专利名称：一种氯代毒素修饰的脑胶质瘤靶向基因递释复合物及其制备方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及脑胶质瘤靶向基因递释复合物，具体涉及一种氯代毒素修饰的脑胶质瘤靶向基因递释复合物及其制备方法。
背景技术：
脑胶质瘤是发病率最高的脑肿瘤，也是死亡率最高的10类肿瘤之一。由于脑胶质瘤自身的浸润性生长特点以及血脑屏障的存在，使得目前常用的治疗手段包括手术切除、 放疗、化疗等均难以达到良好的治疗效果。基因治疗是一种极具潜力的治疗手段，但是基因药物难以自主向胶质瘤富集，需要构建具有主动靶向性质的基因递释载体，使得外源性基因药物在病灶部位实现广泛表达。阳离子高分子材料聚酰胺一胺树状分枝物(polyamidoamine，简称PAMAM)是近年来出现的一类新型纳米级的合成高分子，高度分枝，呈单分散性，其末端氨基丰富，强正电性，并易于经过适当的修饰连接抗体等生物活性物质以增加载体的靶向性，同时内部具有大量的空腔，已有报道表明特定代数的PAMAM可以有效包载基因进入细胞。但是，单独采用PAMAM具有一定的不足，如较强的溶血性等，因此经过一定的修饰后在基因转运方面有很大的应用潜力。研究显示，在脑胶质瘤晚期，血脑屏障受到破坏，此时脑胶质瘤与其他肿瘤类似， 具有EPR效应，在此基础上采用胶质瘤靶向头基修饰基因递释复合物则能进一步提高药物在胶质瘤细胞内的浓集。近年来有学者发现一段由36个氨基酸残基组成的多肽氯代毒素(chlorotoxin， 简称CTX)。CTX具有良好的肿瘤靶向性，能够特异性结合多种肿瘤细胞，如神经胶质瘤、恶性肉瘤、肠癌以及前列腺癌等，特别是对于脑胶质瘤细胞有非常高的结合特异性。研究表明，CTX通过基质金属蛋白酶-2 (MMP-2)介导进入肿瘤细胞，而MMP-2只在肿瘤细胞表面高量表达，正常细胞表面不表达，这就解释了 CTX特异性结合肿瘤细胞的原因。同时，CTX虽然对无脊椎动物有强烈毒性，却对哺乳动物无毒。目前已有利用CTX修饰的放射治疗药物 131I-TM-601，正在接受FDA审批，已进入II期临床试验阶段。同时，有研究将CTX与荧光染料连接用于手术过程的肿瘤显像等。因此，CTX可能成为一种脑胶质瘤特异性非常高的靶向头基。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供新的脑胶质瘤靶向基因递释复合物，尤其是提供一种氯代毒素修饰的脑胶质瘤靶向基因递释复合物。本发明提供的脑胶质瘤靶向基因递释复合物，由氯代毒素修饰的基因递释载体和治疗基因质粒DNA构成，所述的氯代毒素修饰的基因递释载体由阳离子高分子材料、亲水性聚合物和氯代毒素组成。本发明的靶向基因递释复合物中，采用氯代毒素作为靶向头基，阳离子高分子材料为基础载体，通过亲水性聚合物连接氯代毒素构筑形成基因递释载体， 该基因递释载体与治疗基因质粒DNA构筑形成50 400纳米大小的基因递释复合物。本发明提供的脑胶质瘤靶向基因递释复合物，为阳离子高分子材料一亲水性聚合物一氯代毒素/DNA基因递释复合物，本发明通过亲水性聚合物将氯代毒素修饰于阳离子高分子材料上，与质粒DNA通过静电作用复合形成基因递释复合物。所述的基因递释复合物能明显提高治疗基因在脑胶质瘤病灶部位的转染效率和表达水平。本发明的一种氯代毒素修饰的脑胶质瘤靶向基因递释复合物通过以下技术方案实现
