专利名称：2-[(2,3,4-三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯及其制备方法与应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种有机小分子化合物，尤其是涉及2-[ (2，3，4-三烷氧基-6-酰基) 苯基]乙酸酯类化合物及其制备方法和降血糖的药物用途。
背景技术：
糖尿病已成为继心血管病、癌症之后严重危害人类健康的第三大疾病。据世界卫 生组织估计，到2015年，全球糖尿病患者可能达到3亿左右。糖尿病是由于体内胰岛素分 泌不足或胰岛素抵抗引起的以高血糖和糖尿为特征的内分泌代谢疾病。临床上，以II型糖 尿病(非胰岛素依赖性糖尿病，NIDDM)占大多数(达90%以上)。目前，治疗II型糖尿病 的主要药物有双胍类、磺酰脲类、噻唑烷二酮类以及α —葡萄糖苷酶抑制剂等，这些抗糖 尿病药物在临床上虽然具有一定的疗效，但是仍存在着疗效短、不能特异针对病因而有效 缓解病情及药物副作用等问题。因此，研发新型的抗糖尿病药物在临床上不仅十分迫切而 且具有重要性。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)广泛存在于各种 真核细胞中，被认为是真核生物的“中枢细胞能量调节器”，它是由催化亚基α、调节亚基 β和Y组成的复合体。AMPK受ΑΜΡ/ΑΤΡ比值的调节，当比值上升时，磷酸腺苷(AMP)就与 AMPK γ结合，启动上游激酶LKBl磷酸化AMPK α，从而激活ΑΜΡΚ，促进分解代谢途径(如糖 酵解、脂肪氧化等)产生ΑΤΡ，同时关闭合成代谢途径(如糖异生、脂肪合成和蛋白合成等) 以减少 ATP 的消耗(Hardie DG, et al.，J. Physiol.，2006，574，7-15 ；Viollet B, et al.， J. Physiol.，2006，574，41-53 ；Hardie DG, et al. ,Physiology.，2006，21，48-60)。因此，近 年来AMPK已经被认为是开发治疗糖尿病药物的一个非常重要的靶点(Viollet B,et al., J. Physiol.，2006，574，41-53)。研究发现，双胍类抗糖尿病药物可以通过提高AMPK α的磷 酸化水平来抑制肝糖输出，促进外周组织对糖的利用，从而起到降低血糖的作用(Zhou G， et al.，J.Clin. Invest.，2001，108，1167-1174)。但由于二甲双胍的有效剂量较大以及明 显的副作用，目前，仍有不少研究旨在筛选新一代靶向AMPK的抗糖尿病药物，以期取代双 胍类药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一类结构新颖的2-[ (2，3，4-三烷氧基-6-酰基)苯基] 乙酸酯(TAPA)及其制备方法。本发明的另一目的在于提供一类2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯 (TAPA)在制备抗糖尿病药物中的应用。本发明所述2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯的结构如下
5 2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯是一种三烷氧基取代的芳香化合 物，不溶于水，溶于丙酮，乙腈等有机溶剂；取决于R1，R2或R3的不同，这些化合物可以是固 体或液体。本发明所述2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯的制备路线如下
R1 = C1~C5的烷基，R2=C1~C10的烷基，R3=C1~C5的烷基
本发明所述2-[(2，3，4-三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯的制备方法包括以下
步骤
1)制备3-(2，3，4-三烷氧基)苯基丙酸2
将1. O 1. 5倍摩尔数的2，2- 二甲基-1，3-.噁烷 _4，6- 二酮(Meldrum 酸)溶于三乙胺甲酸盐(TEAF)溶液中，制成0.2 1.0!1101/1溶液，再加入2，3，4-三烷氧基苯甲 醛(基准物)，将反应物加热、搅拌至反应完全，冷却下加入冰水，再酸化至PH= 1，提取后 合并提取液，洗涤，干燥，浓缩后残留物用硅胶柱层析纯化得到3-(2，3，4-三烷氧基)苯基 丙酸2 ；2)制备氢化茚酮3将步骤1)制备得到的3-(2，3，4-三烷氧基)苯基丙酸2与相当于3_ (2，3，4_三烷 氧基)苯基丙酸重量的15 25倍的多聚磷酸(PPA)搅拌，反应完全后，冷却下加入冰水， 提取后，合并提取液，洗涤，干燥，浓缩后残留物用硅胶柱层析纯化得到氢化茚酮3 ；
