WitA的免疫用途。PhtBPhtB是肺炎球菌组氨酸三联体蛋白B。出于参比目的，本文的SEQ ID NO 56是全长WitB前体的氨基酸序列。残基578的Xaa可以是赖氨酸。本发明使用的优选WitB多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 56的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID NO :56 的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、 60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 PhtB 蛋白包括 SEQ ID NO 56 的变体。(b)的优选片段包含SEQ ID N0:56的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:56C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 56的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。参考文献107、108和109报道了 PhtB的免疫用途。PhtDPhtD是肺炎球菌组氨酸三联体蛋白D。出于参比目的，本文的SEQ ID NO 57是全长WitD前体的氨基酸序列。在R6基因组中，PhtD是spr0907 [89]。本发明使用的优选WitD多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 57的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%、99·5%或更高)；和/或(b)含有SEQIDN0:57的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、 60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 PhtD 蛋白包括 SEQ ID NO :57 的变体。(b) 的优选片段包含SEQ ID NO :57的表位。其它优选片段缺失SEQID NO :57C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 57的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。参考文献107、108和110报道了 PhtD的免疫用途。PhtEPhtE是肺炎球菌组氨酸三联体蛋白E。出于参比目的，本文的SEQ ID NO 58是全长WitE前体的氨基酸序列。在R6基因组中，PhtE是spr0908 [89]。本发明使用的优选WitE多肽包含的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO 58的同一性为 50%或更高(例如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高)；和 / 或(b)含有 SEQ ID NO :58 的至少'η'个连续氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、 60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。这些 PhtE 蛋白包括 SEQ ID NO 58 的变体。(b) 的优选片段包含SEQ ID N0:58的表位。其它优选片段缺失SEQ ID N0:58C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，而保留SEQ ID NO 58的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白结构域。参考文献107和108报道了 WitE的免疫用途。杂合多肽本发明使用替代的脑膜炎球菌或肺炎球菌抗原时，其可作为独立多肽存在于组合物中。然而，使用超过1种这类抗原时，替代抗原不必以单独多肽形式存在。相反，至少2 种(例如2、3、4、5种或更多)抗原可以单一多肽链(‘杂合’多肽)形式表达，如参考文献 111中公开的脑膜炎球菌抗原。杂合多肽提供2个主要优点首先，本身不稳定或表达较差的多肽可通过加入能克服此问题的合适杂合伴侣而得到改善；其次，由于仅需采用一次表达和纯化以生成2种抗原性多肽而简化商业生产。杂合多肽可包括上述2种或更多脑膜炎球菌或肺炎球菌多肽序列。可使用由来自2、3、4、5、6、7、8、9或10种抗原的氨基酸序列组成的杂合体。具体地，优选由来自2、3、4或 5种抗原的氨基酸序列组成的杂合体，如2或3种抗原。杂合多肽可以式NH2-A- {-X-L-} n-B_C00H表示，其中X是上述替代脑膜炎球菌或肺炎球菌抗原的氨基酸序列；L是可选的接头氨基酸序列；A是可选的N末端氨基酸序列；B 是可选的C末端氨基酸序列；11是2或更大的整数(例如2、3、4、5、6等)。通常η是2或3。如果-X-部分具有其野生型形式中的前导肽序列，在杂合蛋白中可包含或缺少此前导肽。在一些实施方式中，缺失除位于杂合蛋白的N末端-X-部分的前导肽以外的前导肽，即保留&的前导肽，但缺少的前导肽。这等同于缺失所有前导肽并使用&的前导肽作为-A-部分。对于{-X-L-}的各个η情况，可以有或没有接头氨基酸序列-L-。