采用阳离子高分子材料、亲水性聚合物和氯代毒素为组分，三者以共价方式连接制备氯代毒素修饰的高分子基因递释载体；其中，亲水性聚合物与阳离子高分子材料的分子比是广20:1，氯代毒素与阳离子高分子材料的分子比为广10:1 ； 本发明中，基因递释载体采用下述步骤制备
阳离子高分子材料和亲水性聚合物以1 Γ20的分子比溶于pH值7. 8 8. 2磷酸盐缓冲液中，室温搅拌反应60 180分钟，两种分子中含有的基团发生特异性反应，生成阳离子高分子材料-亲水性聚合物，超滤法除去未反应的亲水性聚合物并更换为pH值6. 8 7. 2 磷酸盐缓冲液；同时，氯代毒素与巯基化试剂反应后引入巯基，以1 10:1的分子比与阳离子高分子材料-亲水性聚合物上的特异基团室温搅拌反应12 36小时后生成阳离子高分子材料-亲水性聚合物-氯代毒素，分子排阻色谱法除去未反应的氯代毒素。上述基因递释载体与治疗基因质粒DNA形成50 400纳米大小的基因递释复合物，其中的阳离子高分子材料与治疗基因质粒DNA的质量比是广20:1。本发明还提供了氯代毒素修饰的脑胶质瘤靶向基因递释复合物的制备方法，其特征在于，其包括下述步骤
将制备的阳离子高分子材料-亲水性聚合物-氯代毒素基因递释载体溶于PH值7. 3 7. 5磷酸盐缓冲液中配制成所需浓度的溶液，将治疗基因质粒DNA溶于50 mM硫酸钠溶液中配制成所需浓度的溶液，室温下两者等体积漩涡30 s混勻制成基因递释复合物。本发明中，所述的阳离子高分子材料选自聚酰胺-胺型树状分枝物、树枝状聚赖氨酸、壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙稀酰胺、聚氨基酰胺或阳离子脂质。所述的亲水性聚合物选自聚乙二醇(polyethyleneglycol，简称PEG)、聚氧乙烯或聚-#-(2-羟丙基)-甲基丙稀酰胺。所述的治疗基因质粒DNA选自编码肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL)的质粒 pORF-TRAIL 和肿瘤抑制基因 P53、 PTEN、P21 或P16。本发明研究发现，观察不同浓度的CTX在脑胶质瘤C6细胞和肾上皮293细胞的摄取，荧光显微镜结果显示，CTX在C6细胞上的摄取随着浓度增加而增加，而对应浓度的CTX 在293细胞上则几乎不摄取，说明在一定的范围内，CTX在C6细胞上的摄取存在特异性和浓度依赖性，且CTX只被脑胶质瘤细胞摄取，表明CTX对脑胶质瘤细胞的特异靶向性。本发明中所述的CTX采用Traut’ s试剂进行巯基化，通过Ellman’ s试剂测定巯基化程度，测定结果显示PAMAM-PEG-CTX的产率为82. 4%，表明成功合成高分子基因递释载体 PAMAM-PEG-CTXo本发明所合成的基因递释载体PAMAM-PEG-CTX在C6细胞和293细胞上的摄取结果显示PAMAM-PEG-CTX在C6细胞上的摄取明显增加，在293细胞上则无显著变化，阳性对照载体PAMAM在C6细胞和293细胞上的摄取相当，表明经CTX修饰后可增加脑胶质瘤细胞的摄取。本发明所制备的基因递释复合物在C6细胞的摄取结果显示，经CTX修饰后，基因递释复合物的细胞摄取显著增加，进一步确证CTX的脑胶质瘤靶向作用。实验中，采用本发明提供的PAMAM-PEG-CTX/DNA基因递释复合物对荷脑胶质瘤裸鼠尾静脉注射，剂量为50 mg DNA/只小鼠，2小时置于Maestro 2活体成像仪中进行观察， 随后取出脑、心、肝、脾、肺、肾等脏器进行离体观察，结果表明，与未经修饰的PAMAM/DNA基因递释复合物比较，经CTX修饰的PAMAM-PEG-CTX/DNA基因递释复合物能够有效提高基因在脑部的摄取，同时减少肝脏和肾脏的摄取。