专利名称：：一种温度敏感的壳聚糖水凝胶及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种药物的给药凝胶系统及其制备方法。具体而言，本发明公开了一种温度敏感的壳聚糖水凝胶。本发明还涉及壳聚糖水凝胶为载体的一种胰岛素给药缓释系统。本发明凝胶具有温度敏感性高、机械强度好、制备条件温和，可以用于药物载体，生物组织工程等领域，在医疗领域具有很好的应用前景。
背景技术：
：壳聚糖(chitosan)是天然阳离子多糖，具有良好生物相溶性、可生物降解性、来源丰富等特点已广泛用于药物载体和生物医学领域，而且壳聚糖/β-甘油磷酸钠(GP)水凝胶具有温敏特性，该体系中的甘油磷酸盐也是公认的无毒的生物相容性物质。壳聚糖/GP可以混合成一种良好的注射用支持系统。壳聚糖与GP的混合液在室温与低温状态下为液体状态，在人体的生理温度状态与人体的PH环境下，该混合液就会变成凝胶。近年许多关于壳聚糖/水凝胶支持系统的研究，并大大发展该水凝胶系统在给药系统上的应用[胡巧玲，樊敏，沈家骢.一种壳聚糖水凝胶及其制备方法.(中国专利)申请号200810059134.5；授权公告号CN101215389B.ChoJH,etal.Biomaterrials.2004,25(26):5743-5751.KyungKS,etal.Biomaterrials.2008,29(33):4420-4428]。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰衍生物，具有良好的生物降解性和生物相容性，同时壳聚糖具有生物黏附性能，可起到控制药物释放的作用，具有独特的性质，因此被广泛白勺石开胃巾[EverG,JeanCL.Insitu-forminghydrogelsreviewoftemperature-sensitivesystems.EuroJPharmBio.2004,58(2):409-426.Sanjaykm,ShrutiC,SushmaTetal.ChitosansodiumalginatenanoparticlesassubmicroscopicreservoirsforoculardeliveryFormuIation,optimizationandinvitrocharacterization.EuroJPharmBio.2008,66(3):513-525]。壳聚糖是一种天然的碱性多糖，不溶于水，但壳聚糖含有游离氨基，在酸性条件下能结合氢离子，从而使壳聚糖成为带正电荷的电解质。β-GP是一种弱碱，在壳聚糖的酸溶液中加入适量的β-GP不会立刻中和壳聚糖的质子而使壳聚糖沉淀下来，可使壳聚糖溶液的PH值升至生理范围即ΡΗ7.0-7.4。在低温条件下，壳聚糖与水的作用阻止了壳聚糖链的聚集；温度升高时，甘油与水的结构化作用(该作用能减弱壳聚糖与水的作用)加强，使壳聚糖链脱水，水分子的区域被甘油分子取代，壳聚糖链聚集[E.Ruel-Gariepy，G.Leclair，P.Hildgen，A.Gupta.Thermosensitivechitosan-basedhydrogelcontainingliposomesforthedeliveryofhydrophilicmolecules.ConRel.2002,82(2-3):373-383.]。由此可以看出，壳聚糖/GP温敏凝胶的形成有两个重要因素，一个是壳聚糖游离氨基的存在，它将使壳聚糖在溶液中带正电荷。第二是β-GP的加入，它赋予凝胶系统稳定在中性环境且具有温敏特性。这个特点，使得壳聚糖温敏凝胶在形成凝胶前可以非常方便加载药物[Back，J.F.，Oakenful1,D.,Smith,Μ.B.Increasedthermalstabilityofproteinsinthepresenceofsugarsandpolyols.Biochem.1979,18(23):5191-5196.]目前控制血糖最常用最有效的药物就是胰岛素。由于胰岛素分子量大，半衰期短，脂溶性差，不易透过生物膜，而易被胃肠道的酶所降解。长效胰岛素作用有效时间为22-24小时，迄今为止胰岛素的使用途径以注射用药为主。在牙种植体手术中如何缓解糖尿病的不利影响，减轻糖尿病对牙种植体骨整合的病理变化等十分关键。通过可注射壳聚糖凝胶的形式，可以使胰岛素增强长效性与降低副作用，为此本发明选用了壳聚糖/GP温敏型原位凝胶给药系统作为胰岛素的用药缓释系统。利用壳聚糖和β-GP制备水凝胶系统，应用于药物特别是蛋白类药物提高其长效性与降低相应副作用，具有重要的现实意义。根据壳聚糖和β-GP的理化性质，本发明尝试改进了壳聚糖和β-GP制备水凝胶系统，为胰岛素给药提供了更高性能的缓释系统。
