从骆驼刺植物中提取治疗过敏性结肠炎药物的方法及其药物和用途的利记博彩app

专利名称：从骆驼刺植物中提取治疗过敏性结肠炎药物的方法及其药物和用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种具有抗过敏效果的治疗过敏性结肠炎的中药制剂及其生产方法和该中药制剂的用途，特别是一种从骆驼刺植物中提取的治疗过敏性结肠炎的中药制剂及 其生产方法和该中药制剂的用途。
背景技术：
随着社会的发展，人们的日常生活的环境呈现出越来越复杂的变化，由于受日常 生活环境因素的影响，各种过敏性疾病越来越多，目前抗过敏药物主要为化学药品，很多会 对人体产生一些副作用，特别是对一些例如过敏性结肠炎之类的疾病，过多使用化学药品 学还会出现对肠胃的刺激。而利用中草药进行抗过敏性疾病的治疗，从根本上改善患者的 免疫系统，提高免疫能力，且疗效持久、毒副作用少等特点，就成为现今抗过敏性疾病研究 的热点，利用中药制剂治疗过敏性疾病也有了一定程度的研究.研究发现中药复方制剂对 多项免疫指标有显著的降低作用，这些指标覆盖了 IgE介导的即时型过敏反应的各个主要 环节圆。中国的中医药除有抗过敏反应的作用外，均有不同程度的增强机体免疫功能的作 用，且毒副反应较少。中药治疗以从整体上改善系统的异常为主要特点，这在治疗上拥有了 很大的优势，从传统中药的主剂入手，分离提纯天然植物中的抗过敏有效成分，就成为抗过 敏研究的一个新的热点。骆驼刺(Alhagi pseudalhagi.)是新疆干旱沙漠地区特有的一种落叶灌木，该植 物能分泌糖类物质而凝结其上，干燥后经敲打而脱落，收集所谓的刺糖为维吾尔族民族药， 用于腹痛腹胀、痢疾腹泻、滋补强壮和平衡体液。但因刺糖产出率量少并不易收集，有效物 质含量低，同时还含有一些可能会对人体产生毒副作用的未知物质，因而影响其应用效果。因此一种具有抗过敏效果的治疗过敏性结肠炎的中药制剂及其生产方法，特别严 重是一种从骆驼刺植物中提取的治疗过敏性结肠炎的中药制剂及其生产方法就被提出。

发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗过敏效果的治疗过敏性结肠炎的中药制剂及其 生产方法和该中药制剂的用途，特别是一种从骆驼刺植物中提取的治疗过敏性结肠炎的中 药制剂及其生产方法和该中药制剂的用途。本发明的药物是通过以下方法制取的回流提取取干燥的骆驼刺地上部分，粉碎，按每IOkg置于25000 40000ml 60 95%的乙醇中回流提取1次以上，每次1小时以上得提取液原液，所述的回流提取最 好为2 4次，每次时间优选为1 5小时；所述的粉碎最好为5mm以下的段或颗粒。浓缩合并提取液，提取液浓缩至干物质含量不低于5 %得浸膏，优选为20 40% ；萃取
a.以浓缩所得浸膏体积1-3倍量的乙酸乙酯进行萃取，静置4 6小时澄清至出 现明显分层，去乙酸乙酯层保留水溶层；b.以a步骤水溶层体积1-3倍量的正丁醇进行萃取，静置4 6小时澄清至出现 明显分层，取正丁醇层溶液，浓缩所得正丁醇层提取物即为本发明的药物。
上述萃取最好可重复进行2 5次。上述萃取a步骤之前最好依次进行下列的操作的至少一种以浸膏体积1-3倍量的60-90°C石油醚进行萃取，保留水溶层；以体积1 3倍量 的三氯甲烷进行萃取，保留水溶层。上述正丁醇层溶液最好在旋转蒸发仪中浓缩至干物质含量> 75%。本发明的药物可以用在治疗过敏性结肠炎类疾病的药物中。本发明的药物还可对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均和福氏痢疾杆菌有一定程度的 抑菌和杀菌作用，可以用在治疗因金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均和福氏痢疾杆菌引起的疾 病的药物中。本发明的药物为纯中草药制剂，经试验证明能够改善动物体的免疫系统，提高免 疫能力，特别是对过敏性结肠炎类疾病有较明显的效果，并且具有疗效持久、毒副作用小的 特点，可以广泛应用在各种治疗过敏性结肠炎类疾病的药物中。


图1所显示的为RBL-2H3细胞的复苏与增殖图。图2所显示的为不同浓度C48/80对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响。图3为不同时间C48/80诱导细胞脱颗粒率。图4为空白对照组结肠肌层及浆膜与结肠粘膜层对照图。图5为模型组结肠肌层及浆膜与结肠粘膜层对照图。图6为高剂量组结肠肌层及浆膜与结肠粘膜层对照图。图7为中剂量组结肠肌层及浆膜与结肠粘膜层对照图。见图8为低剂量组结肠肌层及浆膜与结肠粘膜层对照图。
