专利名称：一种靶向乙型肝炎病毒基因的siRNA分子及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种靶向乙型肝炎病毒基因的SiRNA分子及其应用。
背景技术：
肝炎，即肝脏炎症，有多种致病因素-如病毒、细菌、寄生虫、化学毒物、药物和毒 物、酒精等，侵害肝脏，使得肝脏的细胞受到破坏，肝脏的功能受到损害，它可以引起身体的 一系列不适症状，以及肝功能指标的异常。肝炎多数情况下指是由甲型、乙型、丙型、丁型、 戊型等肝炎病毒引起的病毒性肝炎。乙型肝炎病毒Ofepatitis B virus, HBV)感染导致的乙型肝炎，是一种严重威胁 全球人类健康的的传染性疾病，也是最严重类型的病毒性肝炎，它可造成慢性肝病，患者死 于肝硬化和肝癌的风险极高。HBV属嗜肝DNA病毒科Ofepadnaviridae)，全基因组长约3. 2kb，为部分双链环状 DNA。其基因组共有四个开放阅读框(Open Reading Frame，0RF)，编码蛋白包括表面抗原 (S基因)，核心抗原(C基因)，聚合酶蛋白(P基因)和X蛋白(C基因)。据世界卫生组织报道，全世界估计有20亿人感染HBV，其中有3. 5亿以上的人为慢 性乙肝感染者，估计每年有60万人死于急性或慢性乙型肝炎。HBV可造成急性病患，症状可 持续数周，包括皮肤和眼睛发黄(黄疸)，尿色深，极度疲劳，恶心，呕吐和腹痛。患者可能需 要数月乃至一年才能痊愈。乙型肝炎病毒也会造成慢性肝脏感染，以后可能发展成肝硬化 或肝癌。乙型肝炎病毒通过与受感染者的血液或其他体液(比如，精液和阴道分泌物)接 触而在人与人之间传播，传播途径与人类免疫缺陷病毒(艾滋病毒)相同。乙型肝炎病毒 的传染性比艾滋病毒强50-100倍，乙型肝炎病毒在体外可存活至少7天以上。在此期间， 如果病毒进入未感染者的身体，它依然可造成感染。病毒潜伏期平均达90天，但也可能为 大约30至180天不等。乙型肝炎病毒在感染后30至60天即可发现，持续时间差别很大。目前主要是通过婴儿接种乙型肝炎疫苗来预防乙型肝炎的发生，但尽管如此，人 群HBV流行率仍然很高。目前主要治疗慢性乙型肝炎的方法仅局限于抑制患者体内病毒基 因的表达和复制。如口服核苷类抗病毒药-拉米夫定，主要功能是抑制HBV的复制，但是停 药后复发率高，长期应用则可导致病毒变异，在用药6个月后发生由病毒聚合酶基因发生 变异引起的耐药性，使得临床抗病毒治疗面临极大的挑战。近几年来，随着RNA干扰(RNAi)技术的迅猛发展，为疾病尤其是癌症开辟了 全新的治疗途径，为科研工作者提供了一个全新的基因治疗方法。该技术通过用小 干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)干扰特定靶基因的表达，来达到治疗疾病 的目的，是基因治疗的重要组成部分。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是由双链 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)引发的转录后基因沉默机制。其作用机制是核糖核 酸酶III家族的Dicer酶，与dsRNA结合，将其剪切成21_23nt及3’端突出的siRNA，随后 siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合到靶信使RNA(mRNA)上并将其切 断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达。RNAi已作为一种简单有效的基因 敲除的技术，广泛地应用于功能基因组学研究以及抗病毒、抗肿瘤治疗的研究中。本发明提供了一种用RNAi技术来抗HBV的方法。应用RNA干扰技术，用靶向至 HBV基因的siRNA作为靶向药物，在基因的转录后进行干扰，从而有效抑制HBV的蛋白表达 和病毒复制，具有特异性强、高效、副作用小、可持续用药的优势，且能弥补目前治疗乙型肝 炎药物的不足，在不久的将来可能成为一种新的治疗乙型肝炎的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过siRNA全位点分子库技术筛选出的高效靶向HBV 基因的双链siRNA分子，其下述正义链和反义链组成正义链5，-CCAAACCUUCGGACGGAAAUUGCNN-3，(SEQID NO 3)反义链5，-GCAAUUUCC⑶CCGAAG⑶UUGGNN-3，(SEQID NO 4)其中，N是A、T、C、G或U碱基的任何一种。换言之，该双链siRNA分子的主干序列为正义链5，-CCAAACCUUCGGACGGAAAUUGC-3，(SEQID NO 5)反义链5，-GCAAUUUCC⑶CCGAAGGUUUGG-3，(SEQID NO 6)在一个优选的实施方式中，上述序列中3，端的“NN”是两个脱氧胸腺嘧啶dTdT。本发明的另一目的在于提供上述siRNA分子在制备抗HBV药物中的应用。体外实验证明，本发明的siRNA分子的反义链可特异性地与HBV聚合酶基因的 mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，抑制HBV蛋白质翻译和病毒复制，达到抗 HBV的治疗目的。
