专利名称：一种人工加工熊胆粉及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种从动物体内提取胆汁的方法、胆粉的生产方法及胆粉，特别尤其 一种从熊的体内提取胆汁的方法、熊胆粉的生产方法及优质熊胆粉。
背景技术：
熊胆，是熊科动物黑熊Selenarctos thibetanus (G. Cuvier)、东北马熊 Ursus arctos lasiotus Gray或棕熊tosus arctos L.胆囊内的干燥胆汁。在中国，主产云南、黑 龙江、吉林。此外，贵州、四川、青海、西藏、新疆、甘肃、湖北、湖南、陕西、福建等地亦产。熊 胆中的主要成份是胆汁酸类的碱金属盐，此外，还含有胆留醇及胆色素。从黑熊胆中可得约 20%的牛磺熊脱氧胆酸，为熊胆的主要成分，被水解则生中磺酸与熊脱氧胆酸。熊胆又含少 量鹅脱氧胆酸及胆酸。熊脱氧胆酸为鹤脱氧胆酸的立体异构物，乃熊胆的特殊成分，可与它 兽的胆相区别。熊胆能清热解毒，明目，具有解痉、抗惊厥、利胆作用，此外，对流感嗜血杆菌、大肠 杆菌、肺炎球菌、甲型链球菌、绿脓假单胞菌、卡他奈瑟菌等均有抑制作用。在治疗胆结石、 急性黄疸型肝炎和慢性乙型肝炎、急性结膜炎和白内障、抗脑血栓和脑缺血、抗肿瘤、抗溃 疡、抗病毒、解热镇痛、降血脂及抗衰老等方面均发挥着药理作用及保健功效。传统的制备方法一直是杀熊取胆，致使药源动物濒于灭绝。20世纪80年代后期， 国内开发和逐步应用活熊胆囊造漏术插入引流管采集胆汁(有管引流采集法)或有管引流 连续取胆汁技术(有管连续引流采集法)，来生产引流熊胆粉。连续有管引流生产熊胆粉的 技术不足是，引流管在熊体内长期存留，容易引起创口局部发炎和感染；同时有管引流连续 采集也影响熊胆汁的自身代谢。专利号为ZL 01112258. 7的发明公开了一种人造熊胆粉的制备方法，用禽胆汁通 过生物抽取，分别获得牛磺熊去氧胆酸组份、胆汁色素成份和胆汁酸组份，然后将这些组份 进行测定后按比例加工配制成人造熊胆粉。虽然人造熊胆粉含有天然熊胆中的一些主要成 份，但其组份单一，制备工艺复杂，不适合大规模的工业化生产。目前市售熊胆粉价格昂贵，易吸潮，熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸含量较低，使其在医 药及保健方面的应用受到极大的限制。本发明采用人工无管引流采集熊胆汁，此方法可以明显减少胆囊的感染，提高胆 汁的产量与质量，减少因有管存留对胆囊的破坏；同时，还可以减少黑熊的手术次数。通过 外科造瘘术在胆囊切开创口，并与肌肉组织形成瘘管后，可用于每日非连续、定时定量进行 采集，使胆汁在胆囊里充分浓缩，从而获得优质胆汁。即使长期采集，也不会对黑熊自身利 用胆汁(供其生理和生长发育所需)造成影响。通过此方法提取的胆汁制成的熊胆粉，外观色泽纯正，不吸潮，利于储运和加工成 口服剂型，而且熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸含量明显高于目前市售的普通熊胆粉。
发明内容
本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种从熊的体内提取胆 汁的方法和一种人工熊胆粉及其制备方法，本发明的人工熊胆粉中的有效成分含量高，含 水量低，不吸潮，适于储藏、存放和运输，而且熊胆粉的疗效高，明显提高了其应用效果。为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种从熊的体内提取胆汁的方法。其中，在熊的胆囊上切开创口，并与肌肉组织形成瘘管，扎紧；痊愈后挤动瘘口采 集胆汁。其中，在熊的腹中线剑突向下1 IOcm处，切开皮下组织，拉出胆囊；在胆囊切开 1 3cm的创口，并与肌肉组织形成瘘管，扎紧。特别是，于腹中线剑突向下1 IOcm处，切开皮下组织，钝性分离肌肉，切开肌膜、 腹膜，拉出胆囊；在胆囊切开1 3cm的创口，并与肌肉组织形成瘘管，用缝合线适度扎紧； 再固定胆囊和胆囊皮肤；分别缝合腹膜、脂肪、肌膜、肌肉和皮肤；然后清洗和消毒术口。其中，在熊术后苏醒2 4小时，饲喂营养液。特别是，营养液为蜂蜜水、糖水或鸡蛋水。