抗硫苷脂和抗硫酸化蛋白聚糖抗体及其用途的利记博彩app

专利名称：抗硫苷脂和抗硫酸化蛋白聚糖抗体及其用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及特异性地并以高亲和力识别硫苷脂和硫酸化蛋白聚糖的新的单克隆抗体(MAb)。本发明还涉及包含本发明的单克隆抗体或衍生自这些抗体的片段的药物组合物。另外，本发明涉及用于诊断心血管疾病的试剂盒，其包含本发明的抗体或其片段。
背景技术：
在用于获得鼠MAb 的杂交瘤技术(Koehler y Milstein Nature, 256 :495-497, 1975)发展了 30多年以后，已经证明其在疾病诊断和基础研究中是非常有用的，但是仅注册了 20 种用于人类治疗的抗体(Pharma Vitae, Monoclonal Abs Update，6-363，2008)。 这很大程度是由于它们在血液中的半衰期短、人类免疫系统对鼠效应子功能的识别差，以及，当把这些抗体注射进入患者时，由于它们的鼠源性而引发的免疫应答(HAMA应答，“人抗-小鼠抗体”的英文首字母简略词)。数项研究已经证明在施用外来抗体之后，患者中产生的免疫应答可能相当之强，并且能够实质上消除该抗体在最初治疗之后的治疗功用。此夕卜，牛艮据 Khazaeli，M. B. y col. Journal of Immunotherapy 15:42—52(1994)的 艮告，在给予患者鼠MAb之后，随后以不相关的鼠抗体进行的治疗可能是无效的，甚至是有危险的，这是由于交叉反应性的HAMA应答。从以上信息可以看出，有必要获得在人体中免疫原性较低的形式的治疗性抗体，其可以容易地且经济地获得，并且它们适合于制备治疗性制剂和其它用途。Morrison S. L. y col. Adv Immunol.，44 :65-92 (1989)。已经开发了数种方法以从小鼠或大鼠人源化抗体，因此减小当注射入人体时针对这些外来蛋白的异种应答。最初的减小免疫原性的尝试之一是产生“嵌合”抗体，其中鼠蛋白的可变域被连接至人类分子的恒定域，不仅实现了降低的免疫原性，而且实现了免疫效应子功能的激活。Morrison S. L. y col. PNAS USA, 81 :6851-6855 (1984)。这些嵌合分子保持了与抗原结合相关的原始抗体的特征，同时其恒定区是非免疫原性的。动脉粥样硬化及其后果对于世界人民具有重大影响，从数年前开始，其为发达国家(Melian, A. y col. Am. J. Pathol.，155 :775,1999)和古巴(0MS，2004，Anuario Estadistico, MINSAP,2007)发病率和死亡率的主要诱因。动脉粥样硬化是多因素性质的慢性炎性疾病，其大大促成心肌和脑梗塞的发病、坏疽和肢体功能丧失。Greaves， D. R. y col. Trends Immunol 22 :180-181(2001) ；Ross, R. y col. Am Heart J 138(5Pt2) S419-20(1999)。动脉粥样硬化的主要诱因之一是高胆固醇血症。通过与蛋白聚糖的相互作用，低分子量脂蛋白(LDL)穿过动脉壁的运输被阻塞在动脉内膜的细胞外基质中，并发生氧化修饰。结合于动脉内膜的蛋白聚糖的脂蛋白更易于在脂和蛋白部分发生变化，例如氧化和酶促水解，这会增加它们的致动脉粥样化的潜在性。ApoB-100含有数个区域，通过所述区域其能够结合至蛋白聚糖的糖胺聚糖链，所述区域共同之处在于存在多个碱性氨基酸。Camejo, G. , E. y col. Atherosclerosis 139:205-22, (1998) ；Chang, Τ. Y. y col. Curr Opin Lipidoll2 :289-96(2001) ；Camejo, G. , U. y col.Atheroscler Suppl3 :3-9(2002) 糖胺聚糖上的负电荷的密度影响其与LDL的相互作用，硫酸化程度影响LDL与蛋白聚糖的相互作用° Sambandam T. y col. Arterioascler Thromb, 11 :561-568 (1991)。此外，氧化的LDL能够通过巨噬细胞表面上的清道夫受体被巨噬细胞内化，这导致细胞内胆固醇的积累，随后形成泡沫细胞。这些事件代表了启动免疫应答的主要步骤，其中涉及单核细胞/巨噬细胞、肥大细胞、树突细胞、T细胞和NKT。