专利名称：金纳米棒的修饰方法及金纳米棒-功能分子复合体的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种金纳米棒的修饰方法、由该方法获得的金纳米棒-功能分子复合体。
背景技术：
在疾病的预防和治疗过程中，疫苗发挥着极其重要的作用。疫苗载体主要分为病毒载体和非病毒载体两种。相对于病毒载体来说，非病毒载体具有容易生产、毒副作用小等优点。因此，近年来非病毒载体作为潜在疫苗载体或佐剂的研究备受人们关注。与其它非病毒载体相比，纳米材料作为载体具有促进细胞对功能分子如DNA等的摄入、延长功能分子在血液的循环时间并通过适当的修饰加工实现功能分子的靶向运输等优点(Jun-ichiro Jo, Yasuhiko Tabata. Non-viral gene transfection technologies for geneticengineering of stem cells. European Journal of Pharmaceutics andBiopharmaceutics, 2008,68 :90-104.)。生物相容性好或生物可降解性的纳米材料作为最有前景的载体成为近年来的研究热点。而正由于其良好的生物相容性，金纳米颗粒和金纳米棒作为潜在的载体在疾病的诊断和治疗中备受关注。金纳米棒也由于其独特的光学性质，在生物医学成像、疾病诊断和治疗尤其是肿瘤热疗等领域的应用而成为近年来研究的热点。同时金纳米材料容易进行表面修饰，其可通过静电吸附作用与带负电的遗传分子如DNA、小干扰RNA(SiRNA)等结合，进而实现遗传功能分子的有效输运并发挥其功能，预防或治疗相关疾病。通过在金纳米棒表面修饰一些生物分子，还可实现靶向输运，更好的发挥功能分子的作用。另有报道称金-镍纳米棒可显著增强抗原特异性的免疫反应 (Megan Ε. Pearce, Jessica B. Melanko, Aliasger K. Salem. Multifunctional Nanorods for Biomedical Applications. PharmaceuticalResearch,2007,24(12) :2335-2352.)。抗原呈递细胞(Antigen-Presenting Cells, APCs)在机体的免疫防御过程中发挥着重要作用。树突状细胞(Dendritic Cells, DCs)作为专职性的抗原呈递细胞，由于其摄入、处理抗原并将其运输至淋巴组织进而呈递给幼稚T细胞的能力而在免疫反应中发挥着更为重要的作用。对于疫苗来说，能否有效传递至APCs尤其是DCs中并与其相互作用， 从而诱导长期、高效的免疫反应关系到预防或治疗疾病的成败。DCs也因此在疫苗的研究开发中备受研究人员的关注。相对于微米级疫苗载体来说，纳米材料更易进入机体，且粒径为 40-70nm 的纳米材料更容易进入淋巴组织(A. E. Hawley, S. S. Davis, L. Ilium. Targeting of colloids to lymphnodes-influence of lymphatic physiologyand colloidal characteristics. Advanced Drug Delivery Review, 1995,17(1) : 129—148.)。而在纳米材料表面修饰APCs尤其是DCs特异性表面分子的抗体，对于促进抗原的有效传递将提供更为有利的保障。功能分子或疫苗抗原尤其是DNA疫苗若要成功传递至免疫细胞，需要穿越以下三种屏障(1)细胞膜；( 内吞体或溶酶体的降解；C3)细胞核。换句话说，一种成功的疫苗尤其是DNA疫苗需要实现将抗原有效传递、保护其免于降解且进入细胞核中才能真正预防和治疗疾病。
发明内容
