专利名称：副溶血弧菌二价dna疫苗及其制备方法和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物技术领域的疫苗及其制备技术，涉及基因工程及免疫学。具体地 说是副溶血弧菌二价DNA疫苗的制备方法及应用。
背景技术：
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是革兰氏阴性菌，广泛分布于近岸海水 环境，能感染海水鱼类、对虾、甲壳类等多种水产动物，是世界许多国家和地区养殖对虾和 鱼类的主要致病菌，每年都给水产养殖业造成重大经济损失。该菌也是夏、秋季沿海地区海 产品食物中毒和急性腹泻的主要病原菌。副溶血性弧菌的主要致病因子是溶血素、丝氨酸 蛋白酶等。目前已制备的副溶血弧菌疫苗，主要有全菌灭活疫苗和重组蛋白疫苗。灭活疫苗 的优点是安全，但其缺点是免疫效果较差。重组蛋白疫苗由于制备过程中涉及蛋白质提取 纯化等步骤而造价昂贵。研究表明，DNA疫苗是一种在重组蛋白疫苗后兴起的新型疫苗，其原理是将疫苗抗 原基因克隆于一真核表达载体中，随后将该重组载体导入所要免疫的动物体内。疫苗抗原 蛋白在动物体细胞内可以持续表达合成，从而刺激机体的免疫系统，达到免疫保护目的。因 此，DNA疫苗具有灭活疫苗和重组蛋白疫苗两者的优点而无其缺点。但是，DNA疫苗免疫保 护率仍然较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种副溶血弧菌二价DNA疫苗的制备方法及应用，以克服现 有技术的不足。二价DNA疫苗技术上是来源于普通DNA疫苗，其原理是将针对细菌两个重 要致病因子的功能区域蛋白基因克隆于同一真核表达载体中，从而实现针对同一细菌的两 种不同抗原蛋白的表达。将这种二价DNA疫苗导入所要免疫的动物体内，就产生针对同一 细菌的两种不同抗体，其免疫效果优于普通DNA疫苗及两种DNA疫苗的联合免疫，且更加安 全、方便、有效。本发明即是采用这种技术，将副溶血弧菌的两个主要致病因子的基因融合 构建于真核表达载体中，制备成二价DNA疫苗，从而达到双重抵抗副溶血弧菌对水产鱼类 侵染的目的。一种副溶血弧菌二价DNA疫苗，其特征在于所述疫苗为副溶血弧菌溶血素亚单 位基因tdh2和丝氨酸蛋白酶基因vps通过6个核苷酸GAATTC相连而成的tdh2-vps融合 基因蛋白原核或真核表达工程载体疫苗，其中tdh2-vps融合基因的DNA序列为ATGAAGTACCGATATTTTGCAAAAAAATCATTTTTATTTATATCCATGTTGGCTGCATTCAAAACATTT GCCTTTGAGCTTCCATCTGTCCCTTTTCCTGCCCCCGGTTCTGATGAGATATTGTTTGTTGTTCGAGATACAACTTT AATACCAATGCACCGGTCAATGTAGAGGTCTCTGACTTTTGGACAAACCGTAATGTAAAAAGAAAACCGTACAAAGA TGTTTATGGTCAATCAGTATTCACAACGTCAGGTACTAAATGGCTGACATCCTACATGACTGTGAACATTAATGATA AAGACTATACAATGGCAGCGGTGTCTGGCTATAAGCACGGTCATTCTGCTGTGTTCGTAAAATCAGATCAAGTACAGCTTCAACATTCCTATGATTCTGTAGCTAACTTTGTTGGTGAAGATGAAGATTCTATTCCAAGTAAAATGTATTTGGA TGAAACTCCAGAATATTTTGTTAATGTAGAAGCATATGAGAGTGGTAGTGGTAATATATTGGTAATGTGTATATCCA ACAAAGAATCGTTTTTTGAATGTAAACATCAACAAGAATTCATGGAAACACGCTTTAATCGCCTATTTGCCGCTATG TTGGCTGTGGGCCTTGCACCTGCCGTCTCGGCGTTTGATCCGCTCTATTCAGAACAATGGCATCTCGACAACACTGG TCAAATTGCATTCGCAGCAAACCCTGCTGTTGCAGGTAATGACTTAAACACCAAACTTACGCAAGCCATGGGCATTG CCGGTATTGGCGTTAAAGTTGCGGTCATTGATTCTGGTGTGCAGATCGATCACCCAGACCTTGCAGGTAACGTAGTC ACAGGTAGCAGAAACTTCGTTGAAGACTCTTTATTCCCATCCAGTTATCCCGTCGACACTAACGGCCACGGTACTGC