Camejo, G. y col. Atherosclerosisl39(2) :205-22(1998) ；Hurt-Camejo, Ε. y col.Invest Clin 42Suppll 43-73(2001) ；Skalen，K.，M. y col.Nature 417 :750-754(2002) 有实验证据证明存在于巨噬细胞表面上的蛋白聚糖参与氧化的LDL与这些细胞的结合以及这些颗粒的内化或掺入，这最终引起泡沫细胞的形成。Halvorsen B. y col. Biochem J. 331 :743-752(1998)。毫无疑问，采取更健康的生活方式以及使用抗血栓和减脂剂已经对降低发生心血管事件的风险产生了影响，但这些策略仍不足以完全消除这些风险。如上所述，动脉粥样硬化是多因素的炎性疾病，其中多种抗原对于其发展具有重要意义，所以正在开发不同的主动和被动免疫治疗的策略，其旨在实现对该疾病的更大的治疗效果。这些策略之一是增加HDL，因为HDL-胆固醇与心血管疾病之间具有相反的关系。 CETP是HDL代谢中的关键酶，其被认为是治疗的潜在靶标，因为其活性的降低会增加HDL的水平。使用诱导能够结合并抑制CETP功能的抗体的疫苗的策略已经描述于W01997/041227 和WO 2006/133196。然而，最近的研究表明，使用CETP抑制剂Torcetrapib进行的III期临床试验失败了，这使得对于该策略产生了疑虑。Nicholls S. J.y col. Circulation. 9 ； 118 :2506-14(2008) ；Hermann Μ. y col. Curr Hypertens Rep,11 :76-80(2009) 一些作者已经描述了使用氧化的LDL作为免疫原的疫苗，旨在抑制动脉粥样硬化斑的形成。Palinski W. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:821-25(1995) ；Ameli S y col.Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 16 1074-79(1996) ；Freigang S. y col. Arterioscl.Thromb.Vase.Biol. 18 1972-829 (1998) ；Zhou X. y col.Arterioscler. Thromb.Vase. Biol. 21 :108-14(2001) ；George J.y col.Atherosclerosis 138 147-52 (1998) ；Fredrikson G.N.y col. Arterioscler. Thromb. Vase.Biol.23 879-84(2003) ；US 2008/0070265A1。另一项策略是开发基于氧化的载脂蛋白C-III的特异性片段的预防性和治疗性疫苗，其旨在诱导能够预防或减少形成动脉粥样硬化病变的免疫应答(W0 2001/064008, WO 2003/020765, WO 2004/080375 和 WO 2004/081045)。所描述的另一种疫苗方法是基于缀合于醛例如MDA或4-HNE的肽，以诱导与T细胞的α/β受体相互作用的抗体，从而预防形成动脉粥样硬化病变(W02001/068119)。一些作者支持针对动脉粥样硬化中的病原体的疫苗的重要性，以预防动脉粥样硬化斑的形成(W01998/033510, US 006291437Β1, US6471965B1, US006808713B1)。所提出的另一项用于延缓或降低由于摄入膳食性胆固醇而引起的动脉粥样硬化严重性的策略是使用针对固醇的疫苗(us 2002/0018808A1)。作为治疗工具的被动免疫治疗也可以在动脉粥样硬化中发挥重要作用。已经描述了通过使用针对Apo B100的氧化的或修饰的片段的人类抗体来治疗或预防动脉粥样硬化的被动免疫(US 005196324a, US2007/0098725A1, US 2008/0075716A1)。另外，已经提出使用针对磷酰胆碱的特异性抗体的被动免疫作为治疗组合来治疗或预防动脉粥样硬化(US 2007/0286868A1, US2007/0122419A1) 所描述的另一项策略是使用特异性结合人M-CSF的抗体或抗原结合片段(US 2007326414B2)。