例如，当η = 2时， 杂合体可以是 NH2-X1-L1-X2-L2-COOH, NH2-X1-X2-COOH, NH2-X1-L1-X2-COOH, NH2-X1-X2-L2-COOH 等。接头氨基酸序列-L-通常较短(例如20个或更少氨基酸，即20、19、18、17、16、15、14、 13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括促进克隆的短肽序列，聚甘氨酸接头(即包含Glyn，其中η = 2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)，和组氨酸标签(即Hisn，其中η = 3、4、5、 6、7、8、9、10或更多)。其它合适的接头氨基酸序列对于本领域技术人员显而易见。一个有用的接头是 GSGGGG (SEQ ID NO 15)或 GSGSGGGG (SEQ ID NO 16)，从 BamHI 限制性位点形成Gly-Ser 二肽，因而有助于克隆和操作，且(Gly)4四肽是典型的聚甘氨酸接头。其它合适接头，尤其用作最终Ln的接头是Leu-Glu 二肽或SEQ ID NO :59。-A-是可选的N末端氨基酸序列。它通常较短(例如40个或更少氨基酸，即40、39、 38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、 13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指导蛋白运输的前导肽，或者促进克隆或纯化的短肽序列(例如组氨酸标签，即见\，其中11 = 3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。其它适当 N末端氨基酸序列对本领域技术人员显而易见。如果X1缺失其自身N末端甲硫氨酸，-A-优选是提供N末端甲硫氨酸的寡肽(例如有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)如Met-Ala-Ser， 或是单一 Met残基。-B-是可选的C末端氨基酸序列。它通常较短(例如40个或更少氨基酸，即39、 38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、 13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指导蛋白运输的序列，促进克隆或纯化的短肽序列(例如包含组氨酸标签，即Hisn，其中n = 3、4、5、6、7、8、9、10或更多，如SEQ ID NO: 17)，或提高蛋白稳定性的序列。其它适当C末端氨基酸序列对本领域技术人员显而易见。参考文献111和112公开了一种特别有用的脑膜炎球菌多肽抗原组合，因而本发明的组合物可包括以下的1、2、3、4或5种(1) ‘NadA，蛋白；(2) ‘936，蛋白；(3) ‘953， 蛋白；(4) 187’蛋白和(5) fHBP蛋白。例如，组合物可包括(i)具有氨基酸序列SEQ ID NO 4的第一多肽；(ii)具有氨基酸序列SEQ ID NO 5的第二多肽；和(iii)具有氨基酸序列SEQ ID NO 6的第三多肽。佐剂本发明的组合物可包括免疫佐剂。因此，例如，它们可包括铝盐佐剂或水包油乳液 (如水包鲨烯乳液)。也可使用其它佐剂。合适的铝盐包括氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如羟基磷酸盐、正磷酸盐)(例如参见参考文献113的第8与9章)或其混合物。所述盐可采用任何适当形式 (例如凝胶、晶体、无定形等)，通常抗原吸附于盐。给予病人的组合物中Al+++浓度优选低于 5mg/ml，例如彡 4mg/ml、< 3mg/ml、< 2mg/ml、< lmg/ml 等。优选的范围在 0. 3 和 Img/ ml之间。优选最大为0.85mg/剂量。用于CS14和脑膜炎球菌抗原的优选铝盐佐剂是磷酸
O已知不同的水包油乳液佐剂，它们通常包括至少一种油和至少一种表面活性剂， 所述油和表面活性剂可生物降解(可代谢)和生物相容。乳液中的油滴直径一般小于5μπι， 且甚至可具有亚微米直径，通过微流化床获得这些小尺寸以提供稳定乳液。优选尺寸小于 220nm的液滴，因为其可进行过滤除菌。本发明可使用油，如动物(如鱼)或植物来源的油。植物油来源包括坚果、种籽和谷物。花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是最常见的坚果油例子。可使用例如获自霍霍巴豆的霍霍巴油。籽油包括红花籽油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物组，玉米油最易获取，但也可使用其它谷物的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻米、画眉草、黑小麦等。甘油和1， 2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯尽管不天然存在于籽油中，但可从坚果和籽油开始通过水解、 分离和酯化合适物质来制备。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油可代谢，因而可用于实施本发明。本领域熟知从动物源获得纯化油所需的分离、纯化、皂化和其它方法过程。