在肿瘤模型建立后第12天，采用本发明的PAMAM-PEG-CTX/DNA基因递释复合物对荷脑胶质瘤ICR小鼠尾静脉注射，注射剂量为50 ygDNA。注射48小时后，小鼠乙醚麻醉， 迅速断头取脑，4%多聚甲醛固定48 h，相继置于15%和30%蔗糖中脱水至下沉，OCT包埋后-20 °C冷冻，作胶质瘤部位的连续冰冻冠状切片，切片厚度为20 μπι。切片和DAPI(300 ηΜ)室温孵育10 min染核，PBS洗2次，倒置荧光显微镜观察脑胶质瘤病灶部位的基因表达。 结果显示，与未经修饰的PAMAM/DNA基因递释复合物比较，经CTX修饰的PAMAM-PEG-CTX/ DNA基因递释复合物在胶质瘤内部表达显著增多。在肿瘤模型建立后第8天、第10天和第12天，分别采用本发明的PAMAM-PEG-CTX/ DNA基因递释复合物对荷脑胶质瘤ICR小鼠尾静脉注射，每次剂量为50 mg DNA/只小鼠，记录小鼠存活时间，结果表明，与未经修饰的PAMAM/DNA基因递释复合物比较，经CTX修饰的 PAMAM-PEG-CTX/DNA基因递释复合物能够有效延长荷瘤小鼠的存活时间。在肿瘤模型建立后第8天、第10天和第12天，分别采用本发明的PAMAM-PEG-CTX/ DNA基因递释复合物对荷脑胶质瘤ICR小鼠尾静脉注射，每次剂量为50 mg DNA/只小鼠， 第15天取全脑，4°C、4%的多聚甲醛溶液中固定48小时，4°C、15 %的蔗糖溶液中脱水6小时，4°C、30%的蔗糖溶液中脱水M小时，包埋、冷冻后进行冰冻切片，厚度为20 mm，随后进行TUNEL原位凋亡检测，结果表明，与未经修饰的PAMAM/DNA基因递释复合物比较，经CTX 修饰的PAMAM-PEG-CTX/DNA基因递释复合物能够更有效诱导胶质瘤细胞发生大量凋亡。本发明的突出优点在于，采用极具临床应用潜力的脑胶质瘤靶向头基——氯代毒素修饰阳离子高分子材料，增加基因在脑胶质瘤细胞的转染效率和表达水平，特别是，通过无创伤的静脉注射方式给药后显著提高基因递释复合物在脑胶质瘤病灶部位的表达。另外，本发明选用近年来出现的新型阳离子高分子材料PAMAM为基础载体，利用该树型高分子材料自身的一些优势如单分散性、无免疫原性、模拟体内分子特性等，使该基因递释复合物的转染效率较高且相对安全。本发明的氯代毒素修饰的基因递释复合物还可用于转染人体来源和动物来源的内皮细胞、上皮细胞、各种组织实质细胞和/或神经细胞。
图1是本发明中不同浓度CTX在C6和293细胞上的摄取结果图； 其中，CTX使用荧光染料BODIPY标记
A-D为C6细胞摄取结果
E-H为293细胞摄取结果 A，E =CTX 的浓度为 1 μ g/ml B，F:CTX 的浓度为 2 μ g/ml C，G:CTX 的浓度为 5 μ g/ml D，H :CTX 的浓度为 10 μ g/ml。图2是本发明中PAMAM和PAMAM-PEG-CTX在C6和293细胞上的摄取结果图； 其中，PAMAM使用荧光染料BODIPY标记
A:PAMAM 在 C6 细胞上的摄取结果，PAMAM:DNA (3:1，w/w)； B :PAMAM-PEG-CTX 在 C6 细胞上的摄取结果，PAMAMDNA (3:1，w/w)； C =PAMAM在四3细胞上的摄取结果，PAMAMDNA (3:1，w/w)； D :PAMAM-PEG-CTX 在 293 细胞上的摄取结果，PAMAMDNA (3 1，w/w)。图3是本发明中不同温度下PAMAM和PAMAM-PEG-CTX在C6细胞上的摄取结果图； 其中，PAMAM使用荧光染料BODIPY标记
