专利名称：壮骨麝香止痛膏及其半成品的指纹图谱测定方法
技术领域：
本发明涉及中药指纹图谱的测定方法，更具体的说，是涉及用高效液相色谱 (HPLC)指纹图谱方法来测定壮骨麝香止痛膏及其半成品的化学成分的方法。
背景技术：
中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统 研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。 中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴 别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分 的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。在现阶段中药的有效成分绝大多数 没有明确的情况下，中药指纹图谱的研究和建立，对于有效控制中药材或中成药的质量具 有重要意义。壮骨麝香止痛膏一直是消费者亲睐的一种非处方药，具有祛风湿，活血止痛之功 效。主要用于用于风湿关节，肌肉痛，扭伤。目前，壮骨麝香止痛膏质量控制中只有薄层、 挥发性物质气相定性的鉴别及检查，单就这几项指标控制该产品的质量未免有失全面，况 且，生产过程中半成品浸膏没有国家标准，这就在生产过程中不能监控质量，对于生产厂家 则迫切需要一种在药品生产过程中都可以监控质量的方法。为了弥补上述不足，使其质量 控制技术更加完善、科学并对其今后的标准化提供一种可以利用的质量控制模式，现对壮 骨麝香止痛膏及其半成品指纹图谱进行研究，对连续十五批的产品及半成品进行了考察比 较，建立起该产品的指纹图谱HPLC方法，并最终确定壮骨麝香止痛膏成品及其半成品标准 图谱。为产品质量得到更好的控制奠定基础。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种壮骨麝香止痛膏指纹图谱的测定方法。本发明的另一个目的是提供上述壮骨麝香止痛膏的半成品的指纹图谱的测定方 法。本发明的目的是通过下述技术方案来实现的—种壮骨麝香止痛膏指纹图谱的测定方法，该方法包括以下步骤(a)壮骨麝香止痛膏溶液的制备取壮骨麝香止痛膏适量，精密称定，加入水、氯 仿、甲醇、乙醇或与水混合一定比例的甲醇、乙醇中的至少一种溶剂提取，定容，过滤，滤液 作为供试品溶液。(b)壮骨麝香止痛膏溶液的测定吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相 色谱法采用梯度洗脱进行测定，得到壮骨麝香止痛膏的指纹图谱；其中，高效液相色谱的色谱条件为色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流 动相A为含有0. -1%三乙胺的水溶液且采用磷酸调PH2. 5-4. 5，流动相B为乙腈或乙腈 和四氢呋喃的混合溶液，流动相中流动相A与流动相B的体积比随时间增加逐渐减少；检测波长为 200-300nm。上述高效液相色谱的检测波长优选220nm ；色谱柱柱温为30-50°C，优选为40°C ； 流动相A为含有0. -1%三乙胺的水溶液且采用磷酸调PH2. 5-4. 5，优选为流动相A中三 乙胺占0.4%且磷酸调节PH3.0 ；流动相B中乙腈与四氢呋喃的体积比是85 15-15 85， 优选为乙腈与四氢呋喃的体积比是91 9。上述高效液相色谱梯度洗脱的程序如下，其中下述比例均为体积比0-60min 时，流动相 A 流动相 B = 55 45-15 8560-65min 时，流动相 A 流动相 B = 15 85-55 45优选下属的梯度洗脱的程序Omin时，流动相A 流动相B = 55 4560min时，流动相A 流动相B = 15 8565min时，流动相A 流动相B = 55 45一种壮骨麝香止痛膏半成品指纹图谱的测定方法，该方法包括以下步骤(a)壮骨麝香止痛膏半成品溶液的制备取壮骨麝香止痛膏适量，精密称定，加入 水、氯仿、甲醇、乙醇或与水混合一定比例的甲醇、乙醇中的至少一种溶剂提取定容，过滤， 滤液作为供试品溶液。