CGTTGCTGGTTTGATTAGTGCGGTAGGTAACAATGGTGAAGGTGGTCGCGGCGTTGCTTCTCGCTCTTCGCTTGTTG GTTTTAACTGGCTTGCAAACCAAACATTAGAAGTTGGTTAATTTCTCACGGTATGGACCCAGCGACGCGAGATGTAC GCGTATTTAACCAAAGTTATGGCTTTAGTCCGATCAACCCAATCGCGTTTGATGAGAATGACCCACAGTTCAAGCTT GAAATGGATGTCATGCAGAACGTCAGCGAAACGAACGCTTGGGGCCGCGGTGCACTGTTTGTCAAGTCTGCGGGGAA TGGTTACCGCTATTTCAACACCGGACGATTCTTCGTTCTTCCTAGCGATTTCTTCGCGGGAGGAGGAAACCAAGGTT TACCGATGCACAACTCGGCGAATCTTACGACAACTCTAGCTACTTCAACCTTGTCACCAGCGCGCTACGCGCAGATG GCACCCGAGCAAGTTACTCTTCTGTTGGCGCTAACGTGTGGGTTGCCGCGCCAGCAGGGGAATACGGGCAAGACTTC CCTGCGATGGTCACAACTGACCTGATGGGATGTGAAGAAGGACAAAACACCAGTGACGGCCTTGGTATTAATGGTCT ACACGGTGGTACAGAGCTTGACCCGAACTGTAATTACACCAGCACCATGAACGGCACATCATCGGCTGCGCCGAACA CTTCTGGTGCAATCGCCGCTATCATGTCAACTAACCACGCTTTATCTGCCCGTGATATTCGTGCGTTGCTGGCAGAA ACCGCACGCGTTACCGATGCCGAGCATCCGGGTGTTCAACTTGAATTTACCAATAATAAAGGTGAGTTGGTGAGCTA CGAAGCGATCTCACCTTGGCAGAAAAACGCGGCTGGCGTGAACTTCCATACCTTCTATGGTTTTGGTGCCGTTGATT TGGATGAAGCGATGAAACGCGCTCGCATGACAAATAATGTTCTGCCAGCGCAAATCATCACACCGTGGGCAAACAAT GCAACAGAAGTCAGTGTGCCCGATGCAAGCCTTGCTGGTGGTTCGTCAAACATCGCAATTACTGACGACATTACCGT TGAGTCTGTACAGGTGAAGTTGACGCTAGAGCACTCGCGTCTACCTGATTTGGCAATCGAGCTTGTTTCTCCATCAG GCACTCGCTCCGTATTGCAAACACCACGTAACGGCCTTGTTGGTCAGTCTCTTGATCCAAACATTACGGGTTACGAA AACCAACTGATGTTGTCTAACCAATTCTACGGCGAGAATGCCAAGGGTGAATGGACACTGAGAGCTATCGATACAAA CGGTGATGAAGTCTTCTCGTTTATCGCTTACTTCAACTCATCCGCTATCTATGATGTACCGATGGCGAACAACGCAA AACCAGGAGTTATCAAAAACTGGTCTATGCGTATCTTTGGCCACTAA。本发明的副溶血弧菌二价DNA疫苗的制备方法或具体步骤如下首先制备副溶血 弧菌的两个致病因子的溶血素亚单位基因tdh2和丝氨酸蛋白酶基因vps ；然后利用DNA内 切酶双酶切技术使目的基因获得粘性末端，再用DNA连接酶将基因tdh2和基因vps通过6 个核苷酸GAATTC相连，并克隆到原核表达载体pET28a中构建得到tdh2-vps融合基因蛋白 原核表达工程载体；同样再通过内切酶双酶切技术，将tdh2-vps融合基因插入到真核载体 中构建得到tdh2-vps融合基因蛋白真核表达工程载体度苗；最后用常规的方法扩增培养 并收获上述tdh2-vps融合基因蛋白真核表达工程载体载体，即制成副溶血弧菌二价DNA疫 苗悬液。一、制备上述基因tdh2和基因vps的方法1.以副溶血弧菌DNA为模板，用引物a进行PCR反应，得到含有BamHI和EcoRI酶 切位点的基因tdh2 ；引物a为人工设计的DNA片段，其序列如下5' CGCGGATCCATGAAGTACCGATATTTTGCA 3'