3)制备氢化茚4将步骤2)制备得到的氢化茚酮3溶于干燥二氯甲烷中，制成0. 05 0. 15mol/L 溶液，惰性气体保护下，搅拌，加入相当于氢化茚酮摩尔数的1. 5 4. 5倍摩尔数的格氏试 剂R2MgX(R2 = Cl ClO烷基，X = Cl、Br)，加完格氏试剂后升温至室温，继续搅拌至反应 完全，冷却下酸化至PH = 1，搅拌后提取，合并提取液，洗涤，干燥，浓缩后残留物用硅胶柱 层析纯化得到氢化茚4 ；4)制备二羟基氢化茚5将步骤3)制备得到的氢化茚4溶于丙酮/水溶液中，制成0. 05 0. 2mol/L溶 液，搅拌，加入相当于氢化茚1 3倍摩尔数的甲磺酰胺和N-甲基-N-氧化吗啉(NMO)，搅 拌后，加入相当于氢化茚的3% 20%摩尔数的四氧化锇溶液，将反应混合物搅拌至反应 完全，加入饱和硫代硫酸钠溶液，搅拌，减压下蒸除丙酮后提取，合并提取液，干燥，浓缩后 残留物用硅胶柱层析纯化得到二羟基氢化茚5 ；5)制备2- [ (2，3，4-三烷氧基_6_酰基)苯基]乙醛6将步骤4)制备得到的二羟基氢化茚5溶于四氢呋喃/水溶液中，制成0. 1 0. 5mol/L溶液，加入相当于二羟基氢化茚1.0 2.0摩尔数的高碘酸钠，搅拌至反应完 全，加入硅胶，搅拌，过滤，将滤液浓缩，残留物用硅胶柱层析纯化得到2-[ (2，3，4-三烷氧 基-6-酰基)苯基]乙醛6;6)制备2-[(2，3，4-三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸7将步骤5)制备得到的2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙醛6溶于四氢呋 喃/叔丁醇/水溶液中，制成0. 1 0. 5mol/L溶液，搅拌下加入相当于2_[ (2，3，4-三烷氧 基-6-酰基)苯基]乙醛6 12倍摩尔数的2-甲基-2- 丁烯和2 5倍摩尔数的磷酸二氢 钠，冷却下加入2 5倍摩尔数的亚氯酸钠，然后搅拌至反应完全，冷却下加入饱和亚硫酸 钠溶液，搅拌，提取，合并提取液，洗涤，干燥，浓缩后残留物用硅胶柱层析纯化得到2-[ (2， 3,4-三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸7 ；7)制备2-[(2，3，4-三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯(TAPA)将步骤6)制备得到的2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸7溶于无水醇 中，制成0. 1 0. 5mol/L溶液，搅拌，加入相当于2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基] 乙酸摩尔数1 3倍的氯化亚砜，搅拌至反应完全，减压下蒸除过量的醇，残留物用硅胶柱 层析纯化得到2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯(ΤΑΡΑ)。在步骤1)中，所述2，2-二甲基-1，3-二噁烷-4，6-二酮(Meldrum酸)的用量最 好是三烷氧基苯甲醛的1. 2倍摩尔数；所述反应物的浓度最好是0. 7mol/L,反应的温度最 好是85 90°C;所述酸化，可采用6mol/L盐酸酸化；所述提取，可采用乙酸乙酯提取；所述 洗涤，可采用饱和氯化钠溶液洗涤。在步骤2)中，所述多聚磷酸的加入量最好是3-(2，3，4-三烷氧基)苯基丙酸重量 的18 20倍；所述反应的温度最好是50 60°C;所述提取，可采用乙酸乙酯提取；所述洗 涤，可采用饱和氯化钠溶液洗涤。在步骤3)中，所述氢化茚酮的浓度最好是0. 05 0. lmol/L ；所述格氏试剂的加 入量最好是氢化茚酮的3 4倍摩尔数；所述酸化，可采用盐酸酸化，所述酸化的温度最好 是0°C ；所述提取，可采用二氯甲烷提取；所述洗涤，可采用饱和氯化钠溶液洗涤。
7
在步骤4)中，所述丙酮/水溶液，按体积比，丙酮水可为10 1 3 2，最好 为丙酮水=10 1 ；所述饱和硫代硫酸钠溶液，是含有相当于氢化茚2倍摩尔数；所述提 取，可采用乙酸乙酯提取；所述氢化茚浓度最好是0. lmol/L;所述甲磺酰胺的加入量最好 是氢化茚的1. 0倍摩尔数；所述N-甲基-N-氧化吗啉的加入量最好是氢化茚的1. 5倍摩尔数。在步骤5)中，所述四氢呋喃/水溶液，按体积比，四氢呋喃水可为(1 3) 1， 最好为四氢呋喃水=2 1 ；所述硅胶，可采用200 400目的硅胶；所制成的二羟基氢 化茚的浓度最好是0. 2 0. 3mol/L ；所述高碘酸钠的加入量最好是二羟基氢化茚摩尔数的 1. 1 1. 2 倍。