大部分鱼包含易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油如鲸蜡是本文可用的一些鱼油的例子。一些支链油以5-碳异戊二烯单元生化合成且通常称为萜类化合物。鲨鱼肝油包含称为鲨烯的支链不饱和萜类化合物，2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22- 二十四碳六烯)，其在本文中特别优选。鲨烯的饱和类似物鲨烷也是优选的油。鱼油，包括鲨烯和鲨烷，可从商业来源方便地得到，或可通过本领域已知方法获得。其它优选的油是生育酚。可使用油的混合物。组合物包括生育酚时，可使用α、β、Υ、δ、ε或ξ生育酚中的任一种，但优选 α_生育酚。生育酚可采用多种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。D-α-生育酚和DL-α-生育酚都可使用。优选的α -生育酚是 DL-α-生育酚，此生育酚的优选盐是琥珀酸盐。表面活性剂可通过其‘HLB’ (亲水/亲脂平衡)分类。本发明优选表面活性剂的 HLB至少为10，优选至少15且更优选至少16。可与本发明一起使用的表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯去水山梨醇酯(通常称为吐温)，特别是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80 ；以商品名D0WFAX 出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或氧化丁烯的共聚物，，如线性 Ε0/Ρ0嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)基团数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇-9 (曲通Χ-100，或叔辛基苯氧聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧)聚乙氧基乙醇 (IGEPAL CA-630/NP-40;磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如三乙二醇单月桂醚(苄泽30)；和去水山梨糖醇酯(通常称为司盘)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。乳液所含的优选表面活性剂是吐温80(聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)、司盘 85 (去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通Χ-100。可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85的混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的组合也适合。另一种有用的组合包括月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨
醇酯和/或辛苯聚醇。表面活性剂的优选量(重量％ )是聚氧乙烯去水山梨醇酯(如吐温 80)0. 01-1%，特别是约0. ；辛基或壬基苯氧聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污剂)0. 001-0. 1%，特别是0. 005-0. 02% ；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0. 1-20%, 优选0. 1-10%且特定是0. 1-1%或约0. 5%。本发明使用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于 鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。所述乳液的体积组成可以是约5%鲨烯、约0. 5%聚山梨醇酯80和约0. 5%司盘85。按重量计，这些比例是4. 3 %鲨烯、0. 5%聚山梨醇酯80和0.48%司盘85。此佐剂称为‘MF59，[114-116]，详见参考文献113的第10 章和参考文献117的第12章。所述MF59乳液可包括柠檬酸盐离子，例如IOmM柠檬酸钠缓冲液。 鲨烯、生育酚和聚山梨醇酯80 (吐温80)的乳液。所述乳液可包括磷酸盐缓冲盐水。它也可包括司盘85 (例如1%)和/或卵磷脂。这些乳液可具有2-10%鲨烯、2-10%生育酚和0. 3-3%吐温80，鲨烯生育酚的重量比优选为彡1，因为这提供了更稳定的乳液。 鲨烯和吐温80可以约5 2的体积比或约11 5的重量比存在。可通过以下方法制备一种这样的乳液将吐温80溶于PBS以产生2%溶液，然后混合90ml该溶液与(5gDL_ α -生育酚和5ml鲨烯)混合物，随后微流化该混合物。所得乳液可具有亚微米油滴，例如平均直径为100-250nm，优选约180nm。所述乳液也可包括3-脱-0-酰化单磷酰脂质A (3d_MPL)。 此类型另一种有用乳液的每人剂量可包括0. 5-10mg鲨烯、0. 5-1 Img生育酚和0. Hmg聚山梨醇酯80 [118]。 鲨烯、生育酚和曲通去污剂(例如曲通X-100)的乳液。所述乳液也可包括 3d-MPL。所述乳液可包含磷酸盐缓冲液。 