5' CGCGAATTCTTGTTGATGTTTACATTCAAAA 3'2.以副溶血弧菌DNA为模板，用引物b进行PCR反应，得到含有EcoRI和XhoI酶 切位点的基因vps ；引物b为人工设计的DNA片段，其序列如下5’ CGCGAATTCATGGAAACACGCTTTAATCGC 3’5’ CCGCTCGAGGTGGCCAAAGATACGCATAGAC 3’ ；二、构建tdh2-vps融合基因蛋白的原核表达工程载体的步骤1.用基因重组方法，在载体pET28a的酶切位点BamHI和EcoRI之间插入基因 tdh2,构建成载体 pET28a-tdh2 ；2.用基因重组方法，将基因vps克隆到载体pMD19-T Simple中，构建成载体 pMD19_T Simple-vps ；3.分别将载体 pET28a_tdh2 和载体 pMD19_T Simple-vps 用 EcoRI 和 XhoI 进行双 酶切，得到线性载体pET28a-tdh2和基因vps ；将基因vps与线性载体pET28a-tdh2进行重 组连接，构建成tdh2-vps融合基因蛋白原核表达工程载体pET28a-tdh2-VpS。将上述工程载体pET28a-tdh2-VpS转化到大肠杆菌BL2 1中，培养并进行诱导表 达，经SDS-PAGE电泳检测，tdh2-vps融合基因蛋白得到表达。三、构建tdh2-vps融合基因蛋白的真核表达工程载体的步骤将上述(2)构建的工程载体pET28a-tdh2-VpS转化到大肠杆菌DH5 α中，培养并 回收载体，用引物c进行PCR，得到含有XhoI和BamHI酶切位点的融合基因tdh2-vps ；引物 c为人工设计的DNA片段，其序列如下5’ CGCCTCGAGATGAAGTACCGATATTTTGCA 3’5’ CGCGGATCCCCTTAGTGGCCAAAGATACGCAT 3’ ；1.将融合基因tdh2_vps再次克隆到pMD19-T Simple上，并转化到大肠杆菌DH5 α 中，扩增培养后提取载体，用XhoI和BamHI进行双酶切，得到融合基因tdh2-vps，2.将真核载体pEGFP-Nl用XhoI和BamHI进行双酶切，得到线性真核载体 pEGFP-Nl ；3.将融合基因tdh2-vps插入到线性真核载体pEGFP-Nl酶切位点XhoI和BamHI 之间，构建成tdh2-vps融合基因蛋白真核表达工程载体pEGFP-Nl-tdh2-vps，将tdh2-vps融合基因蛋白真核表达工程载体转入CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞) 中，培养并进行诱导表达，经SDS-PAGE电泳检测，tdh2-vps融合基因蛋白得到表达；四、制备副溶血弧菌二价DNA疫苗1.将上述所得的tdh2-vps融合基因真核表达工程载体转化到CHO细胞或大肠杆 菌DH5ci中，进行常规扩增培养，然后将含有tdh2-vps融合基因蛋白的真核表达工程载体 提取出来，溶于0. 05 0. 20mol/L磷酸盐缓冲液PBS中至浓度为200ug/ml，即得到副溶血 弧菌二价DNA疫苗悬液，该步骤所用器皿、材料及试剂均须无菌无热原处理；2.按常规免疫方法，以IOOul/尾的剂量对鱼类进行免疫。本发明的副溶血弧菌二价DNA疫苗应用于鱼类，即副溶血弧菌二价DNA疫苗悬液 以50 200ul/尾的剂量应用于鱼类免疫。本发明具有如下优点在二价DNA疫苗制备过程中所使用的方法简便，实验可操作性强重复率高；并且制备过程中将融合基因先连接到原核表达载体中，有利于检验融合 基因蛋白的表达情况，可以提高融合基因蛋白真核表达的效率；本二价DNA疫苗双基因融 合蛋白表达，双重免疫保护；应用于鱼类的免疫效果较灭活疫苗、重组蛋白疫苗及一价DNA 疫苗高；免疫保护率高于其他类型的疫苗；使用安全无毒副作用；省时省力，只需一次免疫 即可获得有效保护。