本发明的目的在于提供一种金纳米棒的修饰方法、由该方法获得的金纳米棒-功能分子复合体。本发明提供一种金纳米棒的修饰方法，该方法包括将金纳米棒与DNA的溶液或蛋白质抗原的溶液接触，所述金纳米棒表面带正电荷。本发明还提供一种金纳米棒-功能分子复合体，所述金纳米棒-功能分子复合体是通过上述金纳米棒的修饰方法获得的。本发明通过将金纳米棒与DNA的溶液或蛋白质抗原的溶液接触，成功地实现了金纳米棒与遗传功能分子的DNA或蛋白质抗原的复合，进而实现遗传功能分子的有效输运并发挥其功能，预防或治疗相关疾病。本发明的优选实施方式通过以改性聚乙二醇(PEG)修饰金纳米棒，从而避免金纳米棒过早的被网状内皮系统吞噬，延长其在机体内的循环时间。本发明的优选实施方式通过在带正电荷的金纳米棒表面依次修饰融合肽或核定位信号、促进入胞的功能分子(如转铁蛋白、叶酸等)，从而提高基因转染水平、促进蛋白质抗原进入细胞，使其更加有效地发挥作用。本发明的优选实施方式通过以靶向抗原呈递细胞的特异性抗体修饰金纳米棒，从而保证DNA或蛋白质抗原更加有效地呈递至B细胞和T细胞。
图1是实施例1中所述金纳米棒的TEM表征图片。图2是实施例1中所述不同长径比金纳米棒的SEM表征图片。图3是实施例1中所述的不同长径比金纳米棒的紫外扫描图谱。图4是实施例1中所述金纳米棒的电位检测结果。图5是实施例2中所述的金纳米棒吸附pEGFP后的紫外扫描图谱。图6是实施例6、7中所述的金纳米棒-pEGFP-PEG和金纳米棒-pEGFP-PEG_NLS复合体的紫外扫描图谱。图7是实施例10中所述各种金纳米棒-功能分子复合体转染HEK293细胞的图片 (放大倍数10X10)。图8是表示实施例1制备的长径比为4的金纳米棒对HEK293细胞活力的影响的柱状图。
具体实施例方式本发明提供一种金纳米棒的修饰方法，该方法包括将金纳米棒与DNA的溶液或蛋白质抗原的溶液接触，所述金纳米棒表面带正电荷。在本发明提供的修饰方法中，相对于1重量份的所述金纳米棒，DNA的用量为 0. 001-0. 2重量份，DNA的溶液的浓度为2-400 μ g/ml，或蛋白质抗原的用量为0. 1-2重量份，蛋白质的溶液的浓度为0. l_2mg/ml，优选情况下，相对于1重量份的所述金纳米棒，DNA的用量为0. 1-0. 2重量份，DNA的溶液的浓度为200-400 μ g/ml，或蛋白质抗原的用量为 0. 5-1重量份，蛋白质的溶液的浓度为0. 5-lmg/ml。在本发明中使用的金纳米棒的长度为40-70nm，长径比为1-6 1。由于在金纳米棒的制备原料中含有如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)等阳离子型的表面活性剂或如聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDDAC)等带正电的聚电解质，因此所述的金纳米棒表面带正电荷， 本发明中的所述金纳米棒带有10-50毫伏的正电荷。由于DNA和绝大多数蛋白质抗原均带负电，而本发明中所述的金纳米棒表面带正电荷，其易通过静电吸附作用结合在一起，因此在本发明中，对所述DNA或蛋白质抗原的种类没有特别的限制，所述DNA例如艾滋病病毒膜蛋白编码基因(HIV Env DNA)、乙肝病毒膜蛋白编码基因(HBV)和人乳头瘤病毒膜蛋白编码基因(HPV)等，所述蛋白质抗原例如艾滋病病毒膜蛋白(gpl40)、乙肝病毒膜蛋白和人乳头瘤病毒膜蛋白抗原等，所举出的这些DNA 或蛋白质抗原均可与本发明中的金纳米棒相互结合。为了提高DNA和蛋白质抗原进入细胞的量，同时使DNA避免溶酶体的降解，从而保证DNA和蛋白质抗原有效发挥作用，本发明所提供的修饰方法中还包括，将金纳米棒与DNA 的溶液或蛋白质抗原的溶液接触之后，再在溶剂存在下与改性聚乙二醇、融合肽、核定位信号、促进入胞功能分子、靶向抗原呈递细胞的特异性抗体中的任意一种或多种一次或分多次接触，每次接触的时间为2-12小时，所述改性聚乙二醇的骨架为聚乙二醇骨架，所述改性聚乙二醇的一端为巯基且另一端为氨基或羧基。所述溶剂可以为去离子水、磷酸盐缓冲液(PBS)或吗啉乙磺酸缓冲液(MES)等中的一种。在本发明中，所述改性聚乙二醇的重均分子量可以为150-635，所述改性聚乙二醇可以使用例如波兰ftOchimia公司的HSCn-EG2NH2。在本发明的金纳米棒的修饰方法中，相对于1重量份的金纳米棒，所述融合肽的用量可以为0-2重量份，优选为0-1重量份，所述核定位信号的用量可以为0-2重量份，优选为0-1重量份，所述促进入胞功能分子的用量可以为0-2重量份，优选为0-1重量份，所述靶向抗原呈递细胞的特异性抗体的用量可以为0-2重量份，优选为0-1重量份，所述改性聚乙二醇的用量可以为0-3重量份，优选为0-1. 