发明内容本发明制备了一种温度敏感的壳聚糖水凝胶。本发明所述的壳聚糖水凝胶，是由壳聚糖和β-GP所组成。本发明确定了壳聚糖和β-GP混合比例，即为按照重量比的2.5%-3.0%的壳聚糖以及5.0%-6.0%的β-GP0所述壳聚糖的脱乙酰度测定为85%。本发明还公开了一种温度敏感的壳聚糖水凝胶的制备方法，包括以下步骤1)将β-GP溶于双蒸水至中，振荡搅拌使其彻底溶解，制成浓度为50%-60%β-GP溶液(w/v)。2)使用醋酸配制3.2%的壳聚糖溶液，搅拌后高温高压消毒。3)将两种溶液冰浴后，在壳聚糖醋酸溶液到中搅拌同时逐滴加入β-GP溶液。本发明所确定的壳聚糖浓度与以往专利文件相比更具有技术的精确性。本发明发现在壳聚糖和β-GP混合系统中，2%及其以下浓度的壳聚糖在生理温度下很难凝固，而超过3.5%的浓度则难以溶解；本发明同时也确定了β-GP的精确浓度。本发明还公开了一种胰岛素给药的缓释系统，含有浓度为10_6Μ10_7Μ的胰岛素、重量百分比2.5%-3.0%的壳聚糖以及5.0%-6.0%的β-甘油磷酸钠，其中ρΗ值为6.9-7.2。所述的壳聚糖水凝胶用于胰岛素给药过程，并显示了良好的实际效果。图IpH值7.1下壳聚糖/β-GP水凝胶在不同温度的凝结状况。A为室温下的凝结状况，B为37°C下的凝结状况。图2β-GP浓度百分比对于壳聚糖/β-GP水凝胶系统胶凝时间的影响。图3ρΗ值对于壳聚糖/β-GP水凝胶系统胶凝时间的影响。图4胰岛素的壳聚糖/β-GP水凝胶系统在体外释放*:ρ<0.05(5.6%GP和4%GP比较)。实施例1壳聚糖/β-GP水凝胶的制备1.材料与仪器壳聚糖(Sigma，美国)、β_GP(Sigma，美国)、胰岛素(Sigma，美国)、三氟醋酸(Sigma，美国)、冰乙酸(北京化学试剂公司)、乙腈(北京化学试剂公司)；Ph-3spH测量仪(上海精密仪器厂)、Agilent1100LC色谱系统(Agilent，美国)、恒温水浴振荡箱(哈尔滨东明有限公司)。2.实验方法1)壳聚糖含水量与脱乙酰度的测量按照相关文献对本发明所用壳聚糖，脱乙酰度测定为85%。2)β-GP溶液的配制称取β-GP，溶于双蒸水至终体积为Iml中，振荡搅拌器上持续震荡5min，使其彻底溶解。制成浓度为50%、56%、60%β-GP溶液(w/v)，0.22μm滤膜过滤，4°C冰箱备用。3)壳聚糖醋酸溶液的配制使用0.IM的醋酸配制3.2%的壳聚糖溶液。先将醋酸加入双蒸水混勻后，称取壳聚糖放入烧杯中，加入0.IM的醋酸溶液，搅拌6-24小时将获得的壳聚糖溶液121°C高温高压消毒，冷却至室温后使用。4)壳聚糖温敏凝胶的合成将两种溶液冰浴后，注射器吸取壳聚糖醋酸溶液到新烧杯中，快速搅拌同时逐滴加入β-GP溶液，并持续搅拌。最终获得壳聚糖质量浓度为2.5%-3.0%，β-GP终浓度为3.0%-9.0%的壳聚糖/β-GP溶液。5)用pH计测定最终溶液的pH值6)粘度测定将样品转移到盛样器中，于4°C(胶凝前)或37°C(胶凝后)水浴中恒温，分别采用6、60rpm转速测量胶凝前后壳聚糖/β-GP凝胶的粘度。7)胶凝时间考察将壳聚糖/β-GP溶液分装到小玻璃瓶中，37°C恒温孵箱中；每隔0.5min转动小玻璃瓶，将体系由流动液体转变成半固体所需时间记为胶凝时间。每样本测三次，取平均值。3.结果与讨论1)壳聚糖温敏凝胶的形态及浓度影响在室温下(25°C)呈液态，透明、流动性好，pH值7.1(图1A)。放置37°C孵箱内约Smin形成凝胶，呈淡乳白色，凝胶形态良好(图1B)。