针对该疾病的另一项治疗方法是使用防止单核细胞粘附至血管内皮并因此防止侵入内皮和周围组织的MAb (US 005541296A)。已经描述了单克隆抗体作为糖蛋白Ilb/IIIa受体抑制剂并因此作为血小板聚集的抑制剂的用途(W0 1999/052551，US 005976532A)。另外，获得了针对载脂蛋白CIII的保护性肽表位的人单克隆抗体，以用于被动免疫治疗(W0 2004/081046)。另外，使用静脉内免疫球蛋白(IVIG)可以具有防止动脉硬化效应Udi Nyy col. Autoimmunity reviews 7:445—452(2008)。尚未描述与硫苷脂和硫酸化蛋白聚糖反应、或识别巨噬细胞和动脉粥样硬化病变、当以低剂量施用时具有抑制形成动脉粥样硬化病变的能力、并且诱导针对这些硫酸化分子的抗体应答的嵌合的MAb。

发明内容
本发明涉及单克隆抗体，其特征在于识别硫苷脂和硫酸化蛋白聚糖或衍生自它们的片段。本发明的抗硫苷脂和抗硫酸化蛋白聚糖抗体优选为单克隆的。在本发明的范围内还包括抗体片段，例如本说明书中提供的抗硫苷脂和抗硫酸化蛋白聚糖抗体的Fab片段、 Fab' ,Fab' -SH和F(ab' ) 2。可以通过传统方式、例如酶促消化来产生这些抗体片段，或者可以通过重组技术来产生。这些抗体片段可以是嵌合的或人源化的。这些片段用于本说明书中记载的诊断和治疗目的。本发明还包括实质上纯的抗体及片段的实施方式。在具体的实施方式中，本发明的抗体的特征在于下列的重链和轻链可变区序列。重链HCDRl RYSVHHCDR2 MIffGGGSTDYNSALKSHCDR3 SGVRRGRAQAffFAYHFRl QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSHFR2 WVRQPPGKGLEffLGHFR3 RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARHFR4 WGQGTLVTVSA轻链LCDRl KASQDVSTAVALCDR2 SASYRYTLCDR3 QQHYSTPffTLFRl DIVMTQSHKFMSTSV⑶RVSITCLFR3 GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCLFR4 FGGGTKLELK
另外，本发明的抗体包括对于重链是人IgGl恒定区；对于轻链是人Ck。本发明包括组合物，包括药物组合物，其包含本发明的抗硫苷脂和抗硫酸化蛋白聚糖抗体或衍生自它们的片段。如本说明书中使用的组合物包括与硫苷脂和硫酸化蛋白聚糖结合的一种或多种抗体。这些组合物还可以包含合适的载体，例如药学上可接受的赋形剂，包括缓冲液或佐剂，其为本领域熟知的。在另一个实施方式中，本发明涉及包含MAb的药物组合物，所述MAb的重链和轻链可变区序列如下所示。重链HCDRl RYSVHHCDR2 MIffGGGSTDYNSALKSHCDR3 SGVRRGRAQAffFAYHFRl QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSHFR2 WVRQPPGKGLEffLGHFR3 RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARHFR4 WGQGTLVTVSA轻链LCDRl KASQDVSTAVALCDR2 SASYRYTLCDR3 QQHYSTPffTLFRl DIVMTQSHKFMSTSV⑶RVSITCLFR2 WYQQKPGQSPKLLIYLFR3 GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCLFR4 FGGGTKLELK在第三个方面，本发明涉及用于诊断动脉粥样硬化病变的试剂盒，其包含本发明的抗体中的一种或衍生自它的片段。更具体地，试剂组包含具有如上所述的重链和轻链可变区序列的MAb。在另一个方面，本发明涉及本发明的抗体用于治疗心血管疾病、尤其是那些显示出动脉粥样硬化病变迹象的心血管疾病的用途。术语抗体一般是指MAb，更具体是指鼠MAb或嵌合抗体。抗体的获得一般地，可以通过杂交瘤方法从经过以获自天然或合成来源的糖脂提取物免疫的小鼠获得本发明的抗硫苷脂和抗硫酸化蛋白聚糖MAb，该方法首先描述于Kohler et al., Nature, 256 :495 (1975)。