在步骤6)中，所述四氢呋喃/叔丁醇/水溶液，按体积比，四氢呋喃叔丁醇水 可为(4 10) (2 4) 1，最好为四氢呋喃叔丁醇水可为8 3 1;所述加入饱 和亚硫酸钠溶液，是含有相当于2-芳基乙醛2 5倍摩尔数；所述提取，可采用二氯甲烷提 取；所述洗涤，可采用饱和氯化钠溶液洗涤；所述2-甲基-2- 丁烯的加入量最好是2-[(2， 3,4-三烷氧基-6-酰基)苯基]乙醛摩尔数的7 8倍，所述磷酸二氢钠的加入量最好是 2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙醛摩尔数的3 4倍；所述亚氯酸钠的加入量最 好是2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙醛摩尔数的2 3倍。在骤7)中，2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸的浓度最好是0.2 0. 3mol/L ；所述氯化亚砜的加入量最好是2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸摩尔 数的1.0 1.5倍。经细胞和小鼠实验证明，本发明所述2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸 酯可以通过提高AMPK α的磷酸化水平而有效地降低C57BL/KsJ-m+/+L印rdb(db/db)小鼠 (即II型糖尿病小鼠)的血糖水平，具有良好的创制抗糖尿病药物的应用前景，本发明所述 2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯(TAPA)可用于制备抗糖尿病的药物。与二甲双胍类药物相比，2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯类化合物 用于降低小鼠血糖的有效作用浓度更低，且化学结构及制备方法更为简单。这类新型化合 物的制备方法及其降血糖的作用目前未见报道。
图1为TAPAl对鼠正常肝细胞AML12的AMPK α磷酸化水平的影响。实验结果表 明，TAPAl可以提高AMPK α的磷酸化水平，但不会影响AMPK α蛋白的表达水平。分别用 TAPAl 的溶剂 DMS0、TAPA1 (10 μ Μ)和阳性对照 Metformin (ImM)处理 AML12 细胞 12h。用免 疫印迹实验(Western blotting)检测AMPK α的磷酸化水平(p-AMPK α )和AMPK α蛋白表 达水平(ΑΜΡΚ α )。图2为TAPAl作用下II型糖尿病小鼠模型db/db小鼠血糖的变化。实验结果表 明，TAPAl可以降低db/db小鼠的空腹血糖水平。横坐标为时间time (day)，纵坐标为血糖 值Blood glucoselevel (mM) ；a代表溶剂对照组(η = 8)，b代表TAPAl实验组(η = 8)；应 用SPSS13. 0统计软件对实验数据进行统计分析，所得实验数据以均数士标准误差表示；对 照组与实验组差异分析采用两因素方差分析及fisher检验，*表示ρ < 0. 05，具差异显著 性。
8
图3为TAPAl对db/db小鼠肝脏AMPK α磷酸化水平的影响。实验结果表明，TAPAl 可以显著提高db/db小鼠肝脏中AMPKa的磷酸化水平。“_”表示溶剂对照组，“ + ”表示 TAPAl实验组；p-AMPK α和AMPK α分别代表小鼠肝脏AMPK α的磷酸化水平和AMPK α的蛋 白水平。图4为TAPAl对db/db小鼠肝脏糖异生关键酶基因表达的影响。实验结果表明 TAPAl可以显著抑制db/db小鼠肝脏糖异生关键酶G6pc和P印ck基因的表达水平。G6Pase 葡萄糖-6-磷酸酶，Pepck 磷酸烯醇型丙酮酸羧化激酶；横坐标分别代表葡萄糖-6-磷酸 酶(G6paSe)和磷酸烯醇型丙酮酸羧化激酶(Pepck)，纵坐标为基因表达水平的相对倍数 (mRNA relativeexpression level)，a 代表溶剂对照组(η = 8)，b 代表 TAPAl 实验组(η =8)。应用SPSS13. 0统计软件对实验数据进行统计分析，所得实验数据以均数士标准误 差表示；对照组与实验组差异分析采用两因素方差分析及fisher检验，*表示ρ < 0. 05，具 差异显著性。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步说明。实施例12-[(2，3，4-三甲氧基-6-正辛酰基)苯基]乙酸乙酯(化合物TAPAl，R1 = CH3, R2 = n-C7H15，R3 = C2H5)1)3-(2，3，4_三甲氧基)苯基丙酸的制备将2，2-二甲基-1，3-二噁烷-4，6-二酮(Meldrum 酸)(12mmol)溶于 17mL 三乙 胺甲酸盐溶液中，制成0. 