含有聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯80)、曲通去污剂(例如曲通X-100)和生育酚(例如琥珀酸α-生育酚)的乳液。所述乳液可包括质量比约75 11 10的这三种成分(例如750 μ g/ml聚山梨醇酯80，110 μ g/ml曲通X-100和100 μ g/ml琥珀酸α -生育酚)，该浓度应包括抗原中这些成分的任何贡献。所述乳液也可包括鲨烯。所述乳液还可包括3d-MPL。所述水相可包含磷酸盐缓冲液。 鲨烯、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆401的乳液(“普流罗尼克 L121”)。所述乳液可在PH 7. 4的磷酸盐缓冲盐水中配制。此乳液是胞壁酰二肽的有用递送载体，且已在 “ SAF-I ”佐剂中与苏氨酰-MDP [119] (0. 05-1% Thr-MDP，5 %鲨烯，2. 5 %普流罗尼克Ll21和 0. 2%聚山梨醇酯80) —起使用。它也能不与Thr-MDP使用，例如用“AF”佐剂[120] (5%鲨烯，1. 25%普流罗尼克L121和0. 2%聚山梨醇酯80)使用。优选微流体化。 含有鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子表面活性剂(例如聚氧乙烯(1 十六十八醚)和疏水性非离子表面活性剂(例如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯， 如去水山梨醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。所述乳液优选热可逆和/或其中至少90% 的油滴(按体积计)尺寸小于200nm[121]。所述乳液也可包括以下一种或多种糖醇；冷冻保护剂(例如糖，如十二烷基麦芽糖苷和/或蔗糖)；和/或烷基多糖苷。这类乳液可冻干。
含0.5-50%油、0. 1-10%磷脂和0.05-5%非离子表面活性剂的乳液。如参考文献122所述，优选的磷脂成分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。 不可代谢油(如轻矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂，吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包括添加剂，如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂偶联物 (如参考文献123所述，通过葡萄糖醛酸的羧基将脂族胺添加到脱酰基皂苷上而生成的 GPI-0100)、二甲基双十八烷基溴化铵和/或N，N-双十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。 含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[124]。 含矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[124]。 皂苷(例如QuilA或QS21)和甾醇(例如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液 [125]ο水包油乳液本身可用作佐剂，或作为其它免疫刺激化合物如免疫刺激寡核苷酸、 3d-MPL等的载体。药物组合物本发明涉及给予病人的药物组合物。这些通常包括药学上可接受的载体。关于药学上可接受载体的充分讨论见参考文献126。有效剂量体积可常规确定，但该组合物的典型人用剂量体积约为0. 5ml，例如用于肌肉内注射。这是PREVNAR 产品、基于RIVM OMV的疫苗和MeNZB 的剂量体积。这些剂量体积通常用于肌肉内注射，但类似剂量可用于其它递送途径，例如基于OMV的鼻内雾化疫苗可具有每次喷雾体积约100 μ 1或约130 μ 1，4次喷雾给药产生约0. 5ml的总剂量。本发明组合物的pH通常为6-8，更优选6. 5-7. 5 (例如约7)。基于RIVM0MV的疫苗的PH是7. 4[127]，本发明的组合物优选pH < 7. 5。基于RIVM0MV的疫苗通过使用IOmM Tris/HCl缓冲液保持pH，本发明组合物可通过使用缓冲剂如Tris缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂或组氨酸缓冲剂保持稳定的PH。因此，本发明的组合物通常包括缓冲剂。所述组合物可以无菌和/或无热原。本发明的组合物可以与人体等张。给予病人的本发明组合物为免疫原性，更优选为疫苗组合物。本发明所述的疫苗可以是预防性(即，用于防止感染)或治疗性(即，用于处理感染)，但通常是预防性。用作疫苗的免疫原性组合物包括免疫有效量的抗原以及其它所需组分。“免疫有效量”指将该量以单剂量或作为系列的一部分给予个体(可有效治疗或预防。该量根据待治疗个体的健康和身体情况、年龄、待治疗个体的分类组(例如非人的灵长类动物、灵长类动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需保护程度、疫苗配方、治疗医师对医疗状况的评估和其它相关因素而变化。预期该量将落入常规试验确定的较宽范围内。本发明组合物的抗原含量通常以蛋白量/剂量的形式表示。基于OMV的鼻内疫苗常用约0. 9mg蛋白/ml的剂量。脑膜炎球菌和肺炎球菌影响身体的不同区域，因此本发明的组合物可以多种液体形式制备。