(b)壮骨麝香止痛膏半成品溶液的测定吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高 效液相色谱法采用梯度洗脱进行测定，得到壮骨麝香止痛膏的指纹图谱；其中，高效液相色谱的色谱条件为色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流 动相A为含有0. -1%三乙胺的水溶液且采用磷酸调PH2. 5-4. 5，流动相B为乙腈和四氢 呋喃的混合溶液，流动相中流动相A与流动相B的体积比随时间增加逐渐减少；检测波长为 200-300nm。上述高效液相色谱的检测波长优选220nm ；色谱柱柱温为30-50°C，优选为40°C ； 流动相A为含有0. -1%三乙胺的水溶液且采用磷酸调PH2. 5-4. 5，优选为流动相A中三 乙胺占0.4%且磷酸调节PH3.0 ；流动相B中乙腈与四氢呋喃的体积比是85 15-15 85， 优选为乙腈与四氢呋喃的体积比是91 9。上述高效液相色谱梯度洗脱的程序如下，其中下述比例均为体积比0-60min 时，流动相 A 流动相 B = 55 45-15 8560-65min 时，流动相 A 流动相 B = 15 85-55 45优选下属的梯度洗脱的程序Omin时，流动相A 流动相B = 55 4560min时，流动相A 流动相B = 15 8565min时，流动相A 流动相B = 55 45本发明提供了一种壮骨麝香止痛膏成品及其半成品的指纹图谱测定方法。本发明 是在大量实验基础上所得到得切实可行的办法，具有可重复性。在本发明中，通过高效液相 色谱法，在相同的测试条件下所获取的壮骨麝香止痛膏的高效液相指纹图谱及壮骨麝香止 痛膏半成品的高效液相指纹图谱基本相同，说明重复性好。因此可通过将上述测定方法建 立的壮骨麝香止痛膏成品指纹图谱作为制剂的标准指纹图谱、壮骨麝香止痛膏半成品的指 纹图谱作为半成品的标准指纹图谱，上述测定方法可以作为壮骨麝香止痛膏的质量控制标准，该方法能够客观的反应产品内在成分的变化，可以全面控制产品的质量。本发明具有如下优点(1)建立的壮骨麝香止痛膏成品标准指纹图谱及其半成品标准指纹图谱能有效的 表征壮骨麝香止痛膏制剂的质量，从而实现对壮骨麝香止痛膏各批制剂中各化学成分进行 相似度评价，可以从整体上、宏观上控制壮骨麝香止痛膏制剂的质量。(2)以壮骨麝香止痛膏中各成分指纹图谱作为一个整体看待，注重各个构成指纹 特征峰的前后顺序和互相关系，注重整体面貌特征。本发明为完整、准确评价壮骨麝香止痛 膏制剂的质量提供了新的对照标准，将为提高壮骨麝香止痛膏制剂的质量及疗效控制提供 参考依据。(3)本发明方法具有简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。(4)可用于生产工艺稳定性和产品稳定性的考察，有利于对制剂的质量进行全方 面监控。
图1 壮骨麝香止痛膏10批成品HPLC图谱比较图2 壮骨麝香止痛膏成品标准图谱图3 :10批壮骨麝香止痛膏成品与标准图谱相似度评价图4 壮骨麝香止痛膏10批半成品HPLC图谱比较图5 壮骨麝香止痛膏半成品标准图谱图6 :10批壮骨麝香止痛膏半成品与标准图谱相似度评价
具体实施例方式下面将例举具体的实施例对本发明进行详细的说明，下述实施例仅用于说明本发 明，对本发明不构成限制。实施例1.仪器与试剂仪器采用岛津2010液相色谱仪，包括四元泵，在线脱气装置，自动进样器， LC-solution工作站；乙醇、乙腈、四氢呋喃均为色谱纯，磷酸、三乙胺为分析纯，哇哈哈纯 净水；10批壮骨麝香止痛膏半成品；10批壮骨麝香止痛膏制剂。2.色谱条件岛津技尔C18 柱(250mm*4. 6mm*5um)；柱温 40°C ；流速 lml/min ；流动相 A 为 0. 4% 三乙胺且磷酸调节PH3.0;流动相B为乙腈四氢呋喃(91 9)，波长220nm，梯度洗脱，洗 脱程序为Omin时，流动相A 流动相B = 55 4560min时，流动相A 流动相B = 15 8565min时，流动相A 流动相B = 55 453.标准指纹图谱的建立3. 1供试品溶液的制备3. 1. 