A 37 0C 时 PAMAM 的摄取结果，PAMAMDNA (3:1，w/w)； B 37 0C 时 PAMAM-PEG-CTX 的摄取结果，PAMAMDNA (3:1，w/w)； C :4 °C 时 PAMAM 的摄取结果，PAMAMDNA (3:1，w/w)； D :4 °C 时 PAMAM-PEG-CTX 的摄取结果，PAMAMDNA (3:1，w/w)。图4是本发明中活体成像考察经CTX修饰前后的基因递释复合物靶向脑胶质瘤的效率结果其中，质粒DNA使用荧光染料EMA标记
A :PAMAM/DNA基因递释复合物在荷脑胶质瘤裸鼠脑部的蓄积情况； B :PAMAM/DNA基因递释复合物在荷脑胶质瘤裸鼠主要脏器(脑、心、肝、脾、肺和肾)的蓄积情况；
C :PAMAM-PEG-CTX/DNA基因递释复合物在荷脑胶质瘤裸鼠脑部的蓄积情况； D :PAMAM-PEG-CTX/DNA基因递释复合物在荷脑胶质瘤裸鼠主要脏器(脑、心、肝、脾、肺和肾)的蓄积情况。图5是本发明中冰冻切片考察不同基因递释复合物在脑胶质瘤的表达情况图其中，所载质粒DNA为编码绿色荧光蛋白的pEGFP质粒DNA ；
线条圈出区域为脑胶质瘤病灶部位；
A-C :PAMAM/DNA基因递释复合物在荷脑胶质瘤ICR小鼠脑胶质瘤病灶部位的表达结
果；
D-F :PAMAM-PEG-CTX/DNA基因递释复合物在荷脑胶质瘤ICR小鼠脑胶质瘤病灶部位的表达结果；
A，D =DAPI染细胞核的切片 B，E 绿色荧光表达的切片 C :A和B的叠加图片F :D和E的叠加图片。图6是本发明中荷脑胶质瘤ICR小鼠经不同治疗后的生存曲线图、
图7是本发明中原位TUNEL检测荷脑胶质瘤ICR小鼠脑内胶质瘤凋亡情况图； 其中，线条指示脑胶质瘤边缘，箭头指示凋亡区域 A 生理盐水
B :PAMAM-PEG-CTX/pGL2基因递释复合物 C 替莫唑胺胶囊 D 游离 pORF-TRAIL 质粒 DNA E :PAMAM/pORF-TRAIL基因递释复合物 F :PAMAM-PEG-CTX/pORF-TRAIL 基因递释复合物。
具体实施例方式实施例1.
PAMAM和含有双功能基团的PEG按照分子比1:2溶于pH 8.0的磷酸盐缓冲液(简称 PBS)中，室温搅拌反应120分钟，生成PAMAM-PEG，超滤除去未反应的PEG并更换缓冲液为 PH 7.0的PBS。与此同时，氯代毒素与Traut’s巯基化试剂反应后引入巯基基团，纯化后与 PAMAM-PEG按照1 1分子比混合，室温搅拌反应M小时后生成PAMAM-PEG-CTX，分子排阻色谱法除去未反应的氯代毒素即得PAMAM-PEG-CTX。实施例2.
PAMAM和含有双功能基团的PEG按照分子比1:6溶于pH 8. 0的PBS中，室温搅拌反应 120分钟，生成PAMAM-PEG，超滤除去未反应的PEG并更换缓冲液为pH 7. 0的PBS。与此同时，氯代毒素与Traut’ s巯基化试剂反应后引入巯基基团，纯化后与PAMAM-PEG按照3:1分子比混合，室温搅拌反应M小时后生成PAMAM-PEG-CTX，分子排阻色谱法除去未反应的氯代毒素即得PAMAM-PEG-CTX。实施例3.