图1 :tdh2-vps融合基因蛋白原核及真核表达载体基因PCR结果电泳图。其中Ml :DL2000DNA Marker ；M2 :DL15000DNA Marker ；1:阴性对照；2 用引物a进行PCR扩增反应的结果，即基因tdh2 ；3 用引物b进行PCR扩增反应的结果，即基因vps ；4和5 用引物c进行PCR扩增反应的结果，即融合基因tdh2-vps。图2 :tdh2-vps融合基因蛋白原核表达蛋白电泳图。其中，M 蛋白 Marker ；1 基因tdh2单独表达的结果；2 基因vps单独表达的结果；3 :tdh2-vps融合基因的表达结果。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在举例描述，而非以任何 形式对本发明进行限制。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法进行，如 J.Sambrook et al :Molecular Cloning :ALaboratory manual(NewYork :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所用载体 与试剂皆可从相关厂商购得。实施例1 构建tdh2-vps融合基因蛋白的原核表达设苗载体pET28a-tdh2-VpS 一、提取基因组DNA:1、取副溶血弧菌FYZ8621.4的单菌落，接入5ml 2216E液体培养基，28°C振荡培养 24小时；3、将振荡培养好的菌液，以12000rpm离心2min收集菌体；3、用酚-氯仿抽提法，提取得到副溶血弧菌的基因组DNA。二、PCR反应获得基因tdh2和基因vps的方法1.制备基因 tdh2 (1)根据GeneBank中所收录的副溶血弧菌的热稳定溶血素亚单位基因tdh2的序 列，设计了一对扩增基因tdh2的引物a，其序列为5' CGCGGATCCATGAAGTACCGATATTTTGCA 3'5' CGCGAATTCTTGTTGATGTTTACATTCAAAA 3'(2)以上述提取的副溶血弧菌的基因组DNA为模板，进行PCR反应，得到570bp的PCR产物反应条件为94°C预变性5分钟；94°C变性1分钟，58°C退火1分钟，72°C延伸1分 钟；如此反应30个循环；然后72°C延伸10分钟。反应体系为:5μ1 的 Buffer，3 μ 1 的 MgCl2,0. 5 μ 1 的 dNTP，0. 5μ 1 的 Taq 酶，2 μ 1 的模板DNA，各0. 5μ 1的引物a，然后用灭菌去离子水补足到50 μ 1。。(3) PCR产物经的琼脂糖凝胶电泳检测后，将含有570bp目的片段的凝胶切下， 回收纯化后得到含有BamHI和EcoRI酶切位点的基因tdh2。2.制备基因vps (1)根据GeneBank中所收录的的副溶血弧菌的假定丝氨酸蛋白酶基因vps的序 列，设计了一对扩增基因vps的引物b，其序列为5’ CGCGAATTCATGGAAACACGCTTTAATCGC 3’5’ CCGCTCGAGGTGGCCAAAGATACGCATAGAC 3’ ；(2)以上述提取的副溶血弧菌的基因组DNA为模板，进行PCR反应，得到1779bp的 PCR产物。反应条件为94 V预变性5分钟；94 V变性1分钟，61°C退火1分钟，72 °C延伸2分 钟；如此反应30个循环；然后72°C延伸10分钟。反应体系为:5μ1 的 Buffer，3 μ 1 的 MgCl2,0. 5 μ 1 的 dNTP，0. 5μ 1 的 Taq 酶，2 μ 1 的模板DNA，各0.5μ 1的引物b，然后用灭菌去离子水补足到50 μ 1。(3)PCR产物经的琼脂糖凝胶电泳检测后，将含有1779bp目的片段的凝胶切 下，回收纯化后得到含有EcoRI和XhoI酶切位点的基因vps。三、克隆基因tdh2和基因vps 1.克隆基因 tdh2:(1)取4. 5 μ 1纯化的基因tdh2，加入0. 5 μ 1的载体pMD19_T Simple,混合，再加 入5 μ IDNA连接酶，于16°C连接反应16小时，得到基因tdh2连接产物；(2)将基因tdh2连接产物转化到受体大肠杆菌DH5ci中，并于含有氨苄青霉 素、40 μ g/ml X-gal以及、40 μ g/ml IPTG的LB固体培养基上37°C培养12小时；(3)培养后利用常规的蓝白斑筛选方法，挑选白斑接入含氨苄青霉素的LB液体培 养基中，37°C振荡培养12小时后，提取基因tdh2载体DNA ；(4)以提取的基因tdh2载体DNA为模板，以引物a进行PCR反应检测，并且 用BamHI和EcoRI对基因tdh2载体进行双酶切检测，筛选出含有重组载体pMD 19-T Simple-tdh2的阳性菌株。2.克隆基因vps (1)取4. 5μ 1纯化的基因vps，加入0. 5μ 1的载体pMD19_T Simple，混合，再加入 5μ 1 DNA连接酶，于16°C连接反应16小时，得到基因vps连接产物。(2)将上述基因vps连接产物转化到受体大肠杆菌DH5 α中，并于含有氨苄青 霉素、40 μ g/ml X-gal以及、40 μ g/ml IPTG的LB固体培养基上37°C培养12小时。(3)培养后利用蓝白斑筛选的方法，挑选白斑接入含氨苄青霉素的LB液体培养基 中，37°C振荡培养12小时后，提取基因vps载体DNA。(4)依提出的上述基因vps载体DNA为模板，以引物b进行PCR反应检测，并 且用EcoR I和Xho I对基因vps载体进行双酶切检测，筛选出含有重组载体pMD 19-T