具体实施例方式原料药材骆驼刺采于新疆吐鲁番地区，干燥至水分含量< 20%，粉碎至5mm以下 的段或颗粒；设备或试剂薄层层析硅胶GF254 ；200-300目柱层析硅胶；循环水式多用真空泵； 旋转蒸发仪；核磁共振光谱用Bruker ARX-300和AV-600型核磁共振仪测定；相关试剂均为 A.R 级。实施例1 回流提取取干燥粉碎的骆驼刺地上部分，干燥至水分含量< 15%，粉碎至3mm以 下的段或颗粒；按每IOkg置于25000 40000ml 60 95%的乙醇中回流提取2小时并重 复进行3次，第1次乙醇用量为40000ml，之后的两次均为30000ml。浓缩合并上述提取液，在旋转蒸发仪中浓缩至干物质含量为20 40%得浸膏；萃取a.以浓缩所得浸膏体积3倍量的乙酸乙酯进行萃取，充分搅拌后静置4 6小时澄清至出现明显分层，去乙酸乙酯层保留水溶层；b.以a步骤水溶层体积3倍量的正丁醇进行萃取，充分搅拌后静置4 6小时澄清至出现明显分层，取正丁醇层，在旋转蒸发 仪中浓缩至干物质含量> 80 %，所得提取物即为本发明的药物。实施例2 与实施例1相比，本实施例的不同在于在萃取a步骤之前以浸膏体积3倍量的 60-90°C石油醚进行萃取，充分搅拌后静置4 6小时澄清至出现明显分层，取水溶层；所得 水溶层以体积3倍量的三氯甲烷进行萃取，充分搅拌后静置4 6小时澄清至出现明显分 层，取水溶层进入萃取a步骤。实施例3 与实施例1相比，本实施例的不同在于所述的萃取为a.以浓缩所得浸膏体积3 倍量的乙酸乙酯进行萃取，充分搅拌后静置4 6小时澄清至出现明显分层，去乙酸乙酯层 保留水溶层，并且水溶层再重复用2倍量的乙酸乙酯进行萃取2次，b.以a步骤水溶层体 积3倍量的正丁醇进行萃取，静置4 6小时澄清至出现明显分层，取正丁醇层，其水溶层 再重复用2倍量的正丁醇进行萃取2次，合并3次所取正丁醇层溶液在旋转蒸发仪中浓缩 至干物质含量> 75%，所得提取物即为本发明的药物。实施例4 与实施例1相比，本实施例的不同在于在萃取a步骤之前以浸膏体积3倍量的三 氯甲烷进行萃取，充分搅拌后静置4 6小时澄清至出现明显分层，取水溶层，以所得水溶 层体积2倍量的三氯甲烷再重复萃取2次，将最后所得水溶层进入a步骤萃取。实施例5 与实施例1相比，本实施例的不同在于在萃取a步骤之前以浸膏体积3倍量的 60-90°C石油醚进行萃取，充分搅拌后静置4 6小时澄清至出现明显分层，取水溶层，以所 得水溶层体积2倍量的石油醚再重复萃取2次，将最后所得水溶层进入a步骤萃取。实施例6:与实施例1相比，本实施例的不同在于所述回流提取取干燥粉碎的骆驼刺地上 部分，干燥至水分含量彡12%，粉碎至2mm以下的颗粒；按每IOkg置于25000 40000ml 60 95%的乙醇中回流提取2小时并重复进行4次，第1次乙醇用量为40000ml，之后的每 次均为25000ml。本发明药物的药理作用研究与试验如下1骆驼刺提取物有效部位的筛选1. 1.材料与方法1. 1. 1 材料药品硫酸亚铁(天津基准化学试剂有限公司)，双氧水(江西德成制药有限公 司)，水杨酸(北京精益化工有限责任公司)，乙酰胆碱(Ach，天津市远航化学品有限公司)动物健康豚鼠10只，体重200g左右，雌雄不限，由新疆实验动物研究中心提供 (许可证编号SYXK2003-0003)。仪器循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)紫外分光光度计(Beckman公司 DU-7Spectrophotometer)，RM6240BD 多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂)，1.1.2 方法1. 1. 2. 1本发明的提取物对豚鼠离体回肠平滑肌的作用豚鼠禁食24h，正常饮水，处死豚鼠，迅速取末端回肠(距回盲瓣3-4cm)约1cm，于台氏液中漂洗，固定在装有恒温(37°C)台氏液的浴槽中，持续供应95%02，和5%0)2的混 合气体，在Ig前负荷下温育平衡20min，记录肠管正常收缩曲线。待基线稳定后，分别加入 不同提取部位骆驼刺提取物，记录肠管收缩机械运动，以等体积生理盐水做空白对照，以乙 酰胆碱为模型对照。张力变化值=加药后肠管收缩最大张力_加药前肠管收缩最大张力，正值表示肠管收缩，为负值表示肠管舒张1. 1. 2. 2骆驼刺各提取部分对Ach诱发肠管收缩反应的影响同上制备豚鼠离体肠管标本，在Ig前负荷下无钙台氏液温育平衡30min，加入乙 酞胆碱(终浓度2*l(Tm0l/ml)，待曲线上升稳定后记录肌张力值。冲洗肠管2_3次，待 肠管舒缩稳定后，分别加入不同提取部位骆驼刺提取物，温浴3min，加入乙酞胆碱(终度 2*10_7mol/ml)引发肠管收缩，记录骆驼刺不同提取部位对Ach作用下豚鼠离体肠管收缩的 影响。张力变化值=加药后肠管收缩最大张力_加药前肠管收缩最大张力1. 2 结论1. 2. 1本发明的提取物对豚鼠离体回肠平滑肌的作用表1表明乙酰胆碱对豚鼠离体回肠平滑肌有显著的收缩作用，表现为肌张力增 大；骆驼刺正丁醇部位对豚鼠离体肠管收缩活动有显著的抑制作用，表现为肌张力减小； 其余部位对离体肠管收缩无显著性影响。