将来自经免疫的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞P3. X63Ag86. 5. 3融合，在如所描述的选择性培养基上培养，通过以ELISA检测培养物上清液中的免疫球蛋白来选择生产性克隆。在鉴定了以所需的特异性、亲和力和/或活性产生抗体的杂交瘤细胞之后，可以通过有限稀释程序对产生抗体的克隆进行亚克隆，可以通过细胞培养物生长的标准方法使其生长(Goding，Monoclonal Abs Principles and Practice，pags. 59-103 (AcademicPress, 1986))。适合于此目的的培养基包括，例如，培养基D-MEM或RPMI-1640。此外，可以在动物体内以腹水肿瘤的形式使杂交瘤细胞生长。适宜地通过常规程序从培养基、腹水或血清中分离由亚克隆分泌的MAb，以纯化免疫球蛋白，例如，通过A-琼脂糖、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱。也可以通过遗传工程技术通过正确操作鼠免疫球蛋白基因来获得本发明的抗体。 例如，可以通过常规的基因操作技术，例如本领域所描述的，特别是例如，扩增、克隆、基因测序禾口消化，例如描述于 Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual 3rd. edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. Current Protocols in molecular biology(F. M. Ausubel, et al. eds. , (2003)) ；la serie Methods in Enzimology(Academic Press,Inc. ) :PCR 2 :A practical approach(M. J. MacPherson,B. D. Hames y G.R.Taylor eds. (1995)), Harlow y Lane, eds. (1988) ABS，A laboratory manual, y Animal cell culture (R. I. Freshney, ed. (1987))中的那些，从纯化自产生鼠单克隆抗体的细胞的RNA来获得本发明的嵌合抗体。可以从编码鼠抗体的RNA进行抗体可变区的cDNA合成和PCR (聚合酶链式反应的英文首字母缩略词)扩增，合成cDNA，通过PCR扩增VK和VH可变区，这可以通过本领域中为此目的所描述的常规技术来进行。将重链和轻链各自的PCR产物分别克隆进入用于基因测序的载体。使用为此目的所描述的任意方法对得到的克隆进行测序，例如，根据生产商的说明书，使用T7DNA聚合酶，使用双脱氧核苷酸方法。根据用于构建嵌合基因的常规技术，通过中间体构建体的酶限制性消化获得重链 VH和轻链VK的可变区基因，并克隆进入各自的表达载体。为此目的可使用所描述的任意载体以有效表达重组蛋白、尤其是MAb。为了表达嵌合抗体，可以使用NSO细胞，以含有抗体基因的各表达载体中的DNA构建体电穿孔所述细胞。这些细胞生长于选择性培养基。通过使用ELISA(酶联免疫吸附测定)测定培养物上清液来检测产生免疫球蛋白的克隆。具有所需的特异性和功能的抗体的选择在一些实施方式中，可以通过本领域中为此目的描述的多种技术、例如ELISA来检测本发明的抗体。在本发明的一些实施方式中，分析所产生的抗体的生物学活性。在一些实施方式中，就它们与抗原结合的活性来测试本发明的抗体。本领域已知并可用于本说明书中的抗原结合测验尤其包括直接或竞争性结合测验，其使用诸如^festern印迹、放射免疫测验、ELISA、双抗免疫测验(夹心式)、免疫沉淀检验、荧光免疫测验和蛋白A免疫测验的技术。在后面的实施例部分包括了用于抗原结合的示例性测验法。另外，在本发明中，可以鉴定那些产生能够识别人主动脉组织切片中的动脉粥样硬化斑的抗体的克隆，这可以通过使用本领域中描述的常规的免疫组织化学技术来进行。在另一个方面，可以测定本发明抗体在小鼠中诱导抗肝素应答的能力。为此，以本发明的抗体免疫不同组的动物，并就抗肝素抗体的存在来测试这些动物的血清样品。