9Simple-vps的阳性菌株。四、构建原核表达载体pET28a-VpS 1.用EcoRI和XhoI对上述重组载体pMD 19-T Simple-vps进行双酶切，通过琼脂 糖凝胶电泳进行检测后，切胶纯化回收含有基因vps的目的片段。2.将原核表达载体PET28a也通过EcoR I和Xho I进行双酶切，酶切产物同样通 过琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后切胶回收线性载体PET28a。3.将获得的基因vps和线性载体pET28a，通过DNA连接酶在16°C下连接反应16 小时，得到基因vps连接产物。4.将基因vps连接产物转化到受体大肠杆菌DH5 α中，并于含有0. 6%卡那霉素 的LB固体培养基上37°C培养12小时。5.挑取长出的菌落，接入含有0. 6%卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C下振荡 培养12小时后提取基因vps载体DNA。6.以提出的载体DNA为模板，以引物b进行PCR反应检测，并且用EcoRI和XhoI 对载体进行双酶切检测，经过上述双重检测后筛选出含有重组载体pET28a-VpS的阳性菌 株。7.将重组载体pET28a-VpS再转化到受体大肠杆菌BL21中，通过异丙基硫代半乳 糖苷IPTG进行诱导表达后，经SDS-PAGE电泳检测，基因vps目的蛋白能够正常表达。五、构建tdh2_vps融合蛋白原核表达载体pET28a-tdh2_vps 1.用BamH I和EcoR I对重组载体pMD 19_T Simple_tdh2进行双酶切，，通过琼 脂糖凝胶电泳进行检测后，切胶纯化回收含有基因tdh2的目的片段。2.将已构建好的原核表达载体pET28a-Vps同样用BamH I和EcoR I进行双酶切， 酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后切胶回收线性载体pET28a-Vps。3.将基因tdh2与线性载体pET28a-vps通过DNA连接酶16°C连接反应16小时得 到。4.将连接产物转化到受体大肠杆菌DH5 α中，并于含有0. 6%卡那霉素的LB固体 培养基上37°C培养12小时。5.挑取长出的菌落，接入含有0. 6%卡那霉素的LB液体培养基中，37°C振荡培养 12小时后提取载体DNA。6.以提出的载体DNA为模板，分别用基因tdh2的扩增引物a，基因vps的扩增引 物b进行PCR扩增检测；分别用EcoRI、XhoI以及BamHI、EcoRI这两对内切酶进行双酶切 检测，筛选出了含有tdh2-vps融合基因的原核表达载体pET28a-tdh2-VpS的阳性菌株，结 果表明分别都得到了 1779bp左右和570bp左右的目的片断。即tdh2-vps融合基因蛋白原 核表达载体pET28a-tdh2-vps构建成功。为了验证tdh2-vps融合基因在原核表达载体中能够正常表达，将重组载体 pET28a-tdh2-VpS再转化到受体大肠杆菌BL21中，通过异丙基硫代半乳糖苷IPTG进行诱导 表达后，经SDS-PAGE电泳检测，得到了与预想的分子量大小相同的目的蛋白，证明该融合 蛋白能够正常表达，结果如图2所示。实施例2 构建tdh2-vps融合基因蛋白真核表达载体pEGFP-Nl-tdh2-vps 1.将连接在一起的tdh2-vps融合基因作为一个单独的基因，以上述的原核表达载体pET28a-tdh2-VpS为模板，重新设计一对用来扩增tdh2-vps融合基因的引物c，其序列 为5’ CGCCTCGAGATGAAGTACCGATATTTTGCA 3’5’ CGCGGATCCCCTTAGTGGCCAAAGATACGCAT 3’2.以pET28a-tdh2-vps为模板，进行PCR反应，得到2355bp的PCR产物。其反应 条件为94°C预变性5分钟；94°C变性1分钟，58°C退火1分钟，72°C延伸2分30秒；如此 反应30个循环；然后72°C延伸10分钟。其反应体系为5μ1 的 Buffer，3y 1 的 MgCl2，0. 