表1 骆驼刺各提取部位对豚鼠离体肠管收缩作用的影响 +SDn = 10) 与空白对照组比较 *P < 005 **P < 0. 011. 2. 2本发明的提取物对Ach诱发肠管收缩反应的影响表2表明空白对照组在Ach作用下豚鼠离体回肠平滑肌发生大幅度收缩，肌张力 增加；而在骆驼刺正丁醇部位作用下对Ach诱发的肠管收缩有显著的拮抗作用，肌张力变 化较小。抑制率=(给药组张力变化值-空白对照组张力变化值)/空白对照组张力变化 值*100%。抑制率为正表明对Ach诱发的肠管收缩有拮抗作用，抑制率为负表明对Ach诱 发的肠管收缩有协同作用。表2 本发明的提取物对Ach诱发肠管收缩反应的影响(；+SDn = 5) 与空白对照组比较*P < 0. 05 **P < 0. 011. 3.结论通过药理学实验对豚鼠离体回肠平滑肌收缩作用的影响实验，研究植物中是否含 有对肠道平滑肌运动有一定药理作用的活性成分，以此确定骆驼刺植物中的活性部位，为 今后进一步研究其药理作用机制奠定一定的基础。实验结果表明骆驼刺植物正丁醇提取部位对豚鼠离体回肠平滑肌自发收缩运动 有显著的抑制作用，并且能拮抗Ach诱发的回肠平滑肌兴奋。提示该活性部位能抑制肠蠕 动，对腹痛腹泻有一定的药理作用。胃肠道壁平滑肌上主要是M受体，乙酰胆碱(Ach)可激 动胃肠平滑肌上的M受体，M受体是与G蛋白耦联受体，M受体与配体结合后通过G蛋白与 腺苷酸环化酶耦联，抑制该酶活性，使胞内cAMP浓度下降，通过细胞膜信号传导系统，导致 胞内Ca2+浓度升高，兴奋平滑肌产生强烈收缩。当加入骆驼刺提取物III时，可拮抗Ach引发 的肠平滑肌收缩，此结果提示活性部位对肠管的抑制作用可能与M胆碱受体被阻断有关。综上所述，骆驼刺植物中活性部位对肠道平滑肌运动有一定的抑制作用，其机制 可能与其对抗胆碱能神经对胃肠道运动的支配有关。今后的研究重点是对其活性部位的有 效成分进一步分离鉴定，药理作用机制进一步深入研究，将这种新疆优势资源开发成疗效 显著，作用稳定，副作用少的中药制剂。2本发明的提取物对小鼠肠推进的药效学研究在研究中通过对小鼠肠推进的药理学实验探讨植物中是否含有对肠道平滑肌运 动有一定药理作用的活性成分，以此分析骆驼刺治疗胃肠道疾病的药理作用机制，为今后 进一步研究有效的单体成分及开发这种新疆优势药用资源奠定一定的基础。2. 1.材料与方法2. 1. 1 材料动物=SD小鼠 110 只(SPF 级)，体重(18-22) g (许可证编号:SYXK2005_0004)，均 由新疆实验动物研究中心提供(许可证编号SYXK2003-0003)。药品粉状活性炭(中国林科院林产化工研究所)，羧甲基纤维素钠(上海化学试 剂公司)，乙酰胆碱(Ach，天津市远航化学品有限公司)，溴吡斯的明片(上海三维制药有限 公司)。2. 1. 2 方法2. 1. 2. 1对正常小鼠小肠推进的影响小鼠适应性喂养3天后，随机分5组，每组10只，设为空白对照组、给药大、中、小 剂量组。每日ig给药连续4d，空白组和模型组给予等体积蒸馏水，末次给药前禁食12h，给 药后30min，每只小鼠ig5%炭末混悬液，用量0. lml/10g, 20min后颈椎脱臼处死，立即取出 小肠全长，不加牵引的铺于木板上，测量其全长并测炭末前沿到幽门的距离。按下列公式计 算炭末推进百分率。炭末推进率(％ )=炭末在肠内的推进距离/小肠全长*100%
2. 1. 2. 2.对新斯的明所致小鼠小肠推进亢进的影响小鼠适应性喂养3天后，随机分5组，每组10只，设为空白对照组、模型组、给药 大、中、小剂量组。每日ig给药连续4d，空白组和模型组给予等体积蒸馏水，末次给药前禁 食不禁水12h，给药后lh，除空白对照组除外，其余各组均sc溴吡斯的明3mg/kg，30min后 每只小鼠ig5%炭末混悬液，用量0. lml/10g，20min后颈椎脱臼处死，立即取出小肠全长， 不加牵引的铺于木板上，测量其全长并测炭末前沿到幽门的距离。按下列公式计算炭末推 进百分率。炭末推进率(％ )=炭末在肠内的推进距离/小肠全长*100% 2. 2.结论对正常小鼠肠推进的影响见表3表3 本发明的提取物对正常小鼠肠推进作用的影响( +SDn = 10) 与空白对照组比较 *P < 0. 05 **P < 0. 01表3表明骆驼刺正丁醇提取物对正常小鼠肠推进有一定的抑制作用，低剂量对肠 推进无明显影响，而高剂量对肠推进有显著的抑制作用。2. 3对溴吡斯的明所致亢进小鼠小肠推进的影响见表表4表明溴吡斯的明能明显促进小鼠小肠推进运动，而4mg/kg骆驼刺提取物III对 溴吡斯的明所致小鼠小肠推进亢进运动有显著的抑制作用。表4 本发明的提取物对溴吡斯的明所致小鼠小肠推进亢进的影响( +SDn =
10) 与空白对照组比较*P < 0.05< 0.01，与模型组比较#P < 0.05# #P < 0. 012.4.结论