其中，在术后1-15天内，给熊予肌注或口服抗生素。其中，每天定时采集熊胆汁1 3次，每天采集总量为50 200mL。其中，熊为黑熊，优选为养殖于亚洲的黑熊，进一步优选为养殖于中国福建省的黑熊。本发明另一方面提供一种人工加工熊胆粉，在365nm下呈亮黄绿色荧光，即在 365nm的紫外光下呈亮黄绿色荧光。特别是，所述熊胆粉的有效成分牛磺熊去氧胆酸的紫外特征吸收波长为198nm ； 在其后出现的色谱峰中，还有2个色谱峰的紫外吸收波长也是198nm。其中，熊胆粉采用高效液相色谱法测定的色谱峰中，在甲醇溶剂峰后保留时间为 3. 3-3. 4分钟的色谱峰的紫外特征吸收波长为198nm和；其中，所述高效液相色谱 法的色谱条件流动相-甲醇0. 03mol/L磷酸二氢钠(65 30)；用磷酸调PH4. 4 ；流速 l.Oml/min;检测波长210nm;检测器Agilent 1100 DAD ；柱温30°C；柱子Hypersil ODS sum 4. 6 X250mmo特别是，还含有M9nm和494nm的紫外特征吸收峰。其中，所述熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸含量> 40%，优选> 40-60%，进一步优选为 40-45% ο特别是，所述熊胆粉的水分含量< 2%。本发明的优质熊胆粉，经高效液相色谱DAD检测器采集各峰的紫外指纹图谱，主 要有效成分牛磺熊去氧胆酸和另外2个主要色谱峰的紫外吸收谱波长都是198nm，3. 5分出 峰的杂质色谱峰的紫外吸收波长为198nm、2^nm，其余杂质峰均无紫外吸收峰；其中，将所述熊胆粉首先溶于水后，采用乙酸乙酯萃取，得到熊胆粉的乙酸乙酯萃 取物和水溶性物质，其中，所述乙酸乙酯萃取物的紫外吸收波长为；所述水溶性物质 的紫外吸收波长为M9nm和494nm ；其中，将所述熊胆粉以甲醇溶解，然后去除不溶部分，得熊胆粉甲醇溶解物，所述 甲醇溶解物的紫外吸收波长为249nm和^2nm。本发明的优质熊胆粉，经薄层层析，于254nm紫外灯下可检出7个蓝色荧光斑点，
4其Rf值分别为0. 96,0.8,0.7,0. 54，0. 46，0. 4，0. 2 ；于365nm紫外灯下可检出9个亮蓝色 荧光斑点，其 Rf 值分别为 0. 96，0. 84，0. 76，0. 56，0. 5，0. 4，0. 7，0. 18,0. 1。其中，Rf 值为
0. 18的亮蓝色荧光斑点，为其特有斑点。本发明又一方面提供了一种人工加工熊胆粉的生产方法，包括如下步骤1)将熊胆汁静置澄清，获得上清液；2)将上清液进行除杂处理，得到水溶性熊胆汁；3)对水溶性熊胆汁进行干燥处理，粉碎，过筛，即得。其中，步骤1)中所述静置澄清的温度为4 10°C，静置时间为2 M小时；步骤 2)中采用离心、过滤或吸附处理方法对熊胆汁上清液进行所述的除杂处理；步骤幻中所述 的干燥处理选择烘干、真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。特别是，所述离心除杂处理的转速为10000 12000rpm，时间为10-120min ；所述 过滤处理为加压过滤，过滤处理的相对压力为0. 1 0. 3MPa ；所述吸附除杂处理是采用大 孔吸附树脂进行吸附除杂。其中，过滤处理的过滤精度为0. 2-0. 5微米；所述大孔树脂选择为DlOl型大孔树脂。特别是，所述的大孔吸附树脂与熊胆汁上清液的重量之比为1 80 1。其中，所述的真空干燥的相对压力为-0. 05 -0. 095MPa ；干燥温度为30 60°C; 干燥时间为8-60小时。特别是，所述的烘干温度为60 80°C ；烘干时间为M 48小时。特别是，所述冷冻干燥为将熊胆汁在_40°C下预冻3 5小时，接着在-40 _15°C 下升华干燥18 M小时，然后再于-15 30°C下干燥12 20小时。尤其是，冷冻干燥的相对压力为2_20MPa。 特别是，将水溶性熊胆汁在射流速度300 990米/秒，温度为30 60°C、相对压 力为-0. 04 -0. 09MPa的条件下进行所述的喷雾干燥。其中，所述的经过干燥处理后的粉碎的熊胆粉过100 180目筛。本发明另一方面提供一种按照上述方法制备而成的人工加工熊胆粉。