图1是抽提的HBV基因组琼脂糖凝胶电泳检测图。M为Ikb plus DNA Ladder (标 准参照)。图2A HBV聚合酶片段1琼脂糖凝胶电泳检测图，制备得到的DNA片段大小为 1625bp。图2B是HBV聚合酶片段2琼脂糖凝胶电泳检测图，制备得到的DNA片段大小为 874bp。M 为 Ikb plus DNA Ladder (标准参照)。图3是siRNA分子库构建流程示意图。图4是TO-siRNA转录模板-Hl表达框结构示意图。图5是PCR制备的TO-siRNA转录模板-Hl表达框纯化后琼脂糖凝胶电泳检测图。 图中，M 为 Ikb plus DNA Ladder (标准参照)；1 为 HBV-22 ；2 为 HBV-676 ；3 为 HBV-877 ；4 为 HBV-638 ；5 为 HBV-1003 ；6 为 HBV-748 ；7 为 HBV-182 ；8 为 HBV-261 ；9 为阴性对照。图6是表达框转染细胞后实时定量PCR检测HBV聚合酶基因mRNA表达量柱形图， 纵坐标表示HBV聚合酶基因mRNA表达水平；横坐标表示处理实验组，"Negative Control” 为阴性对照组。图7是化学合成的siRNA转染细胞后实时定量PCR检测HBV聚合酶基因mRNA表达 量柱形图，纵坐标表示HBV聚合酶基因mRNA表达水平；横坐标表示处理实验组，"NegativeControl”为阴性对照组。
具体实施例方式本发明中诸如“siRNA”、“siRNA序列”或“siRNA分子”等术语可以互换，其表示的 意思和范围相同。其中，siRNA序列可以是单链结构，也可以是双链结构。本发明的siRNA分子来源于针对HBV聚合酶基因的功能保守区而制备的siRNA分 子库，本发明所用siRNA全位点分子库技术是百奥迈科生物技术有限公司的专利技术(中 国发明专利号为ZL 200710024217. 6，专利名称PCR高通量构建siRNA全位点分子库制备 方法)，其优点在于所制备得到的siRNA随机分布于HBV聚合酶基因区段，长度可控性分布 于 18-25bp，可以提高有效靶位点的命中率。siRNA的制备可采用多种方法，比如化学合成法、体外转录、酶切长链dsRNA、载 体表达siRNA、PCR合成siRNA表达元件等，这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间， 可以更好地获得基因沉默效率。本发明的siRNA分子可以作为抗HBV药物的有效成分。作为该siRNA分子的另一种表达形式，可将其制备成DNA表达框形式，比如:U6启 动子-siRNA转录模板-Hl启动子。简言之，在下文中将“TO启动子-siRNA转录模板-Hl启动子”简写为“TO_siRNA 转录模板-Hl ”或“U6-siRNA-Hl ”，它们表示的意思和范围相同。出于应用目的，可将siRNA分子、表达siRNA分子的DNA表达框、或者包含siRNA 分子表达框的质粒作为药物直接给药于受药者身上特定部位，比如病灶组织。本发明的药物的剂型可以为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地 保持siRNA分子的活性。比如，对于注射用给药系统，剂型可以是冻干粉。任选地，上述药物剂型中可以包含任何药学可接受的辅助剂，只要其适合于相应 的给药体系、并且恰当地保持siRNA分子的活性。为了实现本发明的设计思想并验证筛选得到的siRNA的抗HBV效果，设计了如下
实验方案(1)构建HBV聚合酶基因的siRNA分子库，该分子库中包含靶向至HBV聚合酶基因 的siRNA效应分子，长度分布于18-25bp。(2)制备具有相应效应的siRNA表达框，其结构为U6启动子-siRNA转录模板-Hl 启动子，使其更易于体外筛选。(3)运用实时定量PCR技术，检测上述siRNA表达框在细胞中转录出的效应siRNA 分子对HBV聚合酶基因的抑制作用。(4)化学合成上述方法筛选得到的最优靶点siRNA，在体外细胞实验中进一步运 用实时定量PCR技术检测HBV聚合酶基因的mRNA表达水平。下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。实施例1siRNA全位点分子库的制备