本实验结果表明本发明的提取物对正常小鼠肠推进有显著的抑制作用，对新斯 的明所致小鼠小肠推进亢进运动有显著的抑制作用，提示该活性部位能抑制肠蠕动，对腹 痛腹泻有一定的药理作用。3本发明的提取物抗过敏的药效学研究过敏反应及其引起的病症多属I型变态反应，其发病机理是变应原进人机体后， 刺激机体产生抗体IgE与有关靶细胞表面的受体结合，使机体处于致敏状态，当相应的变 应原再次进人机体后经一系列生化过程，释放出组织胺等过敏反应介质，这些介质与效应 器官作用可引起支气管、消化道平滑肌收缩，毛细血管扩张，通透性增加和腺体分泌增多及 相关的过敏反应性疾病。本研究通过抗过敏动物模型实验法筛选骆驼刺提取物的抗过敏活性，继而采用大 鼠RBL-2H3细胞体外培养方式，C48/80诱导大鼠嗜碱性白血病细胞脱颗粒，ELISA酶联免疫 法测试组胺、肿瘤坏死因子α等过敏反应介质水平。3. 1.材料与方法3. 1.1 材料动物健康豚鼠10只，体重200g左右，雌雄不限，由新疆实验动物研究中心提供 (许可证编号SYXK2003-0003)。细胞株RBL_2H3细胞(大鼠嗜碱性白血病细胞)购于上海试剂卵白蛋白(国药集团化学试剂有限公司)、息斯敏(西安杨森制药有限公 司)、色甘酸钠(Sigma)、胎牛血清(Gibco)、MEM培养基(Hyclone)、Compound48/80 (Sigma)。仪器RM6240BD多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂)低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂TDL-40C)3. 1.2 方法3. 1. 2. 1致敏豚鼠离体回肠肌过敏性收缩实验动物致敏取豚鼠10只，体重200_250g。每只豚鼠两后腿各肌肉注射5%卵蛋白 生理盐水溶液0. 4ml,同时腹腔注射该溶液1. Oml以致敏，正常饲养，每日给与一定量的食 物和水，补充适量Vc，保持饲养环境干净，温度20°C左右，避免阳光直射，约18-25天造模成 功。抗原攻击3周后将豚鼠放血处死，剖腹取回肠，剪成1-1. 5cm肠段，置入盛有台氏 液IOml的浴槽中，一端固定于浴槽底部的固定钩上，另一端与拉力换能器相连，记录收缩 张力，前负荷l_1.5g，恒温37士0.5°C，通氧平衡60min后开始实验。实验分为3组，S卩(1) 空白对照组；⑵息斯敏阳性对照组；⑶正丁醇组。待药物与标本接触15min后，向浴槽内 加入0. 卵蛋白生理盐水0. 6ml进行抗原攻击，比较各组回肠肌收缩张力的差别。3.1.2. 2RBL-2H3细胞脱颗粒释放组胺及TNF- α水平测试3. 1. 2. 2. 1RBL-2H3细胞的复苏与培养将细胞冻存管从干冰中取出，迅速放入37°C水浴中轻轻振摇使其迅速溶解，将细 胞冻存液吸入离心管中，用MEM培养基冲洗冻存管3次，加入MEM培养基配成IOml细胞悬液，离心4°C，800r/min，5min，静置片刻，弃去上清液，可见管底白色细胞沉淀，加入MEM 培养基稀释成Iml细胞悬液，用细胞计数板计数，根据细胞浓度按比例加入10%胎牛血 清-MEM培养基于37°C，5% CO2条件下培养.3. 1. 2. 2. 2受试药物对RBL-2H3细胞活性的影响实验取对数生长期的细胞，调整细胞浓度为2*105/孔，以每孔IOOuL接种于96孔板中， 于37°C CO2孵箱中培养24h，实验分为5组，空白对照组加入50uL新鲜培养基，给药组(色 甘酸钠5mg/mL，提取物1，提取物2，提取物3)每组3个孔，每孔加50uL，于37°C CO2孵箱中 培养5h，培养结束后对每孔细胞用台盼蓝染色做成活率统计，计数板视野内被着蓝色的为 死细胞，不着色的为活细胞，实验重复3次。细胞成活率=死细胞数/(死细胞数+活细胞数)*100%3. 1. 2. 2. 3Compound48/80 诱导 RBL-2H3 细胞脱颗粒实验取对数生长期的RBL-2H3细胞，台盼蓝染色活细胞率> 95%的细胞进行试验，RBL-2H3 细胞用 0. 25%胰蛋白酶-0. 03% EDTA 消化离心(4°C, 1000r/min, 5min),PBS 洗涤 细胞3次，用MEM培养基调整细胞浓度为1. 03*106/ml单细胞悬液，24孔板每孔加入200ul 单细胞悬液，于37°C，5% CO2孵箱中培养过夜，除空白对照组每孔加入不同浓度的C48/80 作用30min后离心。沉淀用0. 5ml Hanks液重悬，0. 05%中性红染色后用于脱颗粒细胞计 数。正常的细胞边缘光滑、核不着色、胞内浅棕色颗粒均勻。脱颗粒的细胞显示肿胀和形态 异常、胞膜破裂、颗粒外排。脱颗粒百分率脱颗粒细胞数/所计数的100个细胞X 100%。3.1.2. 2. 