5重量份，且金纳米棒与融合肽、核定位信号、促进入胞功能分子、靶向抗原呈递细胞的特异性抗体以及改性聚乙二醇的总用量可以为0. 01-11重量份，优选为3. 5-6. 5重量份。在本发明中，对所述融合肽、核定位信号、促进入胞功能分子、或靶向抗原呈递细胞的特异性抗体的种类没有特别的限制，所述融合肽例如JTS-I序列小肽 (GLEEALLFLLESLffELLLEA), INF-7 序列小肽(GLFEAIEGFIENGffEGMIffDYG)和含 KALA 序列的小肽等；所述核定位信号例如SV40T抗原、被间隔区分开的两簇带正电的氨基酸残基序列、 c-MYC原癌基因的核定位信号及其他类型核定位信号如核糖体蛋白等；所述促进入胞功能分子可以举出例如含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的小肽、转铁蛋白、表皮生长因子(EGF)、叶酸等，所述靶向抗原呈递细胞的特异性抗体例如靶向树突状细胞的特异性抗体 anti-DEC205 等。本发明还提供一种金纳米棒-功能分子复合体，所述金纳米棒-功能分子复合体是通过上述金纳米棒的修饰方法获得的。以下结合实施例和附图对本发明进行详细说明。
实施例1金纳米棒基体的合成在25°C条件下，将0. 2mol/L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，Amersco公司，美国)溶液5mL与0. 96mmol/L的四氯金酸溶液5mL混合后，向该混合体系中加入0. 01mol/L 的冰浴的硼氢化钠溶液0. 6mL,以SOOrpm的速度搅拌2min，得到晶种液。在25°C条件下，将25mmol/L的四氯金酸溶液10mL、水250mL加至4mmol/L的硝酸银溶液12. 5mL中混勻，然后向该混合体系中加入0. 2mol/L的CTAB溶液250mL和0. 08mol/ L的抗坏血酸溶液5mL，混合15-30秒，即得生长液。当生长液由橘黄色逐渐变为无色时，即向生长液中加入0. 6mL晶种液，混合均勻后25°C下静置16-1 ，最后离心洗涤即得金纳米棒2。按照上述方法制备金纳米棒，不同的是将调节生长液中硝酸银与四氯金酸的摩尔比调节为0、0. 2,0. 3,0. 4，且生长液总体积不变，得到金纳米棒1、金纳米棒2、金纳米棒3、 金纳米棒4。利用透射电子显微镜、扫描电子显微镜对所得到的金纳米棒进行观察，结果见图1 和图2所示。图1A、图1B、图1C、图ID分别表示金纳米棒1、金纳米棒2、金纳米棒3、金纳米棒4，金纳米棒1、金纳米棒2、金纳米棒3、金纳米棒4的平均粒径分别为40nm、20nmX40nm、 15nmX45nm、15nmX60nm，金纳米棒1、金纳米棒2、金纳米棒3、金纳米棒4的长径比分别为 1 1、2 1、3 1、4 1。图2A、图2B、图2C、图2D分别表示金纳米棒1、金纳米棒2、金纳米棒3、金纳米棒4，金纳米棒1、金纳米棒2、金纳米棒3、金纳米棒4的平均粒径分别为 40nm、20nmX40nm、15nmX45nm、15nmX60nm，金纳米棒1、金纳米棒2、金纳米棒3、金纳米棒 4的长径比分别为1 1、2 1、3 1、4 1。利用紫外光谱仪(UV-vis)对所得到金纳米棒进行检测，结果见图3，金纳米棒1、 金纳米棒2、金纳米棒3、金纳米棒4的特征吸收峰分别在530nm、620nm、700nm和820nm。利用激光粒度仪对所得到金纳米棒进行检测，结果见图4，金纳米棒1、金纳米棒 2、金纳米棒3、金纳米棒4表面均带有约28. 6毫伏的正电荷。实施例2金纳米棒-DNA复合体的制备将lmg/mL的金纳米棒4的水溶液0. 2mL与2 μ g/mL的pEGFP (绿色荧光蛋白的质粒DNA，Biovector-08，Clontech公司)溶液0. ImL混合均勻，25°C条件下放置约30min，即得含有金纳米棒-DNA复合体的混合液，最后离心洗涤即得金纳米棒-DNA复合体。利用UV-vis对所得到金纳米棒-DNA复合体进行检测，结果见图5，可见相对于金纳米棒来说，金纳米棒-DNA复合体的吸光度(OD)值降低。实施例3金纳米棒-DNA复合体的制备将lmg/mL的金纳米棒4的水溶液0. 2mL与200 μ g/mL的pEGFP (绿色荧光蛋白的质粒DNA，Biovector-08，Clontech公司)溶液0. ImL混合均勻，25°C条件下放置约30min， 即得含有金纳米棒-DNA复合体的混合液，最后离心洗涤即得金纳米棒-DNA复合体。利用UV-vis对所得到金纳米棒进行检测，结果与实施例2类似，与金纳米棒相比， 金纳米棒吸附DNA后，其吸光度(OD)值降低。