1壮骨麝香止痛膏半成品溶液的制备；分别取壮骨麝香止痛膏10个批次半成品5. 6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加100 %乙醇60ml，称重，加热回流提取2h，放凉，补 重，过滤，即得。3. 1. 2壮骨麝香止痛膏成品溶液的制备分别取壮骨麝香止痛膏10个批次一片， 将其粘附于纱布上，剪碎，胶面冲上，置具塞锥形瓶中，加100 %乙醇60ml，称重，加热回流 提取2h，放凉，补重，过滤，即得。3. 2测定法分别吸取上述供试液IOul注入液相色谱仪测定，记录70min的色谱 图。构建标准指纹图谱按上述方法，对壮骨麝香止痛膏10个批次半成品、壮骨麝香止痛膏 10个批次分别进行测定，分别找出其共有特征峰，经软件--CHR0MAP1. 15指纹图谱软件拟 合，建立各自的HPLC标准色谱指纹图谱。具体为3. 2. 1图2为壮骨麝香止痛膏成品标准指纹图谱，所示，3. 2. 2图5为壮骨麝香止痛膏半成品标准指纹图谱，所示，3. 3方法学考察3. 3. 1精密度考察 分别以同一批壮骨麝香止痛膏制剂供试液，连续进样6次，考察仪器的精密度。以 标准图谱中3号峰保留时间(约10. 5 11. Smin之间)和峰面积计算，保留时间RSD ) 值为0. 123% ；峰面积RSD)值为0.093%。结果表明精密度良好。3. 3. 2稳定性考察分别以同一批壮骨麝香止痛膏制剂供试液，在0小时，4小时，8小时，12小时，24 小时，48小时进样，考察样品稳定性。考察指标同精密度，保留时间RSD(%)值为1.732%; 峰面积RSD)值为0. 883%。结果表明供试液在48小时内稳定。3. 3. 3重复性考察取同一批壮骨麝香止痛膏制剂6片，按照样品制备方法“3. 1. 2”项下方法进行提 取，测定，以标准图谱3号峰保留时间(约10. 5 11. Smin之间)和峰面积计算，保留时间 RSD(% )值为0.070% ；峰面积RSD)值为1.986%。结果表明此方法重复性良好。4.测定壮骨麝香止痛膏制剂、半成品4. 1按照所述检测方法和条件分别测定5批壮骨麝香止痛膏半成品(除已经采用 的10批以外)，采集70min色谱图，即为这5批待测半成品指纹图谱。4. 2按照所述检测方法和条件分别测定5批壮骨麝香止痛膏制剂(除已经采用的 10批以外)，采集70min色谱图，即为这5批待测制剂指纹图谱。5.测定结果5. 1将5批壮骨麝香止痛膏半成品与3. 2. 2中建立的该半成品标准指纹图谱比较， 采用软件一《CHR0MAP1. 15指纹图谱软件》计算整体相似度，结果相似度分别为0. 9933、 0. 9987,0. 9999,0. 9990,0. 9999。5批半成品与标准指纹图谱的相似度大于0. 90，可以进入
下一步工序。5. 2将5批壮骨麝香止痛膏成品与3. 2. 1中建立的该成品标准指纹图谱比较，采 用软件一《CHR0MAP1. 15指纹图谱软件》计算整体相似度，结果相似度分别为0. 9997、 0. 9995,0. 9998,0. 9991,0. 9999。5批半成品与标准指纹图谱的相似度大于0. 90，可以作为
合格品出厂。
权利要求
一种壮骨麝香止痛膏的指纹图谱测定方法，其特征在于该方法包括如下步骤(a)供试品溶液的制备取壮骨麝香止痛膏适量，精密称定，加入水、氯仿、甲醇、乙醇或与水混合一定比例的甲醇、乙醇中的至少一种溶剂提取，定容，过滤，滤液作为供试品溶液。(b)供试品溶液的测定吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度洗脱进行测定，得到壮骨麝香止痛膏的指纹图谱；其中，高效液相色谱的色谱条件为色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为含有0.1％ 1％三乙胺的水溶液且采用磷酸调PH2.5 4.5，流动相B为乙腈或乙腈和四氢呋喃的混合溶液，其中流动相中流动相A与流动相B的体积比随时间增加逐渐减少；检测波长为200 300nm。