壳聚糖/β-GP溶液负载胰岛素溶液后，仍可在37°C孵箱内约Smin形成凝胶，并且其形态无明显改变。实验发现，2%及其以下浓度的壳聚糖在37°C下很难凝固，低于2%的壳聚糖难以支持凝胶系统，而超过3.5%的浓度则难以溶解，3%浓度的壳聚糖即需要24小时搅拌才能溶解。2)β-GP含量对于胶凝时间的影响低β-GP含量(3%)的凝胶时间过长达到120min仍未见胶凝，4.0%-6.0%浓度的β-GP凝胶时间比较合适。终含量为4%β-GP,5.6%β-GP组胶凝时间约为8min，终含量7%、9%β-GP组胶凝时间太短，5min以内随着β-GP逐滴加入局部就立刻胶凝(图2)。3)pH值对于胶凝时间的影响pH值为4时，观察壳聚糖/β-GP胶凝时间直到120min尚未完全胶凝，pH值在8.0以上时5min以内随着β-GP加入局部立即就胶凝了，并且胶凝的并不均勻，pH值为6.8-7.2时胶凝时间为8-10min(图3)。本实验发现pH值为6.8-7.2时，胶凝时间最为适宜操作，而且此PH值范围符合生理要求。这是因为在一定的pH值范围内，壳聚糖/β-GP溶液中质子减少，则游离氨基多，壳聚糖链间静电斥力减小，分子链间氢键作用增强，当PH>7.2时，因壳聚糖的溶解性降低而沉淀析出。而当pH值较低时(ρΗ<4)，氨基质子化程度高，同时抑制β-GP磷酸质子解离，使壳聚糖/β-GP不易交联凝胶化。β-GP含量的变化致使β-GP分子中的磷酸根基团与壳聚糖分子中氨基之间的静电作用增强，促进系统胶凝时间[K.Gekko,H.Mugishima,S.Koga.Effectsofsugarsandpolyolsonthesol-geltransitionofk-carrageenan:calorimetricstudy.BiolMac.1987,9(3):146_152.]。本发明过程中也证实了β-GP含量对于壳聚糖/β-GP胶凝时间的影响。当β-GP在系统终含量大于7%或低于3%时系统胶凝形态均不理想，β-GP终含量4.0%-6.0%时胶凝时间、胶凝形态最为适宜。这是因为随着β-GP用量比的增加，β-GP会夺取更多NH3+质子，加速了壳聚糖链间静电斥力减弱，使壳聚糖/β-GP溶液凝胶化时间减少，或在较低的温度下就可以凝胶化，37°C时加速了这种过程。但用量增大到一定时如56%β-GP与3.2%壳聚糖等体积混合，因为中和电荷、溶液碱性提高及溶解达到饱和等诸多因素的影响使混合液中的壳聚糖沉淀析出。Kempe[K.Gekko,S.N.Timasheff.Mechanismofproteinstabilizationbyglycerol!Preferentialhydratationinglycerol-watermixtures.Biochem.1981,20(16):4667_4676.]等通过流变学和电子顺磁共振光谱学的方法对壳聚糖温敏凝胶的性质进行研究，发现β-GP的浓度决定了壳聚糖温敏凝胶的粘稠度及PH值，并观察了壳聚糖温敏凝胶对胰岛素的缓释作用，在本实验中也证实了这点。将终含量4%组和5.6%组进行HPLC检测时，观察发现4%β-GP组胰岛素突释很快，在体外释放实验中第一天中释放70%，到第3d时已经检测不到；5.6%β-GP组的胰岛素检测到第14d累计释放率为85%。在温度敏感性原位凝胶给药系统的实际应用中，既要求体系具有在生理温度(37°C)快速凝胶化的特性，又要求在常温(25°C)时保持液相制剂的稳定，而且还需要缓慢释放药物[A.Chenite,C.Chaput，D.Wangetal.Novelinjectableneutralsolutionsofchitosanformbiodegradiblegelsinsituforbioactivetherapeuticdelivery.Biom.2000,21(21):2155_2161.]。本研究选用3%壳聚糖凝胶系统在常温时可持续保持液相，30min内未出现凝胶化，当加入GP至终含量5.6%时，PH值为7.1，温度升高至37°C时，凝胶化时间为8min，符合实际应用要求。实施例2胰岛素给药凝胶系统体外释药实验1.