1.主要仪器、试剂和材料1. 1仪器PCR仪(ABI公司)；电转仪(Bio-Rad公司)；离心机(Eppendorf公司)， 长波长紫外灯等。1. 2材料和试剂!fepG22· 2. 15细胞(百奥迈科公司保存)；Ikb plus DNA Ladder (invitrogen 公司)；DNase I (Roche 公司)；MnCl2 (BBI 公司)；磷酸接头 (Sigma-aldrich 公司)；ATP (BBI 公司)；BSA (NEB 公司)；BmsbI (NEB 公司)；T4DNA 连 接酶(NEB公司)；Tag DNA聚合酶(百奥迈科公司)；琼脂糖(BBI公司)；dNTP(上海生 工)；酚氯仿抽提试剂(上海生工)；低分子量DNA Ladder(NEB公司)；EcoP15I (NEB公 司)；T4DNA聚合酶(NEB公司)；FokI酶(NEB公司)；SfiI酶(NEB公司)；感受态细胞 (invitrogen公司)；pU6Hl_GFP表达载体(NT Oimcs公司)。凝胶抽提试剂盒=QIAEX II Gel Extration Kit (QIAGEN公司)；质粒抽提试剂盒(百奥迈科公司)。其他生化试剂均 购于 Sigma-aldrich 公司。2. siRNA全位点分子库的构建2. IHBV聚合酶基因的获得从细胞H印G22. 2. 15的基因组DNA(如图1所示)中 PCR扩增HBV聚合酶片段。HepG22. 2. 15细胞含2个拷贝的HBV基因组，能稳定分泌HBsAg、 HBeAg, HBcAg及Dane颗粒，并可检测到细胞内HBV的DNA和RNA等中间复制体(Sells et al. Proc Natl Acad Sci，1987 ;84 :1005_1009)，其含有 HBV 的血清亚型为 ayw(GenBank Accession number :U95551)，根据GenBank报道的核酸序列设计PCR扩增引物，分成两个 片段为HBV聚合酶片段1和HBV聚合酶片段2，长度分别为1625bp (如图2A所示)和 874bp (如图2B所示)。引物序列如下HBV聚合酶片段1上游引物5，-AATTCCACAACCTTTCACCAA-3’ ；
HBV聚合酶片段1下游引物5，-TCACGGTGGTCTCCATGCGA-3 ^ ；
HBV聚合酶片段2上游引物5，-ATGCCCCTATCCTATCAACAC-3，；
HBV聚合酶片段2下游引物5，-CCACTGCATGGCCTGAGGAT-3，。
1)HBV聚合酶片段1序列
1aattccacaacctttcaccaaactctgcaagatcccagagtgagaggcctgtatttccct
61gctggtggctccagttcaggagcagtaaaccctgttccgactactgcctctcccttatcg
121tcaatcttctcgaggattggggaccctgcgctgaacatggagaacatcacatcaggattc
181ctaggaccccttctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaagaatcctcacaata
241ccgcagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctagggggaactaccgtgtgt
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781ttgagtccctttttaccgctgttaccaattttcttttgtctttgggtatacatttaaacc
1. 1仪器PCR仪(ABI公司)；实时定量PCR仪(Bio-Rad公司)；凝胶电泳设备 (北京六一)；长波长紫外灯；细胞培养箱(Thermo公司)等。1. 2 材料和试剂lkb plus DNA Ladder (invitrogen 公司)；Pfu DNA 聚合酶(百 奥迈科公司)；琼脂糖(BBI公司)；dNTP (上海生工)；琼脂糖凝胶纯化试剂盒(百奥迈科 公司)，Lipofectamin 2000 (invitrogen 公司)，DMEM 培养基(Gibco 公司)，TurboCapture mRNA kit(QIAGEN 公司)，SensiMix One-Step Kit (Quantace 公司)等。其他生化试剂均 购于上海生工。