7mol/L溶液，再加入2，3，4-三甲氧基苯甲醛(IOmmol)。反应物在 95 100°C加热，搅拌5h。冷却到0°C，搅拌下用6mol/L盐酸酸化至pH= 1。用乙酸乙酯 提取(15mLx 3)，合并提取液，用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩后残留 物用硅胶柱层析纯化得到3- (2，3，4-三甲氧基)苯基丙酸(化合物2，R1 = CH3)，产率85%。2) 4，5，6-三甲氧基-2，3_ 二氢茚酮制备将3-(2，3，4_三甲氧基)苯基丙酸(5mmol)与多聚磷酸(23g)在55°C下搅拌8h。 冷却下加入冰水lOOmL，用乙酸乙酯提取(20mL χ 3)，合并提取液，用饱和氯化钠溶液洗涤， 无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩后残留物用硅胶柱层析纯化得到4，5，6-三甲氧基-2，3- 二 氢-1-茚酮(化合物3，R1 = CH3),产率80%。3) 1-正庚基-4，5，6-三甲氧基_3Η_茚的制备4，5，6-三甲氧基-2，3-二氢-1-茚酮(Immol)溶于50mL干燥二氯甲烷中，氮气 保护下，于0°C搅拌下缓慢滴加正庚基溴化镁格氏试剂(3mmol)。加完格氏试剂后升温至室 温，继续搅拌1.5h。冷却下滴加6mol/L盐酸50mL。搅拌Ih后分出有机层，水层用二氯甲 烷提取(20mL χ 3)，合并提取液，用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩后残 留物用硅胶柱层析纯化得到1-正庚基_4，5，6-三甲氧基-3!1-茚(化合物4，R1 = CH3, R2 =n-C7H15)，产率 82%。4) 1-正庚基-4，5，6-三甲氧基-2，3_ 二氢茚_1，2- 二醇的制备1-正庚基-4，5，6-三甲氧基-3!1-茚(Immol)溶于IOmL丙酮/水(10/1，ν/ν)溶 液中，于0°c搅拌下小心加入甲磺酰胺(Immo)和N-甲基N-氧化吗啉(1. 5mmol)。搅拌0. 5h
9后，滴加四氧化锇溶液(0. lmmol)。将反应混合物在室温下搅拌24h。往该反应混合物中加 入饱和硫代硫酸钠溶液(2mmol)，搅拌3h。减压下蒸去丙酮后用乙酸乙酯提取(15mL χ 3)， 合并提取液，用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩后残留物用硅胶柱层析 纯化得到1-正庚基_4，5，6-三甲氧基-2，3-二氢茚-1，2-二醇(化合物5，R1 = CH3, R2 = n-C7H15)，产率 90%。5) 2-[(2，3，4-三甲氧基-6-正辛酰基)苯基]乙醛的制备1-正庚基-4，5，6-三甲氧基-2，3-二氢茚-1，2-二醇(Immol)溶于5mL四氢呋喃 /水(2/1，ν/ν)溶液中，搅拌下加入高碘酸钠(1. lmmol)，室温下继续搅拌8h。加入2g硅 胶(200 400目)，搅拌15min。过滤，滤渣用IOmL乙酸乙酯洗涤，滤液减压浓缩，残留物 用硅胶柱层析纯化得到2-[(2，3，4_三甲氧基-6-正辛酰基)苯基]乙醛(化合物6，# = CH3, R2 = n-C7H15)，产率 90 %。6) 2-[(2，3，4-三甲氧基-6-正辛酰基)苯基]乙酸的制备2-[(2，3，4-三甲氧基-6-正辛酰基)苯基]乙醛(Immol)溶于8mL四氢呋喃/ 叔丁醇/水(8/3/1，ν/ν/ν)溶液中。搅拌下加入2-甲基-2-丁烯(Smmol)和磷酸二氢钠 (3mm0l)，(TC下加入亚氯酸钠(3mmol)。然后在室温下搅拌40min。冷却下加入饱和亚硫 酸钠溶液(3mmol)，搅拌lOmin。用二氯甲烷提取(15mLx 3)，合并提取液，用饱和氯化钠溶 液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩后残留物用硅胶柱层析纯化得到2-[(2，3，4_三甲氧 基-6-正辛酰基)苯基]乙酸(化合物7，R1 = CH3, R2 = Ii-C7H15)，产率93%。7) 2-[(2，3，4-三甲氧基-6-正辛酰基)苯基]乙酸乙酯(TAPAl)的制备2-[ (2，3，4-三甲氧基-6-正辛酰基)苯基]乙酸(Immol)溶于5mL无水乙醇中， 于0°C搅拌下缓慢滴加氯化亚砜(1.2mm0l)，将反应混合物在室温下搅拌12h。减压下蒸 去过量乙醇，残留物用硅胶柱层析纯化得到2-[(2，3，4_三甲氧基-6-正辛酰基)苯基] 乙酸乙酯(TAPA1，R1 = CH3, R2 = Ii-C7H15' R3 = C2H5),产率 80%。产物为一白色晶体，Mp 45 52°C (EtOAc/PE) ；IR(film)Vmax :3437，2931，2856，1737，1681，1494，1454，1403，1334， 1163,1138,1117,1030cm-1 ；1H NMR(400MHz, CDCl3) δ :0· 70 0· 99 (m，3Η)，1· 01 1· 50 (m， 11H)，1. 50 1. 85 (m, 2H), 2. 75 2. 95 (m, 2H), 3. 68 3. 98 (m, 11H) ,4. 00 4. 23 (m, 2H)，