实验方法将壳聚糖/β-GP含胰岛素(10_6Μ10_7Μ)溶液在37°C恒温孵育箱胶凝后立即取出Iml分别置于透析袋(截留分子量3000)中，放入小玻璃瓶内，在瓶中加入pH7.2的PBSlml，于37°C恒温振荡器中振摇(转速60rpm)。在Id,2d，3d，7d，10d,14d分别将溶出液全部取出，补加同样的37°C的lmlPBS，高效液相色谱法测定制剂在各时间点的累积释放量。所有实验均在室内温度25士2°C、相对湿度60士20%的条件下完成。流动相经过0.45μm微孔滤膜真空负压过滤、超声排气。Agilent1100LC色谱系统，紫外检测器，分析柱AgilentZorbaxSB-C18250mmX4.6mm5μm，流速1.0ml/min，进样量20μ1流动相是0.66%三氟醋酸水溶液纯乙睛(6733)，检测波长214nm，柱温为40°C。将ld，2d，3d，7d，10d，14d析出的液体经0.22μm滤膜过滤后依次进行HPLC检测，观察胰岛素体外释药。SPSS13.0统计软件进行分析，实验数据用χ士s表示，每组样本量η>3。组间差异比较采用One-WayANOVO分析LSD法，P<0.05认为差异具有显著性。2.结果与讨论根据β-GP含量和ρΗ值对于壳聚糖/β-GP凝胶的影响，选择终含量4%β-GP组和终含量5.6%β-GP组(均含有10_6Μ胰岛素)进行胰岛素药物释出的HPLC检测。将ld，2d，3d，7d，10d,14d析出的液体经0.22μm滤膜过滤后依次检测。4%β-GP终浓度组在第Id约有70%的胰岛素释出，到第3d时HPLC已经检测不到；5.6%β-GP终浓度组第Id只有15%左右的胰岛素释出，直到第14d组胰岛素累计释放率为85%，表明仍有胰岛素释出(图4)。经统计学分析，P<0.05两组比较有统计学差异。胰岛素口服给药是所有给药途径中最为方便的一种，其病人依从性最好，但胰岛素在胃肠道内的吸收具有生物利用度低下的缺点。目前胰岛素口服制剂的研究主要着重于如下几方面[M.Hasegawa,K.Yagi,S.Iwakawaetal.Chitosaninducesapoptosisviacaspase-3activationinbladdertumorcells,Jpn.CancerRes.2001,92(4):459_466.H.0.Pae,W.G.Seo,N.Y.Kimetal.Inductionofgranulocyticdifferentiationinacutepromyelocyticleukemiacells(HL-60)bywater-solublechitosanoligomers.Leuk.Res.2001,25(4):339_346.]微球及毫微球制剂，含有海藻酸的壳聚糖微球、羟丙基甲基纤维素_醋酸琥珀酸酯(AS-HG)微球等先包裹胰岛素后进行肠道给药，此方式能保护胰岛素不受酶的降解，同时增加其在吸收部位的滞留时间；胰岛素脂质体是通过改变脂质体的成份来提高胰岛素的生物利用度或作用时间，胰岛素的包封率最高能达到33%[CarinoGP,MatitiowitZE.Oralinsulindelivery.ADDeliRevi.1999,35(2-3)249-257.]；胰岛素微乳及油制剂，微乳具有粒径细小和渗透能力强的特点，可保护胰岛素在胃肠道中不受酸和酶的破坏，同时可模拟食物中乳糜微粒的成分被吸收进入淋巴系统，最终进入血液循环；胰岛素经鼻粘膜吸收被认为是效果确切的，其鼻腔给药制剂包括鼻用气雾剂，喷雾剂，滴鼻剂等均有报道，但由于鼻粘膜较为脆弱，长期给药后易引起局部刺激和充血损伤，因而胰岛素经鼻吸收并非是最理想的途径[M.Mori，Μ.Okumura,K.Matsuuraetal.Effectsofchitinanditsderivativeontheproliferationandcytokineproductionoffibroblastsinvitro.Biom.1997,18(13):947_951.Ε.νKriegstein,K.νKriegstein.Inhaledinsulinfordiabetesmellitus.NEngJMedi.2007,356(20):2106_210.]