在另外的方面，可以测定本发明抗体的抗动脉粥样硬化效应，为此，可以使用通过力保肪宁(Lipofimdin)诱导而在兔子中产生动脉粥样硬化病变的模型(Takers E， Harsing J,Fiizesi S,Jellinek H. 1986Arteriosclerosis developing in rabbits after lipofundin administration. Morphol Igazsagugyi Orv Sz. 26 :99-105 ；Noa M & M0s R(1992). Ateromixol y lesion aterosclerotica en conejos inducida por lipofundin. Progresos en Ciencias Medicas,6 :14-19)。药物组合物在一个实施方式中，本发明提供了包含一种或多种本发明的抗体的药物组合物。 在一个实施方式中，包含抗体的组合物还包含药学上可接受的赋形剂。在一个方面，本发明提供了试剂盒，其包含一种或多种本发明的抗体，还可以包含缓冲溶液。在一个实施方式中，缓冲溶液是药学上可接受的。在一个实施方式中，包含抗体的组合物还包含载体分子，在一些实施方式中，所述载体分子是药学上可接受的。在一个实施方式中，试剂盒还包含用于向受试者施用或使用组合物、例如抗体的说明书。通过将具有所需纯度的抗体与生理上可接受的载体分子、任选赋形剂或稳定剂混合来制备包含本发明抗体的药物组合物以保存它们(Remington :The Science and Practice of Pharmacy 20th editionQ000))，其形式为水溶液、冻干的或其它冻干的制剂。可接受的介质、赋形剂或稳定剂在所使用的所有剂量和浓度对于接受者都是无毒的。本发明的MAb以对于期望目的有效的量组合存在于药物组合物中。用于体内施用的制剂必须是无菌的。通过经由无菌过滤膜的过滤来实现这一点。在一个方面，本发明显示了如何使用本发明的抗体制备用于治疗性和/或预防性处理病症、例如心血管疾病的药物。本发明的抗体可用于治疗、抑制动脉粥样硬化病变、延缓其进展、预防/延缓其发作、缓解或预防与一种或多种抗原性分子的表达和/或活性相关的疾病、病症或过程。根据本发明，这些抗体的治疗剂量将是10 μ g至IOmg/剂，优选100 μ g至lmg/剂。本发明的MAb通过任意合适的方式施用，包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内途径，如果需要局部处理，则可以通过损伤内(intralesional)途径施用。在另一方面，本发明提供了用于诊断病症、例如心血管疾病的试剂盒。实施例以下实施例意在例示本发明而不限制其范围。在下列实施例中，除非另有指明，否则所使用的所有限制性或修饰性酶以及试剂和材料均获自商业途径。实施例1.嵌合MAb抗-S03对于牛脑硫苷脂的识别使用ELISA，以甲醇中的浓度为4 μ g/mL的牛脑硫苷脂溶液以50 μ L/孔包被 PolySorp平板，Nunc，通过在37°C温育90分钟蒸发掉溶剂。然后，以含有牛血清白蛋白(SAB)的磷酸盐缓冲液(PBS)以200 μ L/孔在室温封闭平板1小时。然后，加入50 μ L/ 孔的PBS中的不同浓度的嵌合抗体抗-S03，并在37°C温育1小时。然后以PBS洗涤平板并加入50 μ L/孔的缀合于碱性磷酸酶(Sigma)的山羊抗血清抗-人Y链。将平板在37°C温育1小时，然后再次洗涤平板，并加入100 μ L/孔的底物溶液，其由ρΗ9. 8的二乙醇胺缓冲液中的lmg/mL磷酸对硝基苯酯组成。在室温温育30分钟之后，在ELISA读数器中在405nm 测定反应产物的吸收值。
作为阴性对照，使用通过将嵌合单克隆抗-S03的位置98处的重链可变区中的R 替换为S而修饰的嵌合MAb。图1显示了不同的嵌合MAb针对硫苷脂的反应性。该图显示了嵌合单克隆抗-S03即使在低至0. 01mg/ml的浓度也识别硫苷脂。相反，在位置98处修饰的嵌合MAb不显示任何反应性。实施例2.肝素识别测试随后测定了嵌合单克隆抗-S03是否识别比硫苷脂更复杂的硫酸化分子。选择了肝素进行此研究，肝素是高度硫酸化的分子，其用作硫酸化糖胺聚糖的模型。基于Skalen，K. M. y cols (Nature 417 :750_754，2002)开发的用于 biglican 的 ELISA技术并稍加修改来进行抗肝素反应性的测试。