专利名称：多孔组织工程支架的制备方法
技术领域：
本发明属于材料加工制备技术领域，具体涉及一种多孔组织工程支架的制备方法。
背景技术：
组织工程支架起了引导细胞到预定位置、给工程化组织限定一定的空间的作用， 它不仅为特定的细胞提供结构支撑作用，以抗击压力等外力，在体内维持组织形状和骨架 完整性，而且还起到一定的模板作用，为细胞提供附着场所，减少细胞失活，并能引导特殊 的细胞功能和调节细胞间的相互作用；支架材料还能够引导组织再生和控制组织结构以及 可构成宿主免疫系统分子的物理障碍，避免人体免疫反应。将具有良好生物相容性和生物 降解吸收性能的生物材料制成具有特定形状和孔结构的三维多孔细胞支架是组织工程的 技术关键之一。组织工程支架一般应具备以下要求(1)良好的生物相容性，即无明显的细胞毒 性、炎症反应和免疫排斥；(2)良好的可生物降解吸收性，即在体外以及植入体内后降解和 吸收的速度应与细胞组织生长的速度相匹配；(3)合适的孔尺寸、高孔隙率(一般要求孔隙 率50% -90% )和相互连通的孔壁结构，以利于大量细胞的种植及细胞和组织的生长、细胞 外基质的形成、氧和营养物质的传输、代谢物的排泄以及血管和神经的内生长；(4)必须具 有足够的力学强度，在组织工程研究与临床应用中不会塌陷，以在体内生物力学微环境中 保持结构稳定性和完整性，并为植入细胞提高合适的微应力环境；(5)高的表面积和适宜 的表面理化性质以利于细胞粘附、增殖和分化以及负载生长因子等生物信号分子；(7)由 于所用的材料与人体直接接触，为了防止感染，材料还必须易于消毒。不同的组织或不同的解剖部位对细胞支架的形状和结构的要求不同，不同组织和 器官的细胞的形状和大小不同，对支架要求也不同。在制备组织工程支架时，不但要考虑材 料的生物相容性、降解速度和力学性能，还要考虑支架的表面理化性质和支架的表面积、孔 隙率以及孔尺寸等因素。支架的生物相容性取决于所用材料的生物相容性和支架的表面性 质，支架的力学性质和降解速率则由材料的分子量及其分布、组成、结晶性、亲疏水性和支 架的孔隙率、孔尺寸、孔形态等因素决定，植入体内后还与植入部位的微环境有关。其多孔 结构和外形主要由支架制备方法决定，其表面理化性质和形态则主要取决于所用材料的性 质和制备方法，也可通过其它方法加以改进。在组织工程中，支架往往要求具有多孔和开放的孔结构，这样有利于促进细胞的 种植、粘附、增殖和分化、细胞外基质的形成、血管化和组织在体内的生长。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备多孔组织工程支架的方法，采用该方法，脱模容 易，浙滤造孔剂粒子所用时间短，大大缩短了制作支架的时间，可以比较准确地准确控制支 架的孔隙率和大孔的尺寸，制备的多孔组织工程支架具有高孔隙率和相互连通的、开放的孔壁结构。本发明多孔组织工程支架的制备方法如下称取高分子生物材料，加入溶剂二 氯甲烷或三氯甲烷进行溶解；然后加入造孔剂NaHCO3或Na2CO3的水合物粒子(NaHCO3或 Na2CO3的水合物粒子即含有1，7或10个水分子的Na2CO3或NaHCO3)或两者的混合粒子并搅 拌均勻，再将混合物倒在平铺的玻璃上，流延成膜，在半干状态下将膜加入到模具中，压制 成型；将成型的样品通风干燥；再将样品用强酸浸泡，然后用去离子水水洗、浸泡，真空干 燥即得聚合物支架。所述的高分子生物材料包括所有能溶解于二氯甲烷或三氯甲烷的高分子生物 材料，包括但不限于聚乳酸(PLA)及其共聚物、聚乙醇酸(PGA)、聚(丙交酯-乙交酯) (PLGA)、聚己内酯(PCL)、壳聚糖、胶原等中的一种或几种。所述的高分子生物材料与二氯甲烷或三氯甲烷的用量比例为1. 0g/10ml。所述的NaHCO3或Na2CO3水合物粒子或两者的混合粒子的添加量占高分子生物材 料和造孔剂的总质量的30% -95%。所述的NaHCO3或Na2CO3或两者的混合粒子的粒径范围0. 10-0. 45mm。所述的膜厚度为0. 1-0. 2mm。所述的半干状态为溶剂的含量为最初的10% -30%。所述的强酸浸泡是指在1. 0-5. Omol/L盐酸、硫酸、硝酸或醋酸中浸泡3_5小时。所述的成型样品通风干燥4-6小时；再用强酸浸泡3-5小时，然后用去离子水水洗 3次，再用去离子水浸泡12小时，每4小时换一次水；在40°C，-0. IMPa下干燥4_8小时真 空干燥即得聚合物支架。本发明的特点1、采用NaHCO3或Na2CO3的水合物作造孔剂，由于NaHCO3或Na2CO3的水合物颗粒 大，研磨时不分解，便于研磨，容易制得各粒径范围的造孔剂粒子，从而可通过控制造孔剂 粒子的粒径范围和添加量来控制支架中大孔的尺寸和支架的孔隙率。