其中，熊胆粉在365nm下呈亮黄绿色荧光，即在365nm的紫外光下呈亮黄绿色荧 光。特别是，所述熊胆粉的有效成分牛磺熊去氧胆酸的紫外特征吸收波长为198nm ； 在其后出现的色谱峰中，还有2个色谱峰的紫外吸收波长也是198nm。其中，熊胆粉采用高效液相色谱法测定的色谱峰中，在甲醇溶剂峰后保留时间为 3. 3-3. 4分钟的色谱峰的紫外特征吸收波长为198nm和；其中，所述高效液相色谱 法的色谱条件流动相-甲醇0. 03mol/L磷酸二氢钠(65 30)；用磷酸调PH4. 4 ；流速 l.Oml/min;检测波长210nm;检测器Agilent 1100 DAD ；柱温30°C；柱子Hypersil ODS sum 4. 6 X250mmo特别是，还含有M9nm和494nm的紫外特征吸收峰。其中，所述熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸含量> 40%，优选> 40-60%，进一步优选为 40-45% ο特别是，所述熊胆粉的水分含量< 2%。
本发明再一方面提供一种优质人工提纯熊胆粉。其中，熊胆粉为玻璃样光泽的亮金黄色或鲜黄色粉末，呈亮黄色荧光且不吸潮。其中，所述熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸含量> 40%，优选> 40-60%，进一步优选为 40-45% ο本发明又一方面提供一种人工熊胆粉在制备用于治疗和预防肝炎、肝纤维化、胆 结石、抗肿瘤、抗病毒、眼病、解热药物中的应用。本发明的优点如下1、通过人工无管引流技术，在熊的胆囊上切开创口，并与肌肉组织形成瘘管，扎 紧；痊愈后挤动瘘口采集胆汁。该方法可用于非连续、定时定量和长期采集，而且不会对熊 自身利用胆汁造成影响。2、本发明制备的人工加工熊胆粉外观色泽纯正，不吸潮，吸湿率彡2% ；熊胆粉中 牛磺熊去氧胆酸含量高，达到40%以上，其有效成分牛磺熊去氧胆酸含量显著高于目前市 售的普通熊胆粉，利于熊胆粉的储运和加工，尤其利于口服剂型的制备。3、本发明的人工加工熊胆粉的制备方法简单，工艺条件温和，成本低廉，费用低。
图1 反相高效薄层板RP-ISF254，展开剂氯仿-丙酮-冰醋酸(7 2 1)，展距 5cm。紫外灯254nm下荧光照片；体积之比为7 :2:1图2:反相高效薄层板RP-ISF254，展开剂氯仿-丙酮-冰醋酸(7 2 1)，展距 5cm。紫外灯365nm下荧光照片；图3 本发明实施例4制备的熊胆粉高效液相色谱图；图4 本发明实施例4的熊胆粉高效液相色谱-3D图；图5 本发明实施例4的熊胆粉在保留时间2. 635分钟的甲醇溶剂色谱峰的高效 液相色谱-3D图(紫外吸收波长198nm)；图6 本发明实施例4的熊胆粉在保留时间3. 355分钟的色谱峰的高效液相色 谱-3D图(紫外吸收波长198nm,226nm)；图7 本发明实施例4的熊胆粉在保留时间11. 02分钟的色谱峰的高效液相色 谱-3D图(牛磺熊去氧胆酸紫外吸收波长198nm)；图8 本发明实施例4的熊胆粉在保留时间20. 74分钟的色谱峰的高效液相色 谱-3D图(紫外吸收波长198nm)；图9 本发明实施例4的熊胆粉在保留时间31. 218分钟的色谱峰的高效液相色 谱-3D图(紫外吸收波长198nm)；图10 熊胆粉在254nm紫外灯下荧光照片图；图11 熊胆粉在356nm紫外灯下荧光照片图。照片附图标记说明1.本发明实施例4制备的熊胆粉样品；2.对照例1熊胆粉样品；3.对照例2熊胆 粉样品具体实施例方式以下通过试验例来进一步阐述本发明所述药物的有益效果，这些试验例包括了本发明药物的药效学试验。试验例1熊胆粉抗肿瘤作用试验材料本发明实施例4制备熊胆粉，Ig/瓶；第一对照熊胆粉，IOg/袋(对照例1熊胆粉， 四川省养麝研究所生产)；第二对照熊胆粉，5g/瓶(对照例2的熊胆粉，黑龙江省黑宝药业 股份有限公司生产)；阳性对照药环磷酰胺(CTX，上海华联制药集团生产)。1.对B16小鼠黑色素瘤的抑瘤作用1)试验方法无菌条件下取对数生长期的B16小鼠黑色素瘤培养细胞，制备成2. 5XlOVml的 B16小鼠黑色素瘤培养细胞悬液。