5μ 1 的 dNTP，0. 5μ 1 的 Taq 酶， 2μ1的模板DNA，各0. 5μ 1的引物C，最后用灭菌去离子水补足50 μ 1。3.上述PCR产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳检测后，将含有目的片段的凝胶切下，回 收后得到纯的含有XhoI和BamHI酶切位点的tdh2-vps融合基因。4.将tdh2-vps融合基因与原核载体pMD19-T Simple连接，16°C连接反应16小时 后，转化到大肠杆菌DH5a中。挑取白斑培养后提取载体DNA，经PCR反应和Xho I.BamH I 双酶切检测后，筛选出含有重组载体PMD19-T Simple-tdh2-vps的阳性菌株。5.将 pEGFP-Nl 和 pMD19-T Simple-tdh2_vps 同时经 Xho I.BamH I 双酶切，酶切 产物经琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收得到线性载体PEGFP-Nl和tdh2-vps融合基因。将 线性载体PEGHP-Nl和tdh2-vps融合基因通过DNA连接酶进行连接，得到tdh2-vps融合基 因蛋白真核表达载体pEGFP-Nl-tdh2-vps。为了验证构建的真核表达载体pEGFP-Nl-tdh2-vps中同时包含基因tdh2和基因 vps，将含有上述真和表达的菌株接入到0. 6%卡那霉素的LB液体培养基中，37°C振荡培养 12小时后提取载体DNA，并经PCR和双酶切检测。PCR检测结果如图1所示。实施例3 二价DNA疫苗悬液的制备和使用将上述实施例2所得的pEGFP-Nl-tdh2-vps工程载体转化到大肠杆菌DH5 α中， 在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养12-18小时后，提取工程载体pEGFP-Nl-tdh2-vps， 对此载体进行去除内毒素处理后，将载体溶于0. 05mol/L磷酸盐缓冲液PBS中至浓度为 200ug/ml，即得到副溶血弧菌二价DNA疫苗悬液。便可对鱼类进行免疫。以养殖的牙鲆鱼 为例。免疫实验前两周购买同一批次的健康牙鲆，饲养于水箱中，通气并正常换水、投饵，水 温 20°C。用本发明制备的工程载体pEGFP-Nl-tdh2-vps对牙鲆进行肌肉注射免疫，注射 部位为靠近背鳍的肌肉较为厚实的地方，注射剂量为ΙΟΟμΙ/尾。同时设置注射等量灭菌 磷酸盐缓冲液PBS的对照组。接种后不同时间尾静脉取血，制备血清用于抗体检测。当实 验牙鲆免疫接种4-5周后，用副溶血弧菌对其进行肌肉注射攻毒，攻毒后观察并记录实验 牙鲆的死亡情况，其计算相对免疫保护率RPS为80%。
权利要求
一种副溶血弧菌二价DNA疫苗，其特征在于所述的疫苗为副溶血弧菌溶血素亚单位基因tdh2和丝氨酸蛋白酶基因vps通过6个核苷酸GAATTC相连而成的tdh2 vps融合基因蛋白原核或真核表达工程载体疫苗，其中tdh2 vps融合基因的DNA序列为ATGAAGTACCGATATTTTGCAAAAAAATCATTTTTATTTATATCCATGTTGGCTGCATTCAAAACATTTGCCTTTGAGCTTCCATCTGTCCCTTTTCCTGCCCCCGGTTCTGATGAGATATTGTTTGTTGTTCGAGATACAACTTTTAATACCAATGCACCGGTCAATGTAGAGGTCTCTGACTTTTGGACAAACCGTAATGTAAAAAGAAAACCGTACAAAGATGTTTATGGTCAATCAGTATTCACAACGTCAGGTACTAAATGGCTGACATCCTACATGACTGTGAACATTAATGATAAAGACTATACAATGGCAGCGGTGTCTGGCTATAAGCACGGTCATTCTGCTGTGTTCGTAAAATCAGATCAAGTACAGCTTCAACATTCCTATGATTCTGTAGCTAACTTTGTTGGTGAAGATGAAGATTCTATTCCAAGTAAAATGTATTTGGATGAAACTCCAGAATATTTTGTTAATGTAGAAGCATATGAGAGTGGTAGTGGTAATATATTGGTAATGTGTATATCCAACAAAGAATCGTTTTTTGAATGTAAACATCAACAAGAATTCATGGAAACACGCTTTAATCGCCTATTTGCCGCTATGTTGGCTGTGGGCCTTGCACCTGCCGTCTCGGCGTTTGATCCGCTCTATTCAGAACAATGGCATCTCGACAACACTGGTCAAATTGCATTCGCAGCAAACCCTGCTGTTGCAGGTAATGACTTAAACACCAAACTTACGCAAGCCATGGGCATTGCCGGTATTGGCGTTAAAGTTGCGGTCATTGATTCTGGTGTGCAGATCGATCACCCAGACCTTGCAGGTAACGTAGTCACAGGTAGCAGAAACTTCGTTGAAGACTCTTTATTCCCATCCAGTTATCCCGTCGACACTAACGGCCACGGTACTGCCGTTGCTGGTTTGATTAGTGCGGTAGGTAACAATGGTGAAGGTGGTCGCGGCGTTGCTTCTCGCTCTTCGCTTGTTGGTTTTAACTGGCTTGCAAACCAAACATTAGAAGGTTGGTTAATTTCTCACGGTATGGACCCAGCGACGCGAGATGTACGCGTATTTAACCAAAGTTATGGCTTTAGTCCGATCAACCCAATCGCGTTTGATGAGAATGACCCACAGTTCAAGCTTGAAATGGATGTCATGCAGAACGTCAGCGAAACGAACGCTTGGGGCCGCGGTGCACTGTTTGTCAAGTCTGCGGGGAATGGTTACCGCTATTTCAACACCGGACGATTCTTCGTTCTTCCTAGCGATTTCTTCGCGGGAGGAGGAAACCAAGGTTTACCGATGCACAACTCGGCGCAATCTTACGACAACTCTAGCTACTTCAACCTTGTCACCAGCGCGCTACGCGCAGATGGCACCCGAGCAAGTTACTCTTCTGTTGGCGCTAACGTGTGGGTTGCCGCGCCAGCAGGGGAATACGGGCAAGACTTCCCTGCGATGGTCACAACTGACCTGATGGGATGTGAAGAAGGACAAAACACCAGTGACGGCCTTGGTATTAATGGTCTACACGGTGGTACAGAGCTTGACCCGAACTGTAATTACACCAGCACCATGAACGGCACATCATCGGCTGCGCCGAACACTTCTGGTGCAATCGCCGCTATCATGTCAACTAACCACGCTTTATCTGCCCGTGATATTCGTGCGTTGCTGGCAGAAACCGCACGCGTTACCGATGCCGAGCATCCGGGTGTTCAACTTGAATTTACCAATAATAAAGGTGAGTTGGTGAGCTACGAAGCGATCTCACCTTGGCAGAAAAACGCGGCTGGCGTGAACTTCCATACCTTCTATGGTTTTGGTGCCGTTGATTTGGATGAAGCGATGAAACGCGCTCGCATGACAAATAATGTTCTGCCAGCGCAAATCATCACACCGTGGGCAAACAATGCAACAGAAGTCAGTGTGCCCGATGCAAGCCTTGCTGGTGGTTCGTCAAACATCGCAATTACTGACGACATTACCGTTGAGTCTGTACAGGTGAAGTTGACGCTAGAGCACTCGCGTCTACCTGATTTGGCAATCGAGCTTGTTTCTCCATCAGGCACTCGCTCCGTATTGCAAACACCACGTAACGGCCTTGTTGGTCAGTCTCTTGATCCAAACATTACGGGTTACGAAAACCAACTGATGTTGTCTAACCAATTCTACGGCGAGAATGCCAAGGGTGAATGGACACTGAGAGCTATCGATACAAACGGTGATGAAGTCTTCTCGTTTATCGCTTACTTCAACTCATCCGCTATCTATGATGTACCGATGGCGAACAACGCAAAACCAGGAGTTATCAAAAACTGGTCTATGCGTATCTTTGGCCACTAA。
2.副溶血弧菌二价DNA疫苗的制备方法，首先制备副溶血弧菌的两个致病因子的溶血 素亚单位基因tdh2和丝氨酸蛋白酶基因vps ；然后利用DNA内切酶双酶切技术使目的基因 获得粘性末端，再用DNA连接酶将基因tdh2和基因vps通过6个核苷酸GAATTC相连，并克 隆到原核表达载体pET28a中构建得到tdh2-vps融合基因蛋白原核表达工程载体；同样再 通过内切酶双酶切技术，将tdh2-vps融合基因插入到真核载体中构建得到tdh2-vps融合基因蛋白真核表达工程载体疫苗；最后用常规的方法扩增培养并收获上述tdh2-vps融合 基因蛋白真核表达工程载体，即制成副溶血弧菌二价DNA疫苗悬液。