实施例4金纳米棒-DNA复合体的制备将lmg/mL的金纳米棒4的水溶液0. 2mL与400 μ g/mL的pEGFP (绿色荧光蛋白的质粒DNA，Biovector-08，Clontech公司)溶液0. ImL混合均勻，25°C条件下放置约30min， 即得含有金纳米棒-DNA复合体的混合液，最后离心洗涤即得金纳米棒-DNA复合体。利用UV-vis对所得到金纳米棒进行检测，结果与实施例2类似，与金纳米棒相比， 金纳米棒吸附DNA后，其吸光度(OD)值降低。实施例5 金纳米棒对DNA吸附率的检测将lmg/mL金纳米棒4的水溶液与不同浓度(见表1)的pEGFP溶液等体积混合均勻，在25°C条件下静置30min后，以IOOOOrpm离心15min，之后利用酶标仪在^Onm检测上清液中DNA的吸光度(OD)，并根据“当DNA的吸光度为1时，其浓度相当于50ng/y L”计算上清液中DNA的残留量，从而根据公式吸附率=(DNA总量-残留DNA的量)X 100% /DNA 总量，确定金纳米棒对DNA的吸附率，结果见表1。表 权利要求
1.一种金纳米棒的修饰方法，其特征在于，该方法包括将金纳米棒与DNA的溶液或蛋白质抗原的溶液接触，所述金纳米棒表面带正电荷。
2.根据权利要求1所述的修饰方法，其中，相对于1重量份的所述金纳米棒，DNA的用量为0. 001-0. 2重量份，DNA的溶液的浓度为2-400 μ g/ml，或蛋白质抗原的用量为0. 1-2 重量份，蛋白质的溶液的浓度为0. l-2mg/ml。
3.根据权利要求1所述的修饰方法，其中，所述方法还包括，将金纳米棒与DNA的溶液或蛋白质抗原的溶液接触之后，再在溶剂存在下与改性聚乙二醇、融合肽、核定位信号、 促进入胞功能分子、靶向抗原呈递细胞的特异性抗体中的任意一种或多种一次或分多次接触，每次接触的时间为2-12小时，所述改性聚乙二醇的骨架为聚乙二醇骨架，所述改性聚乙二醇的一端为巯基且另一端为氨基或羧基。
4.根据权利要求3所述的修饰方法，其中，所述改性聚乙二醇的重均分子量为 150-635。
5.根据权利要求3所述的修饰方法，其中，相对于1重量份的金纳米棒，所述融合肽的用量为0-2重量份，所述核定位信号的用量为0-2重量份，所述促进入胞功能分子的用量为 0-2重量份，所述靶向抗原呈递细胞的特异性抗体的用量为0-2重量份，所述改性聚乙二醇的用量为0-3重量份，且金纳米棒与融合肽、核定位信号、促进入胞功能分子、靶向抗原呈递细胞的特异性抗体以及改性聚乙二醇的总用量为0. 01-11重量份。
6.根据权利要求1-5中的任意一项所述的修饰方法，其中，所述金纳米棒带有10-50毫伏的正电荷。
7.根据权利要求1-5中的任意一项所述的修饰方法，其中，所述金纳米棒的长度为 40-70nm，所述金纳米棒的长径比为1-6 1。
8.—种金纳米棒-功能分子复合体，其特征在于，所述金纳米棒-功能分子复合体是通过权利要求1-7中的任意一项所述的修饰方法获得的。
全文摘要
本发明提供一种金纳米棒的修饰方法，该方法包括将金纳米棒与DNA的溶液或蛋白质抗原的溶液接触，所述金纳米棒表面带正电荷。本发明还提供通过所述修饰方法获得的金纳米棒-功能分子复合体。通过本发明的修饰方法获得的金纳米棒-功能分子复合体能够明显提高基因转染水平、促进蛋白质抗原进入细胞且安全性好。
文档编号A61K47/04GK102397557SQ20101027400
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月7日 优先权日2010年9月7日
发明者吴晓春, 许利耕, 陈春英 申请人:国家纳米科学中心