例如，所述组合物可制备成溶液或悬浮液形式的注射剂。可制备所述组合物用于肺部给予，例如通过吸入器，使用细雾。可制备所述组合物用于鼻、耳、眼部给予，例如作为喷雾或滴剂。用于肌肉内给予的注射剂是典型形式。本发明的组合物可包括抗菌剂，特别是以多剂量形式包装时。抗菌剂如硫柳汞和 2-苯氧乙醇常用于疫苗，但优选使用无汞的防腐剂或完全没有防腐剂。本发明的组合物可包括去污剂，例如吐温(聚山梨醇酯)如吐温80。去污剂通常以低水平如< 0.01%存在。本发明的组合物可包括钠盐(例如氯化钠)以产生张力。NaCl浓度通常为 10 士 2mg/ml，例如约 9mg/ml。处理方法本发明也提供了在哺乳动物中引起免疫应答的方法，包括将本发明的组合物给予哺乳动物。所述免疫应答优选提供保护抵御脑膜炎球菌和肺炎球菌(至少针对组合物中表现的脑膜炎球菌免疫型和肺炎球菌血清型，包括14型肺炎球菌)且优选涉及抗体。在已接受初免的患者中该方法可产生加强应答。哺乳动物优选是人。疫苗用于预防性用途时，人优选是儿童(例如幼童或婴儿) 或青少年；疫苗用于治疗性用途时，人优选是成人。用于儿童的疫苗也可给予成人，例如用于评估安全性、剂量、免疫原性等。 本发明也提供本发明组合物用作药物。所述药物优选如上所述用于弓丨起哺乳动物中的免疫应答(即，该药物是免疫原性组合物)且更优选是疫苗。本发明也提供以下成分在引起哺乳动物免疫应答的药物生产中的应用(i)脑膜炎球菌 LOS 和 CS14，其中 LOS 和 / 或 CS14 不包括 Gal β 1_4G1cNAc3 l_3Gal β l_4Glc 四糖；(ii)脑膜炎球菌LOS和CS14，但无佐剂，其中LOS和CS14都包括 Gal β l-4GlcNAc β l_3Gal β l_4Glc四糖；(iii)脑膜炎球菌LOS和肺炎球菌多肽抗原，其中LOS包括Gal β l-4GlcNAc β l-3Gal β l_4Glc四糖且肺炎球菌多肽可引发有效抗14型肺炎球菌的免疫应答；或(iv)脑膜炎球菌多肽和CS14，其中CS14包括 Gal β l-4GlcNAc β l-3Gal β l-4Glc四糖且脑膜炎球菌多肽可引发有效抗B群脑膜炎球菌的免疫应答。这些用途和方法优选用于预防和/或治疗脑膜炎奈瑟菌和/或肺炎链球菌引起的疾病，例如细菌性(或更具体地，脑膜炎球菌和/或肺炎球菌)脑膜炎或败血症。一种检查治疗性处理功效的方法，包括在给予本发明组合物后监测脑膜炎球菌和 /或肺炎球菌感染。一种检查预防性处理功效的方法，包括在给予本发明组合物后监测针对抗原的免疫应答。可通过将本发明的组合物给予测试对象(例如12-16个月大的儿童，或动物模型[1 ])随后确定标准参数包括脑膜炎球菌的血清细菌抗体(SBA)和ELISA效价 (GMT)来确定本发明组合物的免疫原性。通常在给予组合物后约4周测定这些免疫应答，并与给予组合物前测定的值作比较。优选SBA增加至少4倍或8倍。给予超过1剂量的组合物时，可进行大于1次的给予后测定。本发明的组合物通常直接给予病人。通过胃肠外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织间隙)或任何其它适当途径可完成直接递送。本发明可用于引发全身和 /或粘膜免疫。优选肌肉内给予大腿或上臂。注射可以经针头(例如皮下针头)，但可替代使用无针注射。典型的肌肉内剂量是0.5ml。剂量处理可以是单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。初次剂量方案之后可以是加强剂量方案。可常规确定初次剂量间的适当间隔 (例如4-16周之间)以及初次和加强之间的适当间隔。在本发明的一些实施方式中，所述肺炎球菌和脑膜炎球菌抗原可共同或单独给予，即2种抗原可同时、单独或依序给予。然而，通常混合2种抗原以同时联合给予。其它抗原除了含有上述脑膜炎球菌和肺炎球菌抗原，组合物可包括来自更多病原的抗原。 例如，所述组合物可包括以下更多抗原中的一种或多种-来自乙肝病毒的抗原，如表面抗原HBsAg。-来自百日咳鲍特菌(Bordetellapertussis)的抗原，如百日咳全毒素(PT)和来自百日咳鲍特菌的丝状血凝素(FHA)，可选也与百日咳杆菌粘附素和/或凝集原2和3联用。-白喉抗原，如白喉类毒素。-破伤风抗原，如破伤风类毒素。-来自B型流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae B，Hib)的糖抗原，通常是结合的。-灭活的脊髓灰质炎病毒抗原。所述组合物包括白喉抗原时，优选也包括破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，所述组合物包括破伤风抗原时，优选也包括白喉抗原和百日咳抗原。类似地，所述组合物包括百日咳抗原时，优选也包括白喉抗原和破伤风抗原。因此，优选DTP组合。另外，组合物可包括其它脑膜炎球菌或肺炎球菌抗原。例如，除了 CS14抗原，组合物可包括来自一种或多种其它肺炎球菌血清型的荚膜糖。因此，除了 14型，组合物可包括来自以下一种或多种肺炎球菌血清型的荚膜糖1、2、 3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 / 或 33F。 组合物可包括多种血清型，例如总共 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23种或更多血清型。本领域已知7价、9价、10价、11价和13价结合组合物，还有23价未结合组合物。