将实施例1制备的PAMAM-PEG-CTX基因递释载体溶于适量pH 7. 4的PBS中配成300 mg/ml (以PAMAM的质量计算)的溶液，将pEGFP_N2绿色荧光蛋白治疗基因质粒DNA溶于适量的50 mM硫酸钠溶液中配制成100 mg/ml的溶液，室温下两者等体积漩涡30 s混勻制成 PAMAM-PEG-CTX/DNA基因递释复合物。实施例4.
将实施例1制备的PAMAM-PEG-CTX基因递释载体溶于适量pH 7. 4的PBS中配成600 mg/ml (以PAMAM的质量计算)的溶液，将pEGFP_N2绿色荧光蛋白治疗基因质粒DNA溶于适量的50 mM硫酸钠溶液中配制成100 mg/ml的溶液，室温下两者等体积漩涡30 s混勻制成 PAMAM-PEG-CTX/DNA基因递释复合物。实施例5.
将实施例1制备的PAMAM-PEG-CTX基因递释载体溶于适量pH 7.4的PBS中配成 300 mg/ml (以PAMAM的质量计算)的溶液，将pORF-TRAIL治疗基因质粒DNA溶于适量的50 mM硫酸钠溶液中配制成100 mg/ml的溶液，室温下两者等体积漩涡30 s混勻制成 PAMAM-PEG-CTX/DNA基因递释复合物。
实施例6.
将实施例1制备的PAMAM-PEG-CTX基因递释载体溶于适量pH 7.4的PBS中配成 600 mg/ml (以PAMAM的质量计算)的溶液，将pORF_TRAIL治疗基因质粒DNA溶于适量的50 mM硫酸钠溶液中配制成100 mg/ml的溶液，室温下两者等体积漩涡30 s混勻制成 PAMAM-PEG-CTX/DNA基因递释复合物。实施例7.
将实施例2制备的PAMAM-PEG-CTX基因递释载体溶于适量pH 7.4的PBS中配成 300 mg/ml (以PAMAM的质量计算)的溶液，将pORF_TRAIL治疗基因质粒DNA溶于适量的50 mM硫酸钠溶液中配制成100 mg/ml的溶液，室温下两者等体积漩涡30 s混勻制成 PAMAM-PEG-CTX/DNA基因递释复合物。实施例8.
将实施例1制备的PAMAM-PEG-CTX使用绿色荧光染料BODIPY标记，稀释成50 μ g/ml (以PAMAM计)，37 °C时与C6细胞孵育30 min后通过荧光显微镜观察，结果显示，与未经修饰的PAMAM比较，PAMAM-PEG-CTX在C6细胞上的摄取明显增加，表明经CTX修饰后可增加脑胶质瘤细胞的摄取，结果如附图2 A和B所示。实施例9.
将实施例1制备的PAMAM-PEG-CTX使用绿色荧光染料BODIPY标记，稀释成50 μ g/ml (以PAMAM计)，37 °C时与293细胞孵育30 min后通过荧光显微镜观察，结果显示，经CTX修饰前后，高分子基因递释载体在293细胞上的摄取相当，表明CTX修饰不增加正常细胞上基因递释载体的摄取，结果如附图2 C和D所示。实施例10.
将实施例1制备的PAMAM-PEG-CTX使用绿色荧光染料BODIPY标记，稀释成50 μ g/ml (以PAMAM计)，37 °C时与C6细胞孵育30 min后通过荧光显微镜观察，结果显示，37 °C时， 与未经修饰的PAMAM比较，PAMAM-PEG-CTX在C6细胞上的摄取明显增加，表明经CTX修饰后可增加脑胶质瘤细胞的摄取，且此细胞摄取显著高于4。C，表明其细胞摄是能量依赖性的过程，结果如附图3 A和B所示。实施例11.
将实施例1制备的PAMAM-PEG-CTX使用绿色荧光染料BODIPY标记，稀释成50 μ g/ml (以PAMAM计)，4 °C时与C6细胞孵育30 min后通过荧光显微镜观察，结果显示，4 °C时，经 CTX修饰前后，高分子基因递释载体在C6细胞上的摄取均非常少，表明其细胞摄取是能量依赖性的过程，结果如附图3 C和D所示。实施例12.
