专利名称：一种脱细胞角膜或脱细胞角膜基质及其制备方法和用途的利记博彩app
技术领域：
本发明属于医用材料领域，具体涉及一种脱细胞角膜或脱细胞角膜基质及其制备 方法和用途。
背景技术：
角膜病是全球范围内第二致盲眼病，并且以每年150 200万病例的速度递增。角 膜移植是目前治疗角膜盲唯一有效的方法，但供体角膜来源的极端匮乏制约着角膜移植的 开展。因此，研究和开发出人角膜替代品是解决此供需矛盾的关键。目前，体外构建与正常角膜功能等效的活性组织工程角膜已有数十年的历史。由 于角膜独特的生理和光学特性，要求构建的组织工程角膜必须具有(1)良好的生物相容 性；(2)适度的强度和弹性；(3)高透明性；(4)稳定的角膜厚度和角膜曲率。角膜基质如猪角膜基质具有与人角膜基质类似的组织结构、生物物理特性和光学 特性。但是异种移植后强烈的排斥反应阻碍了异种角膜在临床上的应用。近年来的研究发 现，角膜基质内的基质细胞是引起基质型排斥反应的主要抗原。而作为角膜基质架构的胶 原纤维在种系间高度保守，抗原性很低，无细胞的异种角膜移植后不产生排斥反应。因此， 将动物的基质细胞完全脱去，使之成为无细胞的角膜基质可能是人角膜基质的理想替代 物。经典的组织工程角膜是将种子细胞接种在可降解材料上，Minami等在胶原凝胶 上培养角膜细胞，虽然获得三维角膜类似物，但由于其不透明和抗拉力弱，不能用于角膜移 植。Griffith等将转基因的内皮和上皮细胞培养在以胶原-硫酸软骨素为基础的基质上， 成功的培养出功能性类人角膜组织，但是病毒和醛交联对正常细胞均有毒性，且基质强度 也不够，另外由于胶原易被胶原酶消化，因此不稳定，进而影响角膜的光学性能和移植细胞 的长期存活。因此人工合成的角膜生物材料至今还很不理想，无法制备出与人角膜具有相 似的透明性、强度及生物学特性的基质架构。刘晓霞等采用胰酶_冰冻法对新鲜兔角膜进行脱细胞处理，结果显示用该方法获 得的兔角膜全层和分层脱细胞基质未见细胞成分，但透光率低于新鲜角膜而且脱细胞时间 较长，要持续3天。北京大学第三附属医院徐永根等人利用表面活性剂、DNA酶和RNA酶对 天然猪角膜进行脱细胞处理，90%丙三醇脱水4h后其透明性接近天然角膜，但是破坏了天 然角膜基质的超微结构。由于现在大多数使用的脱细胞方法如机械力、离子和去离子除垢 剂、酶处理的方法会影响角膜的透明性而且会破坏角膜的超微结构。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种低免疫原性 与自然角膜特性接近的脱细胞角膜或脱细胞角膜基质的制备方法；该方法用酶消化较短的 时间加上相对温和缺氧冷冻的物理条件，可以保持角膜的透明性而且不影响天然角膜基质 的超微结构，且整个脱细胞的过程持续时间较短，约30h就可以完成。
本发明的另一目的在于提供上述方法制备得到的脱细胞角膜或脱细胞角膜基质。本发明的再一目的在于提供该脱细胞角膜或脱细胞角膜基质在组织工程的人工 角膜构建或者制备角膜移植、屈光手术的医用材料中的应用。本发明的目的通过以下技术方案来实现一种脱细胞角膜或脱细胞角膜基质的制备方法，包括如下具体步骤(1)新鲜动物全层角膜或角膜基质的获取修剪动物眼球表面附属组织后用含 1000 2000u/ml的抗生素的磷酸盐缓冲液洗涤，在手术显微镜下沿角膜缘剪下全角膜， 获得全层角膜；将全层角膜刮去角膜上皮层和撕去后弹力层，得到角膜基质；室温20°C 28°C条件下，将获得的全层角膜或角膜基质称取起始初重；(2)去除角膜上皮、内皮和基质细胞①在室温20°C 28°C下，将获得的全层角膜或角膜基质置于纯水中浸泡0. 