4RBL-2H3细胞脱颗粒释放组胺水平测试取对数生长期的RBL-2H3细胞，台盼蓝染色活细胞率> 95%的细胞进行试验， RBL-2H3 细胞用 0. 25%胰蛋白酶-0. 03% EDTA 消化离心(4°C, 1000r/min, 5min),PBS 洗涤 细胞3次，用MEM培养基调整细胞浓度为1. 03*106/ml细胞悬液，24孔板每孔加入200ul 单细胞悬液，除空白对照组和阳性对照组外，每孔均加入50ul受试药，于37°C ,5% CO2孵箱 中培养60min，取出24孔板每孔加入C48/80 (终浓度10ug/ml) 50ul，于37°C，5% CO2孵箱 中培养30min，用冰浴终止反应，按组别收集细胞液于1. 5mlEp管内，离心4°C，1500r/min， 5min,收集上清液，保存于_20°C待测组胺含量(受试药物用DMSO溶解，再将溶解物用MEM 培养基配成相应浓度，Cdmso <0. 1% )03. 1. 2. 2. 5RBL-2H3细胞脱颗粒释放TNF- α水平测试取对数生长期的RBL-2H3细胞，台盼蓝染色活细胞率> 95%的细胞进行试验， RBL-2H3 细胞用 0. 25%胰蛋白酶-0. 03% EDTA 消化离心(4°C, 1000r/min, 5min),PBS 洗涤 细胞3次，用MEM培养基调整细胞浓度为1. 03*106/ml细胞悬液，24孔板每孔加入200ul单 细胞悬液，除空白对照组和阳性对照组外，每孔均加入50ul受试药，于37°C ,5% CO2孵箱中 培养60min，取出24孔板每孔加入C48/80 (终浓度10ug/ml) 50ul，于37°C，5 % CO2孵箱中 培养4h，用冰浴终止反应，按组别收集细胞液于1. 5mlEp管内，离心4°C，1500r/min, 5min, 收集上清液，保存于_20°C待测TNF- α含量(受试药物用DMSO溶解，再将溶解物用MEM培 养基配成相应浓度，CDMSO < 0. 1% )03.2.结论3. 2. 1对卵白蛋白致敏豚鼠离体回肠肌过敏性收缩反应的影响见表6
表6结果表明卵白蛋白所致豚鼠致敏模型造模成功，在抗原卵白蛋白攻击下豚鼠 离体回肠平滑肌产生过敏性收缩反应，在骆驼刺正丁醇提取物作用下可显著性拮抗抗原攻 击所致的回肠过敏性收缩反应，提示该提取物可能具有一定的抗过敏活性表6 本发明的
提取物对致敏豚鼠回肠过敏性收缩反应的影响( +SD n= 10) 与空白对照组比较*P < 0. 05 **P < 0. 013. 2. 2对RBL-2H3细胞脱颗粒释放组胺及TNF- α水平的影响3. 2. 2. 1RBL-2H3细胞的复苏与增殖见图13. 2. 2. 2受试药物对RBL-2H3细胞存活率的影响见表7表7 受试药物对RBL-2H3细胞存活率的影响 受试药物浓度均选取的是实验中所需的最大浓度，从实验结果可以看出骆驼刺正 丁醇提取物对RBL-2H3细胞的生长有显著性影响，可以保证细胞正常的生理代谢活动。3. 2. 2. 3不同浓度的Compound48/80对RBL-2H3细胞脱颗粒的作用见图2和图3C48/80可活化肥大细胞和嗜碱性粒细胞，导致细胞脱颗粒，释放组胺、TNF-α、白 细胞介素的释放。由图2可以看出不同浓度的C48/80对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响具有差异性，浓 度为lOug/ml的C48/80诱导细胞脱颗粒率达到31%，为最佳浓度，因此在测定组胺及肿瘤 坏死因子水平含量时选用COmpOund48/80 (10ug/ml)刺激细胞脱颗粒，释放组胺及TNF-α 等过敏因子，做抗过敏药效学研究。由图3可以看出10ug/ml的C48/80在诱导细胞脱颗粒的30min反应时间内，于第 10分钟RBL-2H3细胞脱颗粒率达到最大，10分钟之后细胞脱颗粒率没有显著性改变，因此 10ug/ml的COmpOimd48/80在诱导细胞脱颗粒的第10分钟便达到脱颗粒高峰，因此在测定 组胺及肿瘤坏死因子水平含量时选用COmpOund48/80 (10ug/ml)刺激细胞脱颗粒反应时间 应大于10分钟，才能充分释放组胺及TNF-α等过敏因子，做抗过敏药效学研究。3. 2. 2. 4对RBL-2H3细胞脱颗粒释放组胺水平的影响见表8