。另外Rivera[IsisR.，EdwardW.Harhaj,S.C.Sun.InvolvementofNF-ATinTypeIHumanT—cellLeukemiaVirusTax-mediatedFasLigandPromoterTransactivation.JBiolChem.1998，273(28)-.22382—22388.]等利用病毒将胰岛素通过基因转染到细胞内并在内质网中形成聚集体，同时另外再合成一种小分子药物，口服该药物在体内可引起细胞内胰岛素的解聚，从而出现胰岛素的快速脉冲释放，这种基因治疗法在蛋白多肽给药中的新应用，目前已经在糖尿病小鼠身上得到非常满意的预期效果。本发明目的是将胰岛素能局部应用到拔牙窝中，通过胰岛素的局部给药作用改善糖尿病患者种植体周的环境，提高人工种植牙骨愈合能力。所以在本研究中选用了壳聚糖/β-GP系统，具有温敏特性，并将胰岛素溶液凝胶化具有一定胰岛素缓释功能。胰岛素载体的合成，胰岛素与载体的联接方式，间隔基对释放药物性能的影响，载体结构与单克隆抗体特异性的关系等都是十分有意义应用[BeilkerT，FlemmingTF.Implantsinthemedicallycompromisedpatient.CReviOralBiol,Med.2003,14(4):305-316.Pillaio,PanchagrlulaR.Insulintherapies,presentandfuture.D.Disc.2001,5(12)547-553.]。权利要求1.一种温度敏感的壳聚糖水凝胶，其特征在于，所述的壳聚糖水凝胶含有重量百分比2.5%-3.0%的壳聚糖以及5.0%-6.0%的β-甘油磷酸钠，其中pH值为6.9-7.2。2.根据权利要求1所述的壳聚糖水凝胶，其制备方法包括以下步骤1)β-甘油磷酸钠溶液的配制称取β-甘油磷酸钠，溶于双蒸水至中，振荡搅拌器上持续震荡3-lOmin，使其彻底溶解，制成浓度为50^-60%β-甘油磷酸钠溶液(w/v)，0.22um滤膜过滤，4°C冰箱备用。2)壳聚糖醋酸溶液的配制使用0.IM的醋酸配制3.2%的壳聚糖溶液，搅拌6-小时将获得的壳聚糖溶液121°C高温高压消毒10-20min，冷却至室温后使用。3)壳聚糖温敏凝胶的合成将两种溶液冰浴10-20min后，吸取壳聚糖醋酸溶液到容器中，快速搅拌同时逐滴加入β-甘油磷酸钠溶液，并持续搅拌3-lOmin。获得壳聚糖质量浓度为2.5%-3.0%，β-甘油磷酸钠终浓度为5.0%-6.0%的壳聚糖/β-甘油磷酸钠水凝胶。3.一种胰岛素给药缓释系统，其特征在于，所述的缓释系统含有浓度为IO-6M-IO-7M的胰岛素、重量百分比2.5%-3.0%的壳聚糖以及5.0%-6.0%的β-甘油磷酸钠，ρΗ值为6.9-7.2。4.根据权利要求3所述的一种温度敏感的壳聚糖水凝胶，其特征在于，所述壳聚糖水凝胶可以用作于胰岛素给药缓释系统。5.根据权利要求4所述的一种温度敏感的壳聚糖水凝胶的胰岛素给药缓释系统，其特征在于，所述胰岛素水凝胶可以用作口腔种植体周以利于种植体骨整合。全文摘要本发明公开了一种温度敏感的壳聚糖水凝胶，组成为重量百分比2.5％-3.0％的壳聚糖以及5.0％-6.0％的β-甘油磷酸钠，其中pH值为6.9-7.2。壳聚糖/β-甘油磷酸钠水凝胶能够在低温保持液态，温度升高到体温时转变为固态。本发明公开了其制备方法，包括配制浓度为50％-60％β-甘油磷酸钠溶液；使用醋酸配制3.2％的壳聚糖溶液；将两种溶液冰浴后搅拌混合制备凝胶水溶液。本发明还公开了一种胰岛素给药缓释系统，含有浓度为10-6M-10-7M的胰岛素、2.5％-3.0％的壳聚糖及5.0％-6.0％的β-甘油磷酸钠，pH值为6.9-7.2。本发明所述的壳聚糖水凝胶，温度敏感性高、机械强度好、制备条件温和，应用前景广泛，可以用于药物载体，生物组织工程等领域。文档编号A61K9/06GK102399378SQ20101027410公开日2012年4月4日申请日期2010年9月7日优先权日2010年9月7日发明者刘洪臣,汪林,王东胜申请人:中国人民解放军总医院