5 lh；②将经步骤①处理后的全层角膜或角膜基质置于酶溶液中，放在恒温摇床上震荡 消化，然后再用平衡盐溶液震荡清洗；③将经步骤②处理后的全层角膜或角膜基质重复冻融过程6 8次，然后置于平 衡盐溶液震荡清洗6 8次，每次30 40min，得到脱细胞角膜或脱细胞角膜基质；所述冻 融过程是把离心管置于室温下和空气中，将全层角膜或角膜基质放在离心管中，离心管注 满液氮，在瞬间缺氧和-196°C条件下冷冻，并保持缺氧冷冻状态，紧密管口后在室温下放置 1 1. 5h，然后松开离心管口，解除缺氧冷冻状态，待角膜慢慢复温解冻；(3)脱水处理将脱细胞角膜或脱细胞角膜基质在无菌条件下，保持温度20°C 28°C，紫外线照射下，干燥至起始初重；(4)消毒、保存将经过脱水处理的脱细胞角膜或脱细胞角膜基质经辐射剂量为 25kGey的钴6(1辐射灭菌，采用在4°C冰箱中密封保存或在体积分数为95%甘油中保存备用， 得到脱细胞角膜或脱细胞角膜基质产品。步骤⑴所述动物为猪、牛、兔、羊、猫、猴、马、驴或狗，所述动物眼球为屠宰场屠 宰后的新鲜动物尸体上获取的；所述抗生素为庆大霉素；所述磷酸盐缓冲液的PH值为7 8 ；所述洗涤的次数为3 5次。步骤②所述震荡消化的温度保持37°C，PH值为6 8，时间为3 5h ；所述震荡清 洗的次数为3 6次，每次30 40min。步骤②所述酶溶液为磷脂酶溶液或中性蛋白酶溶液；所述酶溶液的用量为10 15ml每块全层角膜或角膜基质；所述平衡盐溶液为pH值为7 8的磷酸平衡盐溶液PBS ； 步骤③所述离心管为50ml塑料离心管。所述磷脂酶溶液是磷脂酶A2溶液；所述中性蛋白酶溶液为中性蛋白酶Dispase II 溶液。所述磷脂酶溶液是将磷脂酶A2溶解在平衡盐溶液中制成的浓度为100 300U/ml 的溶液，所述中性蛋白酶溶液是将中性蛋白酶Dispase II溶解在平衡盐溶液中制成的浓度 为2. 4U/ml的溶液。步骤(3)所述脱水处理是将脱细胞角膜或脱细胞角膜基质放在超净台上进行处 理；所述干燥采用风机吹干。
一种脱细胞角膜或脱细胞角膜基质，是由上述方法制备得到的。上述脱细胞角膜或脱细胞角膜基质可应用于在组织工程的人工角膜构建，也可应 用于制备角膜移植或屈光手术的医用材料。上述方法得到的脱细胞角膜或脱细胞角膜基质为活性人工角膜的支架材料，进行 角膜相关细胞的培养，获得可以进行移植的分层与全层活性人工角膜；也可以作为角膜移 植物进行角膜移植眼表修复。本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果(1)本方法既可以去除动物角膜基质内的细胞成分，又可以保存角膜胶原纤维的 基本架构，从而保留了角膜韧性和透明性，处理后的角膜具有很低的免疫原性。(2)本方法脱细胞角膜处理时间短于现有的脱细胞角膜技术方法，综合应用物理 与酶消化方法，对角膜结构与生理特性影响较小，与自然角膜特性接近，是一种理想的组织 工程角膜。