例如，10价组合物可包括来自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F 和23F型的糖。11价组合物还可包括来自3型的糖。12价组合物可在10价混合物中加入 血清型 6A 禾口 19A ；6A 禾口 22F ； 19A 禾口 22F ；6A 禾口 15B ； 19A 禾口 15B 或 22F 禾口 15B。13 价组合物可在11价混合物中加入血清型19A和22F ；8和12F ；8和15B ；8和19A ；8和22F ； 12F和 15B;12F 禾口 19A ;12F 禾口 22F ;15B 禾口 19A ； 15B 禾口 22F ;6A 禾口 19A 等。有用的 13 价组合物包括来自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19、19F和23F的荚膜糖，例如其全部都单独与CRM197结合，如参考文献1四、130和131所述制备。一种这类组合物包括约8 μ g/ml的 6B型糖和浓度各约4 μ g/ml的其它12种糖。另一种这类组合物包括各约8 μ g/ml的6A和 6B型糖以及各约4 μ g/ml的其它11种糖。组合物包括超过1种肺炎球菌结合物时，各结合物可使用同一载体蛋白或不同载体蛋白。参考文献132描述了在多价肺炎球菌结合疫苗中使用不同载体蛋白的潜在优势。组合物包括来自超过1种血清型的糖抗原时，这些抗原优选单独制备、单独结合， 并随后组合。除了脑膜炎球菌LOS或多肽抗原，组合物可包括脑膜炎球菌荚膜糖，该荚膜糖通常结合载体蛋白。本发明的组合物可包括来自脑膜炎球菌血清组A、C、W135和Y中1、2、3 或4种的一种或多种荚膜糖结合物，例如A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、 A+C+Y、A+W135+Y、A+C+W135+Y等。理想成分含有来自A、C、W1!35和Y所有4种血清组的糖。A群脑膜炎球菌的荚膜糖是(α 1 — 6)连接的N-乙酰_D_甘露糖胺磷酸盐的均聚物，在C3和C4位置有部分0-乙酰化。C3位置的可以70-95%乙酰化。用于纯化糖的条件可导致脱-0-乙酰化(例如在碱性条件下)，但在此C3位置保持OAc是有益的。在一些实施方式中，A群糖中至少50% (例如至少60%、70%、80%、90%、95%或更多)甘露糖胺残基在C3位置0-乙酰化。乙酰基可用封闭基团取代以防止水解[133]，这种改良糖仍是本发明意义内的A群糖。C群荚膜糖是(α 2 — 9)连接的唾液酸(N-乙酰神经氨酸，或‘NeuNAc’ )的均聚物。所述糖结构写为一9)-Neu ρ NAc 7/80Ac-(a2—。大部分C群菌株在唾液酸残基的 C7和/或C8有0-乙酰基，但约15%的临床分离物缺乏这些0-乙酰基[134，135]。有或没有OAc基团会产生独特的表位，抗体结合所述糖的特异性可影响其抗0-乙酰化(OAc+) 和脱-0-乙酰化(OAc-)菌株的杀菌活性[136-138]。本发明使用的C群糖可从OAc+或 OAc-菌株中制备。获批的MenC结合疫苗包括OAc-(NEISVAC-C )和OAc+(MENJUGATE 与 MENINGITEC )糖。在一些实施方式中，生成C群结合物的菌株是OAc+菌株，例如16型， PI. 7a，1亚型等。因此，可使用C: 16:P1. 7a，IOAc+菌株。Pl. 1亚型中的OAc+菌株也有用， 如Cll菌株。W135群糖是唾液酸-半乳糖二糖单元的聚合物。与C群糖类似，它具有可变的 0-乙酰化，但这是在唾液酸7和9位置[139]。所述结构写为一4) -D-Neup5Ac (7/90Ac)-α -(2 — 6)-D-Gal-α -(1 —。Y群糖与W135群糖类似，但所述二糖重复单元包括葡萄糖而不是半乳糖。与W135 群类似，它在唾液酸7和9位置具有可变的0-乙酰化[139]。Y群结构写为一4) -D-Neup 5Ac (7/90Ac) - α - (2 — 6) -D-Glc- α - (1 —。如本发明所述使用的糖可如上所述0-乙酰化(例如具有与天然荚膜糖中所见相同的0-乙酰化模式)，或它们可在糖环的一个或多个位置部分或全部脱-0-乙酰化，或它们可相对天然荚膜糖高-0-乙酰化。结合物中的糖部分可包括由脑膜炎球菌制得的全长糖，和/或可包括全长糖的片段，即所述糖可短于细菌中发现的天然荚膜糖。因此，所述糖可解聚，解聚在糖纯化期间或在糖纯化后但在结合前进行。解聚缩短糖的链长度。一种解聚方法包括使用过氧化氢。将过氧化氢加入糖(例如用于产生1 %的H2A终浓度)，然后孵育所述混合物(例如在约55°C ) 直到获得所需链长度的缩短。另一解聚方法涉及酸水解。其它解聚方法在本领域已知。用于制备本发明所用结合物的糖可通过任何这些解聚方法获得。可使用解聚以提供针对免疫原性的最优链长度和/或缩短链长度用于糖的物理可控性。在一些实施方式中，糖具有以下范围的平均解聚程度(Dp) =A = 10-20 ；C = 12-22 ；W135 = 15-25 ；Y = 15-25。就分子量而非 Dp 而言，所有血清组的有用范围是< IOOkDa ；5kDa_75kDa ；7kDa_50kDa ；8kDa_35kDa ； 12kDa-25kDa ； 15kDa_22kDa。在一些实施方式中，来自各脑膜炎血清群A、C、W135和Y的糖的平均分子量可以大于 50kDa,例如彡 75kDa、彡 IOOkDa,彡 IlOkDa,彡 120kDa、彡 130kDa 等[140]，甚至高达1500kDa，具体由MALLS测定。