7.05 (s，1H) ppm ；13C NMR(100MHz, CDCl3) δ 14. 1，14. 3,22. 6,24. 4,29. 1,29. 2,31. 7,31. 9， 41. 0,56. 2,60. 6,60. 8,61. 1,108. 4，121. 8，133. 6，145. 1，151. 8，152. 8，172. 1,203. Ippm ； MS (ESI) :403m/z (M+Na+). Anal. Calcd. forC21H3206 :C，66. 29 ；H, 8. 48. Found :C，66. 16 ；H,
8.72。实施例22-[(2，3，4-三甲氧基-6-正辛酰基)苯基]乙酸正戊酯(化合物TAPA2，R1 = CH3, R2 = n-C7H15，R3 = n-C5Hn)制备化合物TAPA2的步骤1)至步骤6)与实施例一中的步骤1)至步骤6)相同。 制备化合物TAPA2以2-[(2，3，4-三甲氧基-6-正辛酰基)苯基]乙酸(制备方法见实施 例一，步骤6))为起始物。将2-[(2，3，4-三甲氧基-6-正辛酰基)苯基]乙酸(Immol)溶于5mL无水正戊醇 中，于0°C搅拌下缓慢滴加氯化亚砜(1. 2mmol)，将反应混合物在室温下搅拌12h。减压下蒸 去过量的正戊醇后，残留物用硅胶柱层析纯化得到2-[ (2，3，4-三甲氧基-6-正辛酰基)苯
10基]乙酸正戊酯(TAPA2，R1 = CH3, R2 = H-C7H15' R3 = H-C5H11)，产率75%。产物为一粘稠状液 体，IR(film) vmax =2954,2932, 2857,1736，1684，1455，1168，1005cm-1. 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ :0. 86-0. 91 (m，6H)，1. 29-1. 34(m，12Η)，1. 60-1. 70(m，4H)，2. 86(t，J = 7·2Ηζ，2Η)， 3. 84-3. 92 (m, 11H) ,4. 08 (t, J = 6. 8Hz,2H) ,7. 03 (s, lH)ppm ； 13C NMR(100MHz, CDCl3) δ 13. 9，14. 0,22. 3,22. 6,24. 3,28. 0,28. 3,29. 1,29. 2,31. 7,31. 8,41. 0,56. 2,60. 7,61. 0， 64. 7，108. 4，121. 8，133. 7，145. 1，151. 8，152. 8，172. 1,203. Oppm ；MS (ESI)m/z445 (M+Na.) · Anal. Calcd. for C24H38O6 :C，68. 22 ；H, 9. 06 ；Found :C，68. 34 ；H, 9. 35。实施例3采用Western blotting方法检测实施例一中的TAPAl对鼠正常肝细胞AML12中 AMPKa磷酸化水平的影响。试验方法如下1)细胞裂解细胞接种在培养板上，生长24h后加药处理一定时间，弃培养液，用PBS缓冲液 洗一次，然后加入含lmmol/L的PMSF和Cocktail (临用前加，每100 μ L裂解液加1 μ L) 的 lysis buffer 细胞裂解液(50mM HEPES(pH 7. 4), IOOmM NaCl, 10 % glycerol, 1 % Triton-X-100,1. 5mMMgCl2, 25mM NaF) 400 μ L,冰上超声破碎，4°C，13000rpm 离心 30min 后 收集上清液，测蛋白浓度。2)蛋白浓度的测定a. 96孔板中每孔加200 μ L Bradford蛋白测定液，每组设3孔；b.空白每孔加2 μ L Lysis buffer裂解液混勻；c.标准每孔力口 2 μ L 浓度为 lmg/mL 的 BSA (溶于 Lysis Buffer)；d.样品每孔加2 μ L混勻；e.于酶标仪测OD 595，计算样品浓度。3)蛋白电泳取20-40 μ g蛋白样品，加等体积2XSDS样品缓冲液，100°C煮沸6min，于不连续 SDS-PAGE胶中电泳，电压100V，待样品进入分离胶后电压调为150V。