表8 对RBL-2H3细胞脱颗粒释放组胺水平的影响 与空白对照组比较*Ρ<0. 05 #P<0. 01 与阳性对照组比较AP < 0. 05 < 0. 01本次实验探讨了骆驼刺正丁醇总提物，及正丁醇部分对RBL-2H3细胞脱颗粒释放 组胺含量的影响。从结果可以看出阳性对照药品色甘酸钠对对RBL-2H3细胞脱颗粒释放 组胺的抑制率达到近52%，且随着给药浓度的升高对组胺的抑制率作用也在增强，具有浓 度依赖性，提示模型组作用成功。骆驼刺提取物组给药浓度为0. lmg/ml和0. 05mg/ml骆驼 刺正丁醇层提取物显著的抑制了组胺的释放，对组胺的抑制率达到30%左右，其余部分对 RBL-2H3细胞脱颗粒释放组胺的含量无显著的影响。3. 2. 2. 5对RBL-2H3细胞脱颗粒释放TNF- α水平的影响见表9本次实验探讨了骆驼刺正丁醇总提物，及正丁醇部分对RBL-2H3细胞脱颗粒释放 TNF-α因子的影响。从下表可以看出阳性对照药品色甘酸钠显著的抑制了 RBL-2H3细胞 脱颗粒后TNF-α因子的释放，且呈浓度依赖性，骆驼刺正丁醇层提取物显著抑制TNF-α的 释放(ρ < 0. 01)，且给药浓度为0. lmg/ml时对TNF- α抑制率最高。表9 对RBL-2H3细胞脱颗粒释放TNF- α因子的影响 与空白对照组比较*P< 0.05 #P<0. 01与阳性对照组比较APCiXOSAA P < 0. 013.3.结论随着物质生活水平的提高，环境社会因素的影响，过敏性疾病越来越多，利用中草 药从根本上改善患者的免疫系统，提高免疫能力，且疗效持久、毒副作用少等特点，成为现 今抗过敏性疾病研究的热点。本研究通过动物模型实验和体外细胞培养实验对骆驼刺做抗 过敏药效学研究。在抗过敏动物模型实验中发现骆驼刺正丁醇组分能显著性的拮抗过敏原 引起的豚鼠离体回肠收缩，提示可能具有一定的抗过敏作用，因此进一步通过体外实验大 鼠嗜碱性白血病细胞活化脱颗粒释放活性介质组胺和肿瘤坏死因子进一步研究骆驼刺抗 过敏作用机理。经实验筛选发现选用浓度为10ug/ml的COmpOund48/80作用IOmin对大鼠嗜碱性 白细胞脱颗粒率达到最佳效果，该条件下细胞损伤较小，并且RBL-2H3细胞脱颗粒率达到 30%以上，可以进一步做过敏活性介质因子含量的分析。过敏反应即致敏原与嗜碱性白细胞表面的IgE结合，导致嗜碱性白细胞脱颗粒， 进而释放过敏活性介质组胺、TNF-α等，从而引发一系列过敏反应症状。在本研究中应用 ELISA酶联免疫试剂盒测试了 RBL-2H3细胞脱颗粒释放组胺、TNF-α因子的含量。结果表 明骆驼刺提取物1在给药浓度为0. lmg/ml和0. 5mg/ml时均可显著的抑制组胺的释放，抑 制率达到30%左右。抗过敏药品色甘酸钠组对组胺的释放有显著的抑制作用，0. lmg/ml的 色甘酸钠对组胺的抑制率为32%。肿瘤坏死因子TNF-α含量测定结果表明骆驼刺提取 物1和提取物3均对TNF- α的释放有一定的抑制作用，且呈现浓度依赖性。0. lmg/ml为最 佳给药浓度，在此浓度下提取物3对TNF- α的抑制率达到52%，作用效果高于色甘酸钠，色 甘酸钠组在0. 5mg/ml时对TNF- α的抑制率为42%。从实验结果分析骆驼刺对肠道组织的抗过敏作用机制可能是通过抑制脱颗粒细 胞释放组胺和TNF-α等活性介质，阻断这些活性介质与相关受体结合引发支气管收缩、炎 性反应等一系列生理活性反应，达到抗过敏作用效果，并且实验结果表明该药物对活细胞 的生存无显著性毒害作用，因此可以进一步研究开发该植物相关的抗过敏中药制剂。4本发明的提取物的抗溃疡性结肠炎试验
取大鼠50只分为五组，第一组空白对照组10只，只灌生理盐水，其余40只通过注 射抗原蛋白做成溃疡性结肠炎动物模型，随机将其分为模型组，高剂量组有及低剂量组，以 不同剂量骆驼刺提取物灌胃一个月杀死大鼠取结肠，做病理检查。4.1.材料与仪器4. 1.1 材料 实验用药材骆驼刺(Alhagi pseudalhagi.)(采于新疆吐鲁番地区)按本发明方 法提取正丁醇层萃取物。实验动物SD大鼠；实验仪器紫外分光光度计(Beckman公司 DU-7Spectrophotometer)；低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂TDL-40C)；—次性注射
ο4. 1.2 试剂甲醛、石蜡(西安化学试剂厂)。乙醇(天津市恒心化学试剂制造有限公司)；丙酮(天津百世化工有限公司)；蒸 馏水(自制)。4. 2实验方法4. 2.1溶液的配制配制3种浓度的骆驼刺正丁醇萃取液高剂量组称取正丁醇萃取物lOOmg，溶于 蒸馏水中50ml，配制成2mg/ml溶液，放置冰箱中保存；中剂量组称取正丁醇萃取物50mg， 溶于蒸馏水中50ml，配制成lmg/ml溶液，放置冰箱中保存；低剂量组称取正丁醇萃取物 25mg，溶于蒸馏水中50ml，配制成0. 5mg/ml溶液，放置冰箱中保存。4. 2. 2.结肠黏膜组织致敏法选用体质量在250 400g的健康大鼠，取大鼠结肠黏膜，制成黏膜勻浆，冷冻 24h，融，冰箱保存备用.使用时加入Frend’ s佐剂.(弗氏佐剂冻后以3000r/min速度离 心30min，取上清液提纯测定蛋白质含量与抗原比例1 1)首次每鼠后足垫内注射0. 1 0.3mL抗原(含蛋白6mg)；间隔IOd.于每鼠前足垫内注射0. 1 0.3mL抗原(含蛋白 12mg)；实验第17d，于每鼠背部皮下注射0. 1 0.3mL抗原(含蛋白6mg)；实验24d，在每鼠 腹股沟处注射0. 