实施例5制备的基因递释复合物使用红色荧光染料EMA标记，经荷脑胶质瘤裸鼠尾静脉注射，剂量为50 mg DNA/只小鼠。2小时后处死，取脑置于Maestro 2活体成像仪中进行观察，结果表明，与未经修饰的PAMAM/DNA基因递释复合物比较，经CTX修饰的 PAMAM-PEG-CTX/DNA基因递释复合物能够有效提高基因在脑部的摄取，结果如附图4 A和C 所示。实施例13.
实施例5制备的基因递释复合物使用红色荧光染料EMA标记，经荷脑胶质瘤裸鼠尾静
8脉注射，剂量为50 mg DNA/只小鼠。2小时后处死，取出脑、心、肝、脾、肺、肾等脏器置于 Maestro 2活体成像仪中进行观察，结果表明，与未经修饰的PAMAM/DNA基因递释复合物比较，经CTX修饰的PAMAM-PEG-CTX/DNA基因递释复合物不仅能够有效提高基因在脑部的摄取，同时能减少肝脏和肾脏的摄取，结果如附图4 B和D所示。实施例14.
实施例5制备的基因递释复合物于荷脑胶质瘤ICR小鼠肿瘤模型建立后第12天尾静脉注射，注射剂量为50 yg DNA。注射48小时后，小鼠乙醚麻醉，迅速断头取脑，4%多聚甲醛固定48 h，相继置于15%和30%蔗糖中脱水至下沉，OCT包埋后-20 °C冷冻，作胶质瘤部位的连续冰冻冠状切片，切片厚度为20 ym0切片和DAPI (300 ηΜ)室温孵育10 min 染核，PBS洗2次，倒置荧光显微镜观察脑胶质瘤病灶部位的基因表达。结果显示，与未经修饰的PAMAM/DNA基因递释复合物比较，经CTX修饰的PAMAM-PEG-CTX/DNA基因递释复合物在胶质瘤内部表达显著增多，结果如附图5所示。实施例Ιδ.
荷脑胶质瘤ICR小鼠在肿瘤模型建立后第8天、第10天、第12天分别尾静脉注射实施例5制备的基因递释复合物，每次剂量为50 mg DNA/只小鼠，记录小鼠存活时间，结果表明，与未经修饰的PAMAM/DNA基因递释复合物比较，经CTX修饰的PAMAM-PEG-CTX/DNA基因递释复合物能够有效延长荷瘤小鼠的存活时间，结果如附图6所示。实施例16.
荷脑胶质瘤ICR小鼠在肿瘤模型建立后第8天，第10天，第12天分别尾静脉注射实施例5制备的基因递释复合物，每次剂量为50 mg DNA/只小鼠，第15天取全脑，4°C、4%的多聚甲醛溶液中固定48小时，4°C、15%的蔗糖溶液中脱水6小时，4°C、30%的蔗糖溶液中脱水M小时，包埋、冷冻后进行冰冻切片，厚度为20 mm,随后进行TUNEL原位凋亡检测，结果表明，与未经修饰的PAMAM/DNA基因递释复合物比较，经CTX修饰的PAMAM-PEG-CTX/DNA基因递释复合物能够更有效诱导胶质瘤细胞发生大量凋亡，结果如附图7所示。本发明上述实验中采用的PAMAM购自Sigma公司，氯代毒素序列为MCMPCFTTDHQM ARK⑶DCCGGKGRGKCYGPQ，购自北京中昊时代生物有线公司，双功能PEG购自北京键凯公司。通过上述实验，结果表明，本发明采用极具临床应用潜力的脑胶质瘤靶向头基——氯代毒素修饰阳离子高分子材料，增加基因在脑胶质瘤细胞的转染效率和表达水平，特别是，通过无创伤的静脉注射方式给药后显著提高基因递释复合物在脑胶质瘤病灶部位的表达。
权利要求
1.一种氯代毒素修饰的脑胶质瘤靶向基因递释复合物，其特征在于，由氯代毒素修饰的基因递释载体和治疗基因质粒DNA构成，所述的氯代毒素修饰的基因递释载体由阳离子高分子材料、亲水性聚合物和氯代毒素组成；其中，氯代毒素作为靶向头基，阳离子高分子材料为基础载体，通过亲水性聚合物连接氯代毒素构筑形成基因递释载体，该基因递释载体与治疗基因质粒DNA构筑成基因递释复合物；所述的亲水性聚合物与阳离子高分子材料的分子比是广20:1，氯代毒素与阳离子高分子材料的分子比为广10:1，所述的阳离子高分子材料与治疗基因质粒DNA的质量比是广20:1。