图1为猪角膜脱细胞处理前后的大体观察图，其中(a)为猪角膜脱细胞处理前的 大体观察图，(b)为猪角膜脱细胞处理后的大体观察图。图2为猪角膜脱细胞处理前后苏木精-伊红(HE)染色照片图，其中(a)为猪角膜 脱细胞处理前HE染色照片图，(b)为猪角膜脱细胞处理后HE染色照片。图3为猪角膜脱细胞处理前后的透射电镜照片图，其中(a)为猪角膜脱细胞处理 前的透射电镜照片图，(b)为猪角膜脱细胞处理后透射电镜照片图。图4为猪角膜脱细胞处理后表面进行角膜基质细胞培养图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1 猪全层角膜脱细胞角膜的制备(1)新鲜猪角膜的获取从某屠宰场屠 后的猪尸体上获取新鲜猪眼球，修剪眼 球表面附属组织后用含2000u/ml的庆大霉素的磷酸盐缓冲液(PBS，pH值为7)洗涤3次， 手术显微镜下沿角膜缘剪下猪全层角膜，参见图la、图2a、图3a ；将全层角膜室温20°C 28°C条件下，将获得的猪全层角膜称取起始初重；(2)去除角膜上皮、内皮和基质细胞①室温下，将获得的猪全层角膜置于纯水中浸泡0. 5h ；②将经步骤①处理后的每块猪全层角膜置于IOml 200U/ml的磷脂酶A2溶液中， 置于恒温摇床上震荡消化3h，处理温度为37°C，pH值8. 0 ；然后用pH值为7的磷酸平衡盐 溶液PBS震荡清洗3次，每次40min ；③将经步骤②处理后的猪全层角膜重复冻融过程6 8次，然后置于平衡盐溶 液震荡清洗6 8次，每次30 40min，得到猪脱细胞角膜；所述冻融过程是把50ml塑料 离心管置于室温下和空气中，将猪全层角膜放在离心管中，离心管注满液氮，在瞬间缺氧 和-196°C条件下冷冻，并保持缺氧冷冻状态，紧密管口后在室温下放置1.5h，然后松开离 心管口，解除缺氧冷冻状态，待角膜慢慢复温解冻；
(3)脱水处理将猪脱细胞角膜放在超净台上，温度保持室温下(20°C 28°C )， 紫外线线照射下，风机吹干约4h直至角膜干燥至起始初重，脱水后角膜透明，参见图lb、图 2b、图 3b。(4)消毒、保存脱水处理后的猪脱细胞角膜经钴6°(25kGey)辐射灭菌后，用体积 分数为95%甘油(4°C冰箱)中保存备用，得到猪脱细胞角膜产品。结果取上述所得猪脱细胞角膜产品进行形态学HE染色观察、超微结构透射电镜 观察、透光率、厚度变化、力学性质、生物相容性分析。HE染色结果显示正常角膜具有完整 的复层角膜上皮细胞和单层角膜内皮细胞，角膜基质内存在大量基质细胞。脱细胞角膜中 未观察到任何完整的细胞，上皮层和内皮层，即得到的是脱细胞角膜。透射电镜照片显示 脱细胞角膜中胶原纤维排列整齐，未见胶原纤维降解的迹象。透光率结果显示制备的脱 细胞角膜高度透明，在300 SOOnm波长范围内，脱细胞角膜的透光率随着光波波长的增 加，逐渐增加，在SOOnm波长时达到最大值，脱细胞角膜的透光率随着波长变化的趋势与正 常角膜比较，无显著性差异(P >0.05)。角膜厚度变化结果显示37°C时，干燥后的脱细 胞角膜置于磷酸盐缓冲液后，在吸水IOmin 120min时间范围内，脱细胞角膜厚度随着吸 水时间的延长，逐渐增加，在120min时达到最大值，脱细胞角膜的角膜厚度变化随着吸水 时间变化的趋势与正常角膜比较，无显著性差异(P >0.05)。高精度生物材料试验机力学 性质分析结果显示在0. 1 1.0mm位移范围内，随着位移的增加，脱细胞角膜所受的压强 逐渐增加，脱细胞角膜压强变化随着位移变化的趋势与正常角膜比较，无显著性差异(P > 0. 05)。将制备的脱细胞角膜为支架材料，进行角膜基质细胞的培养，发现角膜基质细胞在 脱细胞角膜表面能够生长，参见图4。说明制备的脱细胞角膜具有良好的生物相容性。