3.如权利要求2所述的副溶血弧菌二价DNA疫苗的制备方法，其特征是上述tdh2-vps 融合基因蛋白原核表达工程载体的构建方法首先制备基因tdh2和基因vps 以副溶血弧菌DNA为模板，用引物a进行PCR反应，得到含有BamHI和EcoRI酶切位点 的基因tdh2 ；引物a为人工设计的DNA片段，其序列如下 5' CGCGGATCCATGAAGTACCGATATTTTGCA 3' 5 ‘ CGCGAATTCTTGTTGATGTTTACATTCAAAA 3‘以副溶血弧菌DNA为模板，用引物b进行PCR反应，得到含有EcoRI和XhoI酶切位点 的基因vps ；引物b为人工设计的DNA片段，其序列如下 5’ CGCGAATTCATGGAAACACGCTTTAATCGC 3’ 5' CCGCTCGAGGTGGCCAAAGATACGCATAGAC 3' (1)构建tdh2-vps融合基因蛋白的原核表达工程载体在载体pET28a的酶切位点BamHI和EcoRI之间插入tdh2，构建成载体pET28a_tdh2 ； 在载体PMD19-T Simple的酶切位点EcoRI和XhoI之间插入vps，构建成载体pMD 19-T Simple-vps ；分别将载体pET28a-tdh2和载体pMD19_T Simple-vps用EcoRI和XhoI进行双酶切， 得到线性载体pET28a-tdh2和基因vps ；将基因vps与上述线性载体pET28a-tdh2进行重组连接，构建成tdh2-vps融合基因蛋 白原核表达工程载体pET28a-tdh2-Vps ；将上述工程载体pET28a-tdh2-VpS转化到大肠杆菌BL21中培养并进行诱导表达，经 SDS-PAGE电泳检测，tdh2-vps融合基因蛋白得到表达。
4.如权利要求2所述的副溶血弧菌二价DNA疫苗的制备方法，其特征是上述的 tdh2-vps融合基因蛋白真核表达工程载体的构建方法将上述权利要求4构建的工程载体pET28a-tdh2-VpS转化到大肠杆菌DH5 α中，培养 回收载体，用引物c进行PCR反应，得到含有XhoI和BamHI酶切位点的tdh2-vps融合基因； 引物c为人工设计的DNA片段，其序列如下 5' CGCCTCGAGATGAAGTACCGATATTTTGCA 3' 5' CGCGGATCCCCTTAGTGGCCAAAGATACGCAT 3'将tdh2-vps融合基因再次克隆到载体pMD19-T Simple上，转化到大肠杆菌DH5 α中， 提取载体后用XhoI和BamHI进行双酶切，得到融合基因tdh2-vps ；将融合基因tdh2-vps与经XhoI和BamHI进行双酶切处理过的载体pEGFP-Nl进行重 组连接，构建成tdh2-vps融合基因蛋白真核表达工程载体pEGFP-Nl-tdh2-vps。
5.如权利要求2所述的副溶血弧菌二价DNA疫苗的制备方法，其特征是上述副溶血弧 菌二价DNA疫苗悬液的制备将上述所得的tdh2-vps融合基因蛋白真核表达工程载体转化到CHO细胞或大肠杆菌 DH5a中，进行常规扩增培养，然后将含有tdh2-vps融合基因蛋白真核表达工程载体提取 出来，溶于005 0. 20mol/L磷酸盐缓冲液PBS中至浓度为200ug/ml，即得到副溶血弧菌二价DNA疫苗悬液。
6.副溶血弧菌二价DNA疫苗悬液以50 200ul/尾的剂量应用于鱼类免疫。
全文摘要
本发明涉及副溶血弧菌二价DNA疫苗及其制备方法和应用，其特征是将副溶血弧菌tdh2基因和vps基因通过6个核苷酸GAATTC相连成的tdh2-vps融合基因蛋白真核表达工程载体疫苗；其制备方法包括利用双酶切技术使基因tdh2和vps获得粘性末端后相连，并克隆到原核表达载体pET28a中构建得到融合基因蛋白原核表达工程载体；再通过双酶切技术，将该融合基因插入到真核载体中构建得到融合基因蛋白真核表达工程载体疫苗；最后用常规的方法制成副溶血弧菌二价DNA疫苗悬液。本发明操作性强重复率高，安全无毒副作用，可对鱼类双重免疫保护，免疫效果较灭活疫苗、重组蛋白疫苗及一价DNA疫苗高。
文档编号A61K48/00GK101947325SQ20101029225
公开日2011年1月19日 申请日期2010年10月26日 优先权日2010年5月5日
发明者何庆芳, 刘瑞, 徐广峰, 陈吉祥 申请人:中国海洋大学