4)电转移电转液于4°C预冷，切好胶后将同样大小的甲醇预处理的PVDF膜以及滤纸浸于电 转液中；PVDF膜贴于胶后，两面覆盖滤纸，赶尽气泡，按膜朝正极的顺序装于电转槽中，于 一 20°C 电转(100V,60min)。5)抗原抗体反应a.封闭封闭液室温封闭Ih ；b. 一抗反应封闭后膜与相应一抗室温孵育l_2h ；c. 二抗反应TBST洗3次，每次5min，加入相应的二抗，室温孵育l_2h。6) ECL 检测TBST洗3次，每次lOmin。ECL的A液和B液以1 1 (V/V)混和，于暗室中滴加于 膜表面，孵育Imin后曝光。试验结果如下如图1所示，用TAPA1(溶解在DMS0)处理鼠正常肝细胞AML12 (10 μ M，12h)后，可
11以显著提高AMPK α的磷酸化水平；用阳性对照的抗糖尿病药物二甲双胍(Metformin，溶解 在磷酸盐缓冲液PBS)处理细胞(lmM，12h)后，也同样提高AMPK α的磷酸化水平。试验结果表明，化合物TAPAl能以1/100的药物浓度达到与二甲双胍同样提高 AMPKa磷酸化水平的能力。实施例4采用小鼠尾静脉采血测定血糖方法测定TAPAl对II型糖尿病小鼠模型db/db小 鼠的降血糖能力。试验方法如下取16只高血糖的db/db小鼠(雄性，8周龄)，随机分为实验组(TAPA1给药组；先 将TAPAl溶于DMSO配成IM母液，然后取所需量与3倍体积的乳化剂Tween-80混合均勻， 静置15min后，缓慢加入生理盐水，轻弹使TAPAl-DMSO-Tween-80混合物缓慢地溶入生理盐 水中以形成水溶液)和对照组(溶剂组用DMSO取代TAPA1-DMS0溶液，配置方法同上)。 采取腹腔注射的方式给药，TAPAl剂量为50mg/kg，溶剂组小鼠注射与实验组同体积的配置 好的溶剂，每天一次，连续注射15天后禁食小鼠18h，再尾静脉取血，用血糖仪测其空腹血 糖值。试验结果如下如图2所示，药物处理前，对照组和实验组小鼠的空腹血糖水平基本没有差异(P > 0. 05)；但是经TAPAl处理15天后，db/db小鼠的空腹血糖水平显著降低(ρ < 0. 05)试 验结果表明，TAPAl能显著降低II型糖尿病模型db/db小鼠的饥饿血糖水平。实施例5采用Western bloting和Realtime PCR的方法检测TAPAl处理后，db/db小鼠肝 脏中AMPKa的磷酸化水平以及糖异生途径关键酶基因表达的变化。试验方法如下将实施例六中经TAPAl处理15天的小鼠断颈处死，取肝脏进行如下试验。1)组织总蛋白提取与Western blotting 用实施例五中试验方法中的细胞裂解液将小鼠肝脏组织在冰上勻浆研磨(0. Ig 组织用Iml裂解液勻浆)并超声裂解，4°C，13000rpm离心30min后收集上清液，即所需的蛋 白溶液。蛋白浓度测定以及Western blotting的操作步骤则参照实施例五的试验方法。2)组织总RNA提取与实时荧光PCR(Realtime-PCR)总RNA提取实验方法参照Qiagen公司的RNeasy Mini Kit使用说明书。RNA提取后，用1 %的琼脂糖凝胶电泳及分光光度计测定所获总RNA的质量和浓 度。质量好的RNA在电泳检测时可见两条亮带，分别为28S和18SRNA，且前一条带亮于后一 条。分光光度计测定所获RNA的纯度，一般要求A260/A280的比值大于1. 8。使用Fermentas逆转录酶，以总RNA为模板，逆转录合成cDNA。实验步骤如下加 入 2 μ g RNA 样品，1 μ L dT18 (50 μ Μ)，加无 RNAase 的 H2O 至 15 μ L 混勻，70°C放置 5min 变 性 RNA，迅速置于冰上 2min。加入 5 μ L 的 5 XFrist-Strand buffer, 1. 25 μ L 无 RNA 酶的 dNTP (10 μ Μ)，1 μ L RNA酶抑制剂及1 μ L逆转录酶，40°C条件下反应60min，最后分装样品 并冻存于_20°C待用。以CDNA为模板，用Realtime-PCR方法检测糖异生通路中相关基因mRNA的表达水
12平。引物序列G6pc =Sense 5' -CACCGACTACTACAGCAACAGC-3‘Antisense 5' -ATC CCAACCACAAGATGACG-3‘；P印ck :Sense :5' CATTGAGGGTATCATCTTTGGTGG 3‘Antisense 5' CAGGTATTTGCCGAAGTTGTAGC 3‘.试验结果如下如图3所示，TAPAl处理后，db/db小鼠肝脏中AMPK α的磷酸化水平显著提高。如 图4所示，TAPAl处理后，db/db小鼠肝脏中糖异生途径关键酶葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)和 磷酸烯醇型丙酮酸羧化激酶(Pepck)的基因表达水平被显著抑制。试验结果表明，TAPAl能显著提高II型糖尿病模型db/db小鼠肝脏中AMPKa的 磷酸化水平以及显著降低其肝脏糖异生途径关键酶的基因表达水平。