以!fepes缓冲的盐溶液(HBSS) (20mM Hepes, 150mM NaCl, pH 7.4)中的 10 μ g/mL(100 μ L/孑L )的肝素(Sigma)包被 Maxisorp 微量滴定板(Nunc)并在4°C过夜温育。以HBSS洗涤平板3次，然后以含有SAB的 HBSS (HBSS-BSA)在室温封闭 1 小时。以 0. 02% 的 HBSS-Tween20 (HBSS-T)洗涤平板 3 次， 并在室温在1小时内加入嵌合单克隆抗-S03的连续稀释物从结合缓冲液(IOmM Hepes, 20mM NaCl, 2mM CaCl2, 2mM MgCl2,pH7. 4)中的40 μ g/mL的最初浓度开始。作为阴性对照， 使用通过将嵌合单克隆抗-S03的位置98处的重链可变区中的R替换为S而修饰的嵌合抗体。以HBSS-T洗涤平板2次，然后与HBSS-T (含有0. SAB)中的缀合于碱性磷酸酶 (Sigma-Aldrich, USA)的山羊抗血清抗-人、链一起在室温温育1小时。进行所需的洗涤，使用溶解于PH9.8的二乙醇胺缓冲液中的底物磷酸对硝基苯酯使反应显色。在ELISA 读数器(Organon Teknica, Austria)中在405nm定量产物的吸收值。如图2所示，嵌合单克隆抗-S03具有针对肝素的高反应性。相反，用作同种型对照的修饰的嵌合抗体在所研究的任何浓度都不显示反应性。实施例3 通过流式细胞术测定J774细胞系的识别 单核细胞和巨噬细胞在炎性过程、例如动脉粥样硬化中具有重要意义(0sterud BBjorklid Ε. Physiol Rev 83 :1069_1112，200 。这些细胞合成蛋白聚糖，已经证明在形成泡沫细胞时，巨噬细胞中掺入氧化的LDL的某些途径涉及细胞膜蛋白聚糖(Halvorsen B, et al. Biochem J. 331 :743-752,1998)。为了测定抗-S03-嵌合抗体是否能够识别巨噬细胞，我们使用鼠巨噬细胞系J774 进行了流式细胞术实验，其培养于补充了 8%灭活胎牛血清(SFT;Gibc0)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL 青霉素、100 μ g/mL 链霉素的 DMEM-F12 (Gibco BRL, Paisley, Scotland)。将细胞(0. 5xl06/管)与20 μ L/管的灭活兔血清在37°C —起温育10分钟以封闭 Fc-Y受体。然后，加入同为生物素化的、浓度为 ομ g/mL的、处于含有牛血清白蛋白 (Sigma, St. Louis,MO)和0. 01%叠氮钠的pH7. 4的PBS中的抗-S03-嵌合MAb和同种型对照修饰的嵌合抗体，置于冰浴中30分钟。洗涤细胞之后，按照1/200稀释将它们与链霉亲禾口素-焚光素异硫氰酸酉旨复合物(Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA)在冰浴中温育30分钟。洗涤细胞，重悬于含有叠氮钠的PBS中并在流式细胞仪 (Becton-Dickinson, San Jose, CA)上分析。如图3所示，用作同种型对照的嵌合抗体不识别细胞系J774。相反，抗-S03-嵌合抗体识别93. 7%的细胞。实施例4 人主动脉中的动脉粥样硬化斑的识别
在固定于福尔马林并包埋于石蜡中的人主动脉片段上进行嵌合抗体抗-S03的识别的免疫组织化学测定。使用4 μ m的组织切片，其封片于硅烷化的载玻片中，并在68°C温育12小时。在二甲苯中使组织切片脱石蜡，在浓度渐减的乙醇中水化。然后将它们在蒸馏中洗涤5分钟，在PBS中洗涤。使用设定在100°C的温度的恒温水浴进行抗原暴露。将平板浸于PH6.0的柠檬酸盐缓冲液中，保持在水浴中30分钟，然后使用微波炉在pH6. 8的柠檬酸盐缓冲液中煮沸10分钟。将切片冷却20分钟，然后以蒸馏水和PBS洗涤。以3%的H2A 溶液在室温抑制内源性过氧化物酶10分钟，以PBS洗涤，加入浓度为50 μ g/mL的生物素化的嵌合抗体抗-S03和同种型对照抗体，在室温放置30分钟。然后，以PBS洗涤切片并在相同的温度加入链霉亲和素-过氧化物酶复合物(Anacrom Diagnostics)，放置相同的时间。 最后，将组织切片与ImL底物缓冲液中的3，3' -二氨基联苯胺(DAB)的新鲜混合物溶液一起温育3-5分钟。