2、NaHCO3或Na2CO3的水合物易溶于水，可与强酸反应而快速除去，从而大大加快 了浙滤造孔剂时间，大大缩短了制作支架的时间，而传统的NaCl粒子浙滤需要3到5天时 间，本发明的浙滤时间只有15小时。3』&!10)3或Na2CO3的水合物与强酸反应生成CO2，有利于形成开放的孔壁结构，这 更有利于细胞的种植、粘附、增殖和分化、细胞外基质的形成。4、将混合物流延成膜，干燥快，将半干的薄膜常温压制成型后，由于小量溶剂的存 在，有润滑作用，有利于支架的脱模。本发明的优势脱模容易，浙滤造孔剂粒子所用时间短，大大缩短了制作支架的时 间(传统的NaCl粒子浙滤需要3到5天时间，本发明的浙滤时间只有15小时)，可以比较 准确地控制支架的孔隙率和大孔的尺寸，孔隙均勻，无残留物体，制备的多孔组织工程支架 具有高孔隙率和相互连通的、开放的孔墙结构。
图1为实施例1的P (LLA-CL) 75/25多孔泡沫支架外观形貌图；图2为实施例1中NaHC03/Na2C03水合物的质量百分比与支架孔隙率之间的关系图；图3为实施例1中以不同粒径范围的NaHC03/Na2C03颗粒作造孔剂制得的 P (LLA-CL) 75/25多孔泡沫支架外观形貌图；a. 0. 30-0. 45mm ；b. 0. 20-0. 30mm ；c. 0. 15-0. 20mm ；d. 0. 12-0. 15mm ；e. < 0. 125mm图4为实施例2的PLGA支架横断面扫描电镜形貌；图5为实施例2的细胞与支架复合物的扫描电镜图；图6为实施例3的PLGA/壳聚糖导管形貌图；图7为实施例3的PLGA/壳聚糖导管支架表面的扫描电镜图(a)200X ； (b)2000X ；图8为实施例3的修复24周时的SD大鼠坐骨神经断裂带再生照片。
具体实施例方式根据所制备的组织工程支架的形状及要求不同，本发明可以有多种实施方案。通过下列实施实例可以更好的理解本发明，但这些实施实例并不是用来限制本发 明。实施例1聚(L-丙交酯-co-己内酯)75/25 (P (LLA-CL) 75/25)多孔泡沫支架的制 备首先，用玻璃小瓶称取P (LLA-CL) 75/25，溶入适量的二氯甲烷中。把NaHC03/Na2C03 水合物粒子研磨、筛分为不同直径范围的粒子。第二，把一定重量一定直径范围的NaHCO3/ Na2CO3水合物粒子加入聚合物溶液中，以超声波振荡搅拌均勻，再将其倾斜倒在干净的玻璃 上，流延成膜，在半干状态下将膜加入到模具中，压制成型。第三，将样品放置通风橱中，室 温下干燥6小时。第四，样品先用4. Omol/L盐酸浸泡3小时，再用蒸馏水洗三次，然后用蒸 馏水浸泡12小时，每4小时换一次水，都是在室温下进行。第五，将样品放在真空干燥箱中， 在40°C、_0. IMPa下干燥6小时。干燥后即得多孔支架，如图1所示。以P (LLA-CL) 75/25为原料，造孔剂NaHC03/Na2C03水合物颗粒直径都是 0. 125-0. 300mm，但造孔剂的质量百分比(指造孔剂占聚合物和造孔剂质量总和的百分比， 以下同)不同，制备多孔支架，支架孔隙率与造孔剂的质量百分比之间的关系如图2所示。 从图上可以看出，支架的孔隙率随着造孔剂与聚合物的质量比增大而增大，几乎成正关系， 当造孔剂的质量百分比增大到90%时，支架的孔隙率可达90%，但是当造孔剂的质量百分 比进一步增大到95%时，支架的孔隙率为94%。以P (LLA-CL) 75/25为原料，以直径范围不同的NaHC03/Na2C03水合物颗粒作造孔 剂，而造孔剂占P (LLA-CL) 75/25和造孔剂总重量的质量百分比均是90 %，制备多孔支架。 以不同粒径范围的NaHC03/Na2C03颗粒作造孔剂制得的支架的表面形貌扫描电镜图如图3 所示。从图3可看出，支架的多孔结构相互连通，孔的尺寸随着造孔剂尺寸的增大而增大。实施例2PLGA多孔泡沫支架的制备首先，用玻璃小瓶称取PLGA，溶入适量的二氯甲烷中。把NaHC03/Na2C03水合物 粒子研磨、筛分为不同直径范围的粒子。第二，把直径范围为0. 125 0. 300mm的NaHCO3/ Na2CO3粒子加入聚合物溶液中，NaHC03/Na2C03粒子的添加量为占高分子材料和造孔剂总重 量的90%，以超声波振荡搅拌均勻，再将其倾斜倒在干净的玻璃上，流延成膜，在半干状态下将膜加入到模具中，压制成型。第三，将样品放置通风橱中，室温下干燥6小时。第四，样 品先用4. Omol/L盐酸浸泡3小时，再用蒸馏水洗三次，然后用蒸馏水浸泡12小时，每4小 时换一次水，都是在室温下进行。第五，将样品放在真空干燥箱中，在40°C、-0. IMPa下干燥 6小时。干燥后即得多孔支架，支架的孔隙率为89. 8%，大孔的范围是100-300 μ m，如图4。 