2.按权利要求1所述的氯代毒素修饰的脑胶质瘤靶向基因递释复合物，其特征在于， 所述的复合物的尺寸为50 400纳米。
3.按权利要求1所述的氯代毒素修饰的脑胶质瘤靶向基因递释复合物，其特征在于， 所述的阳离子高分子材料选自聚酰胺-胺型树状分枝物、树枝状聚赖氨酸、壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙稀酰胺、聚氨基酰胺或阳离子脂质。
4.按权利要求1所述的氯代毒素修饰的脑胶质瘤靶向基因递释复合物，其特征在于， 所述的亲水性聚合物选自聚乙二醇、聚氧乙烯或聚-N-(2-羟丙基)-甲基丙稀酰胺。
5.按权利要求1所述的氯代毒素修饰的脑胶质瘤靶向基因递释复合物，其特征在于， 所述治疗基因质粒DNA选自质粒pORF-TRAIL和肿瘤抑制基因P53、PTEN、P21或P16。
6.权利要求1所述的氯代毒素修饰的脑胶质瘤靶向基因递释复合物的制备方法，其特征在于，其包括步骤将制备的阳离子高分子材料-亲水性聚合物-氯代毒素基因递释载体溶于PH值7. 3 7. 5磷酸盐缓冲液中配制成所需浓度的溶液，将治疗基因质粒DNA溶于50 mM硫酸钠溶液中配制成所需浓度的溶液，室温下两者等体积漩涡30 s混勻制成基因递释复合物。
7.按权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的基因递释复合物为50 400纳米。
8.按权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的基因递释载体中，阳离子高分子材料、亲水性聚合物和氯代毒素以共价方式连接。
9.按权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的基因递释载体通过下述步骤制备阳离子高分子材料和亲水性聚合物以1 Γ20的分子比溶于pH值7. 8 8. 2磷酸盐缓冲液中，室温搅拌反应60 180分钟，两种分子中含有的基团发生特异性反应，生成阳离子高分子材料-亲水性聚合物，超滤法除去未反应的亲水性聚合物并更换为pH值6. 8 7. 2 磷酸盐缓冲液；同时，氯代毒素与巯基化试剂反应后引入巯基，以1 10:1的分子比与阳离子高分子材料-亲水性聚合物上的特异基团室温搅拌反应12 36小时后生成阳离子高分子材料-亲水性聚合物-氯代毒素，分子排阻色谱法除去未反应的氯代毒素。全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及一种氯代毒素修饰的脑胶质瘤靶向基因递释复合物及其制备方法，本发明通过亲水性聚合物将氯代毒素修饰于阳离子高分子材料上，与质粒DNA通过静电作用复合形成基因递释复合物。本发明能有效增加基因在脑胶质瘤细胞的转染效率和表达水平，特别是通过无创伤的静脉注射方式给药后显著提高基因递释复合物在脑胶质瘤病灶部位的基因表达。本发明中的氯代毒素修饰的基因递释复合物还可用于转染人体来源和动物来源的内皮细胞、上皮细胞、各种组织实质细胞和/或神经细胞。
文档编号A61K47/42GK102462846SQ20101053501
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月8日 优先权日2010年11月8日
发明者柯伟伦, 蒋晨, 黄容琴 申请人:复旦大学