1 3PCR引物(百奥迈科合成)5，U6 启动子引物5，-AAGGTCGGGCAGGAAGAGGGC-3，3，HI 启动子引物5，-TATTTGCATGTCGCTATGTGTTCT-3，HBV 聚合酶正向引物5，-TGTGGTTATCCTGCGTTAATG-3，HBV 聚合酶反向引物5，-GCGTCAGCAAACACTTGG-3，GAPDH 正向引物5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，GAPDH 反向引物5，-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，2. siRNA表达框的制备2. 1PCR扩增制备TO-siRNA转录模板-H1表达框选取8例HBV聚合酶siRNA阳 性克隆质粒为模板，用高保真酶Pfu DNA聚合酶通过PCR的方法扩增制备TO-siRNA转录模 板-HI表达框(图3为表达框示意图)。各PCR反应体系为50 u 1反应体系0. 5 ill模板DNA(10-50ng) 1 5，U6启动 子引物(10uM),lu 1 3，HI 启动子引物(10u M), 1 U 1 dNTP (10mM), 0. 5 u 1 Pfu DNA 聚合 酶，用ddH20补足到50iil。反应条件为:95°C lmin预变性，95°C 15sec变性，58°C 30sec退 火，72°C 30sec延伸，20个循环。1. 0%琼脂凝胶电泳检测，PCR产物条带单一，片段大小符
合实验要求。2. 2表达框PCR产物纯化1. 0%琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增得到的表达框，并 用琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化凝胶产物。纯化后的DNA再次进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳检 测，纯化后的TO-siRNA转录模板-HI表达框纯度和浓度符合要求，如图4所示。同时用紫 外分光光度计测得制备后的表达框浓度约为200ng/ia。3.靶位点筛选3. 1细胞培养肝癌细胞IfepG22. 2. 15在含10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% C02培养箱培养。3. 2细胞铺板并转染将细胞按IX 105/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含 10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% C02培养箱培养过夜。转染按照LipofectaminTM2000的说明书转染，U6_siRNA转录模板-HI表达框DNA 量按0. 2iig/孔加入。3. 3实时定量PCR检测HBV聚合酶基因mRNA水平用mRNA提取纯化试剂盒 TurboCapture mRNA kit提取纯化细胞RNA，操作按试剂盒说明书进行，用80 yl无RNase 水/孔溶解RNA，取4 ill RNA为模板进行实时定量PCR反应。用基因特异性引物检测样本中HBV聚合酶基因mRNA表达水平，同时扩增看家基因 GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行实验。建立如下25 u 1的反应体系4 u 1模板
8RNA, 12. 5u 1 2XSensiMix One-Step, 1 u 1 5，正向引物(6 ii M)，1 ii 1 3，反向引物(6 ii M)， 0. 5u 1 50XSYBR Green I，用无RNase水补足体系至25 yl。反应条件42°C反转录30min， 95°C预变性 7min，95°C变性 20sec，60°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，循环 45 次。3. 4结果分析用实时定量PCR 2_AAet法分析实验结果，并作出柱状图，如图5 所示，结果显示对应于HBV聚合酶基因多个位点的siRNA均呈现较好的沉默效果，尤其是 HBV-22，相对于未转染组其沉默效果达到66%。尤其需要说明的是，HBV-22正义链序列与HBV聚合酶基因的第575-597位(下划 ccaaaccttcggacggaaattgc) t目实施例3化学合成siRNA验证沉默效果1.主要仪器、试剂和材料1. 1仪器核酸合成仪(GE公司)、PCR仪(ABI公司)；实时定量PCR仪(Bio-Rad 公司)；细胞培养箱(Thermo公司)等。1. 