例如MenA糖可以在100_210kDa范围内；MenW135糖可以在60-190kDa范围内，例如120_140kDa ；和/或MenY糖可以在60_190kDa范围内，例如 150-160kDa。组合物中脑膜炎球菌糖质量/血清群通常为1 μ g-20 μ g，例如2_10 μ g/血清群， 或约4 μ g或约5 μ g或约10 μ g。当包括的结合物来自超过1种的血清群时，它们可以基本相等的质量存在，例如各血清群糖的质量是彼此相差+10%以内。作为等比例的替代，A群糖可使用双倍质量。因此，疫苗可包括MenA糖10 μ g和的MenC、W135与Y各5 μ g。上面讨论了有用的载体蛋白和链接化学。有用的载体包括白喉类毒素、破伤风类毒素和CRM197。可使用糖蛋白比例(w/w)为1 5(即过量蛋白)到5 1(即过量糖)之间的结合物，例如比例为1 2-5 1和比例为1 1.25-1 2.5。如参考文献141所述， 混合物中的不同脑膜炎球菌血清组结合物可具有不同的糖蛋白比例，例如一种的比例为 1:2-1: 5，而另一种的比例为5 1-1 1.99。如参考文献142所述，混合物可包括一种具有直接糖/蛋白连接的结合物和另一种经接头连接的结合物。当使用来自不同脑膜炎球菌血清群的糖结合物时这种设置尤其有用，例如MenA和MenC糖经接头结合而MenW135和MenY糖直接结合载体蛋白。MM除非另有说明，本发明的实施采用本领域内化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药学的常规方法。这些技术在文献中已详细解释，参见例如参考文献143-149等。术语“包括”涵盖“包含”以及“由…组成”，例如组合物“包括” X可完全由X组成或可包含额外物质，例如X+Y。涉及数值χ的术语“约”是可选的，并指例如χ士 10%。本发明涉及“表位”时，此表位可以是B细胞表位和/或T细胞表位，但通常是 B细胞表位。这种表位可凭经验鉴定(例如使用PEPSCAN[150，151]或类似方法)，或可预测(例如使用Jameson-Wolf抗原指数[152]、基于矩阵的方法[153]、MAP ITOPE [154]、 TEPIT0PE[155，156]、神经网络[157]、OptiMer 与 EpiMer [158，159]、ADEPT [160]、 Tsites[161]、亲水性[162]、抗原指数[163]或参考文献164-168所述方法等)。表位是能被抗体或T细胞受体的抗原结合位点识别并与之结合的抗原部分，也可称为“抗原决定簇”。本发明使用“纯化”抗原时，该抗原从其天然产生的环境分离。例如，除存在的任何其它纯化抗原外，所述抗原基本无其它脑膜炎球菌成分。纯化抗原的混合物通常通过单独纯化各抗原随后将它们重组来制得，即使所述2种抗原天然存在于混合物中。2种氨基酸序列间的序列同一性百分数是指比对时在2种所比较序列中相同氨基酸的百分数。此比对和同源性或序列同一性百分数可用本领域已知的软件程序确定，例如参考文献169的7. 7. 18部分所述程序。优选的比对通过史密斯-沃特曼(Smith-Waterman) 同源性搜索方法确定，使用仿射缺口搜索，缺口开放罚分为12，缺口延伸罚分为2，BLOSUM 矩阵计62。参考文献170描述了史密斯-沃特曼同源性搜索方法。单词“基本”不排除“完全”，例如组合物“基本无” Y可以是完全没有Y。必要时， 本发明的定义可省略单词“基本”。
附图简要说明图1显示L3免疫型的核心糖。图2显示参考文献55中CS14的重复结构。图3显示动物组中的抗LNnT IgG效价。类似地，图4显示抗CP14 IgG效价。两图都显示了以RLU/ml测量的GMT值。实施本发明的方式用以下疫苗免疫小鼠⑴0. 4 μ g剂量的PREVNAR 疫苗；(ii)10yg剂量的制备自B群脑膜炎球菌野生型菌株MC58的外膜囊泡，联用PREVNAR ；或(iii) 10 μ g剂量的制备自B群脑膜炎球菌MC58 Δ IgtB敲除菌株的外膜囊泡，联用PREVNAR 。所有组合物通过添加氢氧化铝佐剂配制。用路明克斯(Luminex)检测分析血清，分析针对14型肺炎球菌荚膜糖和LNnT表位等的抗体。图3显示在第1和21天免疫后，在第34天的3组抗LNnT应答。PREVNAR 疫苗单独引起约h空白对照的抗LNnT应答(0. 2相比0. 12)。加入含LOS的OMV使应答增强 (0. 7)，但在LgtB^veOMV中该增强较低(0. 5)。(iii)组相比⑴组的增加可以是由于OMV可能的佐剂效果(参见参考文献51)。图4显示第34天的抗CS14应答。两种OMV制品都增强抗CS14应答；有利地，用 LgtB^veOMV观察到更大的增强。尽管不尽完整且不能充分确定，抗LNnT测定仅给出低信号，但这些数据显示可联合CS14与LgtB_re0MV以产生比联用CS14和野生型OMV更好的结果。 应理解本发明仅通过举例方式加以描述，可进行修改而同时仍保持在本发明范围和精神内。参考文献
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权利要求
1.一种含脑膜炎球菌脂寡糖(L0Q和14型肺炎球菌荚膜糖(CS14)的免疫原性组合物，其特征在于，所述LOS和/或CS14不包括Gali3 l-4GlcNAci3 l-3Gali3 l-4Glc四糖。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述四糖存在于CS14。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括佐剂。