1权利要求
2 [(2，3，4 三烷氧基 6 酰基)苯基]乙酸酯，其特征在于其结构如下FSA00000159444700011.tif
2.如权利要求1所述的2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯的制备方法，其 特征在于包括以下步骤1)制备3-(2，3，4-三烷氧基)苯基丙酸2将1. O 1.5倍摩尔数的2，2-二甲基-1，3-二噁烷-4，6-二酮(Meldrum酸)溶于三 乙胺甲酸盐溶液中，制成0. 2 1. Omol/L溶液，再加入2，3，4-三烷氧基苯甲醛，将反应物 加热、搅拌至反应完全，冷却下加入冰水，再酸化至PH= 1，提取后合并提取液，洗涤，干燥， 浓缩后残留物用硅胶柱层析纯化得到3-(2，3，4-三烷氧基)苯基丙酸2 ；2)制备氢化茚酮3将步骤1)制备得到的3-(2，3，4_三烷氧基)苯基丙酸2与相当于3-(2，3，4_三烷氧 基)苯基丙酸重量的15 25倍的多聚磷酸搅拌，反应完全后，冷却下加入冰水，提取后，合 并提取液，洗涤，干燥，浓缩后残留物用硅胶柱层析纯化得到氢化茚酮3 ；3)制备氢化茚4将步骤2)制备得到的氢化茚酮3溶于干燥二氯甲烷中，制成0. 05 0. 15mol/L溶 液，惰性气体保护下，搅拌，加入相当于氢化茚酮摩尔数的1. 5 4. 5倍摩尔数的格氏试剂 R2MgX,R2 = Cl ClO烷基，X = Cl、Br，加完格氏试剂后升温至室温，继续搅拌至反应完全， 冷却下酸化至PH = 1，搅拌后提取，合并提取液，洗涤，干燥，浓缩后残留物用硅胶柱层析纯 化得到氢化茚4 ；4)制备二羟基氢化茚5将步骤3)制备得到的氢化茚4溶于丙酮/水溶液中，制成0. 05 0. 2mol/L溶液，搅 拌，加入相当于氢化茚1 3倍摩尔数的甲磺酰胺和N-甲基-N-氧化吗啉，搅拌后，加入相 当于氢化茚的3% 20%摩尔数的四氧化锇溶液，将反应混合物搅拌至反应完全，加入饱 和硫代硫酸钠溶液，搅拌，减压下蒸除丙酮后提取，合并提取液，干燥，浓缩后残留物用硅胶 柱层析纯化得到二羟基氢化茚5 ；5)制备2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙醛6将步骤4)制备得到的二羟基氢化茚5溶于四氢呋喃/水溶液中，制成0. 1 0. 5mol/L 溶液，加入相当于二羟基氢化茚1. 0 2. 0摩尔数的高碘酸钠，搅拌至反应完全，加入硅胶， 搅拌，过滤，将滤液浓缩，残留物用硅胶柱层析纯化得到2-[ (2，3，4-三烷氧基-6-酰基)苯 基]乙醛6 ；6)制备2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸7将步骤5)制备得到的2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙醛6溶于四氢呋喃 /叔丁醇/水溶液中，制成0. 1 0. 5mol/L溶液，搅拌下加入相当于2_[ (2，3,4-三烷氧 基-6-酰基)苯基]乙醛6 12倍摩尔数的2-甲基-2- 丁烯和2 5倍摩尔数的磷酸二氢钠，冷却下加入2 5倍摩尔数的亚氯酸钠，然后搅拌至反应完全，冷却下加入饱和亚硫酸 钠溶液，搅拌，提取，合并提取液，洗涤，干燥，浓缩后残留物用硅胶柱层析纯化得到2-[ (2， 3,4-三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸7 ；7)制备2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯将步骤6)制备得到的2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸7溶于无水醇中， 制成0. 1 0. 5mol/L溶液，搅拌，加入相当于2_[ (2，3，4-三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸 摩尔数1 3倍的氯化亚砜，搅拌至反应完全，减压下蒸除过量的醇，残留物用硅胶柱层析 纯化得到2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯。
3.如权利要求2所述的2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯的制备方法， 其特征在于在步骤1)中，所述2，2-二甲基-1，3-二噁烷-4，6-二酮(Meldrum酸)的用量 是三烷氧基基苯甲醛的1. 2倍摩尔数；所述反应物的浓度是0. 7mol/L,反应的温度是85 900C ；所述酸化，是采用6mol/L稀盐酸酸化；所述提取，是采用乙酸乙酯提取；所述洗涤，是 采用饱和氯化钠溶液洗涤。