1 0. 3mL抗原(含蛋白6mg)；实验31d，在每鼠腹腔内注射0. 1 0. 3mL 抗原(含蛋白6mg，最后1次注射不加佐剂).35d后实验动物出现典型的溃疡性结肠炎的症 状.该实验的实验周期长，实验动物产生的症状与临床相似，且重复性好，但需要一定的实 验设备、条件及相应的技术.病理切片检查取病变肠组织，以10%福尔马林固定，以石蜡包埋，切片，HE染色， 光学显微镜下观察。超微病理结构观察快速处死动物，迅速取下溃疡周围的结肠粘膜，切成Imm3小 块，用2%戊二醛，多聚甲醛固定，锇酸固定，乙醇、丙酮逐级脱水，树脂包埋，超薄切 片，铅、铀双重染色，透射电射电镜观察。病理检查结果如下全部取出50只大鼠结肠，每份结肠取材3-6个部位，以石腊包 埋切片，HE染色，行光镜病理检查。详细结果如下一、空白对照组共10只，镜下见结肠肌层及浆膜层正常，结肠粘膜层未见明显炎 症及溃疡病变。见图4
二、模型组模型组共10只大鼠，镜下见10只大鼠结肠肌层及浆膜层正常，粘膜层 增厚，7只结肠粘膜层有明显炎症，粘膜表层浅表糜烂，溃疡形成，其余正常。见图5三、高剂量组10只大鼠，镜下见粘膜结肠肌层及浆膜层正常，粘膜层有5只粘膜 层增厚，4只有明显炎症，粘膜表层浅表糜烂，溃疡形成不明显，其余正常。见图6四、中剂量组10只大鼠，镜下见粘膜结肠肌层及浆膜层正常，3只粘膜层增厚，3 只有明显炎症，粘膜表层浅表糜烂，溃疡形成不明，其余正常。见图7五、低剂量组10只大鼠，镜下见粘膜结肠肌层及浆膜层正常，粘膜层有5只粘膜层增厚，4只有明显炎症，粘膜表层浅表糜烂，溃疡形成不明显，其余正常。见图84. 3 结论本试验做出的动物模型有效，粘膜炎症及浅表糜烂溃疡形成，空白对照组正常。有 较明显之对比。而用药的三组，低剂量、中剂量及高剂量与模型组相比有几例治疗好转，特 别是中剂量组10只大鼠只有3只还存在病变，其余病变不明显，其它低剂量及高剂量组也 有几只炎症消失。5本发明的提取物的抑菌实验研究5. 1.材料与方法5. 1.1 材料5. 1. 1. 1药材实验用药材骆驼刺(Alhagi pseudalhagi.)采于新疆吐鲁番地区。5. 1. 1.2药液的制备称取一定量的骆驼刺将其粉碎，过20目筛后按本发明方法 提取制备药液。5. 1.1. 3菌种及培养金黄色葡萄球菌(ATCC25923)；大肠杆菌(ATCC25922)；福氏痢疾杆菌 (ATCC51573)；均购自中国药品生物制品检定所。水解酪蛋白(MuelIer-Hinton，MH)肉汤、 琼脂培养基购自杭州微生物试剂厂。实验菌种经传代纯培养后，接种于MH肉汤培养基中，37°C恒温箱培养6h，经比浊 法测定细菌数为109CFU/mL，稀释至106CFU/mL为工作浓度。通过倾注平板法计数，实验中 每ImL液体培养基加入0. ImL细菌液，37°C恒温箱培养24h，计数菌落数乘以稀释倍数即得 最终实验浓度，其中金黄色葡萄球菌为7. IX 106CFU/mL ；大肠杆菌为4. 7X 106CFU/mL，福氏 痢疾杆菌为4. 6X 106CFU/mL。5. 1.2 方法5. 1. 2. 1试管稀释法骆驼刺提取物(lmg/mL)用MH肉汤培养基作连续倍比稀释， 使 MH 肉汤培养基含药浓度分别为 500mg/mL，250mg/mL，125mg/mL,62. 5mg/mL,31. 25mg/mL, 15. 6mg/mL, 7. 8mg/mL, 3. 9mg/mL 禾口 1. 9mg/mL,分别接种等量的实验菌液 0. ImL (105CFU/mL)， 并以无药MH肉汤培养基接种相同菌种作为对照，置37°C恒温箱观察24h后，将完全无菌生 长的最高浓度作为该药物的最低抑菌浓度(MIC)。5. 1. 2. 2琼脂扩散法取培养6h的试验菌液(105CFU/mL)，用无菌拭子将菌液分 别均勻涂布于MH琼脂平板表面，稍干后用无菌镊子将含药纸片(直径6mm，每片吸取药液 30 μ L)紧贴于MH琼脂表面，37°C恒温箱培养24h后观察并测量抑菌圈直径，每个实验菌重
复三次。5. 2结论与分析
5. 2. 1琼脂扩散法本发明的正丁醇提取物的抑菌作用见表10骆驼刺提取物对三种细菌均有一定的抑制作用(见表10)。表10 骆驼刺提取物的抑菌结果 5. 2. 2骆驼刺提取物对细菌生长的影响采用液体培养基连续稀释法将被检药液用MH肉汤培养基作一系列倍比稀释，使 MH 肉汤培养基含药浓度分别为 500mg/mL，250mg/mL，125mg/mL，62. 5mg/mL，31. 25mg/mL, 15. 6mg/mL, 7. 8mg/mL, 3. 9mg/mL禾口 1. 9mg/mL,分别接种等量的实验菌液 0. ImL (105CFU/mL)。 第10管不加药液为MH肉汤培养基接种相同菌种作对照管，每支试管为1. 8mL，然后每支试 管加入0. 