4.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述LOS从缺失LgtB酶活性的脑膜炎球菌菌株中制备。
5.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述LOS从缺失(ialE酶活性的脑膜炎球菌菌株中制备。
6.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述LOS从缺失LgtA和/或 LgtE酶活性的脑膜炎球菌菌株中制备。
7.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述LOS缺失所述 Gal β l-4GlcNAc β l_3Gal β l_4Glc 四糖的末端半乳糖。
8.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述LOS存在于脑膜炎球菌外膜囊泡内。
9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述LOS与所述囊泡中的蛋白结合。
10.如权利要求8或9所述的组合物，其特征在于，所述囊泡从过量表达TbpA的脑膜炎球菌中制备。
11.如权利要求1到6中任一项所述的组合物，其特征在于，所述LOS与载体蛋白结合。
12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述结合是通过LOS中的脂质A部分或通过KDO残基实现。
13.一种含有一种或多种含脑膜炎球菌多肽和14型肺炎球菌荚膜糖的免疫原性组合物，其特征在于，⑴所述14型肺炎球菌荚膜糖包括Gal β l-4GlcNAc β l-3Gal β l_4Glc四糖，(ii)所述脑膜炎球菌多肽可引发有效抗B群脑膜炎球菌的免疫应答，和(iii)所述组合物不包括脑膜炎球菌脂寡糖。
14.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述脑膜炎球菌多肽包括fHBP。
15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述fHBP包括的氨基酸序列与SEQID NO 1有至少85%序列同一性和/或所含氨基酸序列由SEQ ID NO=I的至少7个连续氨基酸的片段组成。
16.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述fHBP包括的氨基酸序列与SEQID NO 2有至少85%序列同一性和/或所含氨基酸序列由SEQ ID NO 2的至少7个连续氨基酸的片段组成。
17.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述fHBP包括的氨基酸序列与SEQID NO 3有至少85%序列同一性和/或所含氨基酸序列由SEQ ID NO 3的至少7个连续氨基酸的片段组成。
18.如权利要求14、15、16或17所述的组合物，其特征在于，所述fHBP被脂化。
19.如权利要求14、15、16、17或18所述的组合物，其特征在于，所述fHBP引发的抗体能结合由氨基酸序列SEQ ID NO :1、2或3组成的脑膜炎球菌多肽。
20.一种含脑膜炎球菌脂寡糖(LOS)和14型肺炎球菌荚膜糖(CS14)的无佐剂免疫原性组合物，其特征在于，所述LOS和CS14都包括Gal β l_4GlcNAc β l_3Gal β l_4Glc四糖。
21.一种含脑膜炎球菌脂寡糖(LOS)和14型肺炎球菌荚膜糖(CS14)的免疫原性组合物，其特征在于，⑴所述LOS和CS14都包括Gal^ 1-4G1cNAc3 l-3Gal3 l-4Glc四糖，(ii) 所述LOS浓度低于5 μ g/ml, (iii)所述CS14浓度低于5 μ g/ml。
22.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述CS14与载体蛋白结合。
23.如权利要求22所述的组合物，其特征在于，所述载体蛋白是CRM197、破伤风类毒素、白喉类毒素或流感嗜血杆菌蛋白D。
24.一种含脑膜炎球菌脂寡糖(LOS)和肺炎球菌多肽抗原的免疫原性组合物，其特征在于，⑴所述LOS包括Gali3 l-4GlcNAci3 l-3Gali3 l-4Glc四糖，(ii)所述肺炎球菌多肽可引发有效抗14型肺炎球菌的免疫应答，和(iii)所述组合物不包括14型肺炎球菌荚膜糖。
25.如权利要求1-19中任一项所述或权利要求21-M中任一项引用权利要求1-19时所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括铝盐佐剂。
26.如权利要求25所述的组合物，其特征在于，所述铝盐是磷酸铝。
27.一种引起哺乳动物中免疫应答的方法，其特征在于，所述方法包括将前述权利要求中任一项所述的组合物给予所述哺乳动物。
全文摘要
脑膜炎球菌脂寡糖和14型肺炎球菌荚膜糖共享一种能与人组织交叉反应的抗原。本发明提供了不同方法使共同给予这两种抗原时产生的自身反应性抗体最少。
文档编号A61K39/095GK102421449SQ201080021232
公开日2012年4月18日 申请日期2010年3月24日 优先权日2009年3月24日
发明者P·科斯塔蒂诺 申请人:诺华有限公司