将其用于人脂肪间充质干细胞(AMSCs)体外诱导成软骨培养，培养2周时的细胞与支架复 合物的扫描电镜图如图5，从图上可以看出，复合物表面出现网状白色组织，细胞分泌大量 细胞外基质，表明细胞生长活跃。实施例3多孔导管支架的制备第一，用玻璃小瓶分别称取一定量的PLGA和壳聚糖，制成10%的二氯甲烷溶液。 PLGA与壳聚糖的质量比为65/35。第二，把直径范围小于0. 125mm的NaHC03/Na2C03水合物 颗粒加入高分子溶液中，高分子材料与造孔剂的质量比为4 6，搅拌均勻，再将其倾斜倒 在干净的玻璃上，流延成膜，在半干状态下将膜加入到模具中，压制成型。第三，把样品从模 具上取出，室温下，在通风橱中干燥4h。第四，把样品放入2. Omol/L盐酸溶液中浸泡3h，再 换用去离子水浸泡12h，每4h换一次水。第五，放入真空干燥箱中，在40°C、_0. IMPa下干燥 4h即得聚合物导管支架，支架的孔隙率为58. 9%，大孔约50-100 μ m，如6和7。将其用于 SD大鼠坐骨神经断裂带修复再生，修复24周时的SD大鼠坐骨神经断裂带再生照片如图8 所示，从图可以看出，在结合点附近没有出现导管的脱落，也没有出现神经瘤；结合处周围 的肌肉组织颜色红润，没有炎症和坏死现象；坐骨神经断裂带已再生。
权利要求
一种多孔组织工程支架的制备方法，其特征在于，称取高分子生物材料，加入溶剂二氯甲烷或三氯甲烷进行溶解；然后加入造孔剂NaHCO3或Na2CO3的水合物粒子或两者的混合粒子并搅拌均匀，再将混合物倒在平铺的玻璃上，流延成膜，在半干状态下将膜加入到模具中，压制成型；将成型的样品通风干燥；再将样品用强酸浸泡，然后用去离子水水洗、浸泡，真空干燥即得聚合物支架。
2.根据权利要求1所述的多孔组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述的高分子 生物材料包括所有能溶解于二氯甲烷或三氯甲烷的高分子生物材料，包括聚乳酸及其共 聚物、聚乙醇酸、聚(丙交酯_乙交酯)、聚己内酯、壳聚糖、胶原中的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的多孔组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述的高分 子生物材料与二氯甲烷或三氯甲烷的用量比例为1. 0g/10ml。
4.根据权利要求1所述的多孔组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述的NaHCO3 或Na2CO3水合物粒子或两者的混合粒子的添加量占高分子生物材料和造孔剂的总质量的 30% -95%。
5.根据权利要求1或4所述的多孔组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述的 NaHCO3或Na2CO3或两者的混合粒子的粒径范围0. 10-0. 45mm。
6.根据权利要求1所述的多孔组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述的膜厚度 为 0. 1-0. 2mm。
7.根据权利要求1所述的多孔组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述的半干状 态为溶剂的含量为最初溶剂的10% -30%。
8.根据权利要求1所述的多孔组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述的强酸浸 泡是指在1. 0-5. Omol/L盐酸、硫酸、硝酸或醋酸中浸泡3_5小时。
9.根据权利要求1或8所述的多孔组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述的成型 样品通风干燥4-6小时；再用强酸浸泡3-5小时，然后用去离子水水洗3次，再用去离子水 浸泡12小时，每4小时换一次水；在40°C，-0. IMPa下干燥4_8小时真空干燥即得聚合物支^K O
全文摘要
本发明公开一种多孔组织工程支架的制备方法，该方法通过用NaHCO3/Na2CO3水合物粒子作造孔剂，将聚合物溶液/造孔剂粒子的混合物先流延成膜，在半干状态下将膜加入到模具中，常温下压制成型，然后先用强酸浸泡，再用水沥滤。采用该方法，脱模容易，沥滤时间短，大大缩短了制作支架的时间，制备的支架具有相互连通的、开放的孔壁结构，孔隙率和大孔尺寸可调控，通过设计模具，可制备形状复杂的支架，可操作性强。
文档编号A61L27/18GK101979103SQ20101052037
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月26日 优先权日2010年10月26日
发明者申雄军, 阮建明 申请人:中南大学