4.如权利要求2所述的2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯的制备方法， 其特征在于在步骤2)中，所述多聚磷酸的加入量是3-(2，3，4-三烷氧基)苯基丙酸重量的 18 20倍；所述反应的温度是50 60°C ；所述提取，是采用乙酸乙酯提取；所述洗涤，是 采用饱和氯化钠溶液洗涤。
5.如权利要求2所述的2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯的制备方法，其 特征在于在步骤3)中，所述氢化茚酮的浓度是0.05 0. lmol/L;所述格氏试剂的加入量 是氢化茚酮的3 4倍摩尔数；所述酸化，是采用盐酸酸化，所述酸化的温度是0°C;所述提 取，是采用二氯甲烷提取；所述洗涤，是采用饱和氯化钠溶液洗涤。
6.如权利要求2所述的2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯的制备方法，其 特征在于在步骤4)中，所述丙酮/水溶液，按体积比，丙酮水为10 1 6 4;所述提 取，是采用乙酸乙酯提取；所述氢化茚是0. lmol/L ；所述甲磺酰胺的加入量是氢化茚的1. 0 倍摩尔数；所述N-甲基-N-氧化吗啉的加入量是氢化茚的1. 5倍摩尔数。
7.如权利要求2所述的2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯的制备方法，其 特征在于在步骤5)中，所述四氢呋喃/水溶液，按体积比，四氢呋喃水为1 3 1;所 述硅胶，是200 400目的硅胶；所制成的二羟基氢化茚的浓度是0. 2 0. 3mol/L ；所述高 碘酸钠的加入量是二羟基氢化茚摩尔数的1. 1 1. 2倍。
8.如权利要求2所述的2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯的制备方法，其 特征在于在步骤6)中，所述四氢呋喃/叔丁醇/水溶液，按体积比，四氢呋喃叔丁醇水 为(4 10) (2 4) 1 ；所述提取，是采用二氯甲烷提取；所述洗涤，是采用饱和氯化 钠溶液洗涤；所述2-甲基-2-丁烯的加入量是2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙 醛摩尔数的7 8倍，所述磷酸二氢钠的加入量是2-[ (2，3，4-三烷氧基-6-酰基)苯基] 乙醛摩尔数的3 4倍；所述亚氯酸钠的加入量是2-[ (2，3，4-三烷氧基-6-酰基)苯基] 乙醛摩尔数的2 3倍。
9.如权利要求2所述的2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯的制备方法，其 特征在于在骤7)中，2-[(2，3，4-三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸的浓度是0.2 0.3mol/ L;所述氯化亚砜的加入量是2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸摩尔数的1.0 `1.5 倍。
10.如权利要求1所述的2-[(2，3，4_三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯在制备抗糖尿 病药物中的应用。
全文摘要
2-[(2，3，4-三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯及其制备方法与应用，涉及一种有机小分子化合物。以2，3，4-三烷氧基苯甲醛1为原料，用Meldrum酸转化为3-(2，3，4-三烷氧基)苯基丙酸2；在多聚磷酸作用下，2经分子内酰化得到相应的氢化茚酮3；3与Grignard试剂加成，再用酸脱水成为氢化茚4；用四氧化锇处理4得到二羟基氢化茚5；5分别用高碘酸钠和亚氯酸钠氧化得到2-[(2，3，4-三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸7；最后在氯化亚砜存在下，7与无水醇反应得到目标产物2-[(2，3，4-三烷氧基-6-酰基)苯基]乙酸酯8。可激活腺苷酸活化蛋白激酶，可用于制备抗糖尿病药物。
文档编号A61P3/10GK101891618SQ20101021144
公开日2010年11月24日 申请日期2010年6月23日 优先权日2010年6月23日
发明者占艳艳, 吴乔, 庄佳佳, 张洪奎, 林圣彩, 沈月毛, 郑忠辉, 陈航姿, 黄培强 申请人:厦门大学