2 材料和试剂Lipofectamin 2000 (invitrogen 公司)，DMEM 培养基(Gibco 公 司)，TurboCapture mRNA kit(QIAGEN 公司)，SensiMix One-Step Kit(Quantace 公司) 等。其他生化试剂均购于上海生工。1 3PCR引物(百奥迈科合成)HBV 聚合酶正向引物5，-TGTGGTTATCCTGCGTTAATG-3，HBV 聚合酶反向引物5，-GCGTCAGCAAACACTTGG-3，GAPDH 正向引物5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，GAPDH 反向引物5，-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，2.化学合成制备siRNA利用百奥迈科生物技术有限公司拥有的核酸合成仪(美国GE公司)分别合成 siRNAl的正义链(sense strand)和反义链(antisense strand)的RNA。并进行纯化，将 正义链和对应的反义链退火成siRNA双链(duplex)，分装10D/管，最后冷冻干燥，转染前用 无RNase水溶解至20 u M。3.沉默效率验证3. 1细胞培养肝癌细胞IfepG22. 2. 15在含10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% C02培养箱培养。3. 2细胞铺板并转染将细胞按IX 105/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含 10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% C02培养箱培养过夜。转染按照LipOfeCtaminTM2000的说明书转染，RNA按lOnM/孔加入。3. 3实时定量PCR检测HBV聚合酶基因mRNA水平用mRNA提取纯化试剂盒 TurboCapture mRNA kit提取纯化细胞RNA，操作按试剂盒说明书进行，用80 yl无RNase 水/孔溶解RNA，取4 ill RNA为模板进行实时定量PCR反应。用基因特异性引物检测样本中HBV聚合酶mRNA表达水平，同时扩增看家基因 GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行。建立如下25 ill反应体系4 ill模板RNA， 12. 5 ii 12X SensiMix One-Step, 1 u 1 5，正向引物(6 ii M)，1 ii 1 3，反向引物(6 ii M)， 0. 5u 150XSYBR Green I，用无RNase水补足体系至25 yl。反应条件42°C反转录30min，95°C预变性 7min，95°C变性 20sec，60°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，循环估次。
3. 4结果分析用实时定量PCR 2_AAet法分析实验结果，并作出柱状图，如图6所 示，结果显示靶向至HBV聚合酶基因的HBV-22的沉默效果达到90%。
权利要求
一种靶向乙型肝炎病毒基因的siRNA分子，其特征在于，具有如下序列结构正义链5’ CCAAACCUUCGGACGGAAAUUGCNN 3’SEQ ID NO3，反义链5’ GCAAUUUCCGUCCGAAGGUUUGGNN 3’SEQ ID NO4，其中，N是A、T、C、G或U碱基的任何一种。
2.如权利要求1所述的靶向乙型肝炎病毒基因的siRNA分子，其特征在于，所述N为
3.权利要求1 2中任一项所述的siRNA分子在制备抗病毒药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的病毒为乙型肝炎病毒。
全文摘要
本发明涉及一种靶向乙型肝炎病毒聚合酶基因的双链siRNA分子及其应用。该siRNA分子正义链为SEQ ID NO3，反义链为SEQ ID NO4，其中，反义链可特异性地与HBV聚合酶基因的mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，达到抗乙型肝炎病毒的目的。
文档编号A61P31/20GK101979558SQ20101052200
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月28日 优先权日2010年10月28日
发明者M·格拉汉姆, 付博峻, 唐小军, 孙云成, 朱远源, 李铁军, 王晋康, 陆毅祥 申请人:百奥迈科生物技术有限公司