使用Mayer' s苏木素进行反衬，将样品在浓度渐增的醇中脱水，在二甲苯中澄清，最后在永久培养基平板Eukitt (Kinder GmbH & Co.)中封片。使用白光显微镜 (Leica)进行测评。图4显示了抗-S03嵌合抗体如何与存在于主动脉中的动脉粥样硬化病变样品强烈地反应。观察到与充满脂的巨噬细胞或泡沫细胞以及与病变脂核的反应性(反应性以深灰色显示)。该图显示了用作同种型对照的抗体不识别人主动脉切片。实施例5.抗-S03嵌合抗体在小鼠中诱导抗-肝素应答的能力使用BALB/c雌性小鼠；它们皮下接受50 μ g抗-S03-嵌合抗体(在200 μ L中)。 每14天进行免疫，以完成总共4剂。施用抗-S03-嵌合抗体而不加佐剂或载体蛋白。在第 0天和第49天(第4剂之后7天)获取血清样品。使用实施例2中描述的ELISA技术测定经免疫的动物的血清中抗-肝素抗体的存在使用肝素(10 μ g/mL, 100 μ L/孔)包被的Maxisorp平板。按照1/100的稀释度测试结合缓冲液中的小鼠血清，100 μ L/孔。作为二抗，使用缀合于碱性磷酸酶(Jackson)的山羊抗-小鼠IgG和IgM抗血清。图5显示了使用在第0天和第49天获取的小鼠血清进行的测验的结果。在任何动物的免疫前血清(第0天)中都没有检测到抗-肝素抗体的存在。相反，在以抗-S03-嵌合抗体免疫小鼠之后，检测到这些血清抗体的存在。该结果说明抗-S03-嵌合抗体不仅强烈识别肝素，而且具有令人惊奇的诱导针对该分子的应答的能力(疫苗效应)。实施例6.抗-S03-嵌合抗体的抗动脉粥样硬化效应为了测定抗-S03-嵌合抗体是否能够在体内产生生物学效应，我们使用了之前描述的模型使用力保肪宁在兔子中诱导动脉粥样硬化病变(Takcics E and cols. Morphol Igazsagiigyi Orv Sz. 26 :99-105,1998, Noa M & R. More Progress in Medical Sciences, 6 :14-19,1992)。使用15只新西兰兔，将它们分成3组，每组5只。组1不接受处理(阴性对照)。 组2每日静脉内接受2mL/kg 20%的力保肪宁(Braim)，持续8天。组3以7天的间隔皮下接受3剂处于PBS中的100 μ g抗-S03-嵌合抗体，在最后一次免疫那天开始每日施用力保肪宁，按照与组2的动物中所使用的相同的方案进行。在接受最后一剂力保肪宁1天之后， 在麻醉下杀死所有的兔子，在同一天杀死组1的阴性对照动物。从动物获取主动脉，进行生理学研究以确定是否存在肉眼可见和显微镜下可见的动脉粥样硬化病变。
来自组1的未接受处理的兔子的主动脉未显示出肉眼能看到的病变。在来自组2 的接受2mL力保肪宁/kg持续8天的兔子的所有主动脉中，观察到肉眼可见的病变。在那些先接受3剂抗-S03-嵌合抗体再施用力保肪宁的兔子的主动脉中，没有肉眼可见的病变。为了进行显微镜下病变研究，将主动脉的片段固定于福尔马林并包埋于石蜡中。 使用4 μ m的组织切片，封片于硅烷化的载玻片中，并以苏木精-曙红染色。使用白光显微镜(Leica)进行测评。当测评未接受处理的兔子的主动脉的组织切片时，均显示出无改变的动脉的正常结构，如图6所示。在来自接受力保肪宁的组的所有兔子的主动脉切片中，观察到特征性的病变出现内膜变厚，在肌肉、弹性和胶原纤维之间的细胞外物质的沉积，以及组织架构畸变。相反，在来自接受3剂抗-S03-嵌合抗体、然后再施用力保肪宁的3只兔子的样品中没有观察到显微镜下的病变。在来自其余2只兔子的样品中，观察到组织变化在动脉壁的一些区域中有一些不连续的增厚，在纤维之间有细胞外物质的沉积。没有内膜的增厚。


图1.抗-S03-嵌合MAb对硫苷脂的识别将多个浓度的抗-S03-嵌合MAb和同种型对照嵌合MAb加入到以甲醇中的浓度为 4 μ g/mL的硫苷脂包被的ELISA平板中。以缀合于碱性磷酸酶的山羊抗-人、链抗血清检测反应性。在ELISA读数器中在405nm定量产物的吸收值Γη < 0. 05，Mann-Whitney U 检验)。图2.抗-S03-嵌合MAb对肝素的识别将多个浓度的抗-S03嵌合-MAb和同种型对照嵌合MAb加入到以HBSS中的浓度为10 μ g/mL的肝素包被的ELISA平板中。以缀合于碱性磷酸酶的山羊抗-人、链抗血清检测反应性。在ELISA读数器中在405nm定量产物的吸收值Γη < 0. 05，Mann-Whitney U 检验)。