2mL实验细菌液，置37°C培养24h，肉眼观察混浊情况，能抑制实验菌生长的最低 浓度为骆驼刺提取物的最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)。结果见 表11。从试管中取0. ImL实验细菌液和IOmL营养琼脂分别倾注平皿中，混勻凝固后置37°C 培养24h (每管每个浓度均倒三块平皿)观察有无细菌生长，凡平板上无菌生长的该药物最 低浓度为骆驼刺提取物的最低杀菌浓度(Minimal bactericidal concentration，MBC)，结 果见表12。表11 骆驼刺提取物的抑菌实验 注“+++”细菌明显生长；“ + ”细菌少量生长；“0”取培养再接种无菌生长。下同。骆驼刺提取物对金黄色葡萄球菌有较好地抑制和杀菌作用，其MIC为31. 25mg/ mL,MBC为62. 5mg/mL。骆驼刺提取物对福氏痢疾杆菌和大肠杆菌的抑制作用比金黄色葡萄球菌较弱，它们的MIC为125mL，MBC为250mg/mL。表12 骆驼刺提取物的杀菌实验 5. 3 结论采用连续稀释法和纸片琼脂扩散法进行骆驼刺提取物MIC和MBC的测定，结果 表明骆驼刺正丁醇提取物对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌均和福氏痢疾杆菌均有一定的抑 菌作用。骆驼刺正丁醇提取物对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和福痢疾杆菌的MIC分别为 31. 25mg/mL、125mg/mL 禾口 125mg/mL ；MBC 分别为 62. 5mg/mL、250mg/mL 禾口 250mg/mL。实验结 果表明骆驼刺提取物在体外对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌均和福氏痢疾杆菌均有一定程度 的抑菌和杀菌作用，为骆驼刺抗菌药用价值的进一步开发开发尊定了基础。
权利要求
一种从骆驼刺植物中提取治疗过敏性结肠炎药物的方法，其特征在于包含以下工艺过程回流提取取干燥的骆驼刺地上部分，粉碎，按每10kg置于25000～40000ml 60～95％的乙醇中回流提取1次以上，每次1小时以上得提取液原液；浓缩将上述提取液原液浓缩至干物质含量不低于5％得浸膏；萃取a.以浓缩所得浸膏体积1-3倍量的乙酸乙酯进行萃取，静置4～6小时澄清至出现明显分层，去乙酸乙酯层保留水溶层；b.以a步骤水溶层体积1-3倍量的正丁醇进行萃取，静置4～6小时澄清至出现明显分层，取正丁醇层溶液，浓缩所得正丁醇层提取物即为本发明的药物。
2.根据权利要求1所述的从骆驼刺植物中提取治疗过敏性结肠炎药物的方法，其特征 在于所述的回流提取重复2 4次，每次为1 5小时。
3.根据权利要求1所述的从骆驼刺植物中提取治疗过敏性结肠炎药物的方法，其特征 在于所述的萃取重复进行2 5次。
4.根据权利要求1或2所述的从骆驼刺植物中提取治疗过敏性结肠炎药物的方法， 其特征在于所述萃取a步骤之前依次进行下列的操作的至少一种以浸膏体积1-3倍量的 60-90°C石油醚进行萃取，取水溶层；以体积1 3倍量的三氯甲烷进行萃取，取水溶层。
5.根据权利要求3所述的从骆驼刺植物中提取治疗过敏性结肠炎药物的方法，其 特征在于所述萃取a步骤之前依次进行下列的操作的至少一种以浸膏体积1-3倍量的 60-90°C石油醚进行萃取，取水溶层；以体积1 3倍量的三氯甲烷进行萃取，取水溶层。
6.根据权利要求1或2所述的从骆驼刺植物中提取治疗过敏性结肠炎药物的方法，其 特征在于所述正丁醇层溶液浓缩至干物质含量> 75%。
7.一种从骆驼刺植物中提取的治疗过敏性结肠炎的药物，其特征在于根据权利要求 1 6中任一项所述的方法制取。
8.根据权利要求7所述从骆驼刺植物中提取的治疗过敏性结肠炎药物的用途，其特征 在于用以治疗过敏性结肠炎类疾病的药物中。
9.根据权利要求7所述从骆驼刺植物中提取的治疗过敏性结肠炎药物的用途，其特征 在于用于治疗因金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均或福氏痢疾杆菌引起的疾病的药物中。
全文摘要
本发明公开了一种从骆驼刺植物中提取治疗过敏性结肠炎药物的方法及其药物和用途，本发明的药物是通过回流提取、浓缩、萃取、浓缩等步骤制取，可以用以治疗过敏性结肠炎类疾病。本发明的药物为纯中草药制剂，经试验证明能够改善动物体的免疫系统，提高免疫能力，特别是对过敏性结肠炎类疾病有较明显的效果，并且具有疗效持久、毒副作用小的特点，可以广泛应用在各种治疗过敏性结肠炎类疾病的药物中。
文档编号A61P31/04GK101862366SQ20101020571
公开日2010年10月20日 申请日期2010年6月9日 优先权日2009年11月19日
发明者夏提古丽, 熊元君, 贾晓光 申请人:新疆维吾尔自治区中药民族药研究所