从结果分析得出本方法制备的脱细胞角膜既去除了动物角膜基质内的细胞成分， 具有很低的免疫原性，又可以保存角膜胶原纤维的基本架构，从而保留了角膜韧性和透明 性，还具有良好的生物相容性，与自然角膜特性接近，是一种理想的组织工程角膜。应用将制备的脱细胞角膜为活性人工角膜的支架材料，进行角膜相关细胞的培 养角膜获得可以进行移植的分层与全层活性人工角膜，也可以作为角膜移植物进行治疗性 角膜移植眼表修复，还可以作为异种角膜移植的供体材料。实施例2 猪角膜基质脱细胞基质的制备(1)新鲜猪角膜基质的获取从某屠宰场屠宰后的猪尸体上获取新鲜猪眼球，修 剪眼球表面附属组织后用含lOOOu/ml的庆大霉素的磷酸盐缓冲液(PBS，pH值为8)洗涤4 次，手术显微镜下沿角膜缘剪下猪全层角膜；将猪全层角膜刮去角膜上皮层和撕去后弹力 层，得到猪角膜基质；室温20°C 28°C条件下，将获得的猪角膜基质称取起始初重；(2)去除角膜基质细胞①室温下(20°C 28°C )，将获得的猪角膜基质置于纯水中浸泡0. 5h ；②将经步骤①处理后的每块猪角膜基质置于15ml 300U/ml的磷脂酶A2溶液中， 置于恒温摇床上震荡消化3h，处理温度为37°C，pH值7. 0，然后用pH值为8的磷酸平衡盐 溶液PBS震荡清洗3次，每次30min ；③将经步骤②处理后的猪角膜基质重复冻融过程6次，然后置于平衡盐溶液震荡 清洗6次，每次40min，得到猪脱细胞角膜基质；所述冻融过程是把50ml塑料离心管置于室 温下和空气中，将猪全层角膜放在离心管中，离心管注满液氮，在瞬间缺氧和-196°C条件下冷冻，并保持缺氧冷冻状态，紧密管口后在室温下放置1. 5h，然后松开离心管口，解除缺氧 冷冻状态，待角膜慢慢复温解冻；(3)脱水处理猪脱细胞角膜基质放在超净台上，温度保持室温下(20°C 28°C )， 紫外线线照射下，风机吹干约4h直至角膜干燥至起始初重。(4)消毒、保存脱水处理后的猪脱细胞角膜基质经钴6°(25kGey)辐射灭菌后，4°C 下保存备用，得到猪脱细胞角膜基质产品。实施例3 牛全层角膜脱细胞角膜的制备(1)新鲜牛全层角膜的获取从某屠宰场屠宰后的牛尸体上获取新鲜牛眼球，修 剪眼球表面附属组织后用含2000u/ml的庆大霉素的磷酸盐缓冲液(PBS，pH值为7. 5)洗涤 5次，手术显微镜下沿角膜缘剪下全角膜获取牛全层角膜；室温20°C 28°C条件下，将获得 的牛全层角膜称取起始初重；(2)去除角膜上皮、内皮和基质细胞①室温下(20°C 28°C )，将获得的牛角膜置于纯水中浸泡Ih ；②将经步骤①处理后的每块牛全层角膜置于15ml 2. 4U/ml中性蛋白酶Dispase II溶液中，置于恒温摇床上震荡消化5h，处理温度为37°C，pH值6. 0，然后用pH值为7. 5的 磷酸平衡盐溶液PBS震荡清洗6次，每次40min ；③将经步骤②处理后的牛全层角膜重复冻融过程8次，然后置于平衡盐溶液震荡 清洗8次，每次30min，得到牛脱细胞角膜；所述冻融过程是把50ml塑料离心管置于室温 下和空气中，将猪全层角膜放在离心管中，离心管注满液氮，在瞬间缺氧和-196°C条件下冷 冻，并保持缺氧冷冻状态，紧密管口后在室温下放置lh，然后松开离心管口，解除缺氧冷冻 状态，待角膜慢慢复温解冻；(3)脱水处理将牛脱细胞角膜放在超净台上，温度保持室温下(20°C 28°C)，紫 外线线照射下，风干约4h直至角膜干燥至起始初重。