图3.抗-S03-嵌合MAb对J774细胞系的识别将细胞与10 μ g/mL的生物素化抗体一起温育。使用缀合于FITC的山羊抗-人 IgG抗血清显示反应，并通过流式细胞术分析。图4.通过抗-S03嵌合MAb识别人动脉粥样硬化斑将固定于福尔马林并包埋于石蜡中的人主动脉的片段Gym)与生物素化的抗-S03-嵌合抗体及同种型对照抗体温育。使用链霉亲和素-过氧化物酶复合物显示反应。抗-S03-MAb对表位的识别通过深灰色颜色指示，以苏木精对比染色细胞的细胞核GOO 倍)。图5 通过以抗-S03-嵌合MAb免疫而诱导的针对肝素的抗体应答通过ELISA测定获自以抗-S03-嵌合MAb在第0天和第49天免疫的BALB/c小鼠的血清样品。每种符号是以小鼠血清获得的数值。Pi和hi分别是预免疫和超免疫ΓP < 0. 05, Mann-Whitney U 检验)。图6.以抗-S03-嵌合MAb进行的处理对于兔子力保肪宁模型中产生动脉粥样硬化病变的效应代表不同的研究组的兔子胸主动脉的组织学切片。A 组1，未处理的动物，其显示出动脉的正常结构，无改变。B:组2，以力保肪宁处理的动物，其中观察到动脉内膜增厚， 在肌肉、弹性和胶原纤维之间出现细胞外物质的沉积，和组织架构的畸变。C和D 组3，以抗-S03-嵌合MAb免疫、后又接受力保肪宁的动物；未观察到明显的组织损伤或内膜增厚。 苏木精-曙红染色，180倍。
权利要求
1.用于诊断和治疗心血管疾病的单克隆抗体，其中所述抗体特异性结合硫苷脂和硫酸化蛋白聚糖。
2.根据权利要求1的单克隆抗体，其中重链和轻链的可变区的互补决定区(CDR)的序列如下所示重链HCDRl RYSVH HCDR2 MIffGGGSTDYNSALKS HCDR3 SGVRRGRAQAffFAY 轻链LCDRl KASQDVSTAVA LCDR2 SASYRYT LCDR3 QQHYSTPffT0
3.根据权利要求2的单克隆抗体，其中重链和轻链的可变区内的框架区的序列如下所示重链HFRl QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSHFR2 WVRQPPGKGLEffLGHFR3 RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARHFR4 WGQGTLVTVSA轻链LFRl DIVMTQSHKFMSTSV⑶RVSITC LFR2 WYQQKPGQSPKLLIY LFR3 GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC LFR4 FGGGTKLELK。
4.根据权利要求3的单克隆抗体，其中恒定区的序列是对于重链而言是人IgGl；对于轻链而言是Ck。
5.包含权利要求1至4的任意单克隆抗体或其片段的药物组合物。
6.权利要求5的药物组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂。
7.权利要求6的药物组合物，其还包含佐剂。
8.用于诊断动脉粥样硬化病变的试剂盒，其包含权利要求1至4的任意单克隆抗体或其片段。
9.特异性结合硫苷脂和硫酸化蛋白聚糖的单克隆抗体在制备用于诊断和治疗心血管疾病的药物中的用途。
10.权利要求1至4的单克隆抗体在制备用于治疗心血管疾病的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，尤其是用于人类健康的新产品。本发明提供了新的特异性单克隆抗体，其特异性地并以高亲和力识别硫苷脂和硫酸化蛋白聚糖。在本说明书中描述的抗硫苷脂和抗硫酸化蛋白聚糖抗体构成了重要的诊断和治疗试剂，其作用于与动脉粥样硬化斑的出现相关的病理学过程。与此相应，本发明提供了包含本发明的单克隆抗体或衍生自这些抗体的片段的药物组合物，其用于与心血管疾病相关的治疗和诊断用途。另外，本发明涉及识别硫苷脂和硫酸化蛋白聚糖的单克隆抗体的片段，所述片段可用于这种病况的治疗或诊断。
文档编号A61P9/10GK102414222SQ201080019730
公开日2012年4月11日 申请日期2010年5月3日 优先权日2009年5月4日
发明者A·M·维兹克兹洛普兹, A·洛普兹瑞克纳, C·马蒂奥德阿卡斯塔德尔瑞奥, V·布瑞托纳维罗, Y·索托洛普兹, Y·费尔南德兹玛瑞奥 申请人:分子免疫中心