取C57BL/6小鼠70只，体重150_200g，雌雄各半，接种B16小鼠黑色素瘤培养细 胞悬液，接种量为0. 2ml/只小鼠；接种后的第二天将小鼠随机分成7组，每组10只，即给药 高、中、低剂量组，第一对照熊胆粉、第二对照熊胆粉、阳性对照药物组和阴性对照组羧甲基 纤维素(CMC)；给药高、中、低剂量组分别口服给予本发明熊胆粉，隔天给药一次，给药高剂 量组^Omg/kg ；给药中剂量组130mg/kg ；给药低剂量组65mg/kg ；第一对照熊胆粉口服给 药，隔天给药一次，给药剂量为^K)mg/kg，第二对照熊胆粉口服给药，隔天给药一次，给药剂 量为^Omg/kg，阳性药物组腹腔注射给予CTX100mg/kg，每天给药一次；阴性对照组口服给 予等重量的CMC混悬液，隔天给药一次，各组小鼠在给药3周后处死，剖取小鼠的肺脏，计测 每只小鼠肺脏所转移的集落数。肿瘤抑制率计算以各组小鼠的肿瘤平均集落数，按下列公式计算肿瘤抑制率
肿瘤抑制率％ =[(对照组平均集落数-给药组平均集落数)/对照组平均集落 数]X100%。2)试验结果不同给药组的抗肿瘤转移疗效比较结果见表1。表1熊胆粉对小鼠黑色素瘤B16疗效试验(n = 3)
权利要求
1.一种人工加工熊胆粉，在365nm下呈亮黄色荧光。
2.如权利要求1所述的熊胆粉，其特征是牛磺熊去氧胆酸的紫外特征吸收波长为 198nm ；在其后出现的色谱峰中，还有2个色谱峰的紫外吸收波长也是198nm。
3.如权利要求1所述的熊胆粉，其特征是采用高效液相色谱法测定的色谱峰中， 在甲醇溶剂峰后保留时间为3. 3-3.4分钟的色谱峰的紫外特征吸收波长为198nm和 226nm ；其中，所述高效液相色谱法的色谱条件流动相甲醇_0. 03mol/L磷酸二氢钠，甲 醇与0.03mol/L磷酸二氢钠的体积之比为65 30 ；用磷酸调pH为4. 4 ；流速1. Oml/ min ；检测波长210nm ；检测器Agilent 1100 DAD ；柱温30°C ；柱子Hypersil ODS sum 4. 6 X 250mm。
4.如权利要求1或2所述的熊胆粉，其特征是水分含量<2%，其中牛磺熊去氧胆酸含 量彡40%。
5.一种人工加工熊胆粉的制备方法，包括如下步骤1)将熊胆汁静置澄清，获得上清液；2)将上清液进行除杂处理，得到水溶性熊胭汁；3)对水溶性熊胆汁进行干燥处理，粉碎，过筛，即得。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是步骤1)中所述静置澄清的温度为4-10°C， 时间为2-24小时。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征是采用离心、过滤或吸附方法对熊胆汁上清 液进行所述的除杂处理。
8.如权利要求5或6所述的制备方法，其特征是步骤幻中所述的干燥处理选择烘干、 真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。
9.一种人工熊胆粉，其特征是按照如权利要求5-8任一所述方法制备而成。
10.如权利要求9所述人工熊胆粉在制备治疗和预防肝炎、肝纤维化、胆结石、抗肿瘤、 抗病毒、眼病、解热药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种熊胆汁的提取方法，在熊的胆囊上切开创口，并与肌肉组织形成瘘管，扎紧；痊愈后挤动瘘口采集胆汁。该方法可用于非连续、定时定量和长期采集，而且不会对熊自身利用胆汁造成影响。本发明公开了一种优质熊胆粉及其制备方法，该熊胆粉在365nm紫外灯下呈亮黄色荧光，其在198nm下有3个色谱峰；制备方法包括将胆汁静置、分离、干燥后粉碎过筛，即得，制备的熊胆粉外观色泽纯正，熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸含量高，不吸潮，利于储运和加工。
文档编号A61P35/00GK102114044SQ20101061777
公开日2011年7月6日 申请日期2010年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者陈志鸿 申请人:福建归真堂药业股份有限公司