(4)消毒、保存脱水处理后的牛脱细胞角膜经钴6°(25kGey)辐射灭菌后，体积分 数为95%甘油(室温下)中保存备用，得到牛脱细胞角膜产品。实施例4 牛角膜基质层脱细胞基质的制备(1)新鲜牛角膜基质的获取从某屠宰场屠宰后的牛尸体上获取新鲜牛眼球，修 剪眼球表面附属组织后用含1500u/ml的庆大霉素的磷酸盐缓冲液(PBS，pH值为7)洗涤5 次，手术显微镜下沿角膜缘剪下牛全层角膜；将牛全层角膜刮去角膜上皮层和撕去后弹力 层，得到牛角膜基质；室温20°C 28°C条件下，将获得的全层角膜或角膜基质称取起始初 重；(2)去除角膜基质细胞①室温下(20°C 28°C )，将获得的牛角膜基质置于纯水中浸泡Ih ；②将经步骤①处理后的每块牛角膜基质置于IOml 2. 4U/ml中性蛋白酶Dispase II溶液中，置于恒温摇床上震荡消化3h，处理温度为37°C，pH值8. 0，然后用pH值为8的 磷酸平衡盐溶液PBS震荡清洗5次，每次30min ；③将经步骤②处理后的牛角膜基质重复冻融过程7次，然后置于平衡盐溶液震荡 清洗7次，每次35min，得到牛脱细胞角膜基质；所述冻融过程是把50ml塑料离心管置于室 温下和空气中，将猪全层角膜放在离心管中，离心管注满液氮，在瞬间缺氧和-196°C条件下冷冻，并保持缺氧冷冻状态，紧密管口后在室温下放置lh，然后松开离心管口，解除缺氧冷 冻状态，待角膜慢慢复温解冻；(3)脱水处理将牛脱细胞角膜基质放在超净台上，温度保持室温下(20°C 28°C )，紫外线线照射下，吹干约4h直至角膜干燥至起始初重。(4)消毒、保存脱水处理后的牛脱细胞角膜基质经钴6°(25kGey)辐射灭菌后，4°C 下保存备用，得到牛脱细胞角膜基质产品。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种脱细胞角膜或脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在于包括如下具体步骤(1)新鲜动物全层角膜或角膜基质的获取修剪动物眼球表面附属组织后用含1000～2000u/ml抗生素的磷酸盐缓冲液洗涤，在手术显微镜下沿角膜缘剪下全角膜，获得全层角膜；将全层角膜刮去角膜上皮层和撕去后弹力层，得到角膜基质；室温20℃～28℃条件下，将获得的全层角膜或角膜基质称取起始初重；(2)去除角膜上皮、内皮和基质细胞①在室温20℃～28℃下，将获得的全层角膜或角膜基质置于纯水中浸泡0.5～1h；②将经步骤①处理后的全层角膜或角膜基质置于酶溶液中，放在恒温摇床上震荡消化，然后再用平衡盐溶液震荡清洗；③将经步骤②处理后的全层角膜或角膜基质重复冻融过程6～8次，然后置于平衡盐溶液震荡清洗6～8次，每次30～40min，得到脱细胞角膜或脱细胞角膜基质；所述冻融过程是把离心管置于室温下和空气中，将全层角膜或角膜基质放在离心管中，离心管注满液氮，在瞬间缺氧和 196℃条件下冷冻，并保持缺氧冷冻状态，紧密管口后在室温下放置1～1.5h，然后松开离心管口，解除缺氧冷冻状态，待角膜慢慢复温解冻；(3)脱水处理将脱细胞角膜或脱细胞角膜基质在无菌条件下，保持温度20℃～28℃，紫外线线照射下，干燥至起始初重；(4)消毒、保存将经过脱水处理的脱细胞角膜或脱细胞角膜基质经辐射剂量为25kGey的钴60辐射灭菌，采用在4℃冰箱中密封保存或在体积分数为95％甘油中保存备用，得到脱细胞角膜或脱细胞角膜基质产品。