2.一种壮骨麝香止痛膏半成品的指纹图谱测定方法，其特征在于该方法包括如下步骤(a)供试品溶液的制备取壮骨麝香止痛膏半成品适量，精密称定，精密称定，加入水、 氯仿、甲醇、乙醇或与水混合一定比例的甲醇、乙醇中的至少一种溶剂提取，定容，过滤，滤 液作为供试品溶液。(b)供试品溶液的测定吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯 度洗脱进行测定，得到壮骨麝香止痛膏的指纹图谱；其中，高效液相色谱的色谱条件为色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A 为含有0.三乙胺的水溶液且采用磷酸调PH2. 5-4. 5，流动相B为乙腈或乙腈和四氢呋喃的混合溶液，其中流动相中流动相A与流动相B的体积比随时间增加逐渐减少；检测波 长为 200-300nm ；柱温 30 50°C。
3.根据权利要求1至2任一项所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测波长为 205-280nmo
4.根据权利要求1至2任一项所述的方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为 35-45 0C ο
5.根据权利要求1至2任一项所述的方法，其特征在于，所述流动相A中三乙胺占 0. 2% -0. 6%。
6.根据权利要求1至2任一项所述的方法，其特征在于，所述流动相A中磷酸调 PH2. 8-3. 5。
7.根据权利要求1至2任一项所述的方法，其特征在于，所述流动相B采用纯乙腈。
8.根据权利要求1至2任一项所述的方法，其特征在于，所述混合流动相B中乙腈与四 氢呋喃的体积比时85 15-15 85。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述高效液相波长为220。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为40°C。
11.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述流动相A中三乙胺占0.4%。
12.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述流动相A中磷酸调PH3.0。
13.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述流动相B中乙腈与四氢呋喃的体积 比时91 9。
14.根据权利要求1至2任一项所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序如下，其中下述比例均为体积比0-60min 时，流动相 A 流动相 B = 55 45-15 85 60-65min 时，流动相 A 流动相 B = 15 85-55 45。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序如下，其中下述比 例均为体积比Omin时，流动相A 流动相B = 55 45 60min时，流动相A 流动相B = 15 85 65min时，流动相A 流动相B = 55 45。
全文摘要
本发明涉及一种监控壮骨麝香止痛膏半成品到成品质量的方法，它公开构建了壮骨麝香止痛膏半成品和成品指纹图谱建立的方法及其标准HPLC指纹图谱。首先制备壮骨麝香止痛膏半成品及成品供试品溶液；然后用HPLC法制定壮骨麝香止痛膏半成品与成品标准指纹图谱；再用HPLC法测定壮骨麝香止痛膏半成品指纹图谱，与其标准指纹图谱比较，整体相似度符合要求的批次进入下一道工序，待测成品膏药中指纹图谱与其标准指纹图谱整体相似度符合要求的批次为合格品。本发明的优点是方法简便、稳定，能从色谱整体特征上把握壮骨麝香止痛膏的质量情况，可作为壮骨麝香止痛膏质量控制指标。
文档编号A61K31/045GK101991839SQ20101054707
公开日2011年3月30日 申请日期2010年11月17日 优先权日2010年11月17日
发明者上官同强, 张军兵, 武惠斌, 熊维政, 王岩, 聂红梅 申请人:河南羚锐制药股份有限公司北京药物研究院;北京羚锐伟业科技有限公司