2.根据权利要求1所述的一种脱细胞角膜或脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在 于步骤(1)所述动物为猪、牛、兔、羊、猫、猴、马、驴或狗，所述动物眼球为屠宰场屠宰后的 新鲜动物尸体上获取的；所述抗生素为庆大霉素；所述磷酸盐缓冲液的PH值为7 8 ；所述 洗涤的次数为3 5次。
3.根据权利要求1所述的一种脱细胞角膜或脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在 于步骤②所述震荡消化的温度保持37°C，pH值为6 8，时间为3 5h ；所述震荡清洗的 次数为3 6次，每次30 40min。
4.根据权利要求1所述的一种脱细胞角膜或脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在 于步骤②所述酶溶液为磷脂酶溶液或中性蛋白酶溶液；所述酶溶液的用量为10 15ml 每块全层角膜或角膜基质；所述平衡盐溶液为pH值为7 8的磷酸平衡盐溶液PBS ；步骤 ③所述离心管为50ml塑料离心管。
5.根据权利要求4所述的一种脱细胞角膜或脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在 于所述磷脂酶溶液是磷脂酶A2溶液，所述中性蛋白酶溶液是中性蛋白酶Dispase II溶 液。
6.根据权利要求5所述的一种脱细胞角膜或脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在 于所述磷脂酶溶液是将磷脂酶A2溶解在平衡盐溶液中制成的浓度为100 300U/ml的溶 液；所述中性蛋白酶溶液是将中性蛋白酶Dispase II溶解在平衡盐溶液中制成的浓度为2.4U/ml的溶液。
7.根据权利要求1所述的一种脱细胞角膜或脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在 于步骤(3)所述脱水处理是将脱细胞角膜或脱细胞角膜基质放在超净台上进行处理；所述干燥采用风机吹干。
8.一种脱细胞角膜或脱细胞角膜基质，是由权利要求1 7任一项所述方法制备得到的。
9.根据权利要求8所述的脱细胞角膜或脱细胞角膜基质在组织工程的人工角膜构建 中的应用。
10.根据权利要求9所述的脱细胞角膜或脱细胞角膜基质在制备角膜移植或屈光手术 的医用材料中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种脱细胞角膜或脱细胞角膜基质及其制备方法和用途。该方法包括步骤(1)新鲜动物全层角膜或角膜基质的获取；(2)去除角膜上皮、内皮和基质细胞①室温下用纯水浸泡全层角膜或角膜基质；②置于酶溶液中，震荡消化，再用平衡盐溶液震荡清洗；③将全层角膜或角膜基质重复冻融过程4～8次，然后置于平衡盐溶液震荡清洗，得到脱细胞角膜或脱细胞角膜基质；(3)脱水处理；(4)消毒、保存。本方法角膜脱细胞处理时间短，对角膜结构与生理特性影响较小，处理后的角膜具有很低的免疫原性，与自然角膜特性接近。脱细胞角膜或脱细胞角膜基质可用于组织工程的人工角膜构建，又可作为医用材料用于角膜移植、屈光手术。
文档编号A61L27/36GK101985051SQ20101051598
公开日2011年3月16日 申请日期2